التحليل التحليلي المعلوماتي الحيوية لعينات نخاع العظم لتحديد علامات مقاومة العلاج الكيميائي في سرطان الدم النخاعي الحاد

ملخص

يقدم هذا البروتوكول سير عمل معلوماتي حيوي موحد لتحليل التغيرات النصية في سرطان الدم النخاعي الحاد (AML). الهدف هو مقارنة عينات نخاع العظم المشخصة حديثا والانتكاسة، وإعطاء الأولوية للتوقيعات الجزيئية المرتبطة بمقاومة العلاج الكيميائي وتطور المرض لإجراء التحقيقات اللاحقة.

الملخص

سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) هو ورم دموي خبيث غير متجانس للغاية، حيث لا تزال الانتكاسة والمقاومة الكيميائية المكتسبة من الأسباب الرئيسية لفشل العلاج. تقدم هذه المقالة بروتوكولا حيويا للتحليل النصي لشفاطات نخاع العظم. الهدف الأساسي من البروتوكول هو توفير سير عمل موحد لتحديد التوقيعات الجزيئية المرتبطة بتقدم المرض ومقاومة العلاج في علاج غسل غسل الأموال المنتكس. يوضح خط الأنابيب الإجراءات الحسابية لمقارنة عينات نخاع العظم غير المتزوجة، والتي تم عرضها باستخدام بيانات التسلسل من خمس حالات تم تشخيصها حديثا وأربع حالات انتكست. توضح هذه الطريقة الخطوات الأساسية لمعالجة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي، وإجراء تحليل التعبير الجيني التفاضلي، وإجراء التقييمات الوظيفية اللاحقة. تطبيق هذا سير العمل حدد 2,025 جينا معبرا تفاضلا (DEGs)، بما في ذلك FOXC1 وHOXA11 وHOXA11-AS وAXL، كنسخ مرشحة مرتبطة بالانتكاس في هذه المجموعة التمثيلية. أعطت التحليلات الوظيفية والشبكية الأولوية لمجموعات الجينات ومراكز التفاعل المتعلقة بإشارات إنزيم GTPase الصغيرة، والإشارات الالتهابية، والتفاعلات المصفوفية خارج الخلية، وعمليات تخليق الحمض النووي الريبي. بشكل عام، توفر هذه المنهجية خط أنابيب حسابية قابل للتكرار لرسم التوقيعات النصية المرتبطة بعلاج غسل الأموال المنتكس، ولتوليد فرضيات تتطلب التحقق التجريبي لاحقا.

المقدمة

سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) هو مجموعة من الأورام الخبيثة المستنسخة التي تنشأ من خلايا جذعية/سلفية مسببة للدم، وتتميز بتكاثر غير طبيعي لخلايا النخاع غير الناضجة في نخاع العظم وتثبيط التمايز الدموي ^1,2,3. على الرغم من أن العلاج الكيميائي التحريضي القياسي الحالي (مثل السيتارابين مع الأنثراسيكلينات) يمكن أن يسبب هدوءا كاملا لمعظم المرضى، إلا أن معدل الانتكاس لا يزال مرتفعا بين 50٪–70٪، كما أن توقعات المرضى المنتكسين متأثرة بشكل كبير ^4,5,6. ترتبط مقاومة العلاج الكيميائي المكتسبة بفشل علاج AML، مما يتطلب تحليلا معمقا للتوقيعات الجزيئية المرتبطة بهذه العملية لتحسين استراتيجيات العلاج ومعدلات بقاء المرضى ^7,8.

في الأدبيات الأوسع، تشير الدراسات الحالية إلى أن مقاومة العلاج الكيميائي في AML لا تقتصر على زيادة تنشيط مضخات تدفق الأدوية أو استقلاب الأدوية غير الطبيعي، بل ترتبط أيضا بالحفاظ على بقاء خلايا اللوكيميا الجذعية (LSCs)، وتكوين أنماط ظاهرية تشبه الانتقال الظهاري-الميزنشيمي (EMT) ضمن التخصص الدموي، والتفاعلات مع البيئة الدقيقة لنخاع العظم^{9. 10، 11}. على سبيل المثال، تظهر مجموعات LSC قدرة عالية على التجديد الذاتي والهدوء، وهو ما يرتبط بمقاومة فطرية للعوامل الكيميائية الخاصة بدورة الخلية¹². بالإضافة إلى ذلك، ارتبط زيادة تنظيم كيناز التيروزين المستقبلي، مثل AXL، بالمقاومة في FLT3-ITD+ AML، وذلك بالتزامن مع تنشيط مسارات PI3K/AKT وMAPK وتعزيز القدرات المضادة للاستماتة^13,14. كما تم التعرف على إعادة برمجة الأيض وإعادة التشكيل فوق الجيني كمحاور تنظيمية مهمة في تكوين المقاومة. تشير الأدلة إلى أن خلايا AML أثناء الانتكاس قد تتكيف مع الإجهاد التأكسدي الناتج عن العلاج الكيميائي وتلف الحمض النووي من خلال زيادة نشاط الفسفرة التأكسدية (OXPHOS)، وتعديل نسب NAD⁺/NADH، وحالات تعديل الهيستون 15,16,17. ترتبط العوامل الالتهابية في بيئة نخاع العظم الدقيقة، مثل IL-6 وCXCL8، أيضا ببقاء LSC ومقاومة العلاج الكيميائي، وغالبا ما تحدث بالتنسيق مع تنشيط مسارات الإشارة STAT3/NF-κB^11,18.

على الرغم من هذه الآليات المعترف بها، لا تزال التغيرات النصية المرتبطة بانتكاس AML ومقاومة الدم الكيميائي غير مكتملة التوصيف، خاصة عند تقييم الإشارات الأيضية والإيبيجينية والبيئة الدقيقة لنخاع العظم معا في العينات السريرية. يلبي هذا السير هذا الحاجة من خلال إعطاء الأولوية لمعدلات التحليل المبكر المرشحة، والمسارات، والشبكات التنظيمية المرتبطة بالانتقال من التشخيص الأولي إلى الانتكاس السريري. يدمج هذا النهج تحليل التعبير التفاضلي، وتحليل إثراء مجموعات الجينات (GSEA)، وبناء شبكات تفاعل البروتين والبروتين (PPI) لرسم خريطة لإعادة برمجة النسخ على مستوى النظام وترشيح مرشحين للتحقق الآلي لاحقا.

