مقالة منهجية

نموذج فأر تركيبي لاضطراب الساعة البيولوجية والضغط الغذائي للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية للشيخوخة المتسارعة بأسلوب الحياة

252 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/70866

⸱

أبريل 28, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chinese Materia Medica, Chengde Medical University, 2School of Pharmacy, Hebei Medical University, 3State Key Laboratory for Innovation and Transformation of Luobing Theory, 4College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hebei University of Chinese Medicine, 5The Second Clinical Medical College, Heilongjiang University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكولا لتأسيس نموذج فأر لاضطراب الإيقاع اليومي بالإضافة إلى النظام الغذائي عالي الدهون والسكر (HFHS)، الذي يحاكي أنماط الحياة غير الصحية ويؤدي إلى اضطرابات الأيض وأنماط الشيخوخة.

الملخص

هدف هذا البروتوكول هو إنشاء نموذج موحد للفئران يعيد تلخيص الضرر متعدد العوامل الناتج عن أنماط الحياة الحديثة غير الصحية. ولهذا الغرض، طورنا نموذجا جديدا من C57BL/6J يجمع بين اضطراب الإيقاع اليومي العشوائي ونظام غذائي عالي الدهون والسكر (HFHS)، مع مجموعات HFHS ذات عامل واحد ومجموعات اضطراب الساعة البيولوجية كعوامل ضابطة. مقارنة بالسطرة، أظهر النموذج المركب اضطرابات أيضية أكثر حدة، بما في ذلك زيادة وزن الجسم، وارتفاع مستويات الجلوكوز والدهون أثناء الصيام، وتعثر الكبد الواضح، بالإضافة إلى إعاقات واضحة في الإدراك والحركة. كما أظهر النموذج المركب شيخوخة متسارعة أكثر أهمية، كما أكدته مؤشر الهشاشة وتلوين الهيماتوكسيلين والإيوسين (HE). هذا النموذج المتكامل يحاكي بشكل موثوق التدهور الأيضي-المعرفي المرتبط بنمط الحياة والشيخوخة المبكرة. يدعم هذا البروتوكول القابل للتكرار خطوة بخطوة الدراسات الميكانيكية حول الشيخوخة التي تعبر عن نمط الحياة وتقييم الاستراتيجيات العلاجية المستهدفة.

المقدمة

تسرع أنماط الحياة الحديثة يعرض السكان بشكل متزايد للسلوكيات المسببة للإيقاع والأنظمة الغذائية المسببة للسمنة، مع أدلة قوية تربط هذه العوامل بتدهور الوظائف الجهازية وأمراض مزمنة1. تكشف البيانات الوبائية عن أمراض مصاحبة لافتة: يظهر العاملون في الورديات انتشارا عاليا لعلامات متلازمة الأيض، بينما يرتبط تناول النظام الغذائي عالي الدهون والسكر على المدى الطويل بخطر أعلى للإصابة بالخرف 2,3. تتلاقى هذه الإهانات لتحفيز أمراض الأعضاء المتعددة—حيث يتزامن خلل الأيض غالبا مع تدهور معرفي متسارع وإعادة تشكيل القلب والأوعية الدموية، مما يظهر تداخلا ثنائي الاتجاه بين التدهور المحيطي والمركزي. على الرغم من التآزر السريري المعترف به، لا تزال النماذج الموحدة قبل السريرية التي تلتقط الفيزيولوجيا المرضية المتكاملة لتدهور الأعضاء الناتج عن نمط الحياة غير متطورة.

على المستوى الجزيئي، يبدأ الانحراف اليومي المزمن سلسلة مرضية تنشأ في النواة فوق التشكيازمية، مما يعطل الإشارات الجلوتاماتيرية إلى منطقة تحت المهاد المحيطة بالبطين، ويضعف نبضات هرمون إطلاق الكورتيكوتروبين. هذا يؤثر على التغذية الراجعة السلبية في محور تحت المهاد، الغدة النخامية-الغددة الكظرية (HPA)السلبية 4، مما يسبب تحسس مستقبلات الجلوكوكورتيكويد وارتفاع مستمر في الكورتيزول. يؤدي تنشيط تكون الجلوكونيوجين الكبدي وكبت الفسفرة في مستقبل الإنسولين العضلي الهيكلي إلى دفع مقاومة الأنسولين الطرفية، مما يؤسس أساسا أيضيا لفرط السكر في الدم وخسر الدهون 5,6. في الوقت نفسه، تخترق الأحماض الدهنية المشبعة الغذائية الحاجز الدموي-الدماغي المتضرر من خلال تقليل تنظيم بروتينات التوصيل البطانية الضيقة 7,8، مما ينشط إشارات TLR4/NF-κB الدقيقة دبقية. هذا يثير التهاب عصبي بوساطة TNF-α/IL-1β9. النقطة الأساسية هي أن هذين العاملين غير الصحي في نمط الحياة لا يعملان بشكل مستقل بل بشكل تآزري. ومع ذلك، لا يزال هناك نقص كبير في الأبحاث المنهجية حول تعرضهما المشترك في الأدبيات الحالية. لذلك، من المهم إجراء دراسات نمذجة تدمج اضطراب الإيقاع اليومي مع الأنظمة الغذائية عالية الدهون والسكر كعوامل مركبة.

