تحديد جينات المحور، وتعدد أشكال النيوكليوتيدات الأحادية، والأهداف الدوائية المحتملة في سرطان الثدي باستخدام التحليل النسخي

Summary

بحثت هذه الدراسة في الجينات المرتبطة بالإجهاد التأكسدي الميتوكوندري المرتبطة بالمقاومة العلاجية في سرطان الثدي الإيجابي HER2. باستخدام مجموعات بيانات النسخ، والمعلوماتية الحيوية المتكاملة، والبيانات السريرية (n = 4,929)، حدد المؤلفون MTHFD2 وPRDX3 كجينات رئيسية معبر عنها تفاضليا ذات قيمة تنبؤية محتملة. في السيليكو. تشير التحليلات إلى تأثيرات وظيفية للمتغيرات الجينية.

Abstract

غالبا ما يطور سرطان الثدي الإيجابي HER2 (HER2⁺) مقاومة للعلاجات مثل لاباتينيب، والتي قد تتضمن إعادة برمجة الأيض والأكسدة الاختزاز في الميتوكوندريا. هدفت هذه الدراسة إلى تحديد جينات الإجهاد التأكسدي الميتوكوندري (MOS-DEGs) كمؤشرات حيوية للمقاومة وتوصيف NSSNPs الوظيفية والتأثيرات الهيكلية لديها. تم تحليل مجموعات بيانات RNA-seq (GSE231524، GSE231525) باستخدام DESeq2 لتحديد DEGs، والتي تقاطعت مع جينات الإجهاد التأكسدي الميتوكوندري للحصول على MOS-DEGs. تم إجراء إثراء وظيفي، وتحليل مثبطات مضخة البروتون، وتحليل ROC، وتحليل التعبيرات، وتحليل البقاء. تم تقييم nsSNPs باستخدام عدة أدوات تنبؤية، وتم تقييم التأثيرات الهيكلية من خلال النمذجة الثانوية وثلاثية الأبعاد. حدد التحليل المتكامل للنسخ والتحليل السريري MTHFD2 وPRDX3 كعوامل MOS-DEGs مركزية تظهران أدوارا تنظيمية متعارضة في أيض الأكسدة الاختزاز في الميتوكوندريا. كان MTHFD2 مرتفعا بشكل ملحوظ ومرتبط بتوقعات ضعيفة (معدل ضربات القلب = 1.53، الضغط = 1.1 × 10⁻¹⁶)، بينما أظهر PRDX3 أنماط تعبير وقائية (معدل ضربات القلب = 0.73، الضغط = 7.7×10^⁻10). أشارت تحليلات ROC إلى إمكاناتها كمؤشرات على الاستجابة العلاجية. كشف تحليل nsSNP عن خمسة متغيرات ضارة في MTHFD2 وأربعة متغيرات ضارة في PRDX3، حيث تم تحديد rs1471336772 (MTHFD2) وrs747786383 (PRDX3.) كالأكثر ممرضة. كان من المتوقع أن تكون هذه المتغيرات ضارة بناء على أنظمة تسجيل حسابية متعددة، بما في ذلك SIFT ≤ 0.05، وPolyPhen-2 ≥ 0.85، ودرجات CADD الضارة، ودرجات REVEL العالية، وكانت تقع ضمن مجالات تحفيزية أو نشطة في الأكسدة الاختزالية. أشارت النمذجة الهيكلية إلى أن هذه الاستبدالات قد تزعزع الاستقرار في التكوين، وتعطيل مواقع ارتباط المعادن والعوامل المساعدة، وتؤثر على تجديد NADPH أو نشاط بيروكسيداز المعتمد على ثيوريدوكسين. أشارت توقعات الديناميكا الجزيئية إلى احتمال فقدان الاستقرار البنيوي وتغير المرونة، مما يشير إلى احتمال وجود ضعف وظيفي في التحكم في الأكسدة الميتوكوندرية. تحدد هذه الدراسة MTHFD2 وPRDX3 كمنظمين للإجهاد التأكسدي الميتوكوندري في سرطان الثدي HER2⁺ . قد تساهم nsSNPs الضارة في هذه الجينات في تغير توازن الأكسدة والاختزال، مما قد يؤثر على التكيف الأيضي (MTHFD2) والدفاع ضد مضادات الأكسدة (PRDX3).

Introduction

سرطان الثدي هو أكثر أنواع السرطان تشخيصا بين النساء حول العالم ويعد سببا رئيسيا للوفاة المرتبطة بالسرطان رغم التقدم الكبير في الكشف المبكر والعلاجات المستهدفة ^1,2,3. التنوع الجزيئي داخل أورام الثدي هو أساس النتائج السريرية المتنوعة واستجابات العلاج، مما يطرح تحديات مستمرة لعلم الأورام الدقيق ^4,5. من بين الأنواع الجزيئية المعترف بها، يمثل سرطان الثدي الإيجابي لمستقبل عامل النمو البشري 2 (HER2) حوالي 15-20٪ من جميع سرطانات الثدي، ويتميز بتضخيم جين HER2 والتعبير الزائد عن مستقبل HER2 التيروزين كيناز ^6,7. على الرغم من أن العلاجات المستهدفة ل HER2، مثل تراستوزوماب ولاباتينيب، قد حسنت بشكل ملحوظ توقعات المرضى، إلا أن المقاومة الأولية والمكتسبة لهذه العوامل تظهر بشكل متكرر، مما يؤدي إلى انتكاس الورم وتطور المرض^8،9. لذا، يبقى فهم الآليات الجزيئية التي تدفع مقاومة علاج HER2 حاجة كبيرة لم تلبى في علم الأورام السريري.

