مقالة منهجية

نموذج موحد للخنزير المخاطية الخارجية لتقييم تدفقات الببتيدات

378 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/70935

⸱

يونيو 9, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1UCD School of Veterinary Medicine and UCD Conway Institute, University College Dublin, 2UCD School of Mechanical and Materials Engineering, University College Dublin

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول منصة فحص تستخدم مخاطية نسيج ظهاري خنازير معزولة حديثا لتقييم نفاذ الببتيدات. تدمج الطريقة نفاذ GLP-1RA في وجود معزز نفاذية من المحاليل وغرف التلال والأفلام في خلايا انتشار فرانز، بالإضافة إلى إدخالات مطبوعة ثلاثية الأبعاد، مصحوبة بتقييم مخاطي نسيج.

الملخص

يوفر إعطاء الأدوية في الأفلام، والأقراص، والمقطينات، وأشكال الجرعات الأخرى طريقا نظاميا مريحا للعلاج الجهازي للأطفال وكبار السن، وللمرضى الذين لا يستطيعون بلع الكبسولات أو الأقراص بسهولة. يتطلب تطوير تركيبات الببتيدات الوعقة وتحت اللسان نماذج ما قبل السريرية تتماشى مع البنى الظهارية الفمية المخاطية غير الكيراتينية لدى البشر، والتي تعتبر الخنازير والكلاب الأكثر ملاءمة. حصلنا على الأنسجة المخاطية الذهبية الطازجة المهملة من الجزيرة. تم تشريح المخاطية من العضلة الملساء الأساسية باستخدام تسخين متحكم فيه ثم تركيبها إما في خلايا فرانز للانتشار أو في إدخالات جديدة منخفضة الحجم مطبوعة بالراتنج ثلاثي الأبعاد. تمت إضافة تركيبات معززات للببتيدات والنفاذية إلى جانب المتبرع، وتم أخذ عينات من الجزيئات المختربة من جانب المستقبل وقياسها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء (uHPLC). بالنسبة للمقنات، تم قياس قيم المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) للمخاطية المثبتة باستخدام أقطاب عود الطعام EVOM. تم فحص نسيج الأنسجة بعد الحضانة في كل من خلايا انتشار فرانز والخليات ثلاثية الأبعاد. تم اختيار التركيز الأمثل لمحسن النفاذية عندما تسبب الخلطات المائية من الببتيد والمحسن زيادة في النفاذ. بلغ نفاذ الببتيدات 4.3٪ خلال 3 ساعات في التركيبات ثلاثية الأبعاد (3D) و1.7٪ في نماذج حجرة هيلتوب، حيث يحاكي الأخير التعرض المباشر من فيلم بوكي. تم تطوير وتطبيق أفلام لامتصاك مخاطية بوليمرية طبقة بطبقة تحتوي على تركيبات معززات الببتيدات على الأنسجة المخاطية لدراسات النفاذية باستخدام غرف الانتشار. بلغ نفاذ الببتيدات خارج الجسم عبر الغشاء المخاطي الخنزيري 2٪ عندما تتعرض المخاطية لمزيج مثالي من الغلايكودوكسي كولات (GDC) المدمج في أغشية الفقاعة. توفر هذه الدراسات للفحص خارج الجسم مسارا لتقييم لاحق للتركيبات الدوائية المحملة بالببتيدات التي تدار عبر مسار المخاط الدهوي في الخنازير والبشر.

المقدمة

تعد الفراغات المخاطية الخنقية وتحت اللسان مسارات جذابة لإعطاء الأدوية الفموية لأنها توفر مواقع مباشرة وتجنب الأيض الأول للكبد، مما قد يحسن التوافر البيولوجي وقبول المرضى مقارنة بطرق أخرى، بما في ذلك الفم 1,2. عادة ما تعطى الببتيدات عن طريق الحقن بدلا من الإعطاء الفموي بسبب ضعف النفاذ عبر الظهارة المعوية بسبب وزنها الجزيئي الأعلى، وجاذبيتها للماء، وقابليتها للتحلل الإنزيمي. وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على 102 ببتيدا للتطبيقات العلاجية، مع ~450 ببتيدا علاجيا قيد التقييم في تجارب ما قبل السريرية أو السريرية4. تشمل هذه الأقراص الفموية المصممة بمنشطات نفاذية (مثل السيماجلوتايد، رايبيلسوس) ومنصات المخاط الذهبي (مينيرين ميلت ونوكدورنا ديسموبريسين تحت اللسان) التي تم تطويرها باستخدام تقنية كاتالنت لأقراص زيديس المتحللة الفموية (ODT)6. على الرغم من التحقيق المكثف في دراسات نفاذية الأدوية الخفية، تظهر قيم نفاذية الجزيئات ضعف في التكرار وقابلية المقارنة المحدودة عبر الدراسات7،8. تنبع هذه التناقضات بشكل كبير من اختلافات في النماذج الحيوانية التجريبية المستخدمة ومن اختلافات في التعامل مع وتحضير المخاطية الخانقية المعزولة9.

تعد اختبارات نفاذية خارج الجسم الحي باستخدام مخاط الأنسجة الوعية وتحت اللسان المعزولة أداة قيمة للتنبؤ بنفاذية جزيئات الساقية الصغيرة في الجسم الحي، وللفحص قبل السريري لمكونات التركيبة ذات الصلة بأشكال الجرعة 10,11,12; ومع ذلك، كان استخدامها في فحص الببتيدات محدودا لأن نفاذية القاعدة ضئيلة. في السنوات الأخيرة، أصبح الغشاء المخاطي الخنزيري النموذجي المفضل لأن بنيته غير الكيراتينية وخصائصه الفسيولوجية والكيميائية الحيوية تشبه إلى حد كبير تلك الخاصة بالبشر13. عينات الفقاع من الكلاب أقل وصولا حتى مقارنة بأنسجة الخنازير من المسالخ، رغم أن كلا المصدرين غير مقرنين14. لا يزال هناك تفاوت كبير في سمك الظهارة وطرق المعالجة. توحيد تحضير المخاط الفمجي في الفتحات وتحت اللسان أمر ضروري. تؤثر متغيرات مثل ظروف التخزين قصيرة وطويلة الأمد، سمك الأنسجة، والحفاظ على قابلية البقاء أثناء التجارب على نتائج نفاذية خارج الجسم الحي.8. الحفاظ على الأنسجة أمر بالغ الأهمية، حيث تؤثر كل من السلامة الهيكلية والنشاط الأيضي للمخاط بشكل مباشر على ملفات الانتشار12,15. فقدان وظيفة الحاجز يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع معدلات نفاذ الأدوية بشكل مصطنع16,17. بعيدا عن التخزين، فإن الطريقة المستخدمة لتشريح مخاطية الخنازير للتركيب في غرف النفاذ، تضيف مزيدا من التباين. يمكن أن تؤثر الاختلافات في إزالة الأنسجة الضامة تحت المخاطية، سواء بوسائل ميكانيكية أو كيميائية أو حرارية، من النفاذية. على الرغم من أن بعض التقارير تشير إلى أن فصل الحرارة لعزل الظهارة عن العضلات الملساء يحافظ على النفاذية19، إلا أن الإجماع غير موجود. حاليا، لا توجد طريقة مقبولة عالميا لتشريح وتقييم سلامة المخاطية الوعيةالمعزولة 20. يستخدم الفلوريسين الإيزوثيوسيانات-ديكستران المحبة للماء الموسوم بالسكر الموسوم (FITC dextran 4000, FD-4) كمؤشر سلامة للمخاط الخنزيري لأن الجزيئات الصغيرة التي تقل ~500 دالتون فقط يمكنها اختراق النسيج بشكل سلبي. على النقيض من ذلك، فإن الغشاء المخاطي السليم يقيد نقل FD-4، ويعتبر النقل من المتبرع إلى المستقبل أقل من 0.6٪ عادة مقبولا خلال 2-4 ساعات 21,22. بالإضافة إلى ذلك، يوفر تلوين أنسجة الهيماتوكسيلين والإيوزين تقييما مباشرا لمورفولوجيا الظهارة23.