على الرغم من فائدتها في دراسة آليات الشيخوخة المعزولة، تفشل نماذج الفأر الحالية في إعادة تلخيص الفيزيولوجيا المرضية المتكاملة للتدهور الناتج عن نمط الحياة. تظهر الشيخوخة الطبيعية تغيرا واضحا بين الأفراد وتتطلب جداول زمنية طويلة لا تتوافق مع كفاءة التجارب. العوامل الدوائية مثل دوكسوروبيسين تسبب بشكل أساسي تلف الحمض النووي والشيخوخة الحادة دون تكرار اضطراب الأيض المزمن10. تستهدف النماذج المعدلة وراثيا مسارات جزيئية مفردة، متجاوزة التوجهات النظامية بين الغدد الصماء والتمثيل الغذائي11,12. إعطاء دي-جالاكتوز، رغم أنه يسبب الإجهاد التأكسدي، لا يحاكي بشكل كاف تأثير اضطراب الساعة البيولوجية على إيقاع الجلوكوكورتيكويد أو الالتهاب العصبي الناتج عن الدهون الغذائية13. والأهم من ذلك، أن التدخلات ذات العامل الواحد لا يمكنها التقاط أنماط تراجع متعددة الأعضاء المتآزرة التي لوحظت سريريا. تتطلب هذه الفجوة الانتقالية منصة تركيبية متقدمة تدمج في الوقت نفسه اضطراب الساعة البيولوجية المزمن والضغوط الغذائية المسببة للسمنة لتسريع التنكس العصبي المترابط، وضعف القلب، والضعف الأيضي بشكل أمين.

لمعالجة هذه المشكلة، طورنا نموذج فأر C57BL/6J يدمج الاضطراب اليومي العشوائي مع نظام غذائي عالي الدهون والسكر لإعادة تلخيص الإهانات المعاصرة المتآزرة. أدى تعريض الفئران لجداول ضوئية متغيرة مع تغذية مزمنة مسببة للسمنة إلى تفاقم اضطرابات الأيض بشكل كبير، بما في ذلك ارتفاع السمنة، وارتفاع سكر الدم أثناء الصيام، وخسر الدهون في الدم. كشفت التقييمات الإدراكية عن نقص واضح في الذاكرة المكانية والتعرفية، بينما أظهرت اختبارات الحركة الحركية انخفاض في القدرة على التحمل. والأهم من ذلك، أظهر القياس الطولي لمؤشر الهشاشة تراكما متسارعا للعجز المرتبط بالعمر. لذا فإن نموذج التحدي المزدوج لدينا يعيد بقوة شيخوخة متسارعة متعددة الأوجه، موفرا منصة جديدة وموثوقة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية المدفوعة بنمط الحياة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة أخلاقيات أبحاث الحيوان في معهد خبي ييلينغ للأبحاث الدوائية (رقم الموافقة: N2024043). تم إسكان اثنين وثلاثين فأرا ذكرا يبلغ من العمر 8 أشهر من نوع C57BL/6J (انظر جدول المواد) في منشأة حيوانية خالية من مسببات الأمراض (SPF) تابعة لمركز تقييم الأدوية الجديدة، معهد أبحاث الأدوية في خبي ييلينغ. تم الحفاظ على بيئة التربية تحت ظروف موحدة: تراوحت درجة الحرارة المحيطة بين 20–26 درجة مئوية، وتم التحكم في الرطوبة النسبية بين 40٪–70٪، وتم تنفيذ دورة ضوء 12 ساعة و12 ساعة ظلام. كان لدى الفئران إمكانية الوصول المجانية إلى نظام غذائي قياسي للقوارض في المختبر ومياه شرب معقمة.

1. تأسيس نموذج فأر تركيبي لاضطراب الساعة البيولوجية والضغط الغذائي (الشكل 1)

ملاحظة: الحيوانات التي ماتت بشكل غير متوقع أثناء التجربة، أو أظهرت فقدانا شديدا في الوزن، أو فشلت في إكمال إجراء النمذجة تم استبعادها من التحليل النهائي. كان العدد الأولي للحيوانات 8 لكل مجموعة، وحجم العينة النهائي الصحيح كان 5 لكل مجموعة.