الهدف العام من هذه الطريقة هو تقديم خط أنابيب معلوماتية حيوية موحد وقابل للتكرار لمقارنة النسخ الضخمة لعينات نخاع العظم AML التي تم تشخيصها حديثا مقابل انتكست. الدافع وراء استخدام هذه التقنية في السيليكو هو قدرتها على التقاط أحداث النسخ غير المتحيزة على مستوى الجينوم، متجاوزة حدود التحليلات ذات المسار الواحد لإعطاء الأولوية لشبكات تنظيمية معقدة متعددة الأبعاد. تقدم هذه التقنية مزايا كبيرة مقارنة بالطرق البديلة مثل المصفوفات الدقيقة أو لوحات qPCR المتعددة المستهدفة، من خلال توفير نطاق ديناميكي أعلى، والقدرة على اكتشاف النسخ الجديدة، وقياس دقيق لتعبير الجينات دون قيود المسبارات المصممة^{مسبقا 19,20}. لتحديد ما إذا كانت هذه الطريقة مناسبة لتطبيقهم، يجب على القراء ملاحظة أن هذا المسار مصمم خصيصا للباحثين الذين يعالجون بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الضخم من مجموعات سريرية مزدوجة أو غير مرتبطة، مثل شفط الأنسجة. وهو مناسب لتحديد التوقيعات المرتبطة بالمقاومة الواسعة والشبكات التنظيمية المرشحة، بينما يحتاج الباحثون الذين يحتاجون إلى دقة خاصة بنوع الخلية أو مكانية إلى استخدام سير عمل تكميلي لتسلسل الخلايا الواحدة أو المكانية. في النهاية، يتيح هذا البروتوكول الحاسوبي إعطاء الأولوية للجينات المرشحة والمسارات والشبكات التنظيمية للتحقيقات التجريبية اللاحقة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الطرق التي تتضمن أخذ عينات الأنسجة البشرية وفقا للإرشادات المؤسسية وإعلان هلسنكي (المعدل في 2013). تم الحصول على عينات نخاع العظم السريرية بموافقة لجنة أخلاقيات المؤسسة (أرقام الموافقة TY-ZKY2024-116-01 وTY-ZKY2024-116-02).

1. جمع العينات السريرية وتصنيف المرضى

1. اختاروا عينات استنشاق نخاع العظم من المرضى الذين تم تشخيصهم رسميا بسرطان الدم النخاعي الحاد (AML) بناء على معايير تصنيف منظمة الصحة العالمية (WHO).
2. تطبيق معايير محددة للإدراج والاستبعاد أثناء اختيار المرضى لضمان تجانس المجموعة وقابليتها للتكرار. يشمل المرضى البالغين الذين يعانون من AML الأولي، واستثناء المرضى الذين يعانون من AML ثانوي، أو سرطان الدم البري النقي الحاد، أو تاريخ سابق لأورام خبيثة أخرى (الجدول 1).
3. خصص العينة المجمعة للمجموعة المشخصة حديثا إذا كان المريض يعاني من AML غير معالج سابقا وقت التشخيص السريري الأولي.
4. خصص العينة المجمعة للمجموعة الانتكاسية إذا أظهر المريض ظهور انفجارات سرطان الدم في الدم المحيطي أو انفجارات تزيد عن 5٪ في نخاع العظم بعد هدوء كامل موثق.
5. اجمع عينات نخاع العظم المتبقية التي لم يتم تحديدها مباشرة بعد إجراء السحب السريري الروتيني.
   ملاحظة: في عرض هذا البروتوكول المحدد، تم جمع تسع عينات متتالية (خمسة تم تشخيصها حديثا وأربعة انتكست) من سبتمبر 2024 إلى سبتمبر 2025. ونظرا لأن هذا النموذج استخدم فقط عينات سريرية متبقية غير محددة الهوية، فقد تنازلت لجنة الأخلاقيات عن شرط الموافقة المكتوبة المستنيرة.
6. يعالج استنشاق نخاع العظم المجمع فورا للحفاظ عليه باستخدام طريقة تحلل الفينول-جوانيدينيوم القياسية²¹.
   1. انقل الشفط الجديد لنخاع العظم إلى أنبوب جمع يحتوي على مضاد تخثر. اهز الأنبوب لخلط الأنبوب مع مادة التخثر جيدا.
   2. استخرج كمية مقاسة من العينة المضادة للتخثر وأضافها إلى مادة تحلل فينول-جوانيدينيوم التجارية. حافظ على نسبة حجم 3 أجزاء من مادة التحليل إلى عينة من جزء واحد.
      تحذير: يحتوي كاشف تحلل الفينول-جوانيدينيوم على مواد كيميائية سامة ومسببة للتآكل يمكن أن تسبب حروقا شديدة وتلف الأنسجة. قم بجميع التعامل مع الكواشف داخل غطاء أبخرة كيميائي وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
   3. اهز الأنبوب بقوة لتوحيد العينة وكاشف التحلل بالكامل. تأكد من خلط الخليط بالكامل وتأكد من عدم بقاء جلطات ظاهرة في المحلول.
   4. قم بتجميد العينة المتجانسة فورا عن طريق غمر الأنبوب في النيتروجين السائل.
      تحذير: النيتروجين السائل بارد جدا وقد يسبب قضمة صقيع شديدة عند ملامستها. ارتد قفازات تبريدية وواقي وجه كامل عند التعامل مع النيتروجين السائل.
7. نقل العينات المجمدة بسرعة إلى فريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد قبل الانتهاء من العزل والتسلسل النسبي للحمض النووي الريبي. يمثل هذا نقطة آمنة يمكن عندها إيقاف التجربة وإعادة تشغيلها لاحقا.
   ملاحظة: يركز سير العمل المعروض في هذا البروتوكول بالكامل على توليد توقيعات مقاومة حسابية. لم يتم إجراء أي تحقق تجريبي مستقل، مثل PCR الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)، على الجينات الرئيسية المعبر عنها تفاضلا تم تحديدها من خلال هذا الخط المحدد.