في هذا العمل، وضعنا بروتوكولا موحدا للتعامل مع الغشاء المخاطي المخاطي المعزول من الخنازير الخشقي، مصمم لتحسين سلامة ونفاذية الغشاء المخاطي خلال فترة زمنية محددة. كانت أهدافنا توفير إطار تجريبي لتشريح الأنسجة الظهارية الخنزيرية وتعزيز موثوقية تقييمات نفاذية الببتيدات عبر المخاطيات العظمية المركبة في غرف الانتشار والإدخالات. أجرينا أولا تحليلات بصرية لتحديد الغشاء المخاطي الخشقي الخالي من الضرر من المسلخ. قمنا بتحسين تقنيات معالجة الأنسجة، وسماكة الغشاء المخاطي، وطرق الحفاظ على سلامة الأنسجة أثناء التجارب. باستخدام نظير مستقر منخفض الفعالية لمستقبل الببتيد-1 الشبيه بالجلوكاجون (GLP-1 RA) كجزيء أداة، أجرينا دراسات نفاذية الببتيدات في وجود وغياب معزز نفاذ ملح الصفراء، وهو صوديوم جليكوكسي كولات (GDC)، على الغشاء المخاطي الورقي المثبت في خلايا انتشار فرانز وتركيبات مطبوعة ثلاثية الأبعاد مخصصة محليا. تم تقديم GDC وGLP-1 RA إلى مخاط الخصم من المحاليل وغرف هيلتوب وأفلام البوليمرية ثنائية الطبقة اللاصقة من المخاط. استخدمنا مؤشرات النفاذية، وعلم الأنسجة، وقيم المقاومة الكهربائية عبر الظهارة/البطانة (TEER) كنقاط نهائية رئيسية لتقييمنا.

البروتوكول

تم جمع خدود الخنازير المستخدمة في هذه الدراسة من مسلخ محلي؛ لذلك، لم تكن هناك حاجة لموافقة أخلاقية.

1. عزل وتحضير وتخزين ظهارة الخنازير الخنزيرية

  1. يجمع أنسجة خدود الخنازير من مسلخ محلي وينقلها خلال 90 دقيقة إلى المختبر في محلول ملحي بارد جدا من الفوسفات (PBS، pH 7.4). خلال ال 60 دقيقة التالية، جهز الأنسجة وفقا للمنهجية الموصوفة سابقا19،24، مع تعديلات طفيفة لمواقع مختلفة للمخاطية العصبية كما هو موضح في الشكل 1.
  2. باستخدام مشرط، افصل الغشاء المخاطي الورقي عن الأنسجة التي تحتها وشطف النسيج ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). تخلص من الغشاء المخاطي الذي يسبب ضررا بصريا على السطح.
  3. اغمر مخاطية سليمة في PBS عند درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 3 دقائق وافصل الظهارة والنسيج الضام المتبقي عن العضلات الملساء باستخدام ملقط من صانع ساعات بحجم 5. هذه الطريقة قابلة للتطبيق أيضا لعزل الغشاء المخاطي تحت اللسان والظهارة اللسانية.
  4. جفف المخاط المخاطي المفصول بلطف على ورق فلتر السليلوز ثم تابع دراسات النفاذية (الخيار المفضل) أو تجميده لمدة لا تتجاوز 4 أسابيع.
  5. لعملية التجميد بعد الفصل، اغمر الساقية الزهرية لمدة ساعتين في واقي تجميد بنسبة 85٪ جليسيرول25، مع هز لطيف. الغليسيرول عالي اللزوجة يحل محل الماء بين الخلايا لمنع تكوين بلورات الماء، والتي قد تضر بنية الأنسجة.
  6. بعد هذه الفترة، استبدل الجلسرول ب PBS طازج و10٪ جليسرول. تجميد عينات المخاط عند -20 درجة مئوية أو -70 درجة مئوية، حسب مدة التخزين المطلوبة. نفذ إجراء التجميد بمعدل متحكم فيه ~-1 °C·min-1.
    ملاحظة: تجرى جميع التجارب باستخدام ما لا يقل عن ثلاث عينات من الأنسجة من وجنتي حيوانات مختلفة.

2. دراسة النفاذية خارج الجسم في الغشاء المخاطي المثبت في خلايا فرانز الانتشارية واستخدام غرف التل لتقديم GLP-1 RA وGDC

ملاحظة: تجرى دراسات نفاذية خارج الجسم في البداية على مخاطية خنازير خنزير معزولة حديثا باستخدام خلايا انتشار فرانز (FDC).