  1. جهز نظاما غذائيا عالي الدهون/السكر (HFHS) (انظر جدول المواد) وغرفة مستقلة مجهزة بمؤقت قابل للبرمجة للتحكم المرن في دورة الضوء والظلام قبل التجربة.
    ملاحظة: تخزين النظام الغذائي عند 4 درجات مئوية أو -20 درجة مئوية لمنع الأكسدة؛ اجعلها تصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام لتجنب تأثير التكثف على تركيبها.
  2. تكيف الحيوانات والتجميع العشوائي
    1. ضع جميع الفئران التي تبلغ من العمر 8 أشهر تحت ظروف قياسية لفترة تغذية تكيفية مدتها 7 أيام قبل بدء التجربة.
    2. قسم الفئران عشوائيا إلى أربع مجموعات بناء على وزن الجسم (n = 8 لكل مجموعة) بعد فترة التكيف: مجموعة التحكم، مجموعة نموذج الإجهاد المركبة (Model)، مجموعة HFHS، ومجموعة اضطراب الإيقاع اليومي (CR).
  3. قدم تدخلا لمدة 8 أشهر في نظام HFHS مع اضطراب الإيقاع اليومي لمجموعة نموذج التوتر المركب. أطعم مجموعة HFHS بنظام HFHS فقط لنفس المدة.
  4. تعرض مجموعة CR لاضطراب الإيقاع اليومي فقط. أطعم المجموعة الضابطة بنظام غذائي قياسي طوال فترة التجربة. توفير وصول مجاني إلى مياه الشرب لجميع الحيوانات.
    ملاحظة: يمكن إيقاف التدخل لمدة 8 أشهر مؤقتا (مثلا لفحوصات صحية روتينية للفئران) دون التأثير على نتيجة التجريب، ويمكن استئناف التدخل بعد الانتهاء من الفحص.
  5. بروتوكول اضطراب الإيقاع اليومي (الشكل 2A,B)
    1. استخدم مؤقتا قابلا للبرمجة (انظر جدول المواد) للتحكم بمرونة في دورة الضوء والظلام الأسبوعية. تطبيق أربعة أنظمة إضاءة مميزة: تبديل سريع بين الضوء والظلام (التناوب بين الضوء والظلام كل 7 دقائق لمدة ساعتين متتاليتين يوميا)، دورة الضوء والظلام العكسية (إطفاء الأنوار الساعة 8:00 وتشغيلها في 20:00 يوميا)، الضوء المستمر (إضاءة 24 ساعة)، والظلام المستمر (ظلام 24 ساعة).
    2. قم بإنشاء تسلسل عشوائي باستخدام برامج إحصائية (لغة R، مع بذرة عشوائية ثابتة) في بداية كل أسبوع. يتم تعيين أوضاع الضوء الأربعة عشوائيا لكل يوم من أيام الأسبوع لضمان تطبيق كل وضع بشكل متتالي لمدة يوم إلى يومين.
  6. قدم نظام HFHS الغذائي للفئران بإرادته، وراقب كمية الطعام التي تتناولها أسبوعيا. يتم عرض التركيب التفصيلي لنظام HFHS الغذائي في الجدول 1.
    ملاحظة: فحص مخزون الغذاء ضروري لمنع نقص التغذية أو الحرمان من الطعام.
  7. وزن الفئران أسبوعيا في وقت محدد (الساعة 9:00 صباحا يوم الخميس) باستخدام ميزان إلكتروني خلال فترة التدخل التي تستمر 8 أشهر. سجل جميع بيانات وزن الجسم بالتفصيل.
    ملاحظة: قم بعملية الوزن بسرعة (كل جلسة تكتمل في أقل من 30 ثانية) لتقليل التوتر واضطراب الإيقاع اليومي.