2. مراقبة جودة الحمض النووي الريبي وتحضير المكتبة

1. تقييم سلامة الحمض النووي الريبي باستخدام نظام الرحلان الكهربائي الشعيرات الدقيقة السائلة. لهذا السير التمثيلي، أدرج عينات RNA برقم سلامة RNA (RIN) ≥ 6.0، ونسبة A260/280 بين 1.8 و2.1، ولا يوجد ذروة تدهور مرئية. سجل نسب RIN والنقاء المقاسة لكل عينة قبل التحضير في المكتبة.
2. إدخال 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لكل عينة لتحضير المكتبة. تنقية mRNA من إجمالي RNA باستخدام حرز مغناطيسي متصلة بأوليغو بولي-T لإثراء النسخ ذات الذيل البولي A.
3. تجزئة ال mRNA المخصي باستخدام كاتيونات متكافئة. حضن الخليط عند 94 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في مخزن تفاعل تخليق السلسلة الأولى بخمس أضعاف.
4. تخليق cDNA للسلسلة الأولى باستخدام بادئات سداسية عشوائية ونسخ عكسي يفتقر إلى نشاط RNase H.
5. قم بتحليل قالب سلسلة RNA باستخدام RNase H. تخليق cDNA للسلسلة الثانية باستخدام DNA Polymerase I وdNTPs في نظام تفاعل بسعة 20 ميكرولتر.
6. احتضن تفاعل تخليق الخيط الثاني عند 16 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بطرد مركزي لخليط التفاعل لفترة وجيزة عند 2000 × جم لجمع السائل في قاع الأنبوب.
7. حول البروز المتبقي إلى نهايات غير حادة باستخدام أنشطة الإكسونوكلئاز والبوليميراز. قم بتحويل الأطراف الثلاثية لشظايا الحمض النووي إلى الأدينيليات وربطها بهياكل حلقية حادة للتحضير للتهجين.
8. قم بتنقية شظايا المكتبة باستخدام خرزات تثبيت مغناطيسية قابلة للعكس في الطور الصلب لاختيار شظايا cDNA بطول 370–420 بيسون بشكل تفضيلي.
9. قم بغسل الإيثانول أثناء تنقية الخرز. قم بطرد المركزي بالأنابيب عند 2000 × جرام لمدة 30 ثانية لجمع وإزالة أي إيثانول متبقي قبل السحب النهائي.
10. قم بتضخيم PCR باستخدام بوليميراز DNA عالي الدقة، وبادئات PCR عالمية، وبادئات مؤشر خاصة بالعينة.
11. نفذ ملف PCR الحراري مع إزالة الطبيعة الأولية عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تابع ذلك ب 12 دورة بدرجة حرارة 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، و60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وتنتهي بتمديد أخير عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
12. قم بتنقية منتجات PCR مرة أخرى باستخدام الخرز المغناطيسي. تطبيق نفس معلمات الطرد المركزي من الخطوة 2.9 للحصول على المكتبة النهائية.
13. قم بقياس تركيز المكتبة الأولي باستخدام جهاز قياس الفلورومتر. تخفيف المكتبة النهائية إلى تركيز 1.5 نانوغرام/ميكرولتر.
14. اخلط المكتبة المخففة جيدا. قم بطرد مركزي بالخليط عند 10,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية لإزالة أي بقايا متبقية قبل التحليل النهائي.
15. تقييم حجم الإدخال في المكتبة باستخدام نظام الرحلان الكهربائي الشعيرية الميكروفلويدية.
16. قم بقياس التركيز الفعال للمكتبة بدقة عبر PCR الكمي اللحظي (qRT-PCR) عند التأكد من أن حجم الإدراج يفي بالتوقعات. تأكد من أن التركيز أعلى من 1.5 نانومتر لضمان استقرار المكتبة وجودة التسلسل.
    ملاحظة: يمثل هذا نقطة آمنة يمكن عندها إيقاف التجربة مؤقتا. يمكن تخزين المكتبات المعدة عند -20 درجة مئوية حتى التجميع والتسلسل.

3. التجميع وتسلسل النسخ

1. قم بتجميع العينات المشفرة بالفهرس على نظام توليد عنقود آلي. استخدم مجموعة تجارية مزدوجة الأطراف وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. تسلسل تحضيرات المكتبة على منصة تسلسل عالية الإنتاجية بعد نجاح إنشاء العنقود. توليد 150 قراءة مزدوجة من زوج القواعد (bp).

4. مراقبة جودة البيانات ورسم الخرائط

1. قيم جودة البيانات الخام (تنسيق FASTQ) باستخدام FASTP v0.23.2 للتحكم في جودة القراءة الخام والتصفية. سجل معلمات سطر الأوامر في سجل تحليل. في هذا السير عمل، تم توليد قراءات نظيفة عن طريق إزالة القراءات التي تحتوي على محولات، والقراءات التي تحتوي على تسلسلات بولي-N، والقراءات منخفضة الجودة باستخدام إعدادات تصفية متطابقة عبر العينات. يتم توفير أمر مزدوج ممثل في الملف التكميلي 1.
2. معالجة القراءات الخام من خلال برنامج معالجة مسبقة آلي. الحصول على قراءات نظيفة عن طريق إزالة القراءات التي تحتوي على محولات، والقراءات التي تحتوي على تسلسلات بولي-N، والقراءات منخفضة الجودة. استخدم معلمات تصفية متطابقة لجميع العينات وسجل رقم القراءة المحتفظ به، ومحتوى Q20، Q30، وGC بعد التصفية.
3. احسب محتوى Q20 وQ30 وGC للبيانات النظيفة. حدد متغيرات الدفعة المحتملة قبل التحليل اللاحق، بما في ذلك تاريخ جمع العينات، تاريخ استخراج RNA، دفعة تحضير المكتبة، مسار التسلسل، وتشغيل التسلسل.
4. تقييم تأثيرات الدفعات بواسطة تحليل PCA وتحليل الارتباط بين العينة والعينة باستخدام قيم تعبير مطبلة. إذا تجمعت العينات بشكل أساسي حسب المتغيرات التقنية بدلا من الحالة السريرية، قم بتوثيق المتغير المتأثر وإدراجه كمتغير ترابط في صيغة تصميم التعبير التفاضلي أو تطبيق طريقة تعديل دفعة معتمدة قبل التصور اللاحق.
5. احصل على الجينوم المرجعي (Homo sapiens, GRCh38) وإصدار Ensembl المقابل 109 ملفات توضيح جينية لمحاذاة القراءة.
6. ابن فهرس الجينوم المرجعي باستخدام HISAT2 v2.0.5.
7. قم بمحاذاة القراءات النظيفة ذات الأطراف المزدوجة مع الجينوم المرجعي باستخدام HISAT2 v2.0.5. استخدم هذا النهج الواعية للمحاذاة لإنشاء قاعدة بيانات لوصلات التوصيل بناء على ملف التعليقات التوضيحية لنموذج الجين.