تشير الأدلة الناشئة إلى أن خلل الميتوكوندريا والإجهاد التأكسدي يلعبان أدوارا حاسمة في التوسط في مقاومة الأدوية في سرطان الثدي. تعد الميتوكوندريا، إلى جانب دورها القانوني في إنتاج ATP، منظمات رئيسية للموت المبرمج، وإشارات الأكسدة الاختزالية، والمرونة الأيضية—وهي كلها عمليات تستغلها الخلايا السرطانية للبقاء على قيد الحياة تحت الضغط العلاجي. على وجه الخصوص، تظهر خلايا السرطان المقاومة HER2⁺ تحولا أيضيا نحو الفسفرة التأكسدية (OXPHOS)، وتعزيز التخزين التفاعلي لأنواع الأكسجين (ROS)، وتغير تكوين الميتوكوندريا. تمكن هذه التكيفات الخلايا من الحفاظ على إشارات البقاء وتجنب الاستماتة المبرمجة رغم التثبيط المستمر لمسارات إشارات HER2. لذلك، فإن الجينات التي تشفر الوحدات الفرعية المعقدة للميتوكوندريا والإنزيمات التي تنظم الأكسدة والاختزال، فهي مؤشرات حيوية محتملة وأهداف علاجية للتغلب على المقاومة.

بالتوازي، يمكن لتعدد أشكال النيوكليوتيد الأحادي غير المرادفة (nsSNPs) في الجينات المرتبطة بالإجهاد التأكسدي أو الميتوكوندريا أن يعدل بنية البروتين ووظيفته، مما يؤثر على نشاط الإنزيم، واستجابة الدواء، وقابلية الإصابة بالأمراض¹⁰. التنبؤ الحسابي بالتأثيرات الضارة لشبكات nsSNP باستخدام سيليكو.توفر أدوات مثل SIFT وPolyPhen-2 وCADD وسيلة سريعة لتحديد المتغيرات الوظيفية التي قد تسهم في تباين السرطان ومقاومته العلاجية. يتيح دمج بيانات النسخ والطفرات رؤية متعددة الأبعاد لاختلال تنظيم الجينات والتغيرات الهيكلية على المستويين النسخي والجينومي.

مكنت التطورات الحديثة في المعلوماتية الحيوية وعلم الأحياء المنظومي من التعرف على جينات المحركات المحتملة عالية الإنتاج من خلال التحليل التعبيري واسع النطاق والتحليل القائم على الشبكة. توفر المستودعات العامة مثل Gene Expression Omnibus (GEO) مجموعات بيانات قيمة لتسلسل الحمض النووي الريبي تلتقط التغيرات الجزيئية عبر النماذج التجريبية ومجموعات المرضى. وبالاقتران مع أدوات تحليلية مثل DESeq2، clusterProfiler، وتحليل شبكات STRING–Cytoscape، تتيح هذه الموارد توصيفا شاملا للجينات المعبر عنها تفاضليا (DEGs)، وإثراء المسارات، واكتشاف جينات المحور. ومن المهم أن دمج توقيعات جينات الإجهاد التأكسدي الميتوكوندري مع DEGs يمكن أن يسلط الضوء على آليات جزيئية جديدة تكمن وراء مقاومة العلاج الموجه ل HER2 ويحدد مؤشرات حيوية مرشحة للتدخل العلاجي.

حظي محور المقاومة المدفوع ب HER3 مؤخرا باهتمام كمسار تعويضي رئيسي بعد تثبيط HER2. يستعيد تنشيط HER3 إشارات PI3K/AKT في المرحلة اللاحقة، مما يعزز بقاء الخلايا وتحمل الأدوية (الشكل 1). تم الارتباط ب DUSP6 (الفوسفاتاز المزدوج النوعية 6)، وهو منظم سلبي لإشارات ERK، في تعديل هذه الاستجابة التكيفية. تثبيط DUSP6 يعيد تنشيط إشارات ERK وقد يعاكس مقاومة HER3، لكن تفاعله مع الإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا والتكيف الأيضي لا يزال غير مفهوم بشكل كاف. لذلك، توفر التحليلات المقارنة للنسخ النصي لسلاسل خلايا HER2⁺ (BT474 وMDA-MB-453) تحت تثبيط DUSP6 والتعرض المزمن للاباتينيب نموذجا مثاليا لتحليل المحددات الجزيئية لمقاومة الأدوية.

الشكل 1. تمثيل تخطيطي للمشهد الجزيئي الذي يربط بين خلل الميتوكوندريا، والإجهاد التأكسدي، وتطور سرطان الثدي. هذه الآليات الجزيئية المدمجة وراء تكوين الأورام الناتج عن الإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا في سرطان الثدي. تؤدي مجمعات سلاسل نقل الإلكترونات الميتوكوندرية غير المنظمة خاصة التي تشمل DUFS3 وUQCRC1 وCOX4I1 وSDHA وATP5PO. إلى توليد مفرط لأنواع الأكسجين التفاعلي (ROS)، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي التأكسدي، وتأكسدة الدهون، وضعف جهد الغشاء الميتوكوندري. تنشط هذه الاضطرابات التأكسدية مسارات الإشارات المسرطنة مثل PI3K/AKT وMAPK وNF-κB، بينما تثبط منظمات الاستماتة مثل p53 وBAX، مما يعزز بقاء خلايا الورم وتكاثرها وتفادي المناعة في الورم. يسلط المخطط الضوء أيضا على التأثير المزدوج للضغط التأكسدي الميتوكوندري على الأيض السرطاني والبيئة الدقيقة للورم، مع التركيز على مساهمته في مقاومة العلاج وتعديل المناعة تحت حالات سرطان الثدي HER2+. يشكل هذا النموذج التكاملي الأساس الآلي للتحليلات اللاحقة للنسخ النصي والتحليل المعتمد على SNP التي تهدف إلى تحديد جينات المحركات الميتوكوندرية والأهداف العلاجية المحتملة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم تصميم الدراسة الحالية لتحديد جينات المحور، وشبكات NSSNP الوظيفية، والأهداف الدوائية المحتملة المرتبطة بالإجهاد التأكسدي الميتوكوندري في سرطان الثدي ^HER2+ بشكل منهجي. من خلال دمج بيانات النسخ من GSE231524 و GSE231525 مع مجموعات جينية ميتوكوندرية ومرتبطة بالإجهاد التأكسدي المختارة، هدفت الدراسة الحالية إلى تعريف الجينات المعبر عنها تفاضلا مرتبطا بالإجهاد التأكسدي في الميتوكوندريا (MOS-DEGs) التي تساهم في مقاومة العلاج. شملت التحليلات اللاحقة إثراء مسار الجينات (GO) وKEGG، وبناء شبكات تفاعل البروتين والبروتينات (PPI)، وتحديد أولويات جينات المحور، وتحليل الارتباط للبقاء باستخدام قاعدة بيانات العلاج المناعي Kaplan–Meier. علاوة على ذلك، تم دراسة جينات رئيسية بشكل أعمق لتباين nsSNP والتأثير البنيوي المحتمل لتحديد العواقب الوظيفية المدفوعة بالطفرات.

