استكشاف البيئة الدقيقة للمبيض: طرق العزلة، والزراعة ثنائية الأبعاد، وزراعة الخلايا الجسدية لمبيض الفأر

ملخص

نحن نصف طرق عزل الخلايا الجسدية لمبيض الفئران عن جزء مليء بالستروما من المبيض، ولتوليد عضويات جسدية في مبيض الفأر باستخدام نهج خال من السقالات.

الملخص

يتكون المبيض من مجموعات غير متجانسة من الخلايا الجسدية، داخل البصيلة والستروما المحيطة، وهي ضرورية لدعم وظيفة المبيض ولتوليد الأمشاج عالية الجودة. نبلغ عن طرق عزل الخلايا الجسدية عن المبايض الفئرانية، بما في ذلك الخلايا البطانية، والخلايا الظهارية، والمسببة للستيرويد، والسترومال، والخلايا المناعية. عندما يتم طلاء هذه الخلايا الجسدية الأولية للمبيض وزراعتها في نظام زراعة ثنائي الأبعاد تقليدي، تفقد التباين الخلوي والتنظيم وكذلك التفاعلات بين الخلايا ومصفوفة الخلايا التي توجد عادة في المبيض. لذا، نصف أيضا كيفية توليد عضويات جسدية في مبيض الفأر باستخدام نهج خال من السقالات. تتجمع هذه الأعضاء ذاتيا، وتحافظ على تجمعات خلايا متنوعة، وتنتج مصفوفة خارج الخلية وعوامل إفراز، بما في ذلك السيتوكينات. يمكن استخدام العضويات في تجارب الزراعة المشتركة ويمكن الحفاظ عليها في الزراعة لمدة لا تقل عن 3 أسابيع مع صلاحية عالية للحياة. بشكل عام، تتيح هذه النماذج استجواب فسيولوجيا المبيض والأمراض من منظور الخلية الجسدية.

المقدمة

على الرغم من أن البويضة أو الأمشاج الأنثوي ضرورية لتكوين الجيل التالي، إلا أن مجموعات الخلايا الجسدية في المبيض تلعب أدوارا حاسمة في تطور الأمشاج، وإنتاج هرمونات الستيرويد، وتوازن المبيض. تشكل البويضات، المحاطة بالخلايا الحبيبية الجسدية وخلايا الثيكا، الوحدات الوظيفية للمبيض المعروفة بالجريبات. خلايا الحبيبات متصلة فعليا بالبويضة عبر البروزاتات عبر المناطق وتوفر دعما أيضيا ومغذيا للبويضة بالإضافة إلى تنظيم توقف الانقسام ^1,2. علاوة على ذلك، استجابة للغدد التناسلية، تنتج خلايا الغرانولوزا والثيكا هرمونات الستيرويد، بما في ذلك الإستروجين والبروجسترون والأندروجينات، والتي لها تأثيرات تتجاوز الجهاز التناسلي، وتؤثر على الجهاز القلبي والأوعية الدموية والعضلية والعصبية، وبالتالي تؤثر على الصحة العامة للمرأة³. تتطور بصيلات المبيض داخل جبات مبيضية غير متجانسة تتكون من الأوعية الدموية، وخلايا المناعة، وعدة مجموعات من الخلايا الليفية الخلالية، وخلايا الميزانشيم، بالإضافة إلى مصفوفة خارج الخلية (ECM^{) منظمة} للغاية. يوفر هذا البيئة الدقيقة للبحوض إشارات فيزيائية وكيميائية تؤثر على نمو الجريبات، والإباضة،^{واللوتين}.

توجد عدة طرق لعزل وزراعة الأمشاج والجريبات في المختبر، وقد طورت هذه الطرق فهمنا لتكوين البويضات وتكوين الجريبات⁵. ومع ذلك، فإن الحجرة الجسدية للمبيض غير مدروسة نسبيا، جزئيا بسبب نقص النماذج المخبرية القوية. النماذج الحالية لقسم المبيض الجسدي تقتصر إلى حد كبير على نوع خلية واحد، مثل الخلايا الليفية، ظهارة سطح المبيض، البطانة، المناعة، أو خلايا الحبيبات ^{6,7,8,9,10,11}. تفضل زراعة الخلايا الجسدية الأولية المبيضة ذات المعرفة الواسعة في الأبعاد ثنائية الأبعاد مجموعات البلاعم مع مرور الوقت، مما يؤدي إلى فقدان التغاير الخلوي¹². علاوة على ذلك، لا تسمح الزراعة التقليدية ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) بتفاعلات الخلايا والخلية المتنوعة التي توجد في المبيض. تحافظ إخراج أنسجة المبيض على تعقيد الخلايا والبنية للنسيج الأصلي لكنها تختلف في تركيبها حسب مكان اشتقاقها داخل المبيض ^13,14.

العضويات هي نسخ ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد)، متعددة الخلايا، مصغرة من الأعضاء أو الأنسجة، تعيد تنظيم الجسم الحي وتعمل^15,16. يمكن توليد الأعضاء من الخلايا الجذعية أو الخلايا الأولية المعزولة من نسيج طبيعي أو مريض¹⁵. في سياق الجهاز التناسلي الأنثوي، تم توليد عضويات لنمذجة بطانة الرحم وقناة فالوب وعنق الرحم والمشيمة¹⁷. ومع ذلك، فيما يتعلق بالمبيض، حتى وقت قريب، كانت نماذج العضوية تقتصر على نوع خلية واحد فقط، مثل الخلايا الظهارية أو الخلايا السرطانية في سطح المبيض، أو تم توليدها من خلايا جذعية متعددة القدرات مستحثة لتشبه هياكل الجريبات بدلا من السدى المبيض^17,18. وقد أنشأت الدراسات الحديثة وصنفت عضويات باستخدام مجموعات غير متجانسة من الخلايا الجسدية المعزولة من أنسجة الفأر، ومقر الريسوس، وأنسجة المبيض البشرية 19,20,21. مكنت هذه النماذج العضوية من دراسة الآليات الخلوية الكامنة وراء شيخوخة المبيض، بالإضافة إلى تأثيرات التعرض للفثالات على تركيبة ECM^19,21.

نظرا للأهمية الحاسمة للخلايا الجسدية، سواء في الجريبات أو في الستروما، لوظيفة المبيض، فإننا نسفي طرقا لعزل الخلايا الجسدية عن جزء غني من مبايض الفئران وزراعتها في المختبر باستخدام زراعة أحادية الطبقة التقليدية أو في نموذج عضوي. باستخدام قوالب أغاروز الدقيقة الخالية من السقالات، تشكل الخلايا الجسدية المبيضية عضويات خلال 1–3 أيام. تحافظ العضوية على مجموعات الخلايا الرئيسية في المبيض، بما في ذلك الخلايا الليفية، والبلاعميات، والخلايا المجنبة للستيرويد، ويمكن زراعتها لمدة تصل إلى 3 أسابيع مع صلاحية عالية للبيا. العضويات الجسدية المبيضية مناسبة للتقييمات النصية والنسيجية، وتحليل الأوساط المشرفة، والزراعة المشتركة مع أنواع الخلايا الأخرى، وطرق الفحص المركبات. بشكل عام، تعد هذه الأعضاء نموذجا قويا للاستجواب الصناعي وتعديل الحجرة الجسدية في المبيض، ويمكن تطبيقها على دراسة تطور المبيض، والشيخوخة، وعلم وظائف الأعراض، والأمراض.

البروتوكول

تم استخدام الحيوانات لتطوير هذا البروتوكول وفقا للجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة نورث وسترن وإرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المخبرية (رقم ضمان رفاهية الحيوان بجامعة نورث وسترن: A3283-01؛ معرف بروتوكول IACUC: IS00013082_IM12). معلومات المصنعين وأرقام الكتالوج لجميع المواد، بما في ذلك قوالب السيليكون لقوالب الأغاروز الدقيقة، والوسائط، والمكملات، مذكورة في جدول المواد. يتم عرض نظرة عامة على خطوات البروتوكول في الشكل 1. يجب تنفيذ جميع خطوات البروتوكول باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة، وامتثالا لجميع لوائح السلامة البيولوجية والصحة والسلامة البيئية المؤسسية، وإذا لم يذكر خلاف ذلك، ضمن خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.