5. التنبؤ بالنص الجديد وقياس تعبير الجين

1. قم بتجميع القراءات المخصصة لكل عينة باستخدام StringTie v1.3.3b بأسلوب مرجعي. استخدم هذه الأداة لتجميع وقياس النسخ الكاملة التي تمثل عدة متغيرات في التوصيل لكل موقع جيني.
2. عد عدد القراءات المرتبطة بكل جين باستخدام featureCounts v1.5.0-p3. استخدم مصفوفة عدد القراءة-عدد الصحيح الخام الناتج كمدخل لتحليل التعبيرات التفاضلية في المراحل النهائية.
3. تكوين featureCounts v1.5.0-p3 لبيانات تسلسل الطرف المزدوج باستخدام خيار الطرف المزدوج (مثلا، -p). قدم ملف التعليقات التوضيحية GRCh38 GTF المحملة لتعريف حدود الميزات الجينومية الصحيحة.
4. احسب الشظايا لكل كيلو قاعدة من النسخ لكل مليون قراءة مأخوذة (FPKM) لكل جين. استخدم قيم FPKM فقط للتصور الوصفي، وتحليل PCA، وعرض خريطة الحرارة، وملخصات التعبيرات الاستكشافية؛ لا تستخدم قيم FPKM كمصفوفة إدخال لاختبار التعبير التفاضلي في DESeq2.

6. تحليل التعبير الجيني التفاضلي

1. إجراء تحليل تعبيرات تفاضلية بين المجموعات المشخصة حديثا والعائدة باستخدام R v3.5.0 وحزمة DESeq2 R v1.20.0. استيراد مصفوفة عدد القراءة الخام التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.2 إلى بيئة R، واحتفظ بقيم FPKM فقط للتصور والتحليلات الاستكشافية.
2. قم بإنشاء كائن مجموعة البيانات المتخصص المطلوب من قبل حزمة التحليل. نفذ الأمر المحدد (مثل DESeqDataSetFromMatrix()) لربط مصفوفة بيانات العد بجدول بيانات العينة المقابل.
3. حدد صيغة التصميم التجريبي داخل كائن البرمجيات. حدد الحالة السريرية (التشخيص حديثا مقابل الانتكاس) كمتغير أساسي للمقارنة (مثلا، التصميم = ~ الحالة). إذا تم تحديد متغير دفعة تقنية في الخطوة 4.3 ولم يتم الخلط فيه تماما مع الحالة السريرية، يجب تضمينه في صيغة التصميم (مثلا، التصميم = ~ دفعة + شرط).
4. نفذ دالة تحليل التعبير التفاضلي الأساسية (مثل DESeq()). يسمح للبرنامج بإجراء تقدير عامل الحجم، تقدير التشتت، واختبار والد السالب²² تلقائيا.
5. استخرج جدول النتائج باستخدام دالة استخراج النتائج (مثل results()). حدد حجة التباين لتحديد المقارنة الدقيقة (الانتكاس مقابل التشخيص الجديد).
6. قم بضبط قيم P الناتجة للتحكم في معدل الاكتشاف الكاذب. استخدم إجراء بنجاميني وهوشبرغ المدمج الذي يطبق تلقائيا في حزمة البرمجيات²³.
7. تصفية جدول النتائج المستخرج لعزل الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) ذات دلالة دلالة. تعيين أي جين له قيمة P معدلة < 0.05 وتغير مطلق لوغاريتميين > 1 كجين معبرا بشكل تفاضلي بشكل ملحوظ.

7. تحليل إثراء الجينات (GO)

1. إجراء تحليل إثراء الأنطولوجيا الجينية (GO) للمستويات المميزة المحددة باستخدام clusterProfiler v3.8.1 وorg. Hs.eg.db الإصدار 3.6.0. أدخل قائمة معرفات جينات إنتريز التي تتوافق مع المستويات المهمة المحددة في الخطوة 6.7.
2. نفذ دالة إثراء GO (مثل enrichGO()). حدد المعلمات المطلوبة، بما في ذلك قاعدة بيانات الكائنات الخلفية المناسبة (مثل OrgDb = org). Hs.eg.db)، والمجال الأنطولوجي المحدد (العملية البيولوجية، المكون الخلوي، أو الوظيفة الجزيئية)، وقطع قيمة P المعدل (0.05).
3. تأكد من تطبيق الخوارزمية للتصحيحات اللازمة أثناء حساب الإثراء. تأكد من أن البرنامج يصحح داخليا انحياز طول الجين ويضبط قيم P باستخدام طريقة بنجاميني وهوخبرغ²⁴.
4. اعتبر مصطلحات GO ذات قيمة P المصححة أقل من 0.05 كأنها غنية بشكل كبير. قم بإنشاء مخطط نقطي أو مخطط شريطي باستخدام وظائف التصور المتكاملة في الحزمة لعرض أفضل مصطلحات GO المثرية.

8. موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) تحليل مسارات إثراء المسارات

1. استخدم موردا شاملا في قاعدة بيانات مخصص لفهم وظائف النظام البيولوجي عالي المستوى لتحديد المسارات غير المنظمة. أعد نفس القائمة من معرفات DEG Entrez المهمة المستخدمة في الخطوة 7.1.
2. تنفيذ دالة إثراء KEGG (مثلا، enrichKEGG()) ضمن حزمة التعليق الوظيفي R.
3. حدد المعاملات الحرجة داخل استدعاء الدالة. اضبط رمز الكائن الحي فقط على الإنسان (مثلا، الكائن الحي = 'يملكه') وحدد طريقة تعديل قيمة P (مثلا، pAdjustMethod = 'BH').
4. استخلاص مسارات KEGG ذات الدلالة الإحصائية. فلتر الناتج بحيث يحتفظ فقط بالمسارات التي تظهر قيمة P مصححة أقل من 0.05.
5. تخيل أكثر مسارات KEGG تطورا. استخدم دوال الرسم المتكاملة (مثل dotplot()) لرسم الدلالة الإحصائية وعدد الجينات المرتبطة بكل مسار.