2. التعرف الجديد على الأشياء

  1. ضع الفئران في صندوق اختبار بطول 60 سم × 60 سم × 40 سم قبل يوم من التدريب، ودعها تستكشف بحرية لمدة 5 دقائق للتكيف مع بيئة الاختبار.
    ملاحظة: أزل البراز والبول من الصندوق بعد كل تجربة. امسح العلبة بنسبة 75٪ إيثانول للقضاء على الروائح المتبقية.
  2. ضع أسطوانتين متطابقتين (A و B) في الزاويتين السفلية اليسرى والسفلى اليمنى من صندوق الاختبار على التوالي. أدخل كل فأرة في الصندوق المواجه بعيدا عن الأشياء ودع الفأرة تستكشف بحرية لمدة 5 دقائق.
    1. تناوب عشوائيا بين وضعيات الأسطوانتين اليسرى واليمينية بين الموضوعات لمنع الانحياز الموضعي.
    2. بعد تدريب الاستكشاف الذي يستغرق 5 دقائق، أوقف التجربة لمدة تصل إلى 23 ساعة، وأكمل الخطوة الجديدة التالية لاستبدال الجسم (الخطوة 2.3) خلال 24 ساعة من التدريب لضمان صحة اختبار التعرف.
  3. استبدل الكائن A في الزاوية السفلية اليسرى بمكعب جديد (الجسم C) بعد 24 ساعة من التدريب. فعل الكاميرا العلوية. ضع الفأرة في الصندوق وسجل السلوك لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: استخدم كائنا جديدا يشبه في الحجم الأشياء المألوفة لكنه يختلف بشكل واضح في المادة أو اللون أو الملمس لضمان قدرة الفأرة على التعرف على حداثته.
  4. حلل الفيديوهات باستخدام نظام تتبع الفيديو (انظر جدول المواد).
    1. عرف الاستكشاف بأنه توجيه الفأر لخطمه نحو أو ضمن 2 سم من جسم. سجل الوقت الذي تقضيه في استكشاف الكائن المألوف (TB) والكائن الجديد (TC).
    2. احسب مؤشر التعرف وفقا للصيغة التالية: مؤشر التعرف = TC / (TB + TC) × 100٪.
      ملاحظة: حافظ على إبقاء المحلل أعمى عن المجموعات التجريبية لتجنب التحيز الذاتي؛ استبعد بشكل منهجي السلوكيات غير الاستكشافية مثل التسلق أو القضم من سجلات وقت الاستكشاف.

3. اختبار قوة القبضة

  1. قس قوة قبضة الطرف الأمامي للفئران باستخدام مقياس قوة قبضة14 (انظر جدول المواد). قم بتدوير مقياس القوة بزاوية 90 درجة عموديا وثبته بإحكام على قاعدة معدنية قبل كل جلسة اختبار لضمان تثبيت النظام بالكامل.
  2. أمسك الفأر بلطف من قاعدة الذيل. دع الأقدام الأمامية تمسك بالقضيب بشكل طبيعي. قم بضبط العداد بعد أن تستقر القراءة، ثم اسحب الذيل أفقيا للخلف بسرعة ثابتة وبطيئة حتى تترك الفأرة قبضتها.
  3. سجل أقصى قوة ذروة (kgf) في لحظة الإطلاق كقوة قبضة. قم بإجراء ثلاث تجارب متتالية لكل فأر يوميا. استخدم متوسط ثلاثة قياسات للتحليل اللاحق.
    ملاحظة: حافظ على سرعة السحب موحدة وبطيئة بما يكفي للسماح للماوس بتوليد مقاومة كاملة ضد السحب.
  4. استبعد أي تجربة من التحليل إذا حدث أحد الحالات التالية: يستخدم الفأر مخلبا أماميا واحدا فقط، أو تلامس الأطراف الخلفية القضيب أو تساهم في الإمساك، أو يلف الفأر جسده أثناء السحب، أو يطلق القضيب دون مقاومة نشطة.
    ملاحظة: قم بوضع علامة على التجارب الغامضة أو الاستثنائية للمراجعة. كرر القياسات عند الحاجة.

4. مؤشر الهشاشة (FI)

ملاحظة: قم بمعايرة جميع معايير المعدات إلى الإعدادات الموحدة قبل الاختبار. حدد وقت التقييم الكلي لكل فأر إلى أقل من 30 دقيقة لتجنب التغيرات الظاهرية الناتجة عن التعب. إجراء جميع الاختبارات ضمن فترة زمنية صباحية محددة (9:00 صباحا – 12:00 ظهرا) لتقليل تأثيرات الإيقاع اليومي.