من خلال الجمع بين التحليل النصي، وعلم الأحياء الشبكي، وتحليل الطفرات في السيليكو، توفر هذه الدراسة إطارا متكاملا لاكتشاف مؤشرات ميتوكوندرية محتملة وأهداف علاجية في سرطان الثدي HER2⁺ . قد يمهد تحديد جينات المحور المرتبطة بالفسفرة التأكسدية ونقاط التحول الوظيفية الخاصة بها الطريق لتطوير استراتيجيات علاجية دقيقة للتغلب على مقاومة الأدوية المستهدفة ل HER2 وتحسين نتائج المرضى.

Protocol

استرجاع البيانات والمعالجة المسبقة

أجريت هذه الدراسة باستخدام بيانات النسخ والجينات المتاحة للجمهور؛ لم يكن هناك أي شخص أو حيوان مشارك بشكل مباشر. تم استرجاع مجموعات بيانات النسخ النصي ذات الصلة بمقاومة علاج سرطان الثدي HER2⁺ من قاعدة بيانات NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)¹¹. تم اختيار مجموعتين من بيانات RNA-seq، GSE231524 و GSE231525، بسبب تركيزهما الخاص على المقاومة المدفوعة بHER3 وتثبيط DUSP6 في خطوط خلايا سرطان الثدي HER2+ (BT474 و MDA-MB-453). شملت هذه المجموعات الظاهرية للوالدين، والمقاومين للأدوية، والأنماط المقاومة للأدوية المستمدة من التعرض للاباتينيب (1 ميكرومولار) وإزالة DUSP6. تم الوصول إلى مصفوفات العد الخام وملفات البيانات الوصفية المقابلة باستخدام حزم GEOquery (v2.70.0) وBiobase (v2.62.0) في RStudio (v4.3.2)¹². تم تنسيق البيانات الوصفية لتحديد تباينين رئيسيين لكل مجموعة بيانات: GSE231524 قارن بين الضابط (BT474 والدي، اليوم 0) مع عينات مقاومة للأدوية وتحمل الأدوية (اليوم 9–الشهر التاسع)، بينما قارن GSE231525 بين الضابط (siRNA مشطح) مع DUSP6 (DUSP6-KD). تم إجراء مراقبة الجودة وتطبيع البيانات باستخدام إطار عمل DESeq2 (v1.42.0)، الذي يطبق تحويل مثبت التباين (VST) لتقليل التغاير وضمان قابلية المقارنة عبر العينات. تم تقييم توزيع البيانات وأنماط التجميع بصريا باستخدام ggplot2 (v3.5.0) وpheatmap (v1.0.12) لتأكيد تجانس البيانات وتحديد الحالات الشاذة المحتملة قبل تحليل التعبير التفاضلي^13,14.

في هذه الدراسة، تم الحفاظ على تمييز واضح بين النتائج المستمدة من مجموعات بيانات النسخ الخلوي وتلك التي تم الحصول عليها من مجموعات بيانات سريرية مستمدة من المرضى. استخدمت بيانات خط الخلايا بشكل أساسي للتحليل الاستكشافي، بما في ذلك تحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي وتوليد رؤى ميكانيكية أولية في نماذج تجريبية مضبوطة. في المقابل، تم استخدام مجموعات بيانات مستمدة من المرضى للتحقق الخارجي لأنماط التعبير الجيني وتقييم الصلة السريرية، بما في ذلك التقييم التنبؤي. وبناء عليه، يتم تفسير نتائج نماذج خط الخلايا والمجموعات السريرية بشكل منفصل لتجنب التعميم المفرط وضمان السياق الترجمي المناسب لجميع النتائج.

تحليل التعبير الجيني التفاضلي

تم إجراء تحليل للتعبير التفريقي لتحديد الجينات التي تم تعديلها بشكل كبير بين ظروف الضابطة والعلاج. تمت معالجة العد المعدل باستخدام نموذج الانحدار المعدل (ARM) المدمج في DESeq2 لتقدير تغيرات ال log₂ في الطيات والدلالة الإحصائية بدقة. تم تعريف صيغة التصميم على أنها ~شرط، تمثل المجموعات الضابطة مقابل المجموعات المعالجة. تم اعتبار الجينات التي لديها قيمة p معدلة (FDR) < 0.05 و≥تغير مطلق في اللوغاريتم-1 معبرا عنها بشكل مختلف بشكل كبير. تم إجراء انكماش تغير الطي لوغاريتي باستخدام طريقة أبيغلم لتعزيز المتانة في تقدير حجم التأثير. تم تصور نتائج التحليل باستخدام EnhancedVolcano (v1.22.0)¹⁵ و ggplot2¹⁶، اللذين أنتجا مخططات بركانية ومخططات MA تظهر العلاقة بين حجم التعبير والثقة الإحصائية. كما تم تقييم تقديرات التشتت ضمن DESeq2 لضمان نمذجة التباين الدقيقة وتطبيع متسق عبر النسخ البيولوجية¹⁷.

استرجاع وتحديد الجينات المعبر عنها تفاضليا مرتبطة بالإجهاد التأكسدي الميتوكوندري (MOS-DEGs)

للتحقيق في العلاقة بين استقلاب الطاقة، والإجهاد التأكسدي، ومقاومة الأدوية، تم تجميع قائمة شاملة بالجينات المرتبطة بالميتوكوندريا والإجهاد التأكسدي من عدة قواعد بيانات، منها Human MitoCarta3.0¹⁸ (https://personal.broadinstitute.org/scalvo/MitoCarta3.0/human.mitocarta3.0.html)، وعلم الجينات (GO:0006979، الاستجابة للإجهاد التأكسدي) (http://geneontology.org/)، ومسار الفسفرة التأكسدية لموسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) (https://www.genome.jp/kegg/)، وقاعدة بيانات جينات الإجهاد التأكسدي البشري (HOSGDB) (http://hosgdb.com/). تم توحيد جميع الجينات المسترجعة لتكون رموز جينية معتمدة من HGNC باستخدام org. Hs.eg.db (v3.18.0) و AnnotationDbi (v1.64.0)، بينما تمت إزالة المدخلات المكررة، والجينات الزائفة، والحمض النووي الريبي غير المشفر لضمان دقة التعليقات. تم استخدام لوحة جينات الإجهاد التأكسدي الميتوكوندري المنسقة (MOS جينات) لاحقا كمرجع للتكامل مع الجينات المعبر عنها تفاضلا تم تحديدها من كلا مجموعتي البيانات الترانسكريبتومية.

تم إجراء تقاطع قائمة جينات MOS المنسقة مع DEGs المستخرجة من GSE231524 و GSE231525 في R باستخدام دوال dplyr (v1.1.3)¹⁹ ودوال تقاطع R الأساسية. مكن هذا النهج التكاملي من تحديد MOS-DEGs، التي تمثل جينات مرتبطة وظيفيا بعملية أيض الميتوكوندريا، وتنظيم الأكسدة والاختزال والتكيف مع الإجهاد التأكسدي. تم تصور التداخل بين مجموعات البيانات باستخدام حزمة VennDiagram (الإصدار 1.7.3) في R لتوضيح الجينات المشتركة والفريدة عبر النماذج التجريبية²⁰. تم استخدام القائمة المنقحة لمواد MOS-DEGs في التحليلات اللاحقة، مما وفر رؤى ميكانيكية حول إعادة البرمجة النسخية والأيضية التي تكمن وراء مقاومة العلاج الموجه ل HER2.

التنميط والتصوير للتعبيرات MOS-DEGs

تم إجراء تحليل تعبيرات MOS-DEGs المحددة باستخدام حزم ComplexHeatmap (v2.18.0)²¹ وpheatmap (v1.0.12) في RStudio لتصور أنماط التعبير العالمية عبر الحالات الأبوية، والظروف المقاومة للأدوية، والمقاومة. تم تحويل بيانات العد الطبيعية باستخدام مقياس درجة z لتوحيد مصفوفة التعبير الجيني عبر العينات. تم إجراء التجميع باستخدام طرق المسافة الإقليدية والربط الكامل لاكتشاف أنماط التعبير المشترك وتمييز ملفات النسخ الخاصة بالشرط. تم توليد خرائط الحرارة ومخططات التجميع باستخدام ggplot2 لضمان تمييز بصري واضح بين الظروف. سهل هذا النهج البصري تحديد مجموعات الجينات المرتبطة بنشاط الميتوكوندريا، وتعديل الإجهاد التأكسدي، وإعادة البرمجة الأيضية في حالات مقاومة للأدوية.

الإثراء الوظيفي وشرح المسارات

لاستكشاف الأهمية البيولوجية والآليات التنظيمية لأنظمة MOS-DEGs المحددة، تم إجراء تحليلات إثراء علم الجينات (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) باستخدام R Studio (الإصدار 4.3.1). تم إجراء التحليلات في بيئة tidyverse باستخدام عدة حزم Bioconductor للحوسبة القابلة للتكرار والتصور. تم إجراء تعليقات جينية ورسم خرائط المعرف باستخدام المنظمة. قاعدة بيانات Hs.eg.db (https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/) مبنية على الجينوم المرجعي للإنسان العاقل (GRCh38). تم إجراء تحليل إثراء GO باستخدام حزمة clusterProfiler (الإصدار 4.8.1؛ https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/)، التي تصنف الجينات إلى ثلاثة أنطولوجيات رئيسية—العملية البيولوجية (BP)، والمكون الخلوي (CC)، والوظيفة الجزيئية (MF). تم استخدام دالة enrichGO²² مع تعيين معاملات على قيمة p < 0.05 وتم تعديل قيمة p. (FDR) < 0.05، باستخدام طريقة تصحيح بنجاميني-هوشبرغ. تم إنشاء تصورات، بما في ذلك مخططات الشريط، ومخططات النقاط، ومخططات الأوتار، باستخدام مخطط الإثراء (https://bioconductor.org/packages/enrichplot/)، وggplot2¹³ (https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/)، وGOplot (https://cran.r-project.org/web/packages/GOplot/). قدمت هذه الأدوات رؤية منظمة لمصطلحات GO المغنية وارتباطاتها الجينية.

تم إجراء إثراء مسار KEGG باستخدام دالة enrichKEGG() داخل حزمة clusterProfiler، والتي تشير إلى قاعدة بيانات KEGG البشرية (https://www.genome.jp/kegg/). تم استخدام حزمة KEGGREST (https://bioconductor.org/packages/KEGGREST/) لاسترجاع بيانات المسارات وتعليق التعليقات. المسارات التي تحتوي على قيمة p معدلة. (قيمة q) < 0.05 اعتبرت ذات دلالة. تم إجراء التصور ورسم خرائط المسارات باستخدام PathView (https://bioconductor.org/packages/pathview/)، ggplot2، وenrichplot، بينما تم استخدام igraph وggraph لتمثيل الشبكة²³. تم تنفيذ جميع تحليلات الإثراء والتصورات في R Studio (الإصدار 4.3.1) باستخدام كود قابل للتكرار وسير عمل Bioconductor موحد، مما يضمن التعرف الموثوق على الفئات الوظيفية المثرية والمسارات البيولوجية المرتبطة ب MOS-DEGs.

التحقق القائم على ROC للمؤشرات الحيوية التنبؤية في سرطان الثدي

للتحقق من القوة التنبؤية السريرية لاختبارات MOS-DEGs، تم إجراء تحليل منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC) باستخدام أداة ROCplotter الإلكترونية (https://www.rocplot.org/)²⁴. ROCplotter هو منصة متكاملة قائمة على الويب تجمع بين بيانات التعبير الجيني ومجموعات بيانات الاستجابة للعلاج المشروحة سريريا من 3,104 مرضى سرطان الثدي، بما في ذلك أولئك الذين عولجوا بالعلاج الكيميائي أو العلاج الهرموني أو مضادات HER2.

تم إجراء التحليل باستخدام معايير "الاستجابة المرضية الكاملة" كمتغير نتيجة و"أي علاج كيميائي" كفئة علاجية. تم تصنيف قيم التعبير الجيني المستمدة من مجموعات بيانات المصفوفات الدقيقة Affymetrix تلقائيا إلى مجموعات المستجيبين وغير المستجيبين بناء على التعليقات السريرية داخل المنصة.

تم تطبيق منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC) (AUC)، واختبار مان–ويتني U، وتغيير الطية، واختبار كاي-تربيع لتقييم قدرة كل جين على التمييز بين المستجيبين وغير المستجيبين. تم استخدام المساحة تحت المنحنى (AUC) كمقياس أساسي لتقييم الأداء التمييزي. تم اعتبار قيم AUC التي تزيد عن 0.55 مع قيم P ROC < 0.05 ذات دلالة، مما يمثل أداء تنبؤيا معتدلا نموذجيا للمؤشرات الحيوية الترانسكريبتومية، بينما تم تطبيق تصحيح معدل الاكتشاف الكاذب (FDR) للحفاظ على الصرامة التحليلية.

تم الاستعلام عن جميع MOS-DEGs المختارة باستخدام معرفات مجسات Affymetrix المقابلة. تم تقييم الإمكانات التمييزية لكل جين عبر مجموعات سرطان الثدي السريرية، حيث تم تقسيم بيانات التعبير إلى مجموعات المستجيبين وغير المستجيبين. تم توليد منحنيات ROC ومخططات الصناديق والمخرجات الإحصائية المرتبطة مباشرة بواسطة منصة ROCplotter وتصديرها للعرض البصري والمقارنة. قام التحليل بقياس القيمة التنبؤية للأكسدة والاختزاز والمنظمات الأيضية المشاركة في الإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا. تم الاحتفاظ بالجينات التي أظهرت دلالة تنبؤية متسقة عبر العينات السريرية لإدراجها في اللوحة التنبؤية النهائية.

تحليل التعبير التفاضلي في الأنسجة الورمية والطبيعية والمنتشرة (تحليل مخطط TNM)

تم تحليل أنماط التعبير للأعلى MOS-DEGs عبر الأنسجة الثدية الطبيعية، والأورام، والأنسجة النقيلية باستخدام أداة الويب TNMplot v2 (https://tnmplot.com/analysis/)²⁵. تم فحص كل من بيانات RNA-Seq (TCGA + GTEx + MET500) ومجموعات بيانات شريحة الجين لضمان التحقق عبر المنصات. تم استخدام وحدة "تحليل الجينات المتعددة" مع سرطان الثدي الغازي كنوع^{نسيج 26} المختار. تم تحويل قيم التعبير إلى log₂ ومقارنتها عبر مجموعات الورم مقابل الطبيعي (TvsN)، والورم المنتشر مقابل الورم (MvsT)، والنقيلي مقابل الطبيعي (MvsN). قام مخطط TNMplot بحساب تغير الطي (FC) وقيم p تلقائيا باستخدام اختبار مان–ويتني U لتقييم الدلالة الإحصائية. تم تصور توزيعات التعبير كمخططات مربعات ومخططات كثافة يتم إنشاؤها مباشرة من واجهة مخطط TNM، حيث تمثل الأخضر والأحمر والرمادي الأنسجة الطبيعية، والأورام، والأنسجة النقيلية على التوالي. تم تصدير جميع الأرقام بدقة عالية لدمجها في قسم النتائج. مكن هذا التحليل ذو المنصتين من تحديد وتحقق قوي لمنظمات الأكسدة والاختزال-أيض الرئيسية للميتوكوندريا المرتبطة بتقدم سرطان الثدي²⁷.

التحليل للبقاء والتنبؤي باستخدام مخطط كابلان-ماير

لتقييم الأهمية التنبؤية لموسوم MOS-DEGs في سرطان الثدي، تم إجراء تحليل البقاء باستخدام أداة كابلان-ماير للرسم الإلكتروني (https://kmplot.com/analysis/)²⁸. تدمج هذه القاعدة بيانات التعبير الجيني والبقاء على قيد الحياة لأكثر من 4,900 مريض بسرطان الثدي، مستمدة من مجموعات بيانات متعددة من GEO وEGA وTCGA. أجري التحليل للبقاء بدون تكرار (RFS) باستخدام معرفات مجسات Affymetrix الفردية التي تتوافق مع الجينات ذات الأولوية: 225609_at (GSR)، 201761_at (MTHFD2)، 201619_at (PRDX3/AOP1)، و 201128_s_at (ACLY). تم تقسيم المرضى إلى مجموعتين من حيث التعبير العالي والمنخفض بناء على الحد المتوسط للتعبير، وتم تقدير احتمالات البقاء على قيد الحياة باستخدام طريقة كابلان-ماير. استخدم اختبار التصنيف اللوغاريتمي لتقييم الدلالة الإحصائية بين منحنيات البقاء، وتم حساب نسب المخاطر (HRs) ذات فواصل ثقة 95٪ تلقائيا بواسطة الأداة. أجريت جميع التحليلات باستخدام نقطة نهاية RFS، دون أي تقييد بناء على مستقبل الهرمون أو حالة HER2 (ER، PR، HER2 = كل). تمت إزالة العينات الزائدة، وتم التحقق من افتراضات المخاطر النسبية لضمان المتانة الإحصائية. تستبعد مرشحات مراقبة الجودة المصفوفات الدقيقة المتحيزة. لم يتم تطبيق أي اختيار يدوي للمجسات أو تصحيح قيم p للاختبارات المتعددة، وفقا لإعدادات KM Plotter الافتراضية. تم تعريف الدلالة الإحصائية بأنها ص. < 0.05. تم تصور مخططات البقاء وتنزيلها بدقة عالية لمزيد من التفسير، حيث قارنت النتائج بين المعبر العالي والمنخفض عن كل جين MOS المرشح^29,30.

بدأ التحليل الحالي باستخدام مجموعات بيانات تحتوي حصريا على عينات سرطان الثدي HER2⁺ لتحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) وجينات المحور. لاحقا، أجري تحليل البقاء دون تقييد على حالة HER2 (ER، PR، HER2 = كل) لتقييم الصلة التنبؤية الأوسع وقابلية التعميم للجينات المحددة. تم استخدام هذا النهج كخطوة ثانوية للتحقق بدلا من إعادة تعريف تركيز الدراسة. لذلك، يتم تفسير التنبؤات لجينات المحور المحددة بحذر، مع بقاء الاستنتاجات الأساسية الخاصة بسرطان الثدي HER2⁺ .

تم استرجاع تسلسلات النسخ الرسمية ل MTHFD2-201 (ENST00000394053.7) وPRDX3-201 (ENST00000298510.4) من متصفح الجينوم Ensembl (https://www.ensembl.org)^31,32. تم إجراء التعليقات التوضيحية وتصنيفها باستخدام متنبئ تأثير المتغير الجماعي (VEP) (https://www.ensembl.org/vep)، الذي قدم سياقا جينوميا مفصلا، وتغييرات في الكودونات، واستبدالات الأحماض الأمينية لكل متغير تم تحديده. تم اختيار متغيرات missense فقط (SNPs غير المرادفة) للتحليل اللاحق.

التنبؤ بالمرضية وتحديد أولويات المتحور

تم تقييم النتائج الوظيفية لكل nsSNP باستخدام مجموعة من أدوات التنبؤ الحاسوبية. تم تطبيق SIFT (https://sift.bii.a-star.edu.sg) لتقييم حفظ الأحماض الأمينية، وصنف المتحورات التي حصلت على درجة ≤ 0.05 على أنها^{ضارة 33}. قدر PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2) التأثير الهيكلي والتطوري للاستبدالات، حيث أشارت الدرجات ≥ 0.85 إلى احتمال الضرر³⁴. قدم CADD (https://cadd.gs.washington.edu) درجة مركبة للضرر تدمج عدة تعليقات، مع قيم ≥ 20 تشير إلى الجهد المرضي العالي³⁵. تم دمج المقاييس التكميلية من MetaLR³⁶ وMutation Assessmentsor وREVEL من واجهة VEP لتعزيز موثوقية التنبؤ³⁷. تم إعطاء الأولوية للمتغيرات التي استوفت العتبات MetaLR ≥ 0.70، وMustation Assessmentsor ≥ 3.5، وREVEL ≥ 0.75 كمرشحة محتملة للممرض.

التنبؤ بالتأثير الهيكلي والميكانيكي

لتقييم كيفية تأثير استبدالات الأحماض الأمينية على السلامة الهيكلية والوظيفة الكيميائية الحيوية، تم تحليل كل NSSNP الأعلى تصنيفا باستخدام MutPred2 (http://mutpred.mutdb.org)³⁸ وDynaMut (http://biosig.unimelb.edu.au/dynamut)³⁹. قدر MutPred2 احتمال حدوث اضطراب وظيفي، بما في ذلك تغير النشاط التحفيزي، وزيادة أو فقدان بقايا الارتباط بالمعدن، وتغيرات في سهولة الوصول إلى المذيبات، والتعديل الأللوستيري، مع تصنيف درجات ≥ 0.80 على أنها شديدة الممرض. قام دايناموت بحساب تغير الطاقة الحرة في جيبس (ΔΔG) بين البروتينات البرية والبروتينات الطافرة، وقيم اتجاه وحجم تغير الاستقرار، وأنتج تصورات للإزاحات الذرية وإعادة ترتيب الروابط الهيدروجينية.

النمذجة الهيكلية الثانوية وثلاثية الأبعاد وتحليل إمكانية الوصول للمذيبات

تم الحصول على البنى البلورية المحسولة تجريبيا ل MTHFD2 وPRDX3 من بنك بيانات البروتين (PDB) ومعالجتها باستخدام PyMOL V:3.1 (https://pymol.org)⁴⁰ لتصور التوزيع المكاني للبقايا الضارة. تم إنشاء نماذج الطفرات عن طريق إدخال استبدالات الأحماض الأمينية المقابلة، تلتها تنقية هيكلية وتقليل الطاقة. أبرزت الفحص ثلاثي الأبعاد المقارن التحولات في العناصر الثانوية، وتغير الاتصالات بين الذرات، والقرب المكاني لشبكات nsSNP من مجالات التحفيز والارتباط بالعوامل المضافة، كاشفا عن اضطرابات محتملة في وظائف الأكسدة والاختزاز والتمثيل الغذائي.

تم إجراء تحليلات الهيكل الثانوي والتعرض للمذيبات باستخدام PSIPRED V: 3.2 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred)^41,42 وNetSurfP 3.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetSurfP-2.0)⁴³. تنبأت هذه الأدوات بحلقات α، و β خيوط، وملفات ومناطق غير منظمة، بالإضافة إلى درجات الوصول النسبي للمذيبات (RSA). تم رسم خرائط البقايا التي تظهر قيم RSA متوسطة إلى عالية وترتيب هيكلي لتحديد المواقع المعرضة للمذيبات والمواقع الحرجة وظيفيا. تم عرض المواقع المتأثرة في مخططات طوبولوجيا ثنائية الأبعاد لتحديد ما إذا كانت طفرات ضارة حدثت في نوى حفازة صلبة أو مناطق حلقات مرنة، مما يتنبأ بتأثيراتها المحتملة على ديناميكيات طي البروتينات والكفاءة الإنزيمية.

التحقق المتقاطع بين قواعد البيانات، والتكامل الوظيفي، والتحقق من صحة الاستقرار

تم مقارنة كل nsSNP تم ترتيبه أولوية مع قواعد بيانات جينومية على مستوى السكان مثل dbSNP و1000 Genomes وExAC وgnomAD لتأكيد تكرار المتغيرات، والتوزيع الأليلي العالمي، والارتباطات السريرية المبلغ عنها سابقا. مكن دمج الحفظ التطوري، والنمذجة الهيكلية، والتنبؤ الوظيفي القائم على التعلم الآلي من تحديد المتغيرات الضارة عالية الثقة في MTHFD2 وPRDX3. تم لاحقا ربط هذه الطفرات عالية التأثير بمجالات وظيفية لتوضيح دورها المحتمل في اختلال الإجهاد التأكسدي الميتوكوندري، وتغير إشارات الأيض، والمقاومة العلاجية في سرطان الثدي. لتأكيد العواقب الديناميكية الحرارية لكل استبدال ضار، تم استخدام iMutant 3.0 (https://folding.biofold.org/i-mutant/i-mutant3.0.html)⁴⁴ للتنبؤ بتأثيرات الطفرات على استقرار البروتين باستخدام بيانات التسلسل والبنيوية. حسب التحليل قيم ΔΔG (كيلو كالوري/مول) التي تمثل التغير في الطاقة الحرة بين البروتينات البرية والبروتينات الطفرة. تم تصنيف المتغيرات التي تظهر قيم ΔΔG سلبية كطفرات مزعزعة للاستقرار، مما يشير إلى انخفاض استقرار البروتين وزيادة احتمال التكشف. أدى دمج توقعات iMutant مع نتائج DynaMut وMutPred2 إلى تحقق متقاطع لتحديد البواقي الحرجة هيكليا التي من المحتمل أن تؤثر على وظيفة الأكسدة والاختزال، والسلامة التحفيزية، والاستقرار العام لتكوين البروتين.

التفسير الوظيفي المتكامل والأهمية العلاجية

تم التحقق من صحة جميع nsSNPs الضارة المحددة من خلال المقارنة مع قواعد بيانات dbSNP وgnomAD وExAC للتحقق من تكرارات الأليلات البسيطة والارتباطات السابقة مع الأنماط الظاهرية للسرطان. أشارت التفسيرات التكاملية لبيانات الحفظ التطوري، ونمذجة البنيوية، والاستقرار إلى أن الطفرات عالية التأثير rs1471336772 (MTHFD2) و rs747786383 (PRDX3) تمارس أقوى التأثيرات الضارة على تكوين البروتين وكفاءة التحفيز. تشير النتائج الحسابية مجتمعة إلى أن الطفرات في MTHFD2 تزعزع استقرار عملية الأكسدة والاختزاز المعتمدة على NADPH، بينما تؤثر الطفرات في PRDX3 على الدفاع عن الإجهاد التأكسدي المدفوع بالبيروكسيداز، مما يساهم في خلل الميتوكوندريا وعدوانية الأورام. يوفر هذا التحليل الهيكلي والوظيفي القائم على nsSNP أساسا حسابيا للفحص العلاجي المستقبلي والتحقق من الطفرات، مع تسليط الضوء على MTHFD2 وPRDX3 كمؤشرات حيوية دقيقة لعلاج سرطان الثدي المستهدف بالأكسدة والاختزال (RED). لتحسين الوضوح وتقديم نظرة شاملة على الاستراتيجية التحليلية، يتم عرض سير عمل تخطيطي يلخص الخطوات الرئيسية للدراسة في الشكل 2. يدمج سير العمل تحليل التعبير الجيني التفاضلي، وترشيح جينات الميتوكوندريا، وبناء شبكة تفاعل البروتين-البروتين، والتحقق السريري باستخدام تحليل ROC، والتوصيف الهيكلي القائم على nsSNP. يبرز هذا الإطار التدريجي التقدم المنطقي من معالجة البيانات النصية إلى تحديد المؤشرات الحيوية وتفسيرها الوظيفي.

الشكل 2. سير عمل متعدد الخطوات متكامل لتحديد والتحقق من المؤشرات الحيوية المرتبطة بالإجهاد التأكسدي الميتوكوندري في سرطان الثدي HER2⁺ . يلخص هذا المخطط خط التحليل المستخدم في الدراسة. أولا، تم إجراء تحليل التعبير الجيني التفاضلي (DEG) على مجموعات بيانات RNA-seq (GSE231524 و GSE231525) لتحديد الجينات المتغيرة بشكل كبير. تم دمج هذه الجينات ذات الصلة بالإجهاد التأكسدي الميتوكوندري المنسقة للحصول على MOS-DEGs. بعد ذلك، تم إجراء تحليل شبكات تفاعل البروتين والبروتين (PPI) باستخدام STRING وCytoscape لتحديد جينات المحور والوحدات الوظيفية. لاحقا، تم تطبيق تحليل منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC) باستخدام منصة ROCplotter لتقييم الأداء التنبؤي للجينات المختارة في مجموعات سريرية. وأخيرا، تم إجراء تحليل SNP غير المرادف (nsSNP) ونمذجة هيكلية لتقييم التأثير الوظيفي والهيكلي المحتمل للمتغيرات الرئيسية في الجينات ذات الأولوية (MTHFD2 و PRDX3). يربط هذا السير التكاملي بين التحليلات النصية، الشبكية، السريرية، والبنيوية لتحديد العلامات الحيوية المحتملة والأهداف العلاجية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Results

تحليل التعبير الجيني التفاضلي

تم إجراء تحليل تعبير تفريقي لدراسة التغيرات النسخية المرتبطة بتطور سرطان الثدي HER2⁺ ومقاومته العلاجية باستخدام مجموعتي بيانات مستقلتين من RNA-seq، GSE231524 و GSE231525. في أول مجموعة بيانات (GSE231524)، تم قياس ما مجموعه 19,727 جينا في البداية. بعد التطبيع والترشيح وتطبيق نموذج الانحدار المعدل (ARM) للتعبير التفريقي، تم الاحتفاظ ب 6,604 جين معبرة بشكل ملحوظ (الجدول التكميلي S1). بعد توحيد رموز الجينات، وإزالة التكرار،...

Discussion

يعد الإجهاد التأكسدي الميتوكوندري سمة مميزة لتكيف الأورام، حيث يتحكم في بقاء الخلية، واللدونة الأيضية، ومقاومة العلاج. استكشفت الدراسة الحالية بشكل منهجي الجينات المعبر عنها تفاضلا (MOS-DEGs) المرتبطة بالإجهاد التأكسدي الميتوكوندري في سرطان الثدي HER2⁺ من خلال دمج بيانات النسخ النصي، والإثراء الوظيفي، والتحقق السريري، وتحليل الطفرات والبنيوية بالتفصيل في السيليكو . وقد وفر دمج التعبير التفاضلي مع تحليل الطفرات فهما متعدد الأبعاد لكيفية تقاطع تنظيم الأكسدة والاختزاز مع...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AnnotationDbi	Bioconductor	v1.64.0	حزمة تعليقات R المستخدمة لتوحيد وتعليق رمز جين HGNC.
apeglm	Bioconductor	طريقة في DESeq2	الطريقة المستخدمة لتقليص التغيير في اللوغاريتمات الثنائية في تحليل التعبير التفاضلي.
Biobase	Bioconductor	v2.62.0	حزمة R المستخدمة للوصول إلى وإدارة كائنات التعبير والبيانات الوصفية المستمدة من GEO.
CADD	جامعة واشنطن / مختبر Kircher	أداة الويب	درجة استنزاف Annotation Dependent Combined المستخدمة للتنبؤ بالتسبب في nsSNP.
clusterProfiler	Bioconductor	v4.8.1	حزمة R المستخدمة لتحليل الإثراء في GO وKEGG.
ComplexHeatmap	Bioconductor	v2.18.0	حزمة R المستخدمة لتوليد مخططات الحرارة وتصنيف التعبير.
Cytoscape	Consortium Cytoscape	البرنامج	منصة تصور الشبكة المستخدمة مع شبكات PPI المشتقة من STRING وتحديد الأولويات في CytoHubba.
dbSNP	NCBI	قاعدة البيانات	قاعدة بيانات المتغيرات السكانية المستخدمة للتحقق من تقاطع nsSNPs المحددة.
DESeq2	Bioconductor	v1.42.0	حزمة R المستخدمة للتطبيع ونمذجة التباين وتحليل التعبير التفاضلي.
dplyr	CRAN / tidyverse	v1.1.3	حزمة R المستخدمة لمعالجة البيانات وتقاطع مجموعات الجينات.
DynaMut	جامعة ملبورن / BioSig	خادم الويب	أداة مستخدمة لتقدير التغيرات في الاستقرار والمرونة المرتبطة بالطفرات في البروتينات.
EnhancedVolcano	Bioconductor	v1.22.0	حزمة R المستخدمة لتصور نتائج التعبير التفاضلي كمخططات البركان.
Ensembl Genome Browser	EMBL-EBI / Ensembl	قاعدة البيانات	المصدر لتسلسلات النصوص الكانونية لـ MTHFD2 وPRDX3.
Ensembl Variant Effect Predictor (VEP)	EMBL-EBI / Ensembl	أداة الويب	أداة مستخدمة لشرح المتغيرات المفترضة ودمج الدرجات التنبؤية.
ExAC	معهد برود	قاعدة البيانات	قاعدة بيانات قاعدة exome على مستوى السكان المستخدمة للتحقق من تقاطع nsSNP.
Gene Expression Omnibus (GEO)	NCBI	قاعدة البيانات	المستودع المستخدم لاسترداد مجموعات البيانات النصية لتحليل سرطان الثدي الإيجابي لـ HER2.
Gene Ontology	Consortium Gene Ontology	GO:0006979	مورد الأنطولوجيا المستخدم لاسترداد الجينات المتعلقة بالإجهاد التأكسدي وتحليل التخصيب.
GEOquery	Bioconductor	v2.70.0	حزمة R المستخدمة للوصول إلى مصفوفات العد في GEO والبيانات الوصفية.
ggplot2	CRAN / tidyverse	v3.5.0	حزمة R المستخدمة لتصور البيانات وتجميع الرسوم البيانية والمخرجات الرسومية.
ggraph	CRAN	حزمة R	حزمة R المستخدمة لتصور الرسوم البيانية والشبكات أثناء تمثيل الإثراء والمسار.
gnomAD	معهد برود	قاعدة البيانات	قاعدة بيانات المتغيرات السكانية المستخدمة للتحقق من التردد والتوزيع لـ nsSNPs المحددة.
GOplot	CRAN	حزمة R	حزمة R المستخدمة لتصور إثراء GO بما في ذلك المخططات الوترية والمخططات الموجزة.
GSE231524	NCBI GEO	الرقم المرجعي	مجموعة بيانات RNA-seq المستخدمة لتحليل الأنماط الظاهرية للأبوين والمتحملين للعقاقير والمقاومة لـ BT474.
GSE231525	NCBI GEO	الرقم المرجعي	مجموعة بيانات RNA-seq المستخدمة لتحليل تقليل DUSP6 في الخلايا السرطانية الثديية الإيجابية لـ HER2.
Human MitoCarta3.0	معهد برود	قاعدة البيانات	المورد المختوم للجين الميتوكوندريا المستخدم لتعريف مجموعات الجينات الميتوكوندريا.
Human Oxidative Stress Gene Database (HOSGDB)	HOSGDB	قاعدة البيانات	قاعدة البيانات المستخدمة لاسترداد الجينات المتعلقة بالإجهاد التأكسدي.
igraph	CRAN	حزمة R	حزمة R المستخدمة لتمثيل الشبكة وتصور المسار.
iMutant 3.0	جامعة بولونيا / Biofold	خادم الويب	أداة مستخدمة للتنبؤ بتأثيرات الطفرة على استقرار البروتين.
Kaplan–Meier Plotter	KMplot	أداة الويب	منصة عبر الإنترنت لاستخدام تحليل البقاء الخالي من الانتكاس في مجموعات سرطان الثدي.
KEGG	جامعة كيوتو	قاعدة البيانات	قاعدة بيانات المسار المستخدمة لتحليل الفسفرة التأكسدية وتحليل الإثراء في المسار.
KEGGREST	Bioconductor	حزمة R	الحزمة المستخدمة لاسترداد وتعليق معلومات مسار KEGG.
Lapatinib	لم يتم تحديده في المخطوطة	حالة علاج بـ 1 μM	مثبط مستهدف لـ HER2 المستخدم في مجموعات البيانات التجريبية المصدر لاستنتاج الأنماط الظاهرية المقاومة / المتحملة للعقاقير.
MetaLR	مدموج عبر Ensembl VEP	الدرجة	مقياس التسبب المحسوب المستخدم لتخصيص الأولويات للتغيرات.
MutPred2	MutPred	خادم الويب	أداة مستخدمة للتنبؤ بالنتائج الوظيفية لبدائل الأحماض الأمينية.
NetSurfP 3.0	الجامعة التقنية في الدنمارك	خادم الويب	أداة مستخدمة للتنبؤ بالهيكل الثانوي والو