9. تحليل تخصيب مجموعات الجينات (GSEA)

1. جهز قائمة الجينات المصنفة مسبقا المطلوبة للتحليل. احسب مقياس الترتيب لجميع الجينات المعبر عنها باستخدام القيمة الموقعة -log10(قيمة P) مضروبة في علامة التغير اللوغاريتمي_ثنائي المستخرج من تحليل التعبير التفاضلي.
2. إطلاق تثبيت محلي لبرنامج معهد برود GSEA الإصدار 4.2.3. أدخل قائمة الجينات المصنفة مسبقا الجديدة في واجهة البرمجيات²⁵.
3. قم بتحميل مجموعات الجينات المحددة مسبقا المطلوبة. احصل على مجموعات بيانات أنطولوجيا الجينات (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) من قاعدة بيانات التواقيع الجزيئية (MSigDB، الإصدار 7.5.1)²⁶.
4. قم بتكوين معلمات البرنامج لإجراء اختبار الإثراء الإحصائي. اضبط عدد التبديلات إلى 1000 واختر نوع التبديل ك 'gene_set'.
5. نفذ خوارزمية التحليل لتحديد ما إذا كانت مجموعات الجينات المحددة مسبقا تظهر فرقا متوافقا وذو دلالة إحصائية بين الحالات البيولوجية المشخصة حديثا والحالة البيولوجية المنتكسة.
6. تقييم الأهمية الإحصائية لملفات الإثراء المولدة. تعريف مجموعات جينية ذات دلالة باستخدام عتبات صارمة: قيمة مطلقة لدرجة الإثراء المعتدلة (NES) > 1.0، وقيمة P الاسمية < 0.05، وقيمة q-معدل اكتشاف خاطئ (FDR) < 0.25.

10. تحليل شبكة تفاعل البروتين (PPI)

1. ادخل إلى قاعدة بيانات STRING للاطلاع على التفاعلات المعروفة والمتوقعة بين البروتين والبروتين. في هذا السير العملي، تم إجراء تحليل PPI باستخدام STRING v11.5²⁷.
2. أدخل قائمة معرفات جينات إنتريز أو رموز الجينات الرسمية للجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي مهم (تم تحديدها في الخطوة 6.7) في واجهة البحث في قاعدة البيانات. اختر الإنسان العاقل ككائن مستهدف.
3. قم بتكوين معلمات بناء الشبكة لضمان استرجاع التفاعلات عالية الجودة. اضبط الحد الأدنى لدرجة التفاعل المطلوبة على حد ثقة عالي (الدرجة > 0.700).
4. تصدير بيانات شبكة التفاعل الناتجة إلى دليل محلي. احفظ خريطة التفاعل كملف جدولي قياسي (مثل تنسيق TSV).
5. استيراد بيانات التفاعل المصدرة إلى Cytoscape v3.9.1 لعرض وتحليل الشبكة²⁸.
6. تصفية الشبكة المبنية لتحسين وضوح التصور وتسليط الضوء على المراكز التنظيمية الرئيسية. قم بإزالة أي عقد منفصلة أو جينات يتيمة لا تظهر تفاعلات مستمرة تحقق عتبة الثقة المحددة.

النتائج

التحقق من المجموعات السريرية والتسلسل

تم تأكيد التنفيذ الناجح لبروتوكول استخراج RNA وإعداد المكتبة (الشكل 1) من خلال مقاييس التسلسل والجودة. في هذه المجموعة الممثلة، أظهرت عينات نخاع العظم من خمسة مرضى حديثا وأربعة مرضى انتكسوا من AML في المتوسط حوالي 6.0 جيجابايت من البيانات الخام لكل عينة. أكد تقييم مراقبة الجودة (الجدول 2) أن جودة القاعدة وعمق القراءة حققا العتبات المطلوبة لتحليل المعلومات الحيوية في المراحل النهائية9. انخفاض سلامة الحمض النووي الريبي (مثل RIN < 6.0)، أو معدلات رسم الخرائط المنخفضة، أو تحيز تدهور النص العالي سيمثل جودة إدخال دون المستوى المثالي وقد يضر بموثوقية تحليل التعبير التفاضلي في مرحلة اللاحق.

التباين العالمي للنسخ النصي وتحليل المكونات المعتمدة

لتقييم تباين النسخ المكتوب العالمي وفحص التجميع السريري، تم إجراء تحليل PCA على بيانات التعبير الطبيعية. في هذه المجموعة التمثيلية، أظهرت المجموعتان المشخصتان حديثا والانتكاسات انفصالا في الفضاء ثنائي الأبعاد (الشكل 2A)²⁰، حيث شكلت PC1 وPC2 23.82٪ و18.75٪ من التباين الكلي على التوالي. توفر مخططات فين في الشكل 2B,C ملخصا وصفيا إضافيا للجينات التي تم اكتشافها عبر العينات ضمن المجموعات التي تم تشخيصها حديثا ومنتكساتها، داعمة فحوصات التكرار على مستوى العينة قبل تحليل التعبير التفاضلي لاحقا. نظرا لأن المجموعة كانت صغيرة وغير متزاوجة، تم تفسير فصل PCA كدليل توضيحي لسير العمل بدلا من دليل قاطع على بيولوجيا الحالة الخاصة بالمرض.

تحليل جينات التعبير التفاضلي (DEG)

تطبيق عتبات البروتوكول المحددة (|log₂FC| ≥ 1 وقيمة P المعدلة ≤ 0.05) على مخرجات DESeq2، تم تحديد 2,025 DEGs، تضم 772 جينا مرتفعا و1,253 جينا منخفضا في المجموعة المنتكسة (الشكل 3A). شملت النسخ المرشحة ذات التنوع العالي FOXC1 (سجل₂FC = 7.55، P = 4.92 × ^10-5)، HOXA11 (سجل₂FC = 7.76)، HOXA11-AS (السجل₂FC = 7.23)، وAXL (السجل₂FC = 3.50)، إلى جانب RHOB وPTX3 وCXCL8 المخفضة. تربط الأدبيات الحالية العديد من هذه الجينات بجذر AML أو إشاراته أو استجابة العلاج^13,29؛ ومع ذلك، يحدد سير العمل الحالي هذه التسجيلات فقط كنسخ مرشحة مرتبطة بالانتكاس. أي دور ميكانيكي نهائي في المقاومة السريرية يتطلب التحقق الوظيفي المستقل لاحقا.