  1. صوم الفئران لمدة 12 ساعة مع إمكانية الوصول إلى الماء مجانا قبل الاختبار لتقليل التأثيرات الحادة لتناول الطعام على القياسات الفسيولوجية.
  2. انقل الفئران إلى بيئة الاختبار قبل 30 دقيقة من التقييم لتأقلمها وتقليل التداخل المرتبط بالإجهاد.
  3. استبعد الفئران التي تعاني من حالات مرضية شديدة مثل الأورام أو العدوى أو تشوهات الأطراف لمنع التأثيرات المربكة على تقييم الضعف.
  4. قيم مؤشر الهشاشة بناء على 31 مؤشرا على عجز ظاهري عبر خمسة مجالات: الوظيفة الحركية، الحالة الغذائية، الوظائف الحسية، النشاط والسلوك التلقائي، والعيوب الفسيولوجية15،16.
    ملاحظة: تغطي العناصر التقييم ال 31 المحددة خمسة مجالات، منها: الوظائف الحركية (7 عناصر مثل انخفاض قوة القبضة، المشي غير الطبيعي، وانخفاض القدرة على التسلق)، الحالة الغذائية (6 عناصر مثل فقدان الوزن، انخفاض درجة حالة الجسم، وتقليل تناول الطعام)، الوظائف الحسية (5 عناصر مثل ضعف البصر، ضعف السمع، وخمول اللمس)، النشاط والسلوك العفوي (7 عناصر مثل تقليل النشاط التلقائي، انخفاض سلوك العناية بالعناية، وانخفاض السلوك الاستكشافي)، والعيوب الفسيولوجية (6 عناصر مثل عيوب العين، عيوب الأذن، وعيوب الجلد). جميع العناصر تعتمد طريقة تقييم ثنائية (0 = لا يوجد عيب، 1 = مع عيب)، ويشير مؤشر الهشاشة النهائي = إجمالي عدد العناصر المعيبة / 31.
  5. تعيين باحثين اثنين من المجموعات التجريبية لإجراء جميع التقييمات بشكل مستقل.
  6. قم بتقييم كل مؤشر ب 0 (بدون عجز) أو 1 (عجز) وفقا لمعايير محددة مسبقا تشمل قوة القبضة، سرعة المشي، تغير وزن الجسم، حالة الفراء، الاستجابة الحسية، قدرة النشاط التلقائي، والشذوذات الجسدية.

5. الكشف عن سكر الدم أثناء الصيام

ملاحظة: الفئران السريعة لمدة 12 ساعة مع وصول مجاني للماء لتقليل التأثيرات الحادة المرتبطة بالتغذية على مستوى السكر في الدم. إجراء القياسات بين الساعة 9:00 صباحا و12:00 ظهرا لتقليل تقلبات الساعة البيولوجية. معايرة جهاز قياس الجلوكوز باستخدام محلول جلوكوز قياسي قبل التجربة لتحقيق الاتساق بين الدفعات.

  1. قيد الفئران بلطف، وقم بتعقيم أطراف الذيل بنسبة 75٪ إيثانول. قم بعمل شق بعرض 1–2 مم في عروق الذيل باستخدام مشقيق معقم قابل للاستخدام مرة واحدة. تخلص من أول قطرة دم لتجنب تلوث السوائل الأنسجة.
  2. اجمع كمية صغيرة من الدم الشعري وحللها فورا باستخدام جهاز قياس السكر المحمول (انظر جدول المواد) مع شرائط اختبار متوافقة. اختبر كل عينة مكررة لضمان دقة البيانات.

6. شمل كشف الدهون في الدم الكوليسترول الكلي (TC)

ملاحظة: استبعد عينات ذات تحلل دموي شديد أو عكارة من التحليل. القياسات المتكررة مع معامل تباين > 10٪ بين الثلاثيات.

  1. ضع الدم المجمع في أنابيب غير مضادة للتخثر. اترك الجلطة طبيعية في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. أخذ عينات من الطرد المركزي عند 1000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لفصل المصل.
    ملاحظة: تأكد من توازن الطرد المركزي بشكل صحيح قبل التشغيل وأغلق الغطاء الداخلي الآمن بإحكام.
  2. استنشق الطبقة العليا من المصل بعناية، وقم بتقليدها، وخزنها فورا عند -80 درجة مئوية لمنع أكسدة الدهون.
    ملاحظة: بعد تخفيض المصل وتخزينه عند -80 درجة مئوية، يمكن إيقاف التجربة لعدة أيام إلى أسابيع؛ يمكن إجراء الكشف التالي عن الكوليسترول الكلي (الخطوة 6.3) عندما تكون مجموعة الاختبار والمعدات جاهزة، لضمان عدم تجميد المصل وإذابته بشكل متكرر.
  3. قس مستويات الكوليسترول الكلي في المصل باستخدام مجموعة اختبار TC التجارية من Greiss (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اختبر كل عينة في ثلاث نسخ وشغل عينات مرجعية قياسية في نفس الوقت للمعايرة.

7. صبغ الهيماتوكسيلين-إيوزين (تلوين HE)