الشكل 1: مخطط عزل الخلايا الجسدية في مبيض الفأر، توليد الأعضاء الجسدية في المبيض، والتطبيقات التالية. يتم عزل مبايض الفئران ويتم إثراء الجزء الفمومي. يتم هضم الجزء الغني من العضلات العضلية إنزيميا وميكانيكيا. الأنسجة غير المهضومة تصفى. يتم تجميع الخلايا بالحبيبات، وغسلها، وعددها، وطلاءها للزراعة ثنائية الأبعاد. لتوليد العضويات، بعد زراعة ثنائية الأبعاد طوال الليل، يتم جمع الخلايا باستخدام التربسين ويتم تثبيتها وغسلها وعددها. تزرع الخلايا في قوالب صغيرة من الأغاروز لزراعة العضويات. يمكن استخدام العضويات في علم الأنسجة، واستخراج الحمض النووي الريبي/البروتين، وتحليل الوسائط المشرطة، والعلاجات، وفحص الأدوية، بالإضافة إلى الزراعة المشتركة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. تحضير الأوساط لعزل وزراعة الخلايا الجسدية المبيضية

ملاحظة: يتطلب هضم أنسجة المبيض والعزل والزراعة اللاحقة للخلايا الجسدية الأولية أربعة أنواع من الوسط: وسائط تشريح (DM؛ تستخدم في الخطوات 2.3–2.4 لتشريح وثقب مبايض الفئران)، الأوساط الإنزيمية (EM؛ تستخدم في الخطوات 2.5–2.8 للهضم الإنزيمي لمبايض الفئران الغنية بالسترومات)، وسط التبريد (QM؛ استخدم في الخطوة 2.9 لإبطاء الهضم الإنزيمي)، ووسائط الطلاء (PM؛ المستخدمة في الخطوات 2.11–2.14 والخطوة 4.6 لغسل، والطلاء، والزراعة ثنائية الأبعاد لخلايا المبيض الجسدية الأولية، بالإضافة إلى تعطيل التربسين عند حصاد الخلايا من الزراعة ثنائية الأبعاد). يجب تجهيز جميع الوسائط في خزانة أمان بيولوجي من الفئة الثانية المعقمة أو غطاء تدفق طبقي. وصفات الوسائط المدرجة أدناه كافية لمعالجة المبايض من 5 إلى 6 فئران، ولكن يجب تحجيمها حسب الحاجة. يمكن تحضير جميع الأوساط قبل أسبوع وتخزينها عند 4 درجات مئوية، لكن يجب إضافة إنزيمات الEM طازجة في يوم عزل الخلايا.

1. حضر DM (15 مل) يحتوي على 1٪ مصل بقري جنيني (FBS) و0.5٪ بنسلين-ستربتوميسين (PS) في وسط L-15 من ليبوفيتز. قم بتعقيم الوسائط باستخدام فلتر معقم.
   ملاحظة: يتم تخزين DM لتبادل الهواء المحيط ويستخدم أثناء التشريح الدقيق للمبيض من الأنسجة المحيطة، بالإضافة إلى إثراء الجزء البترومي.
2. جهز EM (10 مل) يحتوي على 1٪ FBS و0.5٪ PS في αMEM. أضف 82 وحدة إنزيمية/ملتر من كولاجناز IV و0.2 ملغ/مل من DNase I (≥400 وحدة نشاط إنزيمي/ملغ). قم بإذابة الإنزيمات عن طريق عكس الوسط ثم تعقيم الوسط باستخدام مرشح معقم.
   ملاحظة: الوسط الإنزيمي هو بيكربونات الصوديوم مخبأ لتبادل الهواء عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون_{ويستخدم} للهضم الإنزيمي لقطع أنسجة المبيض.
3. حضر QM (20 مل) يحتوي على 10٪ FBS و0.5٪ PS في وسط αMEM. قم بتعقيم الوسائط باستخدام فلتر معقم.
   ملاحظة: الكيموم الكم هو مخبأ ببيكربونات الصوديوم لتبادل الهواء عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ويستخدم لتبريد الهضم الإنزيمي.
4. حضر PM (30 مل) يحتوي على 10٪ FBS و1٪ PS في RPMI 1640 (يحتوي على 25 ملليمولار HEPES و2 مللي مولار L-جلوتامين). قم بتعقيم الوسائط باستخدام فلتر معقم.
   ملاحظة: PMهو مخزن ببيكربونات الصوديوم لتبادل الهواء عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون_{ويستخدم} لتغطية خلايا المبيض الجسدية الأولية، وكذلك للزراعة في 2D.

2. هضم أنسجة المبيض وعزل الخلايا الجسدية الأولية

ملاحظة: يتم عزل مبايض الفئران وهضمها إنزيميا وميكانيكيا لعزل الخلايا الجسدية الأولية. يمكن معالجة مبايض 5–6 فئران معا في نفس الطبق. يجب تنفيذ الخطوات التالية باستخدام تقنية المعقم، ويفضل استخدام مجهر تشريح في غطاء تدفق طبقي.