الإثراء الوظيفي والمسارات (GO، KEGG، وGSEA)

قام بروتوكول التعليق الوظيفي برسم خرائط DEGs إلى أنظمة بيولوجية أوسع. حدد تحليل GO إثراء المصطلحات المتعلقة بنقل الإشارة الصغيرة التي توسطها GTPase، ونقل الأيونات المعدنية، وتجميع الكروماتين (الشكل 4A–C). حدد رسم خرائط مسار KEGG ارتباطات مع تفاعلات مستقبلات ECM وتفاعلات مستقبلات السيتوكين مع السيتوكينات (الشكل 4D). أظهرت GSEA إثراء عمليات تخليق الحمض النووي الريبي في المجموعة المنتكسة وتثريبا في مسارات أيض الطاقة في المجموعة المشخصة حديثا (الشكل 5A). توفر هذه النتائج الترفيهية خارطة طريق وصفية لمجموعات الجينات المتغيرة ويجب تفسيرها كارتباطات تولد فرضيات بدلا من كونها محركات مثبتة للانتكاس.

بناء شبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI)

احتوت شبكة STRING الأولية على 56 عقدة و193 تفاعلا. بعد إزالة العقد غير المتصلة أو اليتيمة، احتوت شبكة سايتوسكيب المعروضة على 42 عقدة و136 تفاعلا (الشكل 5B). أعطى تحليل الشبكات المعياري الأولوية ل TP53 وCCL2 وCXCL8 وIL6 كمراكز رياضية مركزية ذات أكبر عدد من التفاعلات. نظرا لأن شبكة PPI تعتمد على درجات التفاعل المتوقعة من قواعد البيانات (مثل درجة ATF3: 0.982)، يجب تفسير تحديد المركز كأولوية للأهداف للدراسات التجريبية المستقبلية بدلا من الدليل المباشر على التهرب من الاستماتة المبرمج بوساطة p53 أو آليات مقاومة أخرى.

تم إيداع بيانات تسلسل الحمض النووي الخام الخام التي تم توليدها في هذا البروتوكول في مستودع فيجشير وهي متاحة للجمهور عبر DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.30655814 التالية. البيانات المعالجة وملفات التحليل المرتبطة بها مدرجة في المقال وموادها التكميلية. يتم توفير معلمات خط الأوامر التمثيلية وإعدادات التحليل المستخدمة لإعادة إنتاج سير العمل الحسابي كملف تكميلي 1. جميع البيانات الداعمة لنتائج هذه الدراسة متاحة دون قيود.

معرف المريض	العمر (السنوات)	الجنس	الطفرات الجزيئية	البقاء على قيد الحياة/المتابعة (شهور)	الحالة السريرية
R_AML_1	70	ذكر	FLT3-ITD (+)	22	متوفى
R_AML_2	29	أنثى	NPM1 (+)	11	على قيد الحياة
R_AML_3	40	ذكر	CEBPA (+)	17	على قيد الحياة
R_AML_4	55	أنثى	ثلاثي سلبي*	24	متوفى

الجدول 1: الخصائص الديموغرافية والسريرية للمرضى في مجموعة الانتكاس من AML (R_AML). يلخص الجدول 1 السمات الديموغرافية والسريرية لمجموعة علاج غسل الغسل النقدي المنتكسة المستخدمة في التحليل الممثل، بما في ذلك الخصائص السريرية على مستوى المريض ذات الصلة بتفسير سير عمل النسخ.

عينة	المكتبة	Raw_reads	Raw_bases	Clean_reads	Clean_bases	Error_rate	س20	Q30	GC_pct
AML_1	FRAS25 0244891-1r	48705066	7.31G	47807532	7.17G	0.01	99.35	97.48	47.48
AML_2	FRAS25 0244896-1r	42969940	6.45G	42237962	6.34G	0.01	99.35	97.44	46.74
AML_3	FRAS2502 44906-1r	48738386	7.31G	47744462	7.16G	0.01	99.36	97.48	47.28
AML_4	FRAS250 244915-1r	48723650	7.31G	47688240	7.15G	0.01	99.29	97.26	47.45
AML_5	FRAS2502 44920-1r	49508198	7.43G	47740308	7.16G	0.01	99.37	97.53	47.73
R_AML_1	FRAS2502 44892-1r	47879408	7.18G	46671584	7.0G	0.01	99.39	97.49	47.63
R_AML_2	FRAS2502 70005-1r	47657378	7.15G	46957882	7.04G	0.01	99.39	97.49	50.5
R_AML_3	FRAS250 405722-1r	58754766	8.81G	56867112	8.53G	0.01	99.38	97.42	46.52
R_AML_4	FRAS2502 44902-1r	48491122	7.27G	47469334	7.12G	0.01	99.23	97.21	46.43

الجدول 2: ملخص جودة البيانات. يذكر الجدول 2 مقاييس جودة التسلسل لكل عينة، بما في ذلك عائد القراءة، جودة الأساس، محتوى GC، ومعلومات مراقبة الجودة المتعلقة بالخرائط المستخدمة لتحديد ما إذا كانت العينات مناسبة للتحليل اللاحق.