  1. قم بتركيب الغشاء المخاطي النسجي المفصوع في غرف (مساحة النافذة 1.2 سم2) الموضحة في الشكل 2 واستطاع لمدة 30 دقيقة مع PBS، الرقم الهيدروجيني 6.8 (جهة المتبرع، حجم 1 مل) وPBS، الرقم الهيدروجيني 7.4 (جانب المستقبل، حجم 10 مل).
  2. بعد 30 دقيقة من التوازن، استبدل محلول PBS المانح (pH 6.8) ب 1 مل من PBS يحتوي على نسبة 1:1 من GLP-1RA (25 ملغ/مل) وGDC (25 ملغ/مل).
  3. استمر في تحريك غرفة المستقبل ب 10 مل من PBS pH 7.4، مع الحفاظ على 37 درجة مئوية عند 300 دورة في الدقيقة. خذ عينة 1 مل من حجرة المستقبل كل 60 دقيقة لمدة 180 دقيقة. خذ عينات ثلاثية من حجرات المتبرع في بداية ونهاية التجربة. بعد كل عينة جديدة، قم بتجديد الغرف ب 1 مل من PBS.
  4. في نهاية التجربة، تخزين النسيج في 10٪ فورمالين لعلم الأنسجة أو توحيده لقياس كمية ببتيد GLP-1RA المتبقية في النسيج.
  5. وبالمثل، نفذ نفاذية GLP-1RA باستخدام غرف Hilltop (HTC).
    ملاحظة: الغرض من استخدام HTC هو تأكيد تأثير تعزيز نفاذ المخاط الدهوي ل GDC على حمض GLP-1 RA في المحلول قبل تكوين طبقة ثنائية الطبقة. HTC هي غرفة مصنوعة من Kraton G-2705، وهي كتلة كوبوليمر متوافقة حيويا من ستايرين-إيثيلين-بيوتيلين-ستايرين (SEBS)، بقطر خارجي 19 مم، وتحتوي على وسادة ويبريل (قطر 12.7 مم) مكونة من ألياف قطن غير منسوجة بنسبة 100٪، وتعمل كمادة لامتصة غير لاصقة لتطبيق المحلول26.
  6. وبالمثل، قيم نفاذية GLP-1RA وGDC خارج الجسم ( بنسبة 1:1) المحملة في أغشية الطبقة الثنائية اللاصقة من المخاط عن طريق وضع الأغشية في غرف المانح في FDCs أو في إدخالات ثلاثية الأبعاد، كما هو موضح ل HTC.
  7. لتأكيد سلامة نسيج ظهارة الخنازير الخنزيري، استخدم FD-4 (0.05 ملم) كمؤشر تدفق فلوري وأضفه إلى جانب المتبرع لتقييم التسرب عبر الأنسجة.
    ملاحظة: الأنسجة التي تظهر تسرب مستثناة من حسابات النفاذية.
  8. بعد تجربة 3 ساعات، قم بقياس تدفق GLP-1 RA التراكمي من خلال تحليل uHPLC لعينات 200 ميكرولتر تم سحبها من الحجرة الجانبية القاعدية في ثلاث نسخ. كرر جميع تجارب النفاذية ثلاث مرات. قم بقياس التدفق التراكمي ل GLP-1RA من منحنى معايرة مولد من تركيزات مجموعة GLP-1RA.

3. تحضير الأغشية البوقية المحبوسة مع GLP-1RA وGDC

ملاحظة: أفلام الطبقتين البوقية التي تحتوي على لاصق مخاطي وطبقة خلفية تصنع باستخدام صب مذيب مع طبقة طلاء شبه آلية27.

  1. تحضير فيلم ثنائي الطبقة لحبس GLP-1RA باستخدام HPMC و PVP-K90 كبوليمرات لتشكيل الفيلم، ومكون لاصق مخاطي يسمى Na-CMC.
    ملاحظة: راجع الجدول 1 لتركيب اللاصق المخاطي وطبقة الدعم للغشاء الشدقي. يتم دمج GDC مع ببتيد GLP-1 RA في الأفلام النموذجية بكميات منخفضة من الملغ لرؤية تأثيره على نفاذ الببتيدات عبر مخاطية خنازير الخنازير المركبة في الحجرات.
  2. جهز طبقة اللاصق المخاطي عن طريق إذابة البوليمرات المكونة للأغشية، 45 ملغ من HPMC، و10 ملغ من Na-CMC، و25 ملغ من PVP-K90، في ماء منزوع الأيونات يحتوي على 3٪ جليسرول عند 400 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق باستخدام محرك لوح ساخن مغناطيسي.
    ملاحظة: HPMC قابل للذوبان في درجة حرارة الغرفة، بينما يحتاج PVP-K90 إلى تسخين عند 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ليذوب.
  3. أضف 2 ملغ من إيروسيل 200 فهرنهايت تحت التحريك، ثم إضافة GLP-1 RA. ثم أضف GDC ووزعه على 600 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
  4. قم بعمل المحلول البوليمري النهائي بالموجات فوق الصوتية لمدة 90 دقيقة باستخدام حمام فوق صوتي لإزالة الفقاعات.
  5. صب الأفلام على بطانة من البولي إيثيلين تيريفثالات (PET) وغطها بشفرة طبيب مضبوطة على 2600 ميكرومتر بسرعة 2 مم/ثانية. جفف الأفلام في فرن هواء ساخن على درجة حرارة 40 درجة مئوية لمدة ~1 ساعة.
  6. بالنسبة للطبقة الخلفية، قم بإذابة 5٪ إيثيل سليلوز (EC) و5٪ بروبيلين جليسرول (PG) في ماء كحولي (إيثانول:ماء)، ثم صب العجينة المذابة على بطانة PET. وأخيرا، قم بقطع الأغشية المجففة إلى مربعات بحجم 1 سم × 1 سم، ثم تعبئة أكياس الألمنيوم، وخزنها عند 4 درجات مئوية.

4. طباعة إدخال ثلاثي الأبعاد مخصص يحاكي البئر العرضي

ملاحظة: الإدخالات المخصصة المطبوعة ثلاثية الأبعاد تصنع وفقا لطريقة سبق وصفها مع تعديلات طفيفة28.

  1. باختصار، صمم النموذج ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الحاسوب (CAD).
  2. حافظ على أبعاد الإدخال ثلاثي الأبعاد كما في الجسم الأسطواني الرئيسي (غرفة المانح)، بمساحة سطحية قصوى تبلغ 1659.06 مممربع، والأبعاد الخارجية الإجمالية 25.20 مم على المحور x، و14.50 مم على محور y، و21.63 مم على محور z.
  3. بالإضافة إلى ذلك، صمم حلقة تثبيت دائرية قابلة للفصل لدعم النسيج الطلائي. الحلقة لها قطر خارجي حوالي 19.90 مم وقطر داخلي 17.93 مم، وهو ما يتوافق مع أبعاد الجسم الأسطواني الرئيسي، ويمكن أن تتسع في صفائح ترانسويل ذات 12 بئر (الشكل 3).
  4. تصنيع جميع المكونات باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد مكتبية (SLA) باستخدام راتنج شفاف قابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية. جميع الأبعاد تقريبية ويمكن تعديلها حسب الحاجة لضمان التوافق الصحيح في الترانسويل والتوافق التجريبي.
    ملاحظة: لضمان إزالة المونومرات غير المتفاعلة والمواد القابلة للتسرب المحتملة، خضعت جميع الأجزاء لبروتوكول معالجة ما بعد المعالجة الموحد، بما في ذلك غسل لمدة 10 دقائق في كحول الأيزوبروبيل النقي بنسبة 99٪ (IPA) تليها معالجة بالأشعة فوق البنفسجية وفقا لمواصفات الشركة المصنعة، أي دقيقة واحدة في درجة الحرارة المحيطة في نموذج Form Cure 2. يمكن العثور على ملف الطباعة المجسمة (STL) لتصميم النماذج ثلاثية الأبعاد في https://doi.org/10.5281/zenodo.19368577 أو ملفات تكميلية (الملف التكميلي 1 والملف التكميلي 2).