1. أضف 10 مل من EM، و20 مل من QM، و20 مل من PM في أطباق بتري منفصلة بحجم 100 مم. توازن الأطباق في حاضنة زراعة الأنسجة (بيئة رطبة، 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_{) لمدة} ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
2. استخدم DM دافئ في حمام ماء (37 درجة مئوية) قبل الاستخدام.
3. قم بتشريح مبايض الفئران إلى طبق بتري بحجم 35 مم يحتوي على 3 مل من DM. افصل المبايض عن النسيج الدهني الملحق، وقناة البيض، والجراب المبيضي باستخدام ملقط ذو أطراف دقيقة و/أو مقص دقيق (الشكل 2Ai,ii). استخدم مجهر تشريح حسب الحاجة للتشريح الدقيقي.
4. انقل المبايض المقطعة إلى زجاج ساعة بحجم 45 مم مع 2–3 مل من DM. تحت المجهر التشريحي، قم بتثبيت وثقب جميع مناطق المبايض باستخدام إبر الأنسولين 28-G باليدين غير المسيطرة والسائدة على التوالي لمدة تقارب 10 دقائق. قم بتدوير نسيج المبيض بشكل متكرر لضمان تشويش جميع المناطق.
   ملاحظة: ثقب المبايض يثري الجزء البترومي عن طريق إطلاق جريبات ما قبل الشرط بالإضافة إلى مركبات البويضات الركامية وخلايا الحبيبات من الجريبات الشرجية (الشكل 2Aiii–iv).
5. استخدم ملقط رفيع الأطراف لنقل مبايض الفئران الغنية بالستروم إلى طبق بتري مع EM متوازن (الشكل 2Bi).
6. تعمل بسرعة لتقليل تغيرات درجة الحرارة ودرجة الحموضة في الوسط، حيث تمزق المبايض الغنية بالستروما إلى قطع بحجم حوالي 2–3 مم باستخدام ملقط رفيع الأطراف (الشكل 2Bii).
7. أمسك طبق بتري بزاوية وكرر الماصة التي تحتوي على قطع نسيج المبيض باستخدام ماصة p1000، مضبوطة على 1 مل، 100× أو لمدة 3 دقائق أيهما يأتي أولا (الشكل 2Biii). لف طبق بتيري حسب الحاجة للتأكد من أن جميع قطع المناديل تم تثبيتها بالماصة.
   ملاحظة: إذا كان النسيج كبيرا جدا بحيث لا يمكن رشه برأس p1000، يمكن قطع الطرف بمشرط معقم لجعل الفتحة أوسع. يجب أن يكون التجويف عريضا بما يكفي للسماح لمعظم (>50٪)، ولكن ليس كل، قطع الأنسجة بالدخول، مما يخلق تأثير القص.
8. نقل طبق بتري الذي يحتوي على قطع الأنسجة الكهرومغناطيسية والمبيض إلى حاضنة زراعة الأنسجة (بيئة رطبة، 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂) وحضن لمدة إجمالية 30 دقيقة، مع إزالة الطبق واستخدام الماصات مرارا وتكرارا (100× أو لمدة 3 دقائق) بعد 15 دقيقة، ثم مرة أخرى في نهاية فترة الحضانة التي تستمر 30 دقيقة (الشكل 2Biii).
   ملاحظة: بعد أول 15 دقيقة من الحضانة، يجب هضم قطع الأنسجة بما يكفي بحيث تمر >80٪ من القطع عبر رأس الماصة p1000 دون الحاجة لقطع الطرف لجعل الفتحة أوسع. تعتمد المدة الإجمالية للهضم وكمية الماصات المطلوبة على حجم البداية لقطع الأنسجة الممزقة. علاوة على ذلك، فإن عمر وإجهاد الفأر، والتغير الكبير في نشاط الإنزيمات، وحجم قطر الماصة يمكن أن يؤثر كلها على معدل تحلل الأنسجة. يجب أن يتم تبريد الهضم عندما يتم تفكيك قطع نسيج المبيض إلى شظايا بحجم حوالي 1 مم لا تزال مرئية بالعين (الشكل 2Biv). قد يؤدي فرط الهضم إلى فقدان الخلايا وانخفاض قدرة الحيوان على البقاء.
9. قم بتخفيف الإنزيمات لإبطاء هضم الأنسجة بإضافة 20 مل من الكيميوم المسبق التوازن (الشكل 2Ci).
10. مرر تعليق الخلية عبر مصفاة خلية بقطر 40 ميكرومتر موضوعة فوق أنبوب مخروطي بحجم 50 مل لإزالة قطع الأنسجة غير المهضومة (الشكل 2Cii). قم بعمل الطرد المركزي على جهاز الترشيح عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكوين الخلايا (الشكل 2C3).
11. غسل الخلايا بإزالة المادة الفائقة عن طريق الشفط، وإعادة تعليق الحبيبات الخلوية في 1 مل من PMالمتوازنة مسبقا، ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل، والطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإعادة الحبيبات (الشكل 2Civ).
12. أزل الفائق، وأعد تعليق الحبيبات الخلوية في 1 مل من PM، وصبغ 10 ميكرولتر من الخلايا بتقنية تريبان بلو لتقييم بقاء الخلايا، وعد الخلايا باستخدام جهاز قياس الدم.
    ملاحظة: راجع الجدول 1 للأعداد المتوقعة لخلايا المبيض الجسدية الأولية، اعتمادا على سلالة الفأر وعمرها، في هذه المرحلة من بروتوكول العزل. يجب أن تكون قدرة الخلايا على قيد الحياة في هذه المرحلة >80٪.
13. قم بتغليف الخلايا على وعاء معالج بزراعة الأنسجة بكثافة تقارب 1.25 × 10 5-1.5 × ^{10 5}/سم^مربع (على سبيل المثال، لعدد الخلايا حوالي 3 × 10⁶، خلايا الألواح على طبق معالج بزراعة الأنسجة بحجم 60 مم، وللعدد الخلوي الذي يبلغ حوالي 1 × 10⁶، خلايا الألواح على بئر واحد من صفيحة ذات 6 آبار معالجة بزراعة الأنسجة).
    1. أضف كمية إضافية من PM حسب الحجم الكلي للطبق أو الطبق (مثلا، أضف 4 مل إضافية من PM إذا كنت تستخدم طبقا بحجم 60 مم أو 2 مل إضافية من PM إذا كنت تستخدم بئر من لوح بسعة 6 آبار).
       ملاحظة: كثافة الطلاء المذكورة أعلاه موصى بها إذا كانت الخلايا ستستخدم لتوليد العضوية بعد الزراعة ثنائية الأبعاد خلال الليل. بالنسبة لزراعة ثنائية الأبعاد أطول، يمكن طلاء الخلايا بكثافة أقل. يمكن تخزين وسائط الطلاء الإضافية التي لم تتوازن في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. يطلب PMs لتوليد الأعضاء وللحفاظ على الخلايا الجسدية المبيضية في الزراعة ثنائية الأبعاد. في هذه المرحلة من البروتوكول، يمكن الحفاظ على الخلايا الجسدية المبيضية في مزرعة أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد (الخطوة 2.14) أو يمكن استخدامها لتوليد الأعضاء (تابع إلى القسم 3). الزراعة ثنائية الأبعاد خلال الليل قبل تكوين العضويات ضرورية لإزالة أي بويضات من الجريبات في المرحلة المبكرة التي قد تكون مرت عبر مصفاة الخلايا التي تبلغ 40 ميكرومتر.
14. بعد الطلاء طوال الليل (على الأقل 16 ساعة)، اغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS؛ خالي من المغنيزيوم/الكالسيم، pH 7.0–7.3) لإزالة الخلايا الميتة والحطام (الشكل 3A). أضف مشروب بريد جديد بعد الغسيل واستبدل الوسائط بجهاز PM جديد كل يومين في جميع أنحاء الثقافة (الشكل 3B).
    ملاحظة: على الرغم من القدرة العالية على بقاء الخلايا بعد العزل، يلاحظ عادة انخفاض كبير في إجمالي عدد الخلايا بعد الطلاء طوال الليل إما بسبب موت الخلية أو عدم القدرة على الالتصاق بوعاء زراعة الأنسجة (الشكل 3A).

الشكل 2: مخطط عزل الخلايا الجسدية في مبيض الفأر. (أ) صور تمثيلية ل (1,2) تشريح مبيض الفأر و(3,4) إثراء السترومات. يتم تحديد مبيض الفأر بخط متقطع في Ai. (B) صور تمثيلية لقطع أنسجة المبيض طوال الهضم الميكانيكي والإنزيم. المبايض الغنية بالسدى (1) قبل و(2) بعد التمزق، (3) قطع نسيج المبيض أثناء التمزق، و(4) قطع أنسجة المبيض بعد الهضم. (ج) صور تمثيلية ل (1) تبريد الهضم، (2) ترشيح تعليق الخلية، و(3,4) تفريغ الخلايا الجسدية المبيضية الأولية. تظهر الفروع في CII وCiii قطع نسيج غير مهضومة تم التقاطها بواسطة مصفاة الخلية وحبيبات الخلية بعد الطرد المركزي على التوالي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: يمكن زراعة الخلايا الجسدية الأولية للمبيض بشكل ثنائي الأبعاد. (أ) صور الضوء الممثلة لخلايا المبيض الجسدية الأولية المطلية في طبق 60 مم بعد 16 ساعة من الطلاء قبل وبعد الغسل باستخدام PBS. (ب) صور ضوئية ممثلة لخلايا المبيض الجسدية الأولية مطلية في صفيحة مكونة من 24 بئر على مدى 3 أيام في الزراعة. أشرطة المقياس = 400 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. تحضير قوالب الأغاروز الصغيرة والوسائط لتوليد وزراعة الأعضاء

ملاحظة: يتم توليد وزراعة الأعضاء الجسدية المبيضية في قوالب دقيقة من الأغاروز الخالية من السقالات مع وسائط عضوية مبيضية. يجب تحضير قوالب الأغاروز الدقيقة والوسائط العضوية المبيضة باستخدام تقنية المعقمة في خزانة أمان بيولوجية معقمة من الفئة الثانية أو غطاء تدفق طبقي.

1. تحضير قوالب الأجاروز الصغيرة
   1. ضع قوالب السيليكون الخاصة بالمولدات الدقيقة وملقط جرايف في كيس تعقيم وجهاز تعقيم باستخدام دورة جفاف للتعقيم (ضغط الغلاف: 20 رطل لكل بوصة مربعة، درجة حرارة الحجرة: 250 درجة فهرنهايت (121.11 درجة مئوية)، وقت التعقيم: 15 دقيقة).
      ملاحظة: يمكن تعقيم عدة قوالب سيليكون واستخدامها في وقت واحد لتوليد أسرع لقوالب الأغاروز الدقيقة.
   2. أضف 1 مل من PBS يحتوي على 1٪ PS إلى كل بئر من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا لتخزين قوالب الأغاروز الدقيقة.
   3. قم بإذابة 1.5٪ (مع الجهد) من الأغاروز المعقم في PBS عن طريق التسخين في الميكروويف، أو في حمام ماء ساخن، أو على صفيحة ساخنة.
      ملاحظة: إذابة الأغاروز عن طريق تسخين الأغاروز في أنبوب مخروطي بسعة 50 مل في كأس بسعة 100 مل مملوء بالماء يعمل بشكل جيد (الشكل 4Ai). بالإضافة إلى السماح بالغلي المسيطر عليه، فإن حمام الماء الساخن الناتج في الكأس يبطئ إعادة تصلب الأغاروز.
   4. اترك السائل يبرد حتى يصل إلى حوالي 50 درجة مئوية حتى يصبح الأنبوب مريحا.
   5. قم بعمل ماصة ببطء بحجم 300–350 ميكرولتر من 1.5٪ أغاروز في قالب السيليكون، مع التأكد من عدم ملء أو ملء ناقص الصب وتجنب تكوين فقاعات (الشكل 4Aii). تأكد من أن الأجاروز يخلق طبقة مسطحة في أعلى القالب بدلا من حافة مقعرة أو محدبة (الشكل 4Aiii,iv). فرقعة الفقاعات باستخدام رأس ماصة p10 المعقمة قبل أن يبدأ الأجاروز في التصلب (الشكل 4Bمن i–iii).
   6. دع الأغاروز يتصلب في قالب السيليكون لمدة 2–3 دقائق عند درجة حرارة الغرفة (الشكل 4Biv).
   7. بعد أن يصبح صلبا، اقلب السيليكون المصبوب فوق بئر من لوح زراعة الأنسجة المكون من 24 بئر يحتوي على PBS + 1٪ PS. قم بثني السيليكون بعناية لإطلاق القالب الدقيق للأجاروز داخل الصفيحة (الشكل 4Ci).
      ملاحظة: يمكن تخزين قوالب الأجاروز الدقيقة المغمورة في PBS +1٪ PS في صفيحة زراعة أنسجة مكونة من 24 بئرا ملفوفة بطبقة بارا فيلم عند 4 درجات مئوية حتى شهر قبل الاستخدام (الشكل 4Cii). يجب تحضير قوالب الأغاروز الدقيقة قبل الاستخدام ب 16 ساعة على الأقل، حيث غالبا ما تحتوي الآبار الصغيرة على فقاعات هواء فور الصب والغمر في PBS + 1٪ PS (الشكل 4Ciii). ومع ذلك، تتبدد هذه الفقاعات الهوائية أثناء التخزين (الشكل 4Civ). قبل الاستخدام في الزراعة العضوية، يجب فحص إدخالات البئر الدقيقة للأغاروز بعناية تحت المجهر للتأكد من أن الآبار الدقيقة لم تندمج أو تتأثر أثناء الصب (الشكل 4Di–iv). لا ينصح باستخدام القوالب الدقيقة المعيبة لتوليد وزراعة العضويات. يوصى بأن يكون هناك فائض من عفن الأجاروز الدقيق لتعويض ~25٪ من العيوب
2. تحضير وسائط العضوية المبيضية
   1. في خزانة السلامة البيولوجية، أضف مكملات وسطاء نمو العضوية (Mouse) 1 و2 و1٪ PS إلى الوسط الأساسي حسب تعليمات الشركة المصنعة. خزن وسط العضوية المبيضية المحضر عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين قبل الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن جمع المكملات 1 و2 وتخزينها عند -20 درجة مئوية.

الشكل 4: تحضير النماذج الدقيقة لعرض القوالب الدقيقة للأغاروز. (أ) صور تمثيلية ل (1) تحضير 1.5٪ للأغاروز، (2) الحقن في قوالب سيليكون، (3) ملء صحيح، و(4) صب السيليكون المملوء بشكل زائد. تظهر الخطوط المتقطعة في Aiii و AIV قيعان مسطحة ومحدبة لقوالب الأغاروز الدقيقة على التوالي. (ب) صور تمثيلية ل (i,ii) قوالب السيليكون المملوءة بالفقاعات في الأغاروز، (3) فقاعات تفرقع بطرف الماصة قبل تصلب الأغاروز، و(4) قالب دقيق متصلب من الأغاروز داخل صب السيليكون. (ج) صور تمثيلية ل (1) إزالة قوالب الأجاروز الدقيقة المتصلبة من قوالب السيليكون، (2) تخزين قوالب الأغاروز الصغيرة في صفيحة ب 24 بئر تحتوي على PBS + 1٪ PS، (3) الفقاعات الموجودة في الآبار الصغيرة مباشرة بعد الصب، و(4) قالب أغاروز المصبوب بشكل صحيح والخالي من الفقاعات بعد 16 ساعة من التخزين. (د) صور تمثيلية للقوالب الدقيقة مع (1,2) آبار مجمعة، (3) آبار معطلة، أو (4) أضرار. الاختصارات: PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات؛ PS = البنسلين-ستربتومايسين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. توليد وثقافة الأورجينويدات

ملاحظة: بعد الزراعة ثنائية الأبعاد خلال الليل، يتم جمع الخلايا الجسدية الأولية للمبيض من الزراعة ثنائية الأبعاد وتزرع في قوالب دقيقة من الأغاروز لإنتاج عضويات. يجب تنفيذ الخطوات التالية باستخدام تقنية المعقمة في خزانة أمان بيولوجية معقمة من الفئة الثانية.

1. دافئ ال PM والوسائط العضوية إلى 37 درجة مئوية في حمام ماء ودافئ 0.05٪ تريبسين إلى درجة حرارة الغرفة.
2. باستخدام ملقط جرافه، انقل القوالب الصغيرة بعناية إلى آبار صفيحة جديدة مكونة من 24 بئر (الشكل 5Ai).
3. أضف 500 ميكرولتر من وسط عضوي المبيض إلى كل بئر من صفيحة 24 بئر تحتوي على ميكرومولد أغاروز (الشكل 5Aii). تأكد من أن الميكرومولدات مغمورة بالكامل في الوسط ووازن القوالب الدقيقة والوسط لمدة لا تقل عن 30 دقيقة في الحاضنة (بيئة رطبة، 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_).
4. قم بإزالة PM من خلايا المبيض الجسدية الملتصقة عن طريق الشفط وغسل الخلايا ب PBS الخالي من الملغيزمات/الكالسيميليوم.
5. أضف 0.05٪ تريبسين (1–2 مل من التربسين لطبق بست آبار أو طبق 60 مم) لجمع الخلايا من الزراعة ثنائية الأبعاد. حضن الخلايا بالتربسين لمدة 2–3 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في الحاضنة.
6. تأكد من أن الخلايا انفصلت تحت المجهر وقم بتعطيل التربسين بإضافة مجلدين من PMالمسخن لكل حجم واحد من التريبسين المستخدم.
7. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي بسعة 15 مل، ثم قم بتفجير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند حرارة 300 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
8. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من PM، وصبغ مجموعة من الخلايا بلون تريبان بلو لتقييم بقاء الخلية، وعد الخلايا باستخدام جهاز قياس الدم الخلوي.
   ملاحظة: انظر الجدول 1 للأعداد المتوقعة لخلايا المبيض الجسدية الأولية، حسب سلالة الفأر وعمرها، بعد الزراعة ثنائية الأبعاد خلال الليل والتربسين اللاحق. عادة ما تكون صلاحية الخلايا التربسينية أكثر من 90٪.
9. قم بإزالة الخلايا عن طريق الطرد المركزي (300 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة) وإعادة تعليق حبيبات الخلية في وسط عضوي المبيض إلى كثافة 3.33 × 10⁶ خلايا حية لكل 1 مل من الوسط، أي 2.5 × 10⁵ خلايا حية لكل 75 ميكرولتر من الوسط.
   ملاحظة: هنا، يتم زرع 2.5 × 10⁵ خلايا في كل قالب أغاروز. لذا، سيعتمد العدد الإجمالي للقوالب الصغيرة التي يمكن توليدها على إجمالي عدد الخلايا. يمكن توليد العضويات بأقل من 2.5 × 10⁵ خلايا لكل مولد دقيق للأجوروز، لكن حجم العضويات، حركيات التجمع، التركيب الخلوي النسبي، والوظائف، بما في ذلك إنتاج الهرمونات، قد تتأثر.
10. أزل قوالب الأغاروز الدقيقة المتساوية من الحاضنة، وتأكد من أن القوالب المجهورة موجهة بحيث تكون غرفة البذر للخلية موجهة للأعلى، وإزالة وسط العضويات المبيضية من غرف البذر الخلوية (الشكل 5Aiii).
    1. إزالة الوسائط من غرف البذر الخلوية في القوالب الدقيقة باستخدام ملقط جرايف لرفع وإمالة القوالب الدقيقة أو عن طريق التقطيع بالماصات. لإزالة الوسائط من غرف البذر الخلوية عن طريق التسديد بالماصة، قم برفع رأس الماصة بلطف فوق زاوية غرفة البذر أثناء سحب الوسط. لا تلامس مباشرة مولد الأغاروز الدقيق لتجنب تعطيل الآبار الدقيقة.
       ملاحظة: يجب أن تكون غرف بذر الخلايا جافة قدر الإمكان، بحيث تكون الآبار الصغيرة مرئية بالعين، لكن الجزء الخارجي من العفن الدقيقة يجب أن يظل محاطا بوسائط عضوية المبيض (الشكل 5Aiii).
11. قم بتوزيع 75 ميكرولتر من تعليق الخلية (أي 2.5 × 10⁵ خلايا) مباشرة إلى غرفة البذر الخلوية لكل مولد دقيق للأغاروز وتجنب تكوين فقاعات (الشكل 5Bi). أعد لوحة 24 بئرا إلى الحاضنة.
12. بعد ساعة إلى ساعتين من بذر الخلايا، أضف 250 ميكرولتر إضافية من وسائط عضوية المبيض الدافئة حول الجزء الخارجي من قوالب الأغاروز الدقيقة، مع الحرص على عدم إزعاج غرف البذر الخلوية (الشكل 5Bii).
    ملاحظة: يجب أن تبدأ الخلايا الجسدية المبيضية الأولية في التجمع خلال ساعة إلى 24 ساعة بعد البذر في قوالب الأغاروز الصغيرة (الشكل 5Biii).
13. استبدل الوسط المحيط بقوالب الأغاروز الصغيرة ب 750 ميكرولتر من الوسائط العضوية المبيضية الطازجة في اليوم التالي لزراعة الخلايا ثم كل يومين في جميع أنحاء الزراعة.
    1. لتغيير الوسط، أمسك اللوحة بزاوية طفيفة لإزالة الوسائط المستهلكة المحيطة بقوالب الأغاروز. لا تزيل الوسائط من غرف البذر الخلوي. قم بعمل ماصة جديدة بلطف نحو جدار البئر لتجنب إزعاج غرف زرع الخلية.
       ملاحظة: يمكن حفظ وتخزين الوسائط المعدلة الناتجة عن تغييرات الوسائط عند -80 درجة مئوية لتحليل العوامل المفرزة في العضويات. بمجرد تكوين العضويات (بعد يوم إلى ثلاثة أيام من بذر الخلايا)، يمكن استبدال الوسائط بوسائط تحتوي على بروتينات مؤتلفة ومثبطات وما إلى ذلك، لفحص تأثيرات العلاجات المختلفة على وظيفة الأعضاء أو لفحص المركبات.

الشكل 5: مخطط لتوليد العضوية الجسدية في المبيض. (أ) صور تمثيلية ل (1) نقل ميكرومولفات الأغاروز إلى لوحة الزراعة باستخدام ملقط جرايف، (2) توازن عفن الأغاروز الدقيق في وسط عضوي المبيض، و(3) إزالة الوسائط من غرف الزرع الخلوي. السهم في Aiii يشير إلى غرفة بذور الخلايا الفارغة. (ب) صور تمثيلية ل (1,2) بذر الخلايا في قوالب دقيقة للأغاروز و(3) مسح ضوئي منقول لمولد أغاروز يحتوي على خلايا جسدية مبيضية متجمعة. شريط المقياس (Biii): 2500 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

5. استخدام العضوية في التطبيقات اللاحقة

ملاحظة: يمكن استخدام العضويات في مجموعة متنوعة من التطبيقات اللاحقة، بما في ذلك علم الأنسجة، وتطبيقات علم الأحياء الجزيئي (مثل تحليلات RNA/البروتينات)، وتحليل الأوساط المشرطة، والزراعة المشتركة.

1. علم الأنسجة
   ملاحظة: يمكن معالجة الأعضاء للنهايات النسيجة دون إزالتها من قوالب الأغاروز الدقيقة. في الواقع، تعمل الأعضاء داخل القوالب الدقيقة للأغاروز بطريقة مشابهة لمصفوفات الأنسجة، مما يسمح بتقييم نسيجي عالي الإنتاجية لعدة عضويات متباعدة بشكل متسق في وقت واحد.
   1. قم بإذابة 1.5٪ (مع الفتحة) من الأجاروز المعقم في PBS عن طريق الغلي.
   2. باتباع زراعة الأعضاء الجسدية المبيضية، يمسك الصفيحة بزاوية وأزل الوسط المحيط بقوالب الأغاروز الدقيقة.
   3. تحت مجهر تشريح، أزل الوسط من غرف بذر الخلايا عن طريق رفع رأس الماصة برفق فوق زاوية كل غرفة بذر خلية وسحب الوسط بعناية دون إزعاج الأعضاء أو تعطيل القالب الدقيق.
   4. تم تبريد الماصة بعناية بسعة 100–125 ميكرولتر من السائل 1.5٪ من الأجاروز إلى حوالي 50 درجة مئوية في زاوية كل غرفة بذر خلية لملء وإغلاق غرف البذر الخلية، مع الحرص على عدم إزعاج الأعضاء (الشكل 6Ai).
   5. اترك الأجاروز ليتصلب لمدة 2–3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   6. أضف 750 ميكرولتر من ديفيدسون المعدل أو 4٪ بارافورمالديهيد إلى كل بئر وثبت الأعضاء داخل قوالب الأغاروز المغلقة طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   7. بعد التثبيت، أزل المثبت واغسل قوالب الأجاروز الصغيرة بنسبة 70٪ إيثانول.
      ملاحظة: يمكن تخزين الميكرومولد في 70٪ إيثانول عند 4 درجات مئوية حتى يتم معالجة الأنسجة (الجفاف، التنظيف، وتسرب الشمع). أثناء معالجة الأنسجة، تابع اتجاه قوالب الأغاروز الدقيقة.
   8. بعد معالجة الأنسجة، قم بدمج قوالب الأغاروز الصغيرة في البارافين بحيث تكون العفن المجهرية مسطحة داخل كتل البارافين وتكون قاع القوالب الدقيقة هي الأولى التي يتم تقسيمها (الشكل 6Aii).
   9. قم بقطع كتل البارافين عند 5 ميكرومتر ووضع مقاطع الأنسجة على شرائح مجهر مشحونة.
      ملاحظة: يمكن رؤية وجود الآبار الصغيرة بالعين أثناء التقسيم، سواء في مقاطع الأنسجة أو في كتل البارافين (الشكل 6Aiii,iv). يمكن التحقق من وجود العضويات داخل أقسام العفن الدقيق من خلال فحص الشرائح المقسمة تحت المجهر (الشكل 6Av). بدلا من وضع 2–3 أقسام متتالية على نفس الشريحة، فإن وضع 2–3 أقسام تفصل كل منها 50 ميكرومتر (أي^{كل جزء} عاشري) على شريحة واحدة يزيد من احتمال تمثيل معظم العضويات في قسم واحد على الأقل في كل شريحة. تتكون الأعضاء متباعدة باستمرار داخل مقاطع الأنسجة، مما يزيد من سهولة التصوير بعد التلوين النسيجي (الشكل 6A vi).
   10. اترك الشرائح لتجف في الفرن عند حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل.
   11. تابع التلوين النسيجي أو الكيميائي المناعي أو تخزين الشرائح عند درجة حرارة^{الغرفة 19}.
2. حصاد العضويات لأغراض جزيئية
   ملاحظة: بعد الزراعة، يمكن إزالة العضويات من قوالب الأغاروز الصغيرة ومعالجتها لمجموعة متنوعة من تطبيقات علم الأحياء الجزيئي اللاحق، بما في ذلك استخراج الحمض النووي الريبي أو البروتين لتقييم تعبير الجينات أو البروتينات.
   1. أمسك اللوح الذي يحتوي على قوالب الأغاروز بزاوية طفيفة وقم بإزالة الوسط المحيط بقوالب الأغاروز عن طريق استخدام الماصات.
   2. أضف 750 ميكرولتر من PBS بدرجة حرارة الغرفة إلى الآبار التي تحتوي على قوالب الميكرو أجاروز.
   3. استخدم ملقط جرايف لعكس وتحريك قوالب الأغاروز الدقيقة لإطلاق الأعضاء في PBS المحيطة. تأكيد إطلاق الأعضاء من عفن الأغاروز الدقيق تحت المجهر.
   4. قم بإزالة قوالب الأغاروز الفارغة باستخدام ملقط جرايف وانقل PBS الذي يحتوي على الأعضاء إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق عن طريق التلوين.
   5. قم بإزالة الحبيبات العضوية عن طريق الطرد المركزي عند 10,000 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   6. إزالة المادة الفائقة عن طريق الشفط والتقدم إلى استخراج الحمض النووي الريبي أو البروتين. بدلا من ذلك، قم بتجميد الحبيبة بالفلاش وتخزينها عند -80 درجة مئوية¹⁹.
3. حفظ الوسائط العضوية المهيأة للتحليل
   ملاحظة: يمكن حفظ الوسائط المكيفة من العضوية في جميع أنحاء الزراعة لتحليل العوامل المفرزة للعضويات، بما في ذلك الهرمونات والسيتوكينات وعوامل النمو. تظهر النتائج التمثيلية من تحليل السيتوكينات في الأوساط العضوية المشروطة في الشكل 7A.
   1. أمسك اللوحة التي تحتوي على قوالب الأغاروز بزاوية طفيفة وإزالة الوسائط المكيفة المحيطة بالقوالب الدقيقة عن طريق التقطيع بالماصات. لا تزيل الوسائط من غرف البذر الخلوية لتجنب إزعاج الأعضاء العضوية.
   2. انقل الوسائط المعدلة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق ثم تابع تحليل الوسائط أو التجميد الفوري وتخزينه عند -80 درجة مئوية^19,22.
      ملاحظة: اختياريا، قم بطرد مركزي على الوسط المكيف بحرارة 10,000 × جرام لمدة 5 دقائق لإزالة أي خلايا أو حطام ميت. نقل المادة الفائقة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة قبل تحليل الوسائط أو تخزينها.
4. الزراعة المشتركة للأورجينويد
   ملاحظة: يمكن زراعة الأعضاء الجسدية المبيضية مع خلايا وأنسجة أخرى بعدة طرق. تظهر النتائج الممثلة من الزراعة المشتركة العضوية مع خلايا سرطان المبيض والجريبات، بالطرق الموضحة في الخطوتين 5.4.1 و5.4.3 على التوالي، في الشكل 7B,ج.
   1. لتوليد عضويات باستخدام مزيج من خلايا المبيض الأولية في المبيض وأنواع أخرى من الخلايا لدراسة تأثيرات التفاعلات المباشرة بين الخلايا والخلية، اتبع الخطوات 5.4.1.1–5.4.1.4.
      1. اتبع الخطوات 4.1–4.9 لغسل الخلايا الجسدية المبيضية الأولية بعد الزراعة ثنائية الأبعاد طوال الليل، وحصاد الخلايا من الزراعة ثنائية الأبعاد باستخدام 0.05٪ تريبسين، وحبيبات، والعد، وإعادة تعليق الخلايا في وسط عضوي المبيض بكثافة 2.5 × 10⁵ خلايا حية لكل 75 ميكرولتر من الوسط.
      2. إذا كان النوع الآخر من الخلايا الملتصقة، احصد الخلايا من مزرعة ثنائية الأبعاد. عد الخلايا، وقم بإطلاقها بالطرد المركزي، وأعد تعليقها في وسط عضوي المبيض بكثافة 2.5 × 10.5 خلايا حية لكل 75 ميكرولتر من الوسط.
      3. اجمع بين تعليق الخلايا الجسدية المبيضية الأولية مع تعليق النوع الآخر من الخلايا ذات الاهتمام بنسبة معروفة.
      4. اتبع الخطوات 4.10–4.13 لزرع تعليق الخلية الناتج في قوالب دقيقة للأجاروز وعضويات زراعية.
   2. لنقل قوالب الأغاروز الدقيقة التي تحتوي على عضويات متشكلة إلى صفائح 24 بئرا تحتوي على خلايا أو عضويات أخرى، اتبع الخطوات 5.4.2.1–5.4.2.4.
      ملاحظة: لتقييم تأثيرات العوامل المشتقة من العضوية العضوية على أنواع الخلايا الأخرى والعكس صحيح، يمكن أن تبقى العضويات المكونة داخل قوالب الأغاروز الدقيقة، ويمكن نقل عفن الأغاروز الدقيقة بالكامل إلى صفيحة تحتوي على 24 بئر تحتوي على خلايا أو عضويات أخرى. يمكن استخدام طرق الزراعة المشتركة هذه عندما يمكن استخدام وسائط عضوية المبيض لزراعة كلا نوعي الخلايا والأنسجة.
      1. وسط عضوي المبيض الدافئ حتى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
      2. امسك اللوحة التي تحتوي على قوالب الأغاروز بزاوية وقم بإزالة الوسط المحيط بقوالب الأغاروز عن طريق استخدام الماصرات.
      3. باستخدام ملقط جراف، نقل القوالب الصغيرة بعناية إلى صفائح 24 بئر تحتوي على خلايا أو عضويات أخرى.
      4. أضف 750 ميكرولتر من وسط عضوي المبيض الطازج لإحاطة قوالب الأغاروز الدقيقة.
   3. لإزالة العضويات المكونة من قوالب الأغاروز الدقيقة ونقلها إلى قوالب أغاروز الجديدة، اتبع الخطوات 5.4.3.1–5.4.3.13.
      ملاحظة: إذا لم تكن وسائط العضوية المبيضية هي الوسط المرغوب فيه لتجارب الزراعة المشتركة، فإن النموذج الموضح في الخطوة 5.4.2 يشكل تحديا لنقل كبير للوسط، نظرا لأن عفن الأغاروز الصغير مشبع بوسائط عضوية المبيض. يمكن نقل العضويات المتكونة (1-3 أيام بعد البذر الخلوي الأولي) من قوالب الأغاروز الدقيقة ونقلها إلى قوالب أغاروز الجديدة لزراعة إضافية أو زراعة مشتركة لمنع انتقال الوسط.
      1. سخن الوسط المطلوب للزراعة المشتركة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
         ملاحظة: تم استخدام وسائط قائمة على DMEM وαMEM وF12 بنجاح في تجارب الزراعة المشتركة مع الأعضاء الجسدية في المبيض.
      2. باستخدام ملقط جراف، انقل بعناية قوالب الأغاروز الجديدة من PBS +1٪ PS إلى آبار في صفيحة تحتوي على 24 بئر تحتوي على خلايا أو عضويات أخرى للزراعة المشتركة.
      3. تأكد من أن الميكرومولدات مغمورة بالكامل في الوسط، وأضف وسائط إضافية مرغوبة للزراعة المشتركة حسب الحاجة، وتوازن القوالب الصغيرة والوسط لمدة لا تقل عن 30 دقيقة في الحاضنة (بيئة رطبة، 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_).
      4. أمسك اللوحة التي تحتوي على قوالب الأغاروز الصغيرة ذات العضويات المشكلة بزاوية طفيفة وإزالة الوسط المحيط بقوالب الأغاروز عن طريق استخدام الماصات.
      5. أضف الوسط المطلوب للزراعة المشتركة حول قوالب الأغاروز الصغيرة مع العضويات المتشكلة.
      6. استخدم ملقط جرايف لعكس وتحريك قوالب الأغاروز الدقيقة لإطلاق الأعضاء في الوسط المحيط. تأكيد إطلاق الأعضاء من قوالب الأغاروز الدقيقة تحت المجهر.
         ملاحظة: إذا لم تتجمع الخلايا الجسدية الأولية في المبيض بشكل كاف، فقد لا تبقى العضوية سليمة عند إزالتها من عفن الأغاروز الدقيق. قد يستغرق تجميع العضويات من 1 إلى 3 أيام، حسب سلالة وعمر الفئران التي تم عزل خلايا المبيض الجسدية منها.
      7. إزالة قوالب الأغاروز الفارغة باستخدام ملقط جرايف وانقل الوسط الذي يحتوي على الأعضاء إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيق عن طريق استخدام الماصات.
      8. قم بالطرد المركزي بأجهزة العضوية على حرارة 300 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      9. تحت المجهر التشريحي، إزالة المادة الفائقة عن طريق التوصيل، تاركا 50–75 ميكرولتر من الوسائط التي تحتوي على الأعضاء العضوية.
      10. قم بإزالة القوالب الدقيقة المتساوية من الحاضنة وتأكد من أن القوالب المجهزة بحيث تكون غرفة البذر الخلوية موجهة للأعلى.
      11. قم بإزالة الوسائط من غرف البذر الخلوية باستخدام ملقط جرايف أو عن طريق التقطيع بالماصات.
          ملاحظة: يجب ألا تحتوي الآبار على أكثر من 500 ميكرولتر من الوسائط حتى يمكن تفريغ غرف بذر الخلايا من الميكرومولد.
      12. انقل الأعضاء العضوية مباشرة إلى غرفة البذر الخلوية لكل مولد أغاروز جديد عن طريق التقطيع بالماصات. أعد لوحة 24 بئرا إلى الحاضنة.
      13. بعد 1–2 ساعة، أضف 250 ميكرولتر إضافي من الوسط المطلوب حول الجزء الخارجي من قوالب الأغاروز الدقيقة، مع الحرص على عدم إزعاج غرف زرع الخلية.

الشكل 6: يتم حفظ أنواع الخلايا الرئيسية للمبيض في العضويات الجسدية للمبيض. (أ) صور تمثيلية ل (1) إغلاق القالب الدقيق بالأغاروز في نهاية الزراعة، (2) قالب دقيق غير مقطوع، و(3) قالب دقيق مقسم مدمن في كتلة بارافين. يمكن رؤية الآبار الدقيقة في (iv) أقسام مثبتة، ويمكن (v) تأكيد وجود الأعضاء داخل العفن الدقيق المقسمة تحت المجهر قبل (6) التلوين النسيجي. (ب) صور تمثيلية لمقاطع أنسجة المبيض في الفأر ومقاطع العضوية الجسدية في المبيض بعد التلوين الكيميائي المناعي باستخدام الأجسام المضادة ضد فيمنتين، F4/80، Foxl2، و3β-HSD. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: H&E = الهيماتوكسيلين والإيوزين. تم تكييف هذا الشكل بإذن من ديبالي وآخرين. ¹⁹. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: الزراعة المشتركة للعضويات الجسدية المبيضية مع الجريبات وخلايا سرطان المبيض. (أ) تم قياس إفراز السيتوكينات العضوية لكل قالب دقيق للأجاروز في اليوم الخامس من الزراعة، وتم تطبيعه إلى وسط مشروط من قوالب أغاروز بدون عضوات. N = 4 قوالب دقيقة من الأغاروز. (ب) صور الضوء الممثلة المنقولة لجريبات المبيض في الأيام 0 و4 و8 من الزراعة مع أو بدون عضويات (تحكم) و(1) مخطط لنموذج الزراعة المشتركة. أشرطة المقياس = 400 ميكرومتر. قياس (2) بقاء الجريبات و(3) النمو على مدى 8 أيام من الزراعة مع أو بدون (تحكم في العضويات). تعرض البيانات كمتوسط ± SD. بعض أشرطة الخطأ صغيرة جدا بحيث لا يمكن تصورها. N = 56 جريبا لكل مجموعة. **P < 0.01. (ج) صور الضوء المنقول (الأعلى) والفلورية (السفلية) لخلايا المبيض الجسدية الأولية التي زرعت بنسبة 10:1 مع خلايا سرطان المبيض الحمراء الموسومة ببروتين فلوري (OVCAR8-RFP) في الأعضاء في الأيام 1 و3 و5 من الزراعة. أشرطة المقياس = 400 ميكرومتر. الاختصار: RFP = بروتين فلوري أحمر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

6. نصائح لحل الأخطاء

1. المشكلة 1: عدد الخلايا الجسدية الأولية المعزولة في المبيض أقل من المتوقع.
   ملاحظة: إذا كانت شظايا نسيج المبيض أصغر باستمرار من 1 مم أو لا يمكن رؤيتها بالعين بعد الهضم الإنزيمي، فقد يكون عدد الخلايا المعزولة منخفضا بسبب انخفاض القدرة على البقاء بسبب فرط الهضم. إذا كانت شظايا أنسجة المبيض أكبر من 1 مم بعد الهضم الإنزيمي، فقد يكون عدد الخلايا المعزولة منخفضا بسبب ضعف هضم نسيج المبيض.
   1. إذا كانت شظايا نسيج المبيض أكبر من 1 مم بعد الهضم الإنزيمي، اتبع الخطوات 6.1.1.1–6.1.1.2.
      1. تأكد من أن كولاجناز IV و DNase I ضمن فترة الصلاحية الموصى بهما ولم يفقدا النشاط الإنزيمي بسبب التخزين غير المناسب أو، في حالة DNase I، تكرار دورات التجميد والذوبان.
      2. زيادة كمية التفريغ المتكرر في نسيج المبيض، تقليل حجم قطر رأس p1000 إذا تم قطعه لجعل الفتحة أوسع، و/أو زيادة وقت الحضانة في الEM.
   2. إذا كانت شظايا أنسجة المبيض أصغر بكثير من 1 مم بعد الهضم الإنزيمي، قلل من كمية التفريغ المتكرر في نسيج المبيض، وزيادة حجم قطر طرف p1000 عن طريق القطع لجعل الفتحة أوسع، و/أو تقليل إجمالي الحضانة في الكهرومغناطيسية.
2. المشكلة 2: أكثر من ~25٪ من قوالب الأجاروز المصبوبة بها عيوب
   1. تأكد من أن قالب السيليكون خال من أي بقايا من الأجاروز أو الحطام. إذا لزم الأمر، اغسل قوالب السيليكون ب PBS وأعد تعقيمه عن طريق التعقيم. إذا لزم الأمر، أعد تسخين 1٪ من الأغاروز المستخدم في الصب، لأن الأغاروز المتصلب، قد لا يملأ السيليكون بشكل موحد و/أو يؤدي إلى فقاعات.
   2. بمجرد إدخال القالب في القالب السيليكوني، دع الأجاروز يتصلب تماما، لأن إزالة المولد الدقيق للأجاروز من الصب المبكر قد يؤدي إلى تعطيل الآبار الدقيقة.
   3. تأكد من أن قوالب السيليكون ليست غير مكتئلة، لأن ذلك قد يقلل من سلامة هيكل القالب الدقيق للأغاروز، مما يؤدي إلى تلف عند ثني السيليكون لإزالة القالب الدقيق.
   4. بالإضافة إلى ذلك، توصي الشركة المصنعة لقوالب السيليكون بعدم تعقيمها أكثر من 12 مرة. إذا خضع قالب السيليكون لتعقيم مفرط، استبدله.
3. المشكلة 3: تفشل الأعضاء في التكوين في أكثر من 10٪ من الآبار الصغيرة
   1. تأكد من أن قوالب السيليكون ليست ممتلئة بشكل زائد عند صب قوالب الأغاروز، لأن ذلك قد يؤدي إلى توزيع غير منتظم للخلايا داخل الآبار الدقيقة، مما يفضل الآبار الدقيقة المركزية في قالب الأجاروز على الآبار الخارجية.
   2. تجنب تكوين فقاعات عند صرف نظام التعليق الخلوي في غرفة البذر الخلوية لقوالب الأغاروز الدقيقة، لأن الفقاعات قد تعطل توزيع الخلايا في الآبار الدقيقة.
   3. إذا لزم الأمر، ابدأ بتعليق خلوي يزيد عن 75 ميكرولتر (بكثافة 3.33 × 10⁶ خلايا حية لكل 1 مل) لكل ميكرومولد لضمان عدم تكون فقاعات بسبب نقص الحجم في طرف الماصة.
   4. زيادة الفاصل بين بذر الخلايا وإضافة وسائط عضوية المبيض إلى خارج المولد الدقيق للأغاروز لضمان وقت كاف لاستقرار الخلايا في الآبار الدقيقة.

النتائج

لتحديد تركيب الخلايا للعضويات الجسدية في المبيض، أجرينا الكيمياء النسيجية المناعية لأقسام الأنسجة العضوية بعد 6 أيام من الزراعة باستخدام الأجسام المضادة ضد أنواع خلايا المبيض الرئيسية. احتوت العضويات على الأروميات الليفية الموجبة للفيمنتين، والبلاعم الموجبة ل F4/80، بالإضافة إلى مجموعات الخلايا المسببة للستيرويدات (الشكل 6B)¹⁹. استخدمنا جسما مضادا ضد Foxl2 لتمييز خلايا الجرانولوزا والجرانولوزا-لوتين، بالإضافة إلى جسم مضاد ضد 3β-HSD لت...

المناقشة

تصف هذه الورقة طرقا لعزل الخلايا الجسدية الأولية للمبيض في الفأر من جزء مليء بالستروما في المبيض، بطريقة تحافظ على تباين الحجرة الجسدية للمبيض. يمكن زراعة الخلايا الجسدية لمبيض الفأر الأولية في طبقة أحادية ثنائية الأبعاد أو يمكن استخدامها لتوليد عضويات جسدية في المبيض باستخدام قوالب دقيقة غير مرتبة من السقالات. تحتوي قوالب الأغاروز الصغيرة على 96 بئرا دقيقة لتكون العضويات وتتناسب مع بئر واحد من صفيحة مكونة من 24 بئرا، مما يجعل هذه الطريقة عالية الإنتاجية لتوليد عدد كبير من الأعضاء العضوي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.2 μm, Polyethersulfone syringe filter	Corning	431229
1.5 mL microcentrifuge tubes	MIDSCI	PR-MCT15
100 mL glass beaker	Fisherbrand	FB100100
100 mm Petri dishes	Corning	351029
15 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	339651
24-well plates (TC-treated)	Corning	353047
28-gauge insulin needles	Exel International	26027
35 mm Petri dishes	Corning	351008
3β-HSD antibody	Cosmo Bio	K0607	1:1000
4% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	1574100
40 µm cell strainer	Corning	431750
45 mm watch glass	Electron Microscopy Sciences	7054345
50 mL concial tubes	ThermoFisher Scientific	339652
60 mL sterile syringe	Air-Tite	ML60
60 mm TC-treated plates	Corning	353037
6-well plates (TC-treated)	Corning	353046
Agarose	Hoefer	GR140-500	Gel strength >1200 g/cm2; Gel Temperature 36 °C
Autoclave sterilization pouch	Fisherbrand	01-812-55
Biotinylated Goat Anti-Mouse IgG	Vector Laboratories	BA-9200-1.5	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG	Vector Laboratories	PK-6101	1:200
Biotinylated Goat Anti-Rat IgG	Vector Laboratories	BA-9400-1.5	1:100
Bluing reagent	Fisherbrand	23-245681
Centrifuge with swing bucket rotor for 50 mL conical tubes	ThermoFisher Scientific	Sorvall X1R Pro-MD
Class II biosafety cabinet	The Baker Company	SG403A
Cleaved Caspase-3 (CC3) antibody	Cell Signaling Technology	9579T	1:250
CO2 incubator	ThermoFisher Scientific	Heracell VIOS 160i CO2 Incubator
Collagenase, Type IV, powder	Gibco, Fisher Scientific	17-104-019
C-Series Mouse Cytokine Antibody Array 3 Kit	RayBiotech	AAM-CYT-3-8
Cytoseal XYL	Epredia	83124
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Millipore Sigma	DN25-100MG	Dnase I
Dissecting microscissors	World Precision Instruments	WPI-14003
Dissecting scissors	World Precision Instruments	WPI-15922
Dissection microscope	Leica	MZ9.5, S9 series
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco, Fisher Scientific	14-190-250	pH 7.0–7.3
Eosin	Fisherbrand	23-314631
F4/80 antibody	Bio-Rad	MCA497G	1:50
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States	Gibco, ThermoFisher Scientific	10082147
Fine-tipped dissecting forceps	World Precision Instruments	WPI-14098
FOXL2 antibody	Abcam	ab246511	1:200
Graefe Forceps	Fine Science Tools	1105010
Hematoxylin	EK Industries	EKI 47971GL
Hemocytometer	MedOne	DHCN015
Imaging System	ThermoFisher Scientific	EVOS FL Auto
IntestiCult Organoid Growth Medium (Mouse)	STEMCELL Technologies	06005	Basal medium, Supplements 1 and 2
Laminar flow hood	IVFtech	IVFtech sterile workstation
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco, Fisher Scientific	11415114
Microscope slides	Mercedes Scientific	MER 7255/90/WH/CC
MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids	Millipore Sigma	Z764043-6EA	Silicone casts for agarose micromolds
Modified Davidson's Fixative	Electron Microscopy Sciences	6413350
OVCAR8-RFP cells			Gift from Joanna Burdette PhD, University of Illinois Chicago
Penicillin-Streptomycin	Millipore Sigma	P4333-100ML
Picrosirius Red staining solution	StatLab	STPSRPT
RPMI 1640 Medium (ATCC modification)	Gibco, Fisher Scientific	A1049101
Tabletop centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5430 R
Trypan blue	ThermoFisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco, ThermoFisher Scientific	25300054
Vimentin antibody	Cell Signaling Technology	5741S	1:100
αMEM, GlutaMAX Supplement, no nucleosides	Gibco, Fisher Scientific	32561102