الشكل 1: سير عمل البروتوكول. يلخص سير العمل المراحل التجريبية والحوسبة الرئيسية، بما في ذلك جمع العينات السريرية، ومراقبة جودة الحمض النووي الريبي، وتحضير المكتبة وتسلسل المعلومات، ومعالجة ومحاذاة القراءة، وقياس النص، وتحليل التعبير التفاضلي، وإثراء GO/KEGG، وGSEA، وبناء شبكات PPI. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: التحليل الكمي للعينات. (أ) تم إجراء تحليل المكونات الرئيسية (PCA) لتقييم الفروق بين المجموعات وقابلية تكرار العينة داخل المجموعة. تم إجراء تحليل PCA باستخدام طرق جبرية خطية تعتمد على قيم تعبير الجين المعتدلة عبر جميع العينات. (ب، دو) مخططات فين تظهر الجينات التي تم اكتشافها عبر عينات في مجموعتي AML و R_AML على التوالي. تشير المناطق المقيدة بعينة إلى الجينات التي تم اكتشافها في عينات فردية، بينما تمثل المناطق المتداخلة جينات تكتشف عادة عبر عينتين أو أكثر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تحليل التعبير الجيني التفاضلي. (أ) مخطط الشريط يوضح عدد الجينات المعبر عنها تفاضلا (DEGs) بين مجموعات المقارنة، والتي تم تحديدها بواسطة DESeq2 مع عتبات قيمة P معدلة ≤ 0.05 و |log₂FoldChange| ≥ 1. (ب) مخطط بركان من ال DEGs. يمثل المحور x قيم FoldChange log₂، والمحور y يمثل -log10(قيمة P). تشير الخطوط الزرقاء المتقطعة إلى خطوط العتبة المستخدمة في اختيار DEG. (ج) خريطة التجميع الهرمية للمستويات المدمجة (DEGs). المحور x يرمز إلى أسماء العينات، ويظهر المحور y قيم تعبيرات مطبعة لنماذج DEGs. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: تحليل الإثراء الوظيفي للجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي. (أ) قطعة حانة إثراء GO. يمثل المحور x مصطلحات GO، ويظهر محور y دلالة إثراء معبر عنها ك -log10(padj). تمثل الألوان BP (العملية البيولوجية)، CC (المكون الخلوي)، وMF (الوظيفة الجزيئية). (ب) مخطط فقاعة الإثراء في GO. يمثل المحور x نسبة الرموز الموجهة لكل مصطلح GO بالنسبة لعدد المجموعات الكاملة، ويشير المحور y إلى مصطلحات GO. حجم الفقاعة يتوافق مع عدد الجينات المشروحة، وتمثل تدرجات الألوان أهمية الإثراء. (ج) مخطط شريط إثراء KEGG. يمثل المحور x مسارات KEGG، والمحور y يرمز إلى أهمية الإثراء. (د) مخطط فقاعة الإثراء في KEGG. حجم الفقاعة يشير إلى عدد الجينات المشروحة، وتعكس تدرجات الألوان أهمية الإثراء. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: تحليل شبكة إثراء الحمض النووي الوراثي وتفاعل البروتين والبروتين (PPI). (أ) مخطط شريطي يظهر درجات الإثراء المطبرة (NES) لمجموعات جينية ذات دلالة مختارة. تشير قيم NES الإيجابية إلى الإثراء في مجموعة R_AML، بينما تشير قيم NES السلبية إلى الإثراء في مجموعة AML التي تم تشخيصها حديثا. (ب) شبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI). كل عقدة تمثل بروتينا، وكل حافة تمثل تفاعلا بين البروتينات المتصلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

خطوات حرجة في البروتوكول

يعتمد التنفيذ الناجح لهذا سير العمل المعلوماتي الحيوي على عدة خطوات حاسمة. أولا، التجميد الفوري والتحلل الصحيح لاستنشاق نخاع العظم (الخطوة 1.6) أمران أساسيان، حيث أن البيئة الدقيقة لنخاع العظم غنية بالريبونوكلياز التي يمكن أن تدهور بسرعة سلامة النخاع³⁰. خلال المرحلة الحسابية، يعد التكوين الصحيح لصيغة التصميم التجريبي ضمن حزمة DESeq2 (الخطوة 6.3) أمرا بالغ الأهمية للتعبير التفاضلي الدقيق، خاصة عندما يتم مقارنة الحالة السريرية (التشخيص حديثا مقابل الانتكاس) مع النظر في المتغيرات المحتملة المربكة. أخيرا، تطبيق عتبات معدل الاكتشاف الكاذب الصارم (FDR) أثناء تحليل إثراء مجموعات الجينات (GSEA) (الخطوة 9.6) يعد نقطة تحقق إحصائية حاسمة لمنع الإفراط في تفسير الشبكات الوظيفية الإيجابية الكاذبة.

التعديلات وحل المشكلات

من التحديات الشائعة في هذه الطريقة وجود تأثيرات دفعية، والتي تحدث كثيرا عند جمع العينات السريرية وتسلسلها عبر أطر زمنية ممتدة. يجب تعريف متغيرات الدفعة قبل التحليل، بما في ذلك تاريخ جمع العينات، تاريخ استخراج الحمض النووي الريبي، دفعة تحضير المكتبة، مسار التسلسل، وتشغيل التسلسل. إذا كشف تحليل PCA أو تحليل ارتباط العينة عن تجميع يعتمد على تاريخ التسلسل أو متغير تقني آخر بدلا من النمط الظاهري السريري، يجب على المستخدمين تعديل البروتوكول بإدراج المتغير الدفعي في صيغة تصميم التعبير التفاضلي عندما يكون ذلك ممكنا إحصائيا أو بتطبيق خوارزميات تصحيح الدفعات مثل ComBat أو SVA قبل التصور³¹. إذا تم تطبيق هذا البروتوكول على الدم الكامل بدلا من شفاطات نخاع العظم، فإن التعديل الأساسي هو تضمين خطوة استنزاف mRNA للجلوبين أثناء التحضير في المكتبة لمنع نصوص الغلوبين الوفيرة جدا من احتكار تسلسل عمق القراءة. تم تعزيز إصدارات البرمجيات والمعلمات الرئيسية لسير العمل التمثيلي كما يلي: fastp v0.23.2، HISAT2 v2.0.5، StringTie v1.3.3b، featureCounts v1.5.0-p3، R v3.5.0، DESeq2 v1.20.0، clusterProfiler v3.8.1، org. Hs.eg.db v3.6.0، تسلسل 150 نقطة أساس مزدوج في النهاية، GSEA v4.2.3 مع 1000 تبديلة جينية، MSigDB v7.5.1، STRING v11.5 مع تفاعلات عالية الثقة، وCytoscape v3.9.1. يتم توفير معلمات سطر الأوامر التمثيلية وإعدادات التحليل في الملف التكميلي 1.