  1. تخدير الفئران باستخدام بنتوباربيتال الصوديوم (20 ملغ/كغ) بعد اختبارات السلوك.
  2. اجمع الدم عبر الضفيرة الوريدية العكسية الحجاجية. قم بتشريح الأنسجة وتثبيت في 4٪ بارافورمالديهايد لمدة 48 ساعة.
    ملاحظة: بعد تثبيت الأنسجة في بارافورمالديهيد بنسبة 4٪ لمدة 48 ساعة، يمكن إيقاف التجربة؛ يمكن تخزين الأنسجة الثابتة في بارافورمالديهيد بنسبة 4٪ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع قبل الانتقال إلى خطوة الجفاف (الخطوة 7.3).
  3. جفف الأنسجة الثابتة باستخدام معالج آلي باستخدام سلسلة إيثانول متدرجة (60٪، 70٪، 90٪ إيثانول لمدة ساعة لكل منهما؛ 95٪، 100٪ إيثانول لمدة ساعتين لكل منهما).
    تحذير: الإيثانول سائل قابل للاشتعال ذو نقطة اشتعال منخفضة. ابتعد عن اللهب المفتوح، ومصادر الحرارة، والشرارات أثناء التخزين والتشغيل. استخدمها في مكان جيد التهوية، وارتد قفازات غير ثابتة ومعطف مختبر. تجنب التخزين الكبير في منطقة التجربة؛ خزنها في خزانة سائلة قابلة للاشتعال مخصصة.
  4. نظف الأنسجة المجففة في الزيلين لمدة ساعتين، ثم تسربها بالبارافين عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات (انظر جدول المواد). دمج الأنسجة الموجهة وفقا لمستويات تشريحية قياسية.
    ملاحظة: يجب ألا يكون وقت التنظيف طويلا جدا لتجنب هشاشة الأنسجة؛ الحفاظ على درجة حرارة بارافين ثابتة أثناء التسرب لمنع التبلور. بعد دمج البارافين، يمكن تخزين كتل الأنسجة المدمجة في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر، ويمكن تنفيذ خطوة التقسيم (الخطوة 7.5) عند الحاجة.
  5. بمجرد أن تتصلب كتل البرافين تماما، قم بقطع مقاطع متصلة بطول 4 ميكرومتر باستخدام مقطع بارافين (انظر جدول المواد)، ثم انقله إلى شرائح مغطاة بالبولي-إل-ليسين، وجففه في الهواء عند درجة حرارة الغرفة، ثم ختمه للتخزين.
    ملاحظة: بعد تركيب القسم والتجفيف بالهواء، يمكن تخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة في بيئة خالية من الغبار لمدة تصل إلى شهر قبل الانتقال إلى خطوة التلوين (الخطوة 7.6).
  6. قم بصبغ الأقسام باستخدام نظام تلوين تلقائي (انظر جدول المواد).
    1. قم بإزالة البارارافين في زيلين I وزيلين II (10 دقائق لكل منهما).
    2. أعد ترطيب الإيثانول عبر سلسلة إيثانول متناقصة (100٪، 95٪، 80٪، دقيقتين لكل منهما)، ثم اشطفها بالماء المقطر.
    3. صبغ بالهيماتوكسيلين لمدة 3–8 دقائق حتى تظهر النوى بوضوح، ثم اشطفه تحت ماء جاري لتعزيز اللون الأزرق، ثم صبغ الإيوزين بالإيوزين لمدة 1–3 دقائق لتحقيق تلوين وردي سيتوبلازمي كاف.
  7. جفف الأجزاء المصبوغة بالكحول المطلق، وشفافة في الزيلين، وركب البلسم المحايد لتحليل الماسح السريع (انظر جدول المواد).

8. صبغة زيتية باللون الأحمر

  1. دمج أنسجة الكبد الطازجة في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OTC) (انظر جدول المواد) خلال 30 دقيقة من الجمع.
    ملاحظة: بعد دمج أنسجة الكبد الطازجة في مركب الوصفة بدون وصفة، يمكن تخزين الأنسجة المدمجة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر قبل التشريح (الخطوة 8.3)، لتجنب التجميد المتكرر والذوبان.
  2. ضع الأنسجة المدمجة في جهاز تجميد ودعها تتجمد تماما قبل التقسيم.
  3. اضبط درجة حرارة الكريوستات على -22 درجة مئوية وقطع كتل الأنسجة المجمدة بالكامل إلى أقسام متتالية بسماكة 8 ميكرومتر.
  4. انقل الأقسام مباشرة إلى شرائح زجاجية غير مطلية وقم بتسويتها بلطف لضمان التصاق محكم بين الأقسام والشرائح.
  5. ثبت شرائح بالفورمالين المحايد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد التثبيت، اشطف الأقسام بإيزوبروبانول 60٪ لمدة 5 ثوان.
  6. ضع الأقسام المعالجة مسبقا في غرفة رطوبة، أضف محلول تلوين Oil Red O (انظر جدول المواد)، وحضن لمدة 20 دقيقة.
  7. بعد التلوين، قم بتمييز المقاطع ب 60٪ من الإيزوبروبانول حتى تصبح قطرات الدهون وحدود الأنسجة البينية واضحة جدا.
    ملاحظة: راقب الأقسام عن كثب أثناء التمايز لمنع التمايز الزائد، الذي يسبب تصبغات باهتة.
  8. فحص المقاطع الملونة المتمايزة تحت المجهر الضوئي لملاحظة التغيرات النسيجة المرتبطة بترسيب الدهون الكبدية.
    ملاحظة: بعد التلوين والتمايز، يمكن تخزين المقاطع عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أيام قبل الفحص المجهري، لضمان عدم تأثر تأثير التلوين.