5. النفاذ عبر الغشاء المخاطي المثبت في إدخالات ثلاثية الأبعاد

ملاحظة : يمكن أيضا تقييم نفاذية GLP-1RA وGDC المدمجة في أغشية الطبقة الثنائية اللاصقة من المخاط باستخدام إدخالات ثلاثية الأبعاد منخفضة الحجم مصممة خصيصا لمحاكاة ترانسويل (الشكل 2) كبديل لأقراص FDCs. وذلك لأن جانب المستقبل بسعة 10 مل من FDCs يخفف الببتيد، مما يتحدى حساسية الكشف في uHPLC. لذلك، فإن تصميم FDC ليس فعالا من حيث التكلفة أو عمليا لتدفقات الببتيدات، لأنه سيتطلب اكتشافا مستمرا من خلال اختبار المقاومة المناعية المرتبطة بالإنزيمات (ELISA) أو التحليل المناعي الإشعاعي (RIA).

  1. تصنيع/طباعة الإدخالات في راتنج قابل للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية باستخدام طابعة SLA ثلاثية الأبعادمكتبية 28، وركبها في ألواح زراعة أنسجة بسعة 12 بئر.
  2. وضع الغشاء المخاطي الخنزيري عبر منطقة نافذة بمساحة 1.4 سم2 بين الحجرة القمية والجانبية، وقس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة الأساسية (TEER) باستخدام فولتوهممتر EVOM 2 مع أقطاب STX2 الموضوعة في جانبي المتبرع والمستقبل من الإدخالات. يتم حساب TEER بواسطة قانون أوم.
  3. بعد وضع الفيلم (1.0 × 1.0 سم2) على أعلى النسيج، يتم استخدام الماصة بحجم 0.5 مل من PBS (pH 6.8) في الحجرة القمية و1.5 مل من PBS (pH 7.4) في الحجرة الجانبية.
  4. اجمع عينات (0.2 مل) من جانبي المستقبل بفواصل ساعة واحدة على 3 ساعات واستبدلها بأحجام متساوية من المخزن الجديد.
  5. قم بقياس ببتيد GLP-1 RA المتدفخ بواسطة uHPLC.
    ملاحظة: لم يلاحظ أي امتصاص ل GLP-1RA مع إدخالات ثلاثية الأبعاد بعد 3 ساعات، كما هو موضح في الشكل التكميلي 1 والملف التكميلي 3.
  6. قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) باستخدام فولتوميتر EVOM 2 مع أقطاب STX2 بفواصل ساعة واحدة على 3 ساعات. يتم حساب TEER بواسطة قانون أوم.
  7. لتأكيد سلامة نسيج الظهارة تحت اللسان والخنازير، استخدم FD-4 (0.05 ملم) كمؤشر فلوري.
    ملاحظة: تجرى جميع التجارب على شكل ثلاث نسخ، والنتائج المبلغ عنها هي متوسط ± SD لثلاث مجموعات من البيانات.

6. الكشف عن uHPLC لجهاز GLP-1 RA

  1. قم بقياس كمية حمض GLP-1 RA المنتشرة عبر الفراغ المخاطي المثبت في الأقراص العصبية والتركيبات، من كل من المحاليل الجانبية للمتبرع، وHTCs، والأفلامش بواسطة uHPLC باستخدام عمود CSH C18 (130 Å، 1.7 ميكرومتر، 2.1 مم × 50 مم) مع طور متحرك 0.1٪ TFA في الأسيتونيتريل (Eluent A) و0.1٪ TFA في الماء (Eluent B). التطهير التدرج على مدى 8 دقائق عند 30 درجة مئوية، مع حجم حقن 20 ميكرولتر ومعدل تدفق 0.7 مل/دقيقة، وكشف الأشعة فوق البنفسجية عند 214 نانومتر (وقت الاحتفاظ: ~4.2 دقيقة).
  2. قم بإجراء دراسة خطية.
    1. تصميم دراسة خطية لتقدير الاستجابة التحليلية لظروف uHPLC المحسنة باستخدام معايير معايرة GLP-1 في نطاق 2.5–20.0 ميكروغرام·مل⁻1.
    2. إعداد معايير المعايرة (n = 6–8 مستويات) بشكل مستقل وحقن العينات على شكل ثلاث نسخ. إجراء انحدار خطي بأقل مربعات لمساحة الذروة (mAU) مقابل التركيز الاسمي، وتقييم الخطية باستخدام معامل التحديد (r2)، ونسبة التقاطع y، وتوزيع البواقي (الاستجابة المرصودة-المتوقعة).
      ملاحظة: أظهر الفحص البصري لمخطط المعايرة ومخطط البقايا انحرافا طفيفا عن الخطية عند أدنى مستوى حساسية (2.5 ميكروغرام·مل⁻1)، مع وجود بقايا ضمن حد القبول المحدد مسبقا (±3٪). يتم تقييد نطاق المعايرة لاحقا إلى نطاق 2.5–20.0 ميكروغرام·مل⁻1، حيث أظهر الانحدار خطية مقبولة (r2 ≥ 0.999، ٪ تقاطع y < 2٪، وجميع البواقي ضمن ±3٪).

7. تقدير GLP-1RA المحتجز في الأنسجة الخانقية

  1. قم بإزالة الغشاء المخاطي الظهاري الخنزيري المتعرض ل GLP-1 RA وGDC من الأقراص العصبية الورقية/الإدخالات.
  2. اشطف الأنسجة ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة المواد الممتزة من الأدوية والفيلم.
  3. ثم يتم توحيد النسيج بسعة 5 مل من PBS باستخدام جهاز تجانس على الطاولة حتى يتفتت تماما.
  4. تخزين العينة طوال الليل عند 4 درجات مئوية للسماح بتوازن تقسيم الببتيدات بين الأنسجة المتجانسة وPBS.
  5. بعد ذلك، يتم طرد المركزي للخليط عند 5000 × جرام لمدة 5 دقائق لترسيب الشظايا وجمع المادة الفائقة للقياس.
  6. تعقيم المادة الفائقة من خلال مرشحات طرد مركزي بحجم 0.22 ميكرومتر لإزالة الجسيمات المتبقية قبل تحليل uHPLC.

8. علم الأنسجة المخاطية الدهوية

ملاحظة: بعد 3 ساعات من نفخ GLP-1 RA من الخلطات أو HTCs أو الأفلام، تتم معالجة المخاط لتقييم الضرر.

  1. ثبت الأنسجة في فورمالين بنسبة 10٪ لمدة 48 ساعة، ثم غرس الأنسجة المثبتة في البارافين.
  2. قسم الأنسجة بحجم 5 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم.
  3. ثم تصبغ الأنسجة بالهيماتوكسيلين والإيوسين (HE) لفحص السلامة النسيجية باستخدام المجهر الضوئي بتكبير 4×.
  4. يتم تصوير الشرائح باستخدام مجهر قائم وتحليلها باستخدام برامج تحليل الصور.
    ملاحظة: يتم تلخيص سير العمل العام في الشكل 4.