قيود الطريقة

على الرغم من شمولية هذا البروتوكول، إلا أن له قيودا منهجية متأصلة. أولا، يستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي الضخم، الذي يلتقط متوسط الملف التصويري لكامل استنشاق نخاع العظم ويفتقر إلى الدقة المكانية لخلية واحدة. لذلك، لا يمكن لسير العمل تحديد ما إذا كان توقيع مرتبط بالانتكاس المعدل المرتفع ينشأ من خلايا جذعية لللوكيميا، أو خلايا سترومال، أو خلايا مناعية، أو تغيرات في تركيب نوع الخلية³². ثانيا، مجموعة البيانات الممثلة صغيرة (n = 9) وغير مقترنة، مما يحد من المتانة الإحصائية ويمنع الاستدلال السببي النهائي. ثالثا، سير العمل فقط في سيليكو. يولد مراكز تنظيمية مرشحة ومسارات إشارات، لكنه لا يستطيع التحقق من ضرورتها الوظيفية في مقاومة الكيمياء بشكل مستقل دون التحقق التجريبي المتعامد في المختبر أو في الجسم الحي.

وسعت الدراسات الحديثة للجينوم أحادي الخلية والخلية الواحدة إطار مرجعي AML من خلال حل تباين حالة الخلية، وبنية الاستنساخ، والتطور المرتبط بالعلاج بدقة أعلى ^33,34,35,36. هذه الأساليب تكمل سير عمل التسلسل الجماعي للRNA-seq الموضح هنا: يوفر التسلسل الجماعي استراتيجية فحص عملية وفعالة من حيث التكلفة لتوقيعات النسخ على مستوى المجموعة، في حين يمكن استخدام طرق الخلية الواحدة ومتعددة الأوميك في الدراسات المتابعة لتعيين إشارات مرشحة لمجموعات خلايا خبيثة أو بيئية دقيقة محددة.

الأهمية بالنسبة للطرق الحالية

على الرغم من هذه القيود، يقدم هذا المسار الترانسكريبتوميك مزايا مقارنة بالتقنيات التشخيصية والتحليلية البديلة. تعتمد التقييمات السريرية التقليدية لانتكاسة AML غالبا على لوحات qPCR متعددة الأبعاد أو قياس تدفق الخلايا القياسي. على الرغم من فائدتها للتشخيص السريع، فإن هذه الطرق المستهدفة مقيدة بمجسات محددة مسبقا ولا يمكنها تقييم مؤشرات مقاومة معروفة إلا¹⁹. من خلال استخدام تسلسل النسخ الجينومي غير المتحيز على مستوى الجينوم مع تحليل الشبكة، يمكن لهذا البروتوكول ترشيح نصوص جديدة وارتباطات نظامية قد تغفل عنها الطرق المستهدفة الحالية.

الأهمية والتطبيقات المحتملة

المنهجية الموضحة في هذا البروتوكول ذات صلة بعلم الدم الانتقالي والطب الشخصي لأنها يمكن أن تعطي الأولوية لتوقيعات النسخ المكتوب المرتبطة بالانتكاس لدراسة إضافية. تطبيق محتمل لاحقا هو ترشيح المستضدات السطحية أو مسارات التهرب المناعي التي تظهر أثناء الانتكاس. يمكن لهؤلاء المرشحين أن يساهموا في تصميم دراسات التحقق المستقبلية، وإذا تم تأكيدهم تجريبيا، فقد يساهم في تطوير علاجات مناعة من الجيل القادم، بما في ذلك استراتيجيات خلايا CAR-T أو CAR-NK³⁷. يجب اعتبار هذه التطبيقات الترجمية مولدة فرضيات بدلا من استنتاجات مثبتة من مجموعة البيانات الحالية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	RRID:SCR_019389	G2939BA
AMPure XP system	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	RRID:SCR_008452	A63881
cBot Cluster Generation System	Illumina, San Diego, CA, USA	-	SY-301-2002 أو معرف النظام الخاص بالمؤسسة
clusterProfiler (البرنامج)	Bioconductor	RRID:SCR_016884	v3.8.1
Cytoscape (البرنامج)	Cytoscape Consortium	RRID:SCR_003032	v3.9.1
DESeq2 (البرنامج)	Bioconductor	RRID:SCR_015687	v1.20.0
DNA Polymerase I	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	M0209L
dNTP Solution Mix	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	N0447L
edgeR (البرنامج)	Bioconductor	RRID:SCR_012802	v3.22.5
fastp (البرنامج)	OpenGene	RRID:SCR_016962	v0.23.2
featureCounts / Subread (البرنامج)	The Walter and Eliza Hall Institute	RRID:SCR_012919	featureCounts v1.5.0-p3
مرجع الجينوم GRCh38	Genome Reference Consortium / Ensembl	-	GRCh38؛ إصدار Ensembl 109
برنامج GSEA	Broad Institute	RRID:SCR_003199	v4.2.3
HISAT2 (البرنامج)	Johns Hopkins University	RRID:SCR_015530	v2.0.5
M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-)	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	M0253L
مجموعات الجينات MSigDB	Broad Institute	RRID:SCR_016863	v7.5.1
NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	E7760L/E7765L أو مجموعة مختبرات معملية محددة
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	E7770L
منصة تسلسل NovaSeq	Illumina, San Diego, CA, USA	RRID:SCR_016387	نظام NovaSeq؛ معرف أداة مزود الخدمة
org.Hs.eg.db (حزمة التوصيف)	Bioconductor	-	v3.6.0
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RRID:AB_2756816	F530L
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RRID:SCR_018095	Q32866
مجموعة Qubit dsDNA HS Assay	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	-	Q32851
برنامج R	R Foundation for Statistical Computing	RRID:SCR_001905	v3.5.0
Random Hexamer Primer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	-	SO142
مجموعة RNA 6000 Nano	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	-	5067-1511
RNase H	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	M0297L
مجموعة RNA-seq Library Prep / خدمة التسلسل	Novogene, بكين, الصين	-	رقم المشروع X101SC25054246-Z01-J003
قاعدة بيانات STRING	STRING Consortium	RRID:SCR_005223	v11.5
StringTie (البرنامج)	Johns Hopkins University / Center for Computational Biology	RRID:SCR_016323	v1.3.3b
مجموعة TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS	Illumina, San Diego, CA, USA	-	PE-401-3001