9. التحليل الإحصائي

  1. عبر عن جميع البيانات التجريبية كمتوسط ±± خطأ معياري للمتوسط (SEM)
  2. طبق اختبار شابيرو-ويلك للتحقق مما إذا كانت البيانات تتوافق مع توزيع طبيعي. إجراء اختبار ليفين لتقييم تجانس التباين عبر المجموعات إذا تم تأكيد الطبيعية.
    ملاحظة: طبق اختبارات غير معلمية مباشرة إذا لم تستوف البيانات افتراض الطبيعية.
  3. استخدم التحليل الأحادي الاتجاه للتباين (ANOVA) لاختبار الدلالة الإحصائية للفروق الكلية بين مجموعات متعددة، وإجراء مقارنات زوجية باستخدام اختبار الفرق الأقل دلالة (LSD) لفيشر.
    ملاحظة: استخدم ANOVA الويلشي بدلا من ذلك عندما تكون الفروقات متجانسة.
  4. استخدم اختبار t للطالب ذو الذيلين للمقارنات بين مجموعتين مستقلتين من العينة.
  5. عرف الدلالة الإحصائية كقيمة p ثنائية الجانب < 0.05. قم بإجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برامج التحليل الإحصائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تفاقم تآزري لأمراض الأيض في مجموعات التعرض المزدوج
كشف المراقبة الطولية لوزن الجسم عن مسارات نمو مميزة بين الفئات. أظهرت مجموعة النموذج ومجموعة HFHS زيادة وزن متسارعة مقارنة بكل من مجموعتي التحكم والأشعة المستمرة. ومن الجدير بالذكر أن مجموعة CR أظهرت تسارعا متواضعا مقارنة بالتحكم (الشكل 3A). تم تقديم دليل إضافي على خلل الأيض من خلال الملاحظة التي تشير إلى أن مستويات جلوكوز الدم والدهون في الدم أثناء الصيام كانت أعلى بشكل ملحوظ في مجموعتي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أكدت الأبحاث المعاصرة بشكل لا لبس فيه أن اضطراب النظام اليومي والنظام الغذائي عالي الدهون والسكر هما من المحركين المستقلين للتدهور الوظيفي الجهازي في الكائن الحي. تظهر بياناتنا أن الضرر المرضي الناتج عن تأثير هذين العاملين المشترك أكثر حدة بكثير من التأثير الإضافي البسيط لأي منهما بمفرده. مقارنة بمجموعات التدخل ذات العامل الواحد، لم تظهر مجموعة النموذج المركب فرقا ذا دلالة إحصائية في السمنة مقارنة بمجموعة HFHS، لكنها أظهرت ارتفاعا ملحوظا مقارنة بمجموعة CR. كانت مستويات الجلوكوز في الدم ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل مشروع برنامج العلوم والتكنولوجيا في خبي (246W2501D، 252W7716D)، وبرنامج S&T. في خبي (24462501D) ومنصة يانتشاو الذهبية (A20240022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ANY-mazeScienceSA225
Accu-Chek Active Blood Glucose MonitorSwitzerland, Roche Diagnosticsaccu check active
C75BL/6J miceBEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTDNo.110324241101250228
Grip strength meterUSA, Columbus Instruments1027CSM-E54
High-fat and high-sucrose dietChina, Xietong Biotechnology Co., Ltd.XT303
HistoCore MULTICUT - Semi-Automated Rotary MicrotomeGermany, LeicaRM2245
Oil Red O solutionChina, Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1260
Optimal cutting temperature compoundJapan, Sakura4583
Programmable Timer SocketChina, GONEOGND-1
Tissue Tech Prisma PlusJapan, Sakura20B2X00014000034
Tissue-Tek TEC 6 Embedding ModuleJapan, SakuraM01-021E-02
Total Cholesterol (TC) Assay KitChina, Suzhou Grace Biotechnology Co., Ltd.G0909W