النتائج

عزل وتشريح أنسجة ظهارية خنزير البحر
يستخدم الغشاء المخاطي الخنزيري على نطاق واسع كنسيج بديل للغصب المخاطي البشري لأنه يشترك في خصائص تشريحية وخصائص حواجز فسيولوجية مماثلة.29. يتم عزل أنسجة ظهارية الخنازير بطرق جراحية وتسخين، كما هو موضح في الشكل 4. في البداية، يستخدم المشرط لإزالة العضلات والأنسجة الضامة العميقة من الخدين. ثم توضع القطع المعزولة من الأنسجة ذات الطبقات المخاطية المخاطية والأنسجة الضامة المدمجة وسليمة في PBS دافئ ويتم تسخينها إلى 65 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. يتم إزالة النسيج من الحاجز، ويتم تقشير الظهارة والصفيحة الخلفية باستخدام ملقط الحجم 5. يسمح التسخين بسمك ثابت ومنتظم في الظهارة المقطعة الناتجة.

النفاذية الخارجية لمادة GLP-1RA عبر المخاط المخاطي الخفري المثبت في الأقراص الدقيقة والمواد المطبوعة ثلاثية الأبعاد
تم تقييم النفاذية خارج الجسم لمادة GLP-1RA باستخدام مخاطية نسيج ظهاري خنزيري مركبة في الورشات العصبية والتركيبات. لتقييم نسبة التركيز المثلى ل GLP-1 RA: GDC، تم تثبيت HTCs التي تحتوي على وسادات قطنية بمساحة 12.7 مم على الجانب المانح من الغشاء المخاطي المركب في FDCs، وتم تركيب خليط معزز الببتيدات على الوسادة القطنية. بلغ النفاذ التراكمي لحمض GLP-1 RA حوالي 4.3٪ خلال 3 ساعات عندما تم تضمين GDC بنسبة 1:1 (GLP-1RA 25 ملغ: GDC 25 ملغ). وعلى النقيض من ذلك، في غياب GDC، لم يلاحظ تدفق GLP-1RA قابل للكشف27. يتم حساب معاملات النفاذية الكمية، بما في ذلكتطبيق P، باستخدام الصيغة التالية:

تطبيق P =figure-results-1

حيث:
تطبيق P: معامل نفاذية ظاهري (cm/s).
dQ/dt: معدل نقل GLP-1RA في الحالة المستقرة، يحسب ككمية الببتيد المنقولة لكل وحدة زمنية (μg/s).
A: مساحة الإدخال ثلاثي الأبعاد (سم2).
Co: التركيز الأولي للببتيد في الحجرة المانحة (الحلقية) (ميكروغرام/مل).

معامل نفاذية ظاهري (Papp) ل GLP-1RA عبر الغشاء المخاطي الخنزيري موضح في الشكل التكميلي 2. عندما كانت نسبة GLP-1RA:GDC 1:1، تم دمج نفس التركيزات الموجودة في HTCs في أفلام الطبقات الثنائية؛ ومع ذلك، لم يكن نفاذ GLP-1RA عبر أنسجة خنازير معزولة من الخنازير قابلا للقياس باستخدام نظام FDC التقليدي، حيث أن عرض GLP-1RA من الأغشية إلى الغشاء المخاطي أبطأ من مزيج في المحلول أو من HTCs. لتجاوز هذا القيد، تم تطوير إدخالات مطبوعة ثلاثية الأبعاد منخفضة الحجم مخصصة لتقليل حجم المستقبل إلى 1.5 مل، مما يحسن حساسية الكشف. باستخدام الإدخالات ثلاثية الأبعاد، كان النفاذ التراكمي ل GLP-1RA من الأغشية البدعية على مدى 3 ساعات قابلا للقياس ووصل إلى حوالي 1.8٪، كما هو موضح في الشكل 5. تم استخدام قيم TEER وتدفقات FD-4 لتقييم سلامة الحاجز الظهاري ونفاذية الخلايا الجانبية. لوحظ انخفاض في TEER يعتمد على الزمن (الشكل التكميلي 3) في مجموعات العلاج، وتزامن مع زيادة نفاذ GLP-1RA. لم تظهر الأنسجة المعالجة بالطبقة البيضاء والطبقات البيضاء أي تغييرات في TEER، مما يشير إلى أن مصفوفة الطبقة الثنائية لم تعطل الحاجز. تشير هذه البيانات إلى أن GDC هو المساهم الرئيسي في تأثير تعزيز النفاذ.

التقييم النسيجي لأنسجة الخنازير
تم إجراء تقييم نسيجي للمخاط الغطائي خارج الجسم لتقييم تأثير طرق عزل الأنسجة وفحص سلامة الظهارة بعد التعرض لمدة 3 ساعات ل GLP-1RA وGDC. كما هو موضح في الشكل 6، حافظت الأنسجة المعزولة حديثا التي تم الحصول عليها بطريقة التسخين على البنية الفسيولوجية الطهارية الطبيعية، مع طبقات طبقية سليمة ومخاط سطحي مستمر، ولم تظهر أي دليل على تلف هيكلي. على النقيض من ذلك، أظهرت الأنسجة المعزولة بالفصل الميكانيكي أو التي خضعت للتخزين/التجميد تغيرات طفيفة في شكل الخلايا الظهارية وانخفاضا في سمك مخاط السطح. المخاط المخاطي الخشقي الذي تعرض ل 25 ملغ من GLP-1RA بحضور 25 ملغ من GDC حافظ على سلامة الظهارة وكانت تشبه إلى حد كبير الضوابط غير المعالجة. لوحظ فقط وذمة خفيفة وتآكل سطحي للظهارة. التعرض ل GLP-1RA وحده أو للبلانك وGLP-1RA: لم تسبب أغشية الطبقة الثنائية المحملة ب GDC ضررا مرئيا للأنسجة، وكانت الخصائص النسيجة مشابهة لتلك الموجودة في الأنسجة الضابطة المعالجة ب PBS.

figure-results-2
الشكل 1: تجويف الفم الخنزيري يظهر مناطق المخاط الشدي وتحت اللسان. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 2: وحدات FDC ومكوناتها. تم تركيب ست غرف في نظام متكامل (على اليسار). يظهر شخص، فرانز سيل، (في الوسط). نظام التثبيت للأنسجة الفحمية في حجرة فردية (يمين). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 3: مكونات من إدخالات راتنج بحجم 1 سم2 مطبوعة ثلاثية الأبعاد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 4: سير العمل لعزل ظهارة الخنازير الخنزيرية، وتركيبها، ونفاذها، وعمليات توصيف الأنسيج. تم إنشاؤه في BioRender.com. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 5: الكمية التراكمية لحمض GLP-1 RATO. الكمية التراكمية خارج الجسم الحي من حمض GLP-1 RA التي تسربت على الجانب المستقبل من الغشاء الظهاري الخنزيري بعد تطبيق 180 دقيقة من 25 ملغ/مل GLP-1RA (أحمر)، 25 ملغ/مل GLP-1RA: 25 ملغ/ملليتر محلول GDC (أسود)، و25 ملغ/ملليتر GLP-1RA: 25 ملغ/ملليتر GDC محمول في الأفلام (بنفسجي) مطبقة عبر إدخالات HTC وFDC وثلاثية الأبعاد. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7
الشكل 6: صور مجهرية مصبوغة ب HE للمخاطية الظهارية الخنزيرية تحت ظروف تعرض مختلفة. (أ) الغلاف الفارغ، (ب) مزيج مائي من GLP-1RA: GDC، (C) الأفلام المحبوسة ب GLP-1RA:GDC، (د) مخاطية معزولة من نسيج طازج بعد المعالجة الحرارية (65 درجة مئوية)، (ه) ظهارة الخلافة المعزولة من الأنسجة المجمدة بعد المعالجة الحرارية، (و) الغشاء المخاطي المعزول بطريقة ميكانيكية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تركيب طبقة اللاصق المخاطي
المكوناتالتركيز (ملغ)
GLP-1RA12.5 ملغ
GDC12.5 ملغ
HPMC45 ملغ
Na-CMC10 ملغ
PVP-K9025 ملغ
الجلسرول3 ملغ
إيروسيل 200F2 ملغ
طبقة الدعم
إثيل السليلوز5 ملغ
بروبيلين جليكول5 ملغ

الجدول 1: تركيب اللاصق المخاطي وطبقات الغلاف البوكي.

الشكل الإضافي 1: امتصاص GLP-1RA بعد حضانة 0.5 ملغ من GLP-1RA لمدة 6 ساعات مع إدخالات ثلاثية الأبعاد. البيانات هي متوسط ± SD لثلاث تجارب (n = 3).يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: معامل نفاذية ظاهري (Papp) لجهاز GLP-1RA بعد التعرض لمدة 3 ساعات للأنسجة المخاطية الخزفية المركبة في إدخالات ثلاثية الأبعاد. محلول GLP بسعة 25 ملغ/مل (أحمر)، 25 ملغ/ملليتر GLP + 25 ملغ/ملليتر محلول GDC المائي (أسود)، و25 ملغ/ملليتر GLP + 25 ملغ/مل GDC مدمج في أغشية الوجع (البنفسجي). البيانات الممثلة هي المتوسط ± SD (n = 3). لوحظت دلالة إحصائية بين المجموعات: p < 0.05. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 3: مقاومة الظهارة العرضية (TEER). انخفاض تدريجي للمقاومة عبر الظهارة (TEER) من نسيج ظهاري خنزيري معزول تم تثبيته في إدخالات ثلاثية الأبعاد، بعد التعرض لمحلول GDC بجرعة 25 ملغ/مل من GLP-1 + 25 ملغ/مل (أحمر)، 25 ملغ/ملليتر GLP-1 + 25 ملغ/مل GDC في أغشية الخدق (الأخضر)، و25 ملغ/ملليتر GLP-1RA في PBS (الأزرق). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 4: سلامة الأنسجة وتسربها. تم تقييم سلامة الأنسجة وتسرب النسيج من خلال تعريض أنسجة ظهارية خنزير في إدخالات ثلاثية الأبعاد إلى 0.05 ملليمولار FD4 على جانب المتبرع. تم سحب العينات على فترات ثابتة من 60 دقيقة على مدى 6 ساعات. متوسط +SD لثلاث تجارب. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: transwell-Oring-v7 (JOVE).stl.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف الإضافي 2: transwell-v9 (JOVE).stl.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: تفاصيل تجريبية إضافية.يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

تصف هذه المنهجية بروتوكولات تجريبية لعزل ظهارة الخنازير الخنزيرية وأخرى من ظهارة المخاط الدهوي، إلى جانب اختبارات النفاذية للعلاجات القائمة على الببتيدات باستخدام نظير GLP-1RA منخفض الفعالية كنموذجمثالي 30. الببتيدات هي جزيئات كبيرة محبة للماء ذات نفاذية ضئيلة عبر الأغشية المخاطية17. يعتمد التنفيذ الناجح للبروتوكول أعلاه على العزل الدقيق وتركيب الغشاء المخاطي تحت اللسان. يتطلب العزل مهارة متخصصة وتحكم صارم في درجة الحرارة؛ حتى التقلبات الحرارية الطفيفة أثناء عملية التسخين يمكن أن تسبب تغيرات فسيولوجية وشكلية ضارة في النسيج الطلائي، مما يضر في النهاية بسلامة بيانات النفاذ. علاوة على ذلك، يمثل تثبيت الأنسجة المعزولة داخل الإدخالات المخصصة المطبوعة ثلاثية الأبعاد خطوة حاسمة. نظرا للطبيعة الحساسة لطبقات الظهارة، هناك خطر أكبر لتمزق أو تسرب الأنسجة أثناء التثبيت. ولتقليل ذلك، استخدمنا اختبار تسرب FD4، الذي يعمل كإجراء لمراقبة الجودة لضمان سلامة الغشاء قبل بدء دراسات التدفق. تم تقييم تسرب FD4 بصريا في البداية وتم قياسه بشكل أكبر باستخدام التحليل الطيفي المرئي بالأشعة فوق البنفسجية. يتم توفير البيانات المقابلة في البيانات التكميلية (الشكل التكميلي 4 والملف التكميلي 3).

يعتبر FDC التقليدي معيارا لدراسات خارج الجسم الحي ، وغالبا ما يواجه تحديات عند قياس علاجات الببتيدات بسبب الأحجام العالية في غرفة المستقبل، عادة 10 مل. الحجم العالي يؤدي إلى تخفيف العينة بشكل مفرط، مما يدفع تركيزات الببتيدات المتغلغلة إلى ما دون مستوى LOD المنخفض في الطرق التحليلية القياسية. لتجنب ذلك، طورنا ملحق جديد مطبوع ثلاثي الأبعاد يحاكي مقياس وأحجام نظام الترانسبول المستخدم في طبقات الخلايا الطهارية الأحادية، بما في ذلك Caco-231. يمكن وضع هذه التركيبات مباشرة في ألواح زراعة الأنسجة القياسية ذات 12 بئرا وتستوعب بشكل آمن الغشاء المخاطي الظهاري الخنزيري المعزول. يقلل هذا التعديل بشكل كبير من حجم حجرة المتبرع تقريبا 7 أضعاف ليصل إلى 1.5 مل، مما يركز على التحليل ويتغلب على قيود حساسية uHPLC. يعد هذا التكيف مهما بشكل خاص لقياس أدوية الببتيدات منخفضة النفاذية المكلفة.

لوحظ زيادة في نفاذ GLP-1 RA في وجود GDC باستخدام نظام الإدخال ثلاثي الأبعاد. وصلت الكمية التراكمية المتغلغلة من GLP-1RA إلى ~55.3 ميكروغرام عند 3 ساعات، مما يعادل ~4.3٪ من التركيز المطبق في البداية على الجانب المانح. على النقيض من ذلك، لم يتم اكتشاف تدفق روماتويدي قابل للقياس من GLP-1 عندما تم تطبيق تركيزات مماثلة من GLP-1RA وGDC محبوسة في أغشية الغطاق على الغشاء المخاطي البدقي المثبت في FDCs، مما يشير إلى أن نفاذا للببتيدات قد حدث لكنه ظل غير قابل للكشف تحليليا بسبب التخفيف المفرط في حجم المستقبل الكبير. ومع ذلك، بلغ النفاذ التراكمي لحمض GLP-1 RA من تركيبة الطبقة الثنائية الغطى حوالي 1.8٪ عند 3 ساعات في الإدخال ثلاثي الأبعاد خلال 3 ساعات، مما يثبت جدوى اكتشاف نقل الببتيدات منخفض المستوى عبر الأنسجة الخانقية من خلال أشكال الجرعات باستخدام نظام المستقبل المصغر. كما تم تقييم نفاذ GLP-1 RA خارج الجسم الحي ، باستخدام HTCs تحتوي على وسادة قطنية محملة بالببتيد وGDC. هذه أداة فحص أولية مفيدة جدا لإثبات أن عرض ببتيد من الأفلام مع معزز نفاذ ممكن. يمكن مراقبة سلامة الحاجز لظهارة الخنازير الخنزيرية خلال التجربة باستخدام تسرب TEER وFD-4. لوحظ انخفاض بطيء ويعتمد على الوقت في TEER أثناء التعرض لمنشط مستقبلات GLP-1 (GLP-1 RA)، وهو ما يتوافق مع زيادة النقل فوق الخلوي الناتج عن المخاط الدهاني بواسطة ملح الصفراء32.

من قيود هذه التقنية الاعتماد على نسيج الخنزير الطازج، الذي لا يتوفر دائما عند الطلب من المسالخ، وجودة الأنسجة قد تكون متغيرة. لمعالجة قيود الحصول على نسيج طازج على مسافة معقولة من المختبر، قمنا بتقييم الحماية من التجميد لتخزين عينات عالية الجودة يمكننا استخدامها لاحقا. بينما يعد استخدام الأنسجة الطازجة مثاليا، يتطلب استخدام الأنسجة المخاطية المخزنة المعزولة استخداما دقيقا لمواد الحماية من التجمد ومعدلات التجميد لمنع تكون بلورات الجليد وتلف الحواجز اللاحقة. يمتلك البروتوكول القدرة على سد الفجوة بين دراسات النفاذية على نطاق الكلي القياسية وتحليل الببتيدات عالي الحساسية. من خلال تحسين عملية عزل الأنسجة وبروتوكول النفاذية باستخدام إدخالات ثلاثية الأبعاد، حققنا درجة أعلى من قابلية التكرار والحساسية مقارنة بما يتم الإبلاغ عنه عادة مع الأقراص الثلاثية الجزئية. علاوة على ذلك، يوفر استخدام الإدخالات ثلاثية الأبعاد إطارا للباحثين لتوفير حدود للكشف عن جزيئات الببتيدات المكلفة، مما يمثل تحسنا كبيرا في مرونة وإنتاجية أبحاث المخاط خارج الجسم الحي .

توفر هذه البروتوكولات أساسا لقياس موثوق لنفاذ الأنسجة المخاطية باستخدام فئات أدوية تتجاوز الببتيدات. ستساعد القدرة على توليد ملفات نفاذية عالية الدقة من نماذج خارج الجسم الحي في التنبؤ ببيانات الامتصاص قبل السريرية المستمدة من نماذج الحيوانات. كما تم تقييم نفاذية GLP-1 RA خارج الجسم باستخدام HTCs تحتوي على وسادة قطنية محملة بالببتيد وGDC، وهو محلول معزز للنفاذ. ضمن هذا النهج التلامس الحميم والقابل للتكرار بين الخلطة وسطح الغشاء المخاطي. لوحظ زيادة كبيرة في نفاذ GLP-1RA بنسبة 1:1 من GDC في الإدخالات ثلاثية الأبعاد التي تحاكي الأنابيب الترانسبول. هذه أداة فحص مفيدة جدا لإثبات فكرة أن عرض ببتيد من أفلام مع معزز نفاذ يمكن أن يكون ممكنا في تصميم مبني من طبقات أحادية مزروعة من الخلايا الظهارية إلى الغشاء المخاطي في الأنسجة. يمكن مراقبة سلامة الحاجز لظهارة الخنازير الخنزيرية خلال التجربة باستخدام قياس TEER وتسرب FD4.

بشكل عام، تظهر التقييمات النسيجة الخارجية وتحليل النفاذية الجسدية أن التقييم الموثوق لنقل الببتيدات في الظرفية وتحت اللسان في وجود معزز نفاذية يعتمد على تحضير الأنسجة، وبروتوكولات التدفق، والحساسية التحليلية. من بين طرق العزل التي تم فحصها، وفر فصل الظهارة الخنازيرية الجديدة المصدرة وتحت اللسان باستخدام طريقة الحرارة توازنا جيدا بين الحفاظ على سلامة الظهارة وقابلية استنساخ النسيج، كما يتضح من استقرار TEER الأساسي الثابت، وتسرب FD4 البسيط، والحفاظ على هياكل خلايا الأنسجة. ومن المهم أن الإدخال المطبوع ثلاثي الأبعاد حسن بشكل ملحوظ من الموثوقية التجريبية من خلال تقليل تخفيف حجرة المستقبل، مما مكن من قياس تدفقات الببتيدات المنخفضة التي لا يمكن اكتشافها في ال FDCs. ومجتمعة، تدعم هذه النتائج استخدام الغشاء المخاطي الظهاري الخزفي المعزول في غرفة إدخال الأنسجة كمنصة خارج الجسم لتقييم إعطاء الببتيدات العلاجية في العقد الجهازي.

الإفصاحات

لا توجد لدى المؤلفين أي تورط مالي أو تضارب مصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون بن شوفلين (كلية الطب البيطري بجامعة دبلن) على المساعدة التقنية. نشكر أيضا الدكتور هانز إيكهارت (كلية الكيمياء بجامعة دبلن) على دعمه في تحليل uHPLC. حصل هذا المشروع على تمويل من برنامج هورايزن أوروبا للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي بموجب رقم المنحة 101071054. كما نعترف بالدعم المالي الإضافي من المنحة رقم 13/RC/2073_P2، ومركز أبحاث أيرلندا CURAM للأجهزة الطبية، وصندوق التنمية الأوروبي. يرغب المؤلفون في شكر كينيث ماكنمارا من شركة روسديرا آيرش ميتس على توفير خدود الخنزير.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الكمبيوتر / اللابتوبعامأي نظام قياسي≥8 GB RAM موصى به
سكربت الحصول على البياناتمخصصcollect.pyسكربت الحصول المبني على بايثون
إلكترودات الجيل القابل للتصرفعامإلكترودات Ag/AgCl مطلية مسبقًاأحادية الاستخدام، لاصقة
وحدة الحصول على EEGUpside Down LabsBioAmp EXG Pillواجهة أمامية تناظرية لإشارات biopotential
هلام الإلكترود (في حالة استخدام الإلكترودات القابلة لإعادة الاستخدام)عامهلام موصليحسن من توصيل الإشارة
تطبيق تفاعلي (لعبة)عامأي لعبة بسيطة (على سبيل المثال، السباق)واجهة تحكم باللوحة المفاتيح
أسلاك Jumperعامموصلات ذكر-أنثىأسلاك اللوح القياسية
Matplotlib / Seabornمصدر مفتوحآخر الإصداراتمكتبات التصور
لوحة المتحكمArduinoUno / Maker UnoADC ذو 10 بت، واجهة USB
بيئة برمجة بايثونمؤسسة برمجيات بايثونبايثون ≥3.8لغة برمجة مفتوحة المصدر
مكتبة PyTorchMeta AIالإصدار ≥1.12إطار العمل للتعلم العميق
Scikit-learnمصدر مفتوحآخر إصدار مستقرأدوات التعلم الآلي
مكتبات معالجة الإشارةSciPyآخر إصدارالترشيح، STFT
كابل USBعامUSB Type-A إلى Bكابل نقل البيانات

المراجع

  1. Karki, S., et al. Oromucosal films for peptide delivery: formulation strategies using permeation enhancers and polymers. Drug Deliv Transl Res. , (2025).
  2. Karavasili, C., Eleftheriadis, G. K., Gioumouxouzis, C., Andriotis, E. G., Fatouros, D. G. Mucosal drug delivery and 3d printing technologies: a focus on special patient populations. Adv Drug Deliv Rev. 176, 113858(2021).
  3. Brayden, D. J., Hill, T., Fairlie, D., Maher, S., Mrsny, R. Systemic delivery of peptides by the oral route: formulation and medicinal chemistry approaches. Adv Drug Deliv Rev. 157, 2-36 (2020).
  4. Al Musaimi, O. FDA's stamp of approval: unveiling peptide breakthroughs in cardiovascular diseases, ACE, HIV, CNS, and beyond. J Pept Sci. 30 (11), e3627(2024).
  5. Lewis, A. L., McEntee, N., Holland, J., Patel, A. Development and approval of Rybelsus (oral semaglutide): ushering in a new era in peptide delivery. Drug Deliv Transl Res. 12 (1), 1-6 (2022).
  6. Zhang, Y., Zhang, H., Ghosh, D., Williams, R. O. Just how prevalent are peptide therapeutic products? a critical review. Int J Pharm. 587, 119491(2020).
  7. Wanasathop, A., Patel, P. B., Choi, H. A., Li, S. K. Permeability of buccal mucosa. Pharmaceutics. 13 (11), 1814(2021).
  8. Mazzinelli, E., et al. Oral mucosa models to evaluate drug permeability. Pharmaceutics. 15 (5), 1559(2023).
  9. Djekic, L., Martinovic, M. In vitro, ex vivo and in vivo methods for characterization of bioadhesiveness of drug delivery systems. Bioadhesives Drug Deliv. , (2020).
  10. Mura, P., et al. A preliminary study for the development and optimization by experimental design of an in vitro method for prediction of drug buccal absorption. Int J Pharm. 547 (1-2), 530-536 (2018).
  11. Majid, H., Bartel, A., Burckhardt, B. B. Development, validation and standardization of oromucosal ex-vivo permeation studies for implementation in quality-controlled environments. J Pharm Biomed Anal. 194, 113769(2021).
  12. Wakchaure, R. S., Dhial, K., Pathak, A. Ethical and Safety Considerations in Drug Delivery Systems. Next-Generation Drug Delivery Systems. , Springer, Humana. New York, NY. (2025).
  13. Wang, S., Zuo, A., Guo, J. Types and evaluation of in vitro penetration models for buccal mucosal delivery. J Drug Deliv Sci Technol. 61, 102122(2021).
  14. Sa, G., et al. Histological features of oral epithelium in seven animal species: as a reference for selecting animal models. Eur J Pharm Sci. 81, 10-17 (2016).
  15. Patel, V. F., Liu, F., Brown, M. B. Modeling the oral cavity: in vitro and in vivo evaluations of buccal drug delivery systems. J Control Release. 161 (3), 746-756 (2012).
  16. Tian, Y., et al. Oromucosal films: from patient centricity to production by printing techniques. Expert Opin Drug Deliv. 16 (9), 981-993 (2019).
  17. Malhotra, S., Lijnse, T., O'cearbhaill, E., Brayden, D. J. Devices to overcome the buccal mucosal barrier to administer therapeutic peptides. Adv Drug Deliv Rev. 220, 115572(2025).
  18. De Vries, M. E., et al. Localization of the permeability barrier inside porcine buccal mucosa: a combined in vitro study of drug permeability, electrical resistance and tissue morphology. Int J Pharm. 76 (1-2), 25-35 (1991).
  19. Diaz Del Consuelo, I., Pizzolato, G. P., Falson, F., Guy, R. H., Jacques, Y. Evaluation of pig esophageal mucosa as a permeability barrier model for buccal tissue. J Pharm Sci. 94 (12), 2777-2788 (2005).
  20. Pather, S. I., Rathbone, M. J., Şenel, S. Current status and the future of buccal drug delivery systems. Expert Opin Drug Deliv. 5 (5), 531-542 (2008).
  21. Junginger, H. E., Hoogstraate, J. A., Verhoef, J. C. Recent advances in buccal drug delivery and absorption—in vitro and in vivo studies. J Control Release. 62 (1-2), 149-159 (1999).
  22. Goswami, T., Jasti, B. R., Li, X. Estimation of the theoretical pore sizes of the porcine oral mucosa for permeation of hydrophilic permeants. Arch Oral Biol. 54 (6), 577-582 (2009).
  23. Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D., Grizzle, W. A. Standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining. Biotech Histochem. 91 (5), 309-326 (2016).
  24. Franz-Montan, M., et al. Evaluation of different pig oral mucosa sites as permeability barrier models for drug permeation studies. Eur J Pharm Sci. 81, 52-59 (2016).
  25. Pegg, D. E. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. , Springer, Humana. New York, NY. (2014).
  26. Hoogstraate, A., et al. In vivo buccal delivery of fluorescein isothiocyanate-dextran 4400 with glycodeoxycholate as an absorption enhancer in pigs. J Pharm Sci. 85 (5), 457-460 (1996).
  27. Karki, S., et al. A pullulan-based bilayer film for buccal delivery of a GLP-1 peptide analogue. Carbohydr Polym. 380, 125064(2026).
  28. Shu, W., et al. Computational and experimental analysis of drug-coated microneedle skin insertion: the mode of administration matters. Adv Mater Interfaces. 12 (17), 2500202(2025).
  29. Marxen, E., Axelsen, M. C., Pedersen, A. M. L., Jacobsen, J. Effect of cryoprotectants for maintaining drug permeability barriers in porcine buccal mucosa. Int J Pharm. 511 (1), 599-605 (2016).
  30. Rebollo, R., et al. Salcaprozate-based ionic liquids for GLP-1 gastric delivery: a mechanistic understanding of in vivo performance. J Control Release. 377, 267-276 (2025).
  31. Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nat Protoc. 2 (9), 2111-2119 (2007).
  32. Brayden, D. J., Stuettgen, V. Sodium glycodeoxycholate and sodium deoxycholate as epithelial permeation enhancers: in vitro and ex vivo intestinal and buccal bioassays. Eur J Pharm Sci. 159, 105737(2021).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نموذج موحد للخنزير المخاطية الخارجية لتقييم تدفقات الببتيدات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.