المراجع

  1. Wang, F., et al. Meta-analysis on night shift work and risk of metabolic syndrome. Obes Rev. 15, 709-720 (2014).
  2. Zhang, S., et al. Associations of sugar intake, high-sugar dietary pattern, and the risk of dementia: a prospective cohort study of 210,832 participants. BMC Med. 22, 298 (2024).
  3. Yeomans, M. R., Armitage, R., Atkinson, R., Francis, H., Stevenson, R. J. Habitual intake of fat and sugar is associated with poorer memory and greater impulsivity in humans. PLoS One. 18, e0290308 (2023).
  4. Sharma, V. K., Singh, T. G. Chronic stress and diabetes mellitus: Interwoven pathologies. Curr Diabetes Rev. 16, 546-556 (2020).
  5. Kaikaew, K., Steenbergen, J., van Dijk, T. H., Grefhorst, A., Visser, J. A. Sex difference in corticosterone-induced insulin resistance in mice. Endocrinology. 160, 2367-2387 (2019).
  6. Guillaume-Gentil, C., Assimacopoulos-Jeannet, F., Jeanrenaud, B. Involvement of non-esterified fatty acid oxidation in glucocorticoid-induced peripheral insulin resistance in vivo in rats. Diabetologia. 36, 899-906 (1993).
  7. Gori, M., et al. Palmitic acid affects intestinal epithelial barrier integrity and permeability in vitro. Antioxidants (Basel). 9 (5), 417 (2020).
  8. Dong, Q., et al. Effects of Tremella fuciformis polysaccharides on intestinal barrier and its functional mechanism. Mycosystema. 44 (03), 104-113 (2025).
  9. Velloso, L. A., Folli, F., Saad, M. J. TLR4 at the crossroads of nutrients, gut microbiota, and metabolic inflammation. Endocr Rev. 36, 245-271 (2015).
  10. Marques, M., et al. Doxorubicin induces a senescent phenotype in murine and human astrocytes. J Neurochem. 169, e70177 (2025).
  11. Krüger, P., et al. Inflammation and fibrosis in progeria: Organ-specific responses in an HGPS mouse model. Int J Mol Sci. 25 (17), 9323 (2024).
  12. Cristòfol, R., et al. Neurons from senescence-accelerated SAMP8 mice are protected against frailty by the sirtuin 1 promoting agents melatonin and resveratrol. J Pineal Res. 52, 271-281 (2012).
  13. Azman, K. F., Safdar, A., Zakaria, R. D-galactose-induced liver aging model: Its underlying mechanisms and potential therapeutic interventions. Exp Gerontol. 150, 111372 (2021).
  14. Takeshita, H., et al. Modified forelimb grip strength test detects aging-associated physiological decline in skeletal muscle function in male mice. Sci Rep. 7, 42323 (2017).
  15. Whitehead, J. C., et al. A clinical frailty index in aging mice: comparisons with frailty index data in humans. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69, 621-632 (2014).
  16. Feridooni, H. A., Sun, M. H., Rockwood, K., Howlett, S. E. Reliability of a frailty index based on the clinical assessment of health deficits in male C57BL/6J mice. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 70, 686-693 (2015).
  17. Zhang, Y., Chu, J. M., Wong, G. T. Cerebral glutamate regulation and receptor changes in perioperative neuroinflammation and cognitive dysfunction. Biomolecules. 12 (4), 597 (2022).
  18. Fujiwara, M., Ferdousi, F., Isoda, H. Investigation into molecular brain aging in senescence-accelerated mouse (SAM) model employing whole transcriptomic analysis in search of potential molecular targets for therapeutic interventions. Int J Mol Sci. 24 (18), 13867 (2023).
  19. Ong, J., et al. Senescence accelerated mouse-prone 8: a model of neuroinflammation and aging with features of sporadic Alzheimer's disease. Stem Cells. 43 (2), sxae091 (2025).
  20. Linders, A. N., et al. A review of the pathophysiological mechanisms of doxorubicin-induced cardiotoxicity and aging. NPJ Aging. 10, 9 (2024).
  21. Sadigh-Eteghad, S., et al. D-galactose-induced brain ageing model: A systematic review and meta-analysis on cognitive outcomes and oxidative stress indices. PLoS One. 12, e0184122 (2017).
  22. Kohsaka, A., et al. High-fat diet disrupts behavioral and molecular circadian rhythms in mice. Cell Metab. 6, 414-421 (2007).
  23. Morris, C. J., Purvis, T. E., Hu, K., Scheer, F. A. Circadian misalignment increases cardiovascular disease risk factors in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E1402-E1411 (2016).
  24. Latimer, M. N., Rhoads, M. K., Reynolds, L. D., Pollock, D. M. Chronic circadian stress impairs blood pressure and sodium homeostasis in a diet- and sex-specific manner. Am J Physiol Renal Physiol. 330, F186-F198 (2026).
  25. Joo, J., et al. The acute effects of time-of-day-dependent high fat feeding on whole body metabolic flexibility in mice. Int J Obes (Lond). 40, 1444-1451 (2016).
  26. Pati, P., et al. Time-restricted feeding reduces cardiovascular disease risk in obese mice. JCI Insight. 10 (4), e160257 (2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة