مقالة مراجعة

تقدم البحث في استراتيجيات تقييم كفاءة إصلاح أضرار الحمض النووي

DOI:

10.3791/71031

⸱

يونيو 23, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College, 2School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 3Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 4Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تصنيف اختبارات كفاءة إصلاح تلف الحمض النووي بشكل عام إلى ثلاث مجموعات: اختبارات الوظيفة القائمة على الخلايا، والاختبارات الكيميائية الحيوية في المختبر ، وفحوصات العلامات الجزيئية. تمكن هذه الأساليب من التقييم النوعي أو الكمي لكفاءة الإصلاح عبر مسارات إصلاح تلف الحمض النووي المتعددة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتعرض الحمض النووي الجيني الخلوي باستمرار لعوامل داخلية وخارجية تسبب أشكالا مختلفة من تلف الحمض النووي. في الخلايا الثديية، قد يصل عبء تلف الحمض النووي اليومي إلى 104–10 أو 5 آفات لكل خلية. تلف الحمض النووي الذي يستمر حتى مرحلة S يمكن أن يؤدي إلى طفرات. عندما تحدث مثل هذه الطفرات في جينات الأورام أو جينات مثبط الأورام أو الجينات المشاركة في تكاثر الخلايا، قد تعزز التحول الخلوي وتكوين السرطانات. لذلك، يلعب إصلاح تلف الحمض النووي دورا حيويا في الحفاظ على استقرار الجينوم ومنع تطور السرطان. يتم تقييم قدرة إصلاح الحمض النووي بشكل أفضل من خلال قياس النشاط الوظيفي لأنظمة إصلاح الحمض النووي. مسارات إصلاح تلف الحمض النووي وفعاليتها ذات صلة كبيرة بتطوير الأدوية الكيميائية، والتحقق من وظائف الجينات، وعلاج السرطان. وبالتالي، فإن دراسة كفاءة إصلاح مسارات إصلاح تلف الحمض النووي الفردية لها أهمية نظرية وعملية مهمة. تلخص هذه المراجعة المسارات الرئيسية لإصلاح أضرار الحمض النووي، والأساليب المستخدمة لتقييم كفاءة الإصلاح، ومزايا وحدود هذه الأساليب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد نظام إصلاح تلف الحمض النووي آلية دفاع خلوية حيوية تحافظ على استقرار الجينوم من خلال تقليل تكرار الطفرات وقمع السرطان1. يتم إصلاح أنواع مختلفة من تلف الحمض النووي من خلال مسارات إصلاح مميزة لكنها مترابطة2. على سبيل المثال، يتم تصحيح عدم تطابق القواعد الناتج أثناء تكرار الحمض النووي من خلال إصلاح عدم التطابق (MMR)، بينما يتم إصلاح القواعد المعدلة كيميائيا، مثل القواعد المعدلة بالألكيلات، بشكل أساسي من خلال إصلاح استئصال القاعدة (BER)3. يتم إزالة الأشعة فوق البنفسجية (UV) من 6-4 منتجات ضوئية ومضافات نيوكليوتيدات ضخمة الناتجة عن بعض العوامل الكيميائية من خلال إصلاح استئصال النيوكليوتيدات (NER). يتم إصلاح تلف الربط بين الخيوط (ICL) من خلال أنشطة منسقة للبروتينات المرتبطة بمسار فقر الدم فانكوني4. يتم إصلاح كسور السلسلة الواحدة (SSBs) من خلال مسار إصلاح كسر السلسلة الواحدة (SSBR)، بينما يتم إصلاح كسرات السلسلة المزدوجة (DSBs) بشكل أساسي من خلال الربط النهائي غير المتماثل (NHEJ) أو إعادة التركيب المتماثل (HR). في معظم الحالات، يتم حل الآفات المعقدة للحمض النووي من خلال تفاعلات منسقة بين مسارات إصلاح متعددةللحمض النووي 5.

عادة ما يعتمد تقييم تلف الحمض النووي وكفاءة الإصلاح في الخلايا على مزيج من الأساليب التجريبية، بما في ذلك اختبار كوميت، وتألق المناعة (IF)، والبليت الغربي (WB)، وإعادة تنشيط الخلايا المضيفة (HCR)، واختبارات الإصلاح المعتمدة على البلازميدات. تقوم هذه الطرق بتقييم تلف وإصلاح الحمض النووي من خلال اكتشاف كسور خيوط الحمض النووي، وعلامات تلف الحمض النووي، والتعبير أو تحديد مواقع البروتينات المرتبطة بالإصلاح6. ومع ذلك، فإن القياس الدقيق لكفاءة إصلاح الخلايا يتطلب عادة اختبارات ديناميكية قائمة على التحدي. في هذه الأساليب، يتم تحفيز آفات DNA محددة تجريبيا، ويتم أخذ عينات من الخلايا في نقاط زمنية متتابعة لمراقبة تكوين وإزالة إشارات التلف. مقارنة مستويات الضرر المتبقية مع مرور الوقت مقارنة بعبء الضرر الأولي تمكن من تقييم كمي لحركة الإصلاح ووظائف المسار.

لمقارنة خصائص وتطبيقات اختبارات كفاءة إصلاح تلف الحمض النووي المتوفرة حاليا، تلخص هذه المراجعة طرق الكشف الرئيسية وفقا لخمسة معايير: خصوصية الآفات/الركيزة، الدقة التحليلية، الحساسية، القدرة الكمية، ومتطلبات الأجهزة (الجدول 1). تهدف هذه المراجعة إلى تقديم دليل منهجي عملي لاختيار الأساليب المناسبة لدراسة مسارات إصلاح تلف الحمض النووي في البحث الأساسي والترجمي والسريري.

طريقة الكشفخصوصية الآفات/الركيزةالدقة التحليليةعتبة الحساسية/الكشفالناتج الكمي مقابل النوعيمتطلبات الأجهزة
البقعة الغربيةCPDs، 6-4PPs، بروتينات إصلاح (مثل MGMT، RAD51)السكانمعتدلشبه كميالرحلان الكهربائي للبروتين، نقل الغشاء، نظام التصوير الكيميائي المضيء
التألق المناعيCPDs، بؤرة DSB (مثل γ-H2AX، RAD51)الخلية الواحدةمعتدلشبه كميمجهر الفلورة
HPLC-MS/MSCPDs، 6-4PPs، تلف القاعدتين التأكسدي والألكيلاتيفيالسكان/المختبرمرتفع جداالكميةHPLC-MS/MS
اختبار نشاط إنزيم MGMTضرر ألكليشن O⁶-meGالسكان/المختبرعاليالكميةقارئ الميكروبليت
اختبار المذنبSSBs، DSBs، القواعد المؤكسدة (مع معالجة FPG/OGG المسبقة)الخلية الواحدةعاليالكميةمجهر الفلورة/نظام الرحلان الكهربائي
اختبار الشقمواقع AP، شقوق NER، شقوق BERالسكان/المختبرعاليالكميةتصوير الجل، التصنيف الإشعاعي/كشف الفلورة
نظام الإصلاح المعاد تشكيلهضرر القاعدة حسب الموقع، مواقع نقاط الوصول، كسور الخيوطفي المختبرعاليالكميةالرحلان الكهربائي الهلامي، الفلورة/كشف التصلب المتعدد
اختبار الإصلاح القائم على البلازميداتالأضرار الخاصة بالموقعالسكانمعتدلالكميةقارئ الألواح الدقيقة، مقياس تدفق التومي، عد المستعمرات
اختبار المراسلأضرار محددة في الموقع؛ بير، نير، إتش آر، نيه، إم إم آرالسكانعاليالكميةقارئ الألواح الدقيقة، مقياس تدفق الخلية، المجهر الفلوري
HCR/FM-HCRضرر الأشعة فوق البنفسجية، روابط متقاطعة بلاتينية، ضرر خاص بالموقعالسكانعاليالكميةمقياس تدفق السيل، كاشف التألق/الكيميولوجي المضيء
RADDتلف الحمض النووي واسع الطيفالخلية الواحدةمرتفع جداالكميةمجهر الفلورة أحادي الجزيئ
qPCRتلف الأشعة فوق البنفسجية، آفات تسد السلسلةالسكانمعتدلالكميةجهاز qPCR في الوقت الحقيقي
كشف MSIعدم استقرار الأقمار الصناعية الدقيقة المرتبط بنقص MMRالسكانمعتدلنوعيجهاز PCR/الرحلان الكهربائي الشعري
DR-GFP/EJ5-GFPإصلاح DSB بنظام HR وNHEJالسكانعاليالكميةمقياس التدفق الخلوي/مجهر الفلورة
مبارك/سعادةرسم خرائط DSB على مستوى الجينومالخلية الواحدةمرتفع جداالكميةمتسلسل عالي الإنتاجية
iPONDبروتينات DDR عند شوك التكرار/الإصلاح المرتبط ب TLSشوكة التكرار/بروتيومعاليشبه كميمنصة مطيافية الكتلة/التسلسل

الجدول 1: مقارنة منهجية لطرق اكتشاف كفاءة إصلاح تلف الحمض النووي. مقارنة الطرق الشائعة الاستخدام لتقييم كفاءة إصلاح تلف الحمض النووي عبر مسارات إصلاح متعددة. يلخص الجدول خصوصية الآفة أو الركيزة، والدقة التحليلية، والحساسية، والقدرة الكمية، ومتطلبات الأجهزة لكل اختبار، بما في ذلك الأساليب الكيميائية الحيوية والجزيئية والخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

مراجعة ومنظور

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الإصلاح المباشر (DR)

الإصلاح المباشر (DR) هو أبسط أشكال إصلاح الحمض النووي ويشير إلى الاستعادة المباشرة للحمض النووي التالف دون إزالة القواعد أو النيوكليوتيدات7. يصلح DR بشكل أساسي نوعين رئيسيين من آفات الحمض النووي. الأول هو تلف دايمر السيكلبوتان البيريميدين (CPD) الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية (UV). في العديد من الكائنات الحية، يتعرف الفوتولياز على دايمرات البيريميدين ويرتبط بها. عند التعرض للضوء المرئي، ينشط الفوتولياز ويعكس تلف الحمض النووي مباشرة، ثم ينفصل عن جزيء الحمض النووي. تعد آلية إعادة تنشيط الضوء هذه مهمة بشكل خاص في النباتات والكائنات السفلى. ومع ذلك، تفتقر الثدييات المشيمة، بما في ذلك البشر، إلى الفوتوليز الوظيفي وبالتالي لا يمكنها إجراء إعادة تنشيط الضوء. وبالتالي، يتم إصلاح تلف CPD الناتج عن الأشعة فوق البنفسجية في الخلايا البشرية بشكل أساسي من خلال إصلاح استئصال النيوكليوتيدات (NER)8.

النوع الثاني الرئيسي من الأضرار الذي يتم إصلاحه عبر DR هو الضرر الأساسي الناتج عن التكلية. يتم التوسط في الإصلاح بواسطة إنزيم O 6-ألكيل جوانين-DNA ألكيل ترانسفيراز (AGT)، المعروف أيضا باسم O6-ميثيلجوانين-DNA ميثيل ترانسفيراز (MGMT). ينقل هذا الإنزيم مجموعات الألكيل من موقعO 6 لبقايا الجوانين إلى نفسه، مما يعيد بذلك قاعدة الحمض النووي التالفة مباشرة.

طرق اكتشاف كفاءة الكشف عن الكشف عن الضرر

  1. اكتشاف كفاءة الإصلاح لأضرار CPD الناتجة عن الأشعة فوق البنفسجية (UV)
    1. اختبار البقعة الغربية (WB) لاكتشاف التغيرات في محتوى تطوير المستهلك المستمر
      باستخدام الأجسام المضادة الخاصة ب CPDs، يمكن للباحثين اكتشاف التغيرات في وفرة CPD في نقاط زمنية مختلفة بعد الإشعاع فوق البنفسجي واستنتاج كفاءة الإصلاح من مستوى الضرر المتبقي. كفاءة الإصلاح الأعلى تعني إزالة CPD بشكل أسرع. يعد الكشف عن CPD القائم على WB نهجا كلاسيكيا وفعالا لتقييم نشاط إصلاح DNA؛ ومع ذلك، هناك عدة قيود. أولا، يقيس الاختبار متوسط مستويات الضرر عبر مجموعات الخلايا وبالتالي يفتقر إلى دقة خلية واحدة. ثانيا، والأهم، لا يمكن للاختبار التمييز بين مسارات الإصلاح. نظرا لأن CPDs في الخلايا البشرية يتم إصلاحها أساسا عبر NER، فإن تحليل WB وحده لا يمكنه التمييز بين ما إذا كان النشاط المرصود للإصلاح يعكس الإصلاح الفوتوليز أو نشاط NER دون سياق تجريبي إضافي.
    2. تغيرات ديناميكية التركيز في تموضع التوهج المناعي (IF)
      يمكن صبغ الخلايا التي تتعرض للإشعاع فوق البنفسجي وعلاج الإصلاح الضوئي باستخدام أجسام مضادة خاصة ب CPD، ويمكن رؤية التغيرات في بؤر CPD النووية بواسطة المجهر الفلوري. التحليل الكمي لتكوين وإزالة بؤر CPD يمكن تقييم قدرة إصلاح الحمض النووي على مستوى السكان والخلايا المفردة. معدل اختفاء بؤرة CPD يعكس مباشرة كفاءة الإصلاح. يوفر IF تصورا مكانيا وزمنيا-مكانيا لديناميكيات الإصلاح داخل الخلايا الفردية ويسمح بالكشف عن التباين بين الخلية. ومع ذلك، فإن إشارات الفلورة عرضة للتقطيع، وغالبا ما يعتمد التحليل الكمي على العد اليدوي، مما يضيف الذاتية. في الخلايا الثديية التي تفتقر إلى نشاط إعادة تنشيط الضوء، تعكس هذه الطريقة بشكل أساسي كفاءة الإصلاح التي ينظمها NER.
    3. الكروماتوغرافيا السائلة-مطيافية الكتلة عالية الأداء (HPLC-MS/MS) للتحليل الكمي CPD
      يتم هضم الحمض النووي المستخرج إنزيميا إلى نوكليوسيدات، وبعد ذلك يتم فصل CPDs عن النيوكليوسيدات الطبيعية بواسطة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC). يتم إجراء التحليل الكمي لاحقا باستخدام مطيافية الكتلة المزدوجة (MS/MS). يتم تحديد كفاءة الإصلاح بمقارنة وفرة CPD قبل وبعد الإصلاح9. يوفر HPLC-MS/MS خصوصية عالية جدا وحساسية على مستوى البيكومولار؛ ومع ذلك، تتطلب الطريقة أجهزة مكلفة، وتحضير عينات معقدة، ولا تعكس حالة الإصلاح الميدانية للخلايا السليمة. في عينات الخلايا البشرية، تعكس نتيجة الإصلاح المقاسة بشكل رئيسي نشاط NER.
  2. فعالية إصلاح تلف قاعدة الحمض النووي الناتج عن عوامل التليك
    1. اختبار نشاط إنزيمات MGMT
      يتم تقييم كفاءة إصلاح تلف الحمض النووي الناتج عن عوامل الكيلية عادة بقياس نشاط MGMT10. تستخدم ركائز الحمض النووي المثيلة الموسومة بالإشعاع لمراقبة نقل مجموعات الميثيل من الحمض النووي التالف إلى بروتين MGMT، مما يمكن من تقييم كمي لكفاءة الإصلاح.
    2. تقرير اختبار الجين للكشف عن كفاءة إصلاح O6 ميغاغرامت
      يمكن بناء بلازميدات المراسلة التي تحتوي على آفات O 6-ميثيلغوانين (O6-meG) لتقييم كفاءة الإصلاح. تثبط الآفة المدخلة تعبير جين المبلغ حتى تستعيد عملية الإصلاح التي تعبر عن MGMT نشاط المراسل. يتم قياس كفاءة الإصلاح لاحقا من خلال قياس مستويات تعبير جينات المبلغ. توفر اختبارات الجينات المراسلة تقييما حدسيا وكميا لنشاط الإصلاح في الخلايا الحية11. ومع ذلك، تتطلب هذه الاختبارات بناء ناقلات خاصة بالآفات وتشمل دورات تجريبية طويلة نسبيا12.
  3. كفاءة إصلاح الأضرار عند اكتشاف انقطاع السلسلة
    1. اختبار المذنب
      اختبار المذنب، المعروف أيضا باسم الرحلان الكهربائي الهلامي أحادي الخلية (SCGE)، هو طريقة حساسة للكشف عن كسور خيوط الحمض النووي على مستوى الخلية الواحدة. تهاجر شظايا الحمض النووي التالفة من النواة أثناء الرحلان الكهربائي، مكونة ذيول شبيهة بالمذنبات، بينما يبقى الحمض النووي سليما مركزا داخل المنطقة النووية. يمكن قياس معايير مثل طول ذيل المذنب، ومحتوى الحمض النووي للذيل، وعزم الذيل باستخدام مجهر الفلورة وبرامج تحليل الصور. تمكن هذه المقاييس من التقييم الكمي لشدة كسر خيوط الحمض النووي. من خلال مقارنة ملفات المذنبات مباشرة بعد تحفيز تلف الحمض النووي مع تلك التي تم الحصول عليها بعد الإصلاح، يمكن تقدير كفاءة الإصلاح13.
      يقدم اختبار المذنب عدة مزايا، منها التشغيل البسيط، والتكلفة المنخفضة نسبيا، والحساسية العالية، ودقة خلية واحدة. أدى المزيد من التحسين لهذه الطريقة إلى تطوير متغيرات معدلة بالإنزيمات واختبارات إصلاح الحمض النووي في المختبرات القائمة على المذنبات، والتي يمكن استخدامها لتقييم أنشطة BER وNER.

2. إصلاح استئصال القاعدة (BER)

إصلاح استئصال القاعدة (BER) هو مسار إصلاح حمض نووي محفوظ للغاية يزيل بشكل أساسي الآفات القاعدية الصغيرة الناتجة عن الأكسدة والكيلية وإزالة الأمين. يشترك BER في تداخل ميكانيكي كبير مع إصلاح كسور السلسلة الواحدة (SSBR)، وتعتبر بعض أحداث SSBR امتدادات ل BER. وفقا لطول رقعة الإصلاح، يصنف BER إلى قطع قصيرة BER (SP-BER) وBER طويلة الرقعة (LP-BER).

يبدأ BER بواسطة جليكوزيليز DNA التي تتعرف على القواعد التالفة وتقتلها عن طريق شق الرابطة N-جليكوسيدية بين القاعدة والديوكسيريبوز، مما يولد مواقع أبورينية/أبيريميدينية (AP)رقم 15. ينقسم النيوكلياز الداخلي AP 1 (APE1) بعد ذلك العمود الفقري للحمض النووي عند الجانب 5′ من موقع AP، منتجا نهايات فوسفات 3′-OH و5′-ديوكسيريبوز فوسفات (dRP). خلال SP-BER، تزال مجموعة dRP، ويملأ β بوليميراز DNA (Polβ) الفجوة النيوكليوتيدية المفردة، ويكمل DNA ليغاز III (LigIII) الربط.

يتبع إصلاح الكسور أحادية السلسلة الناتجة عن التكلية التي تحتوي على نهايات محجوبة بزاوية 3′ آلية مشابهة لكنه يتطلب معالجة نهائية إضافية. يزيل إنزيم بولي نوكليوتيد كيناز 3′-فوسفاتاز (PNKP) أولا الأطراف غير الطبيعية 3′ لتوليد مجموعة 3′-OH الصحيحة. بعد ذلك، يملأ بولب النيوكليوتيد المفقود، ويغلق ليجIII الشك لإكمال الإصلاح.

طرق اكتشاف كفاءة BER

  1. اختبار المذنب المعدل بالإنزيم
    يمدد اختبار كوميت المعدل بالإنزيم اختبار كوميت القياسي من خلال دمج إنزيمات إصلاح خاصة بالآفات. تتعرف هذه الإنزيمات على القواعد التالفة وتقطعها، مما يحول الآفات التي لا يمكن اكتشافها إلى كسور خيوط يمكن اكتشافها. تعكس شدة ذيل المذنب الناتج مستوى تلف الحمض النووي16˒17.
    لتقييم كفاءة BER، يستخدم فورماميدوبيرميدين DNA جليكوزيليز (FPG) أو نظيره الثديي 8-أوكسوجوانين DNA جليكوزيليز (OGG1) لتحويل آفات القاعدة المؤكسدة إلى كسور أحادية الخيوط، والتي يتم تحليلها لاحقا باستخدام اختبار Comet18.
  2. اختبار الشق
    اختبار الشق هو نهج أساسي في المختبر لتقييم نشاط BER. يتم حضن ركائز الحمض النووي التي تحتوي على مواقع AP بواسطة إنزيمات أو مستخلصات خلوية منقاة، ويتم قياس نسبة ركائز الحمض النووي المقسومة. يعكس هذا الاختبار مباشرة نشاط الشق الذي يتوسط بواسطة APE1 ويوفر خصوصية عالية وحساسية مع تقليل التداخل من البيئة داخل الخلية19.
    ومع ذلك، لا يعيد اختبار الشق نشاط BER بالكامل في الخلايا الحية لأنه لا يستطيع تقييم التنظيم الديناميكي لعملية الإصلاح الكاملة، بما في ذلك التعرف على الآفات، واستئصال القاعدة، وانقسام موقع AP، وتخليق الحمض النووي، والربط20.
  3. نظام الإصلاح المعاد تشكيله
    نظام الإصلاح المعاد تشكيله هو منصة تجريبية في المختبر تعيد بناء مسارات إصلاح الحمض النووي باستخدام بروتينات إصلاح منقاة. يتيح هذا النظام تحليلا تفصيليا للوظائف الجزيئية والتفاعلات بين بروتينات الإصلاح الفردية، ويستخدم على نطاق واسع في الدراسات الميكانيكية وفحص الأدوية.
    لتقييم كفاءة BER، يتم حضن الجليكوزيلياز المنقى، والإندونولياز AP، وبوليميرازات DNA، والليغازات بشكل متسلسل مع ركائز DNA تالفة لإعادة تشكيل التعرف على الآفات، واستئصالها، وتركيبها، وربطها. يتم تحليل منتجات الإصلاح بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي، أو وضع علامات الفلورة، أو مطيافية الكتلة21. على الرغم من أن هذا النهج يمكن من دراسات ميكانيكية محكمة للغاية، إلا أنه لا يأخذ في الاعتبار بنية الكروماتين أو التنظيم الخلوي العالمي لنشاط الإصلاح22.
  4. اختبار الإصلاح القائم على البلازميدات
    تشمل اختبارات الإصلاح المعتمدة على البلازميدات إدخال البلازميدات التي تحتوي على آفات DNA محددة في خلايا العائل أو حضانة باستخدام مستخلصات خلوية تحتوي على إنزيمات إصلاح، تليها تقييم كفاءة الإصلاح باستخدام اختبارات التقرير، أو قياس تدفق الخلية، أو تحليل تكوين المستعمرات23.
    لتقييم كفاءة BER، يتم حضن البلازميدات التي تحتوي على تلف تأكسدي في الحمض النووي مع مستخلصات خلوية ثم تحولت لاحقا إلى سلالات بكتيرية تفتقر إلى إصلاح، مثل الإشريكية القولونية. يتم بعد ذلك تقدير كفاءة الإصلاح من معدلات تكوين المستعمرات.
  5. اختبار جين المراسل
    تقوم اختبارات الجين المبلغ بتقييم غير مباشر لكفاءة إصلاح الحمض النووي أو النشاط التنظيمي للجينات من خلال قياس استعادة تعبير جين المبلغ24. في هذه الاختبارات، تدمج آفات الحمض النووي أو العناصر التنظيمية في بنى التقرير، ويتم قياس كفاءة الإصلاح من خلال التغيرات في نشاط المبلغ بعد الإصلاح.
    لتحليل BER، يمكن إدخال آفة 8-oxoG في منطقة ترميز جين تقرير اللوسيفيراز. إذا بقيت الآفة دون إصلاح، تتعطل الترجمة؛ الإصلاح الناجح يعيد تعبير البروتين الكامل في التقرير. تستخدم البلازميدات غير التالفة، مثل ناقلات pRL-TK رينيلا لوسيفيراز، عادة كضوابط داخلية.
  6. إعادة تنشيط الخلايا المضيفة (HCR)
    إعادة تنشيط خلايا المضيف (HCR) هو اختبار كلاسيكي يقيم بشكل غير مباشر كفاءة إصلاح الحمض النووي من خلال قياس قدرة خلايا المضيف على استعادة التعبير من البلازميدات التالفة25. يتم نقل البلازميدات التي تحمل آفات محددة، مثل دايمرات البيريميدين الناتجة عن الأشعة فوق البنفسجية أو الروابط المتقاطعة الكيميائية، إلى خلايا المضيف. يتم قياس كفاءة الإصلاح لاحقا من خلال قياس تعبير جين المبلغ.
    توفر اختبارات HCR حساسية عالية وتسمح بتقييم نشاط الإصلاح تجاه أنواع الآفات المحددة. ومع ذلك، هناك حاجة إلى نقل فعال وتحضير البلازميدات التالفة عالية الجودة. أحد القيود الرئيسية في HCR التقليدي هو أن معالجة البلازميدات بعوامل ضارة للحمض النووي غالبا ما تولد مجموعات آفات غير متجانسة في جميع أنحاء البلازميد، مما يعقد التفسير الآلي26.
    لمعالجة هذه القيود، تم تطوير اختبارات إعادة تنشيط خلايا المضيف المعتمدة على قياس تدفق الخلايا الخلوية (FM-HCR) باستخدام بلازميدات آفة واحدة محددة الموقع. يتيح FM-HCR التحليل الكمي السريع لنشاط الإصلاح في الخلايا الحية، رغم أن الاختبار يتطلب أجهزة متخصصة وله قيود على التحليل الآلي المتزامن لعدة مساراتBER 27.
    كما تم تطوير اختبارات إعادة تنشيط خلايا المضيف (PL-HCR) تعتمد على ركائز BER الخاصة بالآفات لدراسة آليات تنشيط الخلايا الخلفية في الخلايا الحية (الشكل 1)28. في هذا النهج، يتم إدخال البلازميدات التي تحتوي على آفة واحدة 1,N 6-إيثينوآدينين (εA) إلى خلايا الثدييات. بعد الإصلاح، يتم استرجاع حمض البلازميد، وهضمه باستخدام إنزيمات التقييد، وتحويله إلى الإشريكية القولونية، وقياسه من خلال تحليل تكوين اللويحات. تصبح البلازميدات التي تم إصلاحها بالكامل خطية بعد الهضم المقيد وتفشل في توليد اللويحات، بينما تبقى البلازميدات غير المصلحة أو غير المصلحة بشكل كامل دائرية وتشكل لويحات. لذلك، يتم تحديد كفاءة BER بواسطة قياس اللويحات الكميمة.
  7. كشف الأضرار بمساعدة الإصلاح
    الكشف عن الأضرار بمساعدة الإصلاح (RADD) هو طريقة جزيئية واحدة لاكتشاف وقياس تلف الحمض النووي29. في هذا النهج، تتعرف إنزيمات الإصلاح الخاصة بالآفات وتزيل القواعد التالفة، ثم تدمج البوليميراز الحمض النووي نوكليوتيدات موسومة بالفلورية في الفجوات الناتجة. يتم لاحقا تصور جزيئات الحمض النووي بواسطة المجهر الفلوري، مما يمكن من الكشف المباشر وقياس آفات الحمض النووي (الشكل 2)30.
    يوفر RADD تحليلا نوعيا وكميا حساسا للغاية لتلف الحمض النووي على مستوى الجزيء الواحد. ومع ذلك، تقيس الطريقة بشكل أساسي عبء تلف الحمض النووي بدلا من تقييم حركية الإصلاح أو كفاءة الإصلاح العامة في مجموعات الخلايا بشكل مباشر.

figure-protocol-1
الشكل 1: إعادة تنشيط خلايا المضيف (PL-HCR). يتم نقل الحمض النووي الدائري أحادي السلسلة M13mp18 الذي يحتوي على آفة محددة إلى خلايا كفاءة. بعد النقل، تزرع الخلايا على صفائح الأجار للسماح بتكون اللويحة. يتم عزل الحمض النووي M13 المكرر بعد ذلك من اللويحات، وهضمه باستخدام إنزيمات التقييد، وتحليله بواسطة الرحلان الكهربائي الهلام لتمييز المنتجات الطفرة والمنتجات البرية وتحديد ما إذا كان قد حدث إصلاح الآفات. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-2
الشكل 2: كشف الأضرار بمساعدة الإصلاح (RADD). الفجوات أحادية السلسلة التي تنشأ أثناء إصلاح الحمض النووي تملأ بالنيوكليوتيدات الموسومة بالبيوتين. ثم يستخدم الأفيدين أو الستريبتافيدين الموسوم بالفلورية للكشف عن النيوكليوتيدات المدمجة، مما يتيح التقييم الكمي لمستويات تلف الحمض النووي من خلال تحليل التألق. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. إصلاح استئصال النيوكليوتيدات (NER)

إصلاح استئصال النيوكليوتيدات (NER) هو مسار رئيسي لإصلاح الحمض النووي مسؤول عن إزالة الآفات الكبيرة في الحمض النووي التي تشوه اللولب المزدوجللحمض النووي 31. تشمل ركائز NER دايمرات السيكلوبيوتان البيريميدين المحفزة بالأشعة فوق البنفسجية (CPDs)، ومنتجات ضوئية من 6-4 بيريميدين-بيريميدون (6-4PPs)، وآفات بيورين مؤكسدة، ومقتربات كيميائية ضخمة، وروابط متقاطعة داخل خيوط ناتجة عن السيسبلاتينرقم 32. ترتبط عيوب NER باضطرابات مثل الجفاف الجلدي الصباغي، الذي يتميز بحساسية شديدة للأشعة فوق البنفسجية وزيادة القابلية للسرطان.

يتكون NER من مسارين فرعيين رئيسيين: NER-NER-NER33 وNER-NER34 المرتبط بالنسخ (TC-NER)34. يقوم GG-NER بمسح الجينوم بأكمله بحثا عن آفات مشوهة للحلزون، مما يثبط الطفرات وتكوين السرطانات. في المقابل، يزيل TC-NER بشكل انتقائي الآفات التي تمنع النسخ من الجينات المنسوخة بنشاط، وهو ضروري للحفاظ على سلامة النسخ. تساهم عيوب TC-NER في اضطرابات مثل متلازمة كوكاين ومتلازمة الحساسية للأشعة فوق البنفسجية35.

طرق اكتشاف كفاءة NER

  1. اختبار الشق
    يقيم اختبار الشق كفاءة NER من خلال اكتشاف شقوق الخيوط التي تدخلها البروتينات الإصلاحية في مواقع تلف الحمض النووي. في هذا الاختبار، يتم حضن ركائز الحمض النووي التالفة، مثل الحمض النووي المشع بالأشعة فوق البنفسجية التي تحتوي على CPDs، مع بروتينات إصلاح أو مستخلصات خلوية، ويتم اكتشاف نواتج الشقوقلاحقا 36.
    يمكن استخدام الوسم الإشعاعي أو الفلورة لتحسين الحساسية والسماح بمراقبة دقيقة لنشاط الشق37. يقيس الاختبار مباشرة نشاط بروتينات NER الرئيسية المسؤولة عن التعرف على الضرر وإزالته. ومع ذلك، يتطلب التنفيذ الناجح تحضير ركائز تالفة عالية الجودة ومستخلصات بروتينية نشطة.
  2. اختبار إصلاح الإنزيمات المذنب
    يمكن أيضا تقييم كفاءة NER باستخدام اختبارات مذنب معدلة بالإنزيمات. في هذا النهج، يتم حضن النيوكلياز الداخلي T4 V مع خلايا تالفة لتحويل دايمرات البيريميدين إلى انكسارات أحادية السلسلة قابلة للكشف، والتي يتم تحليلها لاحقا باستخدام اختبار Comet38.
  3. اختبار PCR الكمي الفلوري في الوقت الحقيقي (qPCR)
    يقوم اختبار PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) بتقييم كفاءة إصلاح الحمض النووي بشكل غير مباشر من خلال قياس التأثيرات المثبطة لآفات الحمض النووي على تضخيم PCR39. خلال تحليل NER، يستخدم أولا الإشعاع فوق البنفسجي لتحفيز دايمرات البيريميدين. تعيق هذه الآفات تقدم بوليميراز الحمض النووي وتقلل من كفاءة التضخيم، مما يؤدي إلى زيادة قيم عتبة الدورة (Ct). بعد إصلاح مسار NER، تستعاد سلامة الحمض النووي وتتحسن كفاءة التضخيم، مما يؤدي إلى انخفاض قيم Ct. لذا يمكن قياس كفاءة الإصلاح بمقارنة التضخيم قبل وبعد الإصلاح بالنسبة لمنطقة التحكم الداخلية40 التي لم تتضرر.
    بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام qPCR لتقييم مستويات التعبير للجينات المشاركة في إشارات ومسارات إصلاح تلف الحمض النووي، بما في ذلك ATM، ATR، BRCA1، CDKN1A، وXPC، مما يعكس بشكل غير مباشر قدرة إصلاح الحمض النووي41.
  4. إعادة تنشيط خلايا المضيف المعتمدة على قياس التدفق الخلوي (FM-HCR)
    تستخدم اختبارات FM-HCR البلازميدات التي تحتوي على آفة محددة الموقع ويتم نقلها إلى خلايا المضيف وتحدد كفاءة الإصلاح من خلال تحليل تدفق الخلايا الخلوية لشدة الفلورة ونسبة الخلايا الفلورية (الشكل 3)42˒43). عادة ما تعكس شدة الفلورة المتزايدة قدرة أكبر على إصلاح الحمض النووي44˒45.
  5. تسلسل إصلاح الاستئصال (XR-seq)
    تسلسل إصلاح الاستئصال (XR-seq) هو تقنية شاملة على مستوى الجينوم لرسم خريطة نشاط NER عند دقة النيوكليوتيد الواحد. تقوم هذه الطريقة بإثراء وتسلسل الأوليجونكليوتيدات المحتوية على التلف التي تم استئصالها خلال NER، مما يولد خرائط عالية الدقة لنشاط الإصلاح عبر الجينوم. يتيح XR-seq التحليل الكمي لكفاءة الإصلاح وأنماط التوزيع المرتبطة بمسارات GG-NER وTC-NER ويمثل تقدما تقنيا كبيرا في أبحاث NER.
    نظرا لأن NER يتكون من مسارين فرعيين ميكانيكيين مختلفين ويشمل العديد من بروتينات الإصلاح، فإن هناك حاجة إلى عدة طرق تكميلية لتقييم شامل لنشاط الإصلاح46˒47. بالإضافة إلى الطرق الموضحة أعلاه، يمكن أيضا تقييم كفاءة NER باستخدام اختبارات الوتلة الغربية، واختبارات الفلورة المناعية، واختبارات الإصلاح المعتمدة على البلازميدات، واختبارات الجين التقريري.

figure-protocol-3
الشكل 3: مبدأ الكشف لإعادة تنشيط خلايا المضيف المعتمدة على تدفق الخلايا الخلوية (FM-HCR). البلازميدات التي تحتوي على أربعة أنواع مميزة من تلف الحمض النووي تنقل معا إلى خلايا ثديية مزروعة. يتم قياس قدرة إصلاح الحمض النووي (DRC) لاحقا بواسطة قياس التدفق الخلوي بناء على شدة التألق في المبلغ. DRC، قدرة إصلاح الحمض النووي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. إصلاح عدم التطابق (MMR)

إصلاح عدم التطابق (MMR) هو مسار تصحيح أخطاء بعد التكرار مسؤول عن إصلاح عدم تطابق القاعدة، مثل الاختلاقات بين G-T وA-C، بالإضافة إلى الحلقات الصغيرة التي تنشأ أثناء تكرار الحمض النووي48. يبدأ MMR عندما يتعرف MutS على القواعد غير المتطابقة، وبعدها يقوم MutL بتجنيد عوامل الإصلاح في المراحل النهائية والصوتات الخارجية لتفعيل عملية الإصلاح49. خطوة حاسمة في MMR هي التمييز بين خيوط الحمض النووي الوالدية وسلسلة DNAالمصنعة حديثا.

في بدائيات النواة، يتم التمييز بين الخيوط من خلال مثيلة الحمض النووي، التي تحدد السلسلة الأبوية. في حقيقيات النواة، يتم تحديد هوية الخيوط من خلال شقوق عابرة في الحمض النووي المصطنح حديثا وتفاعلات مع مستضد نووي الخلوي المتكاثر (PCNA). يحسن MMR بشكل كبير من دقة التكرار ويلعب دورا أساسيا في الحفاظعلى استقرار الجينوم. العيوب في MMR مرتبطة ارتباطا وثيقا بعدة أنواع سرطان، بما في ذلك متلازمة لينش.

طرق تقييم كفاءة MMR

  1. اختبار عدم استقرار الأقمار الصناعية الصغيرة
    يؤدي مؤشر MMR المعيب إلى فشل تصحيح أخطاء انزلاق النسخ عند مواقع الأقمار الصناعية الدقيقة، مما يؤدي إلى عدم استقرار الأقمار الصناعية الدقيقة (MSI). يتضمن اختبار MSI تضخيم PCR لعلامات الأقمار الصناعية الدقيقة الممثلة تليها تحليل شظايا قائم على الرحلان الكهربائي الشعري. يشير عدم الاستقرار عند عدة مواقع إلى ضعف نشاط MMR، بينما تشير ملفات الميكروساتلايت المستقرة إلى وظيفة MMR سليمة. يوفر اختبار MSI حساسية عالية وخصوصية عالية لتحديد نقص MMR؛ ومع ذلك، يظل مقياسا غير مباشر لوظيفة MMR ولا يقيم كفاءة الإصلاح بشكل كمي.
    يمكن أيضا استخدام بلازميدات المراسلين التي تحتوي على عدم تطابقات محددة أو حلقات إدخال-حذف لتقييم كفاءة MMR من خلال اختبارات جينات المبلغ. بالإضافة إلى ذلك، قد توفر اختبارات البلوتينغ الغربية والفلورية المناعية التي تستهدف البروتينات المرتبطة ب MMR تقييما غير مباشر لنشاط المسار.

5. إصلاح كسر الخيطين (DSB)

تعد كسور السلسلة المزدوجة (DSBs) من أكثر أشكال تلف الحمض النووي سمية للخلايا. فشل إصلاح DSBs بدقة قد يؤدي إلى طفرات، وحذف كروموسومي، وانتقالات، وعدم استقرار جينومي، وتكون الأورام. يحدث إصلاح DSB بشكل أساسي من خلال إعادة التركيب المتماثل (HR) والانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ)، اللذين يعملان بشكل تفضيلي خلال مراحل مختلفة من دورة الخلية52.

طرق تقييم كفاءة إصلاح DSB

  1. اختبار تركيز جاما-H2AX
    اختبار تركيز γ-H2AX هو أحد أكثر الطرق استخداما للكشف غير المباشر عن DSBs. بعد تكوين DSB، يتم فسفر هيستون H2AX بسرعة عند Ser139 لتوليد تركيزات γ-H2AX. يرتبط عدد بؤر γ-H2AX بمدى تكوين DSB، ويمكن استنتاج كفاءة الإصلاح من خلال مراقبة معدل اختفاء البؤر مع مرور الوقت باستخدام المجهر المناعي الفلوري.
    يقدم هذا الاختبار عدة مزايا، منها الحساسية العالية، ودقة الخلايا الواحدة، وبروتوكولات تجريبية معتمدة، مما يجعله طريقة مركزية في أبحاث استجابة تلف الحمض النووي (DDR).
  2. بارك ونعمة
    BLESS (Breaks Labeling، Enrichment on Streptavidin، والتسلسل) وBLISS (Breaks Labeling In Situ and Sequencing) هما طرق رسم خرائط DSB على مستوى الجينوم تعتمد على التصنيف في الموقع والتسلسل عالي الإنتاجية. تحدد كلا النهجين مواقع DSB من خلال ربط مباشر لمحولات التسلسل على نهايات الحمض النووي المكسورة، مما يتيح تحديد الموقع والقياس الدقيق للجينوم الكامل. يمكن أيضا استخدام هذه الطرق لتقييم حركية إصلاح DSB بشكل عام.
    بالإضافة إلى ذلك، يمكن لاختبارات الجينات الخاصة ب DSB تقييم كفاءة إصلاح DSB بشكل كمي والتمييز بين الإصلاح الذي يعبر عن نبض القلب عن الإصلاح الذي يعبر عنه NHEJ (الشكل 4). ومع ذلك، رغم أن اختبارات γ-H2AX وBLESS وBLISS تقيس بشكل فعال عبء DSB العالمي وحركيات الإصلاح، إلا أنها لا تستطيع تحديد ما إذا كان الإصلاح قد حدث تحديدا من خلال مسارات HR أو NHEJ.

figure-protocol-4
الشكل 4: اختبار جين ريبورتر لإصلاح كسر السلسلتين (DSB). يتم إدخال بلازميدات مراسل DSB إلى الخلايا المستهدفة. بعد فترة إصلاح مناسبة بعد النقل، يتم مراقبة تألق جين المبلغ باستخدام المجهر الفلوري لتقييم كفاءة إصلاح DSB. DSB، كسر مزدوج الخيط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

6. إصلاح إعادة التركيب المتماثل (HR)

إعادة التركيب المتماثل (HR) هو مسار إصلاح DNA عالي الدقة يعمل بشكل أساسي خلال مرحلتي S و G2 من دورة الخلية، عندما يتوفر كروماتيد شقيق غير تالف كقالب إصلاح53. بعد تكوين DSB، يتعرف مركب MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) على نهايات الحمض النووي ويبدأ استئصال نهاية الحمض النووي بالتعاون مع CtIP54. تنتج هذه العملية نترات بروز الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) بطول 3 أقدام (ssDNA).

يتم تغليف الحمض النووي الناتج ssDNA في البداية ببروتين التكاثر A (RPA)، الذي يحمي الحمض النووي من تحلل النوكلياز ويمنع تكوين الهياكل الثانوية55. لاحقا، يتوسط BRCA2 استبدال RPA بإنزيم RAD51 المعاد تركيبه، مما يؤدي إلى تكوين خيط نوكليوبروتينRAD51 رقم 56. يبحث هذا الخيط عن تسلسلات الحمض النووي المتماثلة على الكروماتيد الشقي ويعزز غزو الخيوط في قالب الحمض النووي المزدوج المتماثل، مما يولد بنية حلقة إزاحة (D-loop)57˒58. ثم تتابع عملية تصنيع الحمض النووي وتبادل الخيوط إلى الإصلاح الكامل.

يمكن تقييم كفاءة معدل ضربات القلب كميا باستخدام أنظمة تقرير DR-GFP في اختبارات جينات المبلغ. بدلا من ذلك، يمكن إجراء التقييم غير المباشر باستخدام اختبارات Western blotting أو اختبارات الفلورة المناعية التي تستهدف البروتينات المرتبطة بضربات قلب.

7. الربط النهائي غير المتماثل (NHEJ)

يصلح الربط النهائي غير المتماثل (NHEJ) الربط النهائي العميق دون الحاجة إلى تشابه تسلسل واسع بين نهايات الحمض النووي59. بدلا من ذلك، تتم معالجة نهايات الحمض النووي المكسور وربطها مباشرة، مما يجعل NHEJ مسار إصلاح عرضة للأخطاء بطبيعته. نظرا لأن نهايات الحمض النووي قد تخضع لتحلل قبل الربط والأطراف الناتجة عن DSBs غير مرتبطة ببعضها البعض، يمكن أن يؤدي NHEJ إلى طفرات وحذف وإعادة ترتيب كروموسومي60.

تم التعرف على ثلاثة أشكال رئيسية من الإصلاح غير المتماثل: NHEJ الكلاسيكي، التلدين أحادي السلسلة (SSA)، والربط النهائي بوساطة الميكروهومولوجيا (MMEJ).

  1. NHEJ الكلاسيكي
    يعمل NHEJ الكلاسيكي طوال دورة الخلية. يتعرف جهاز Ku70/Ku80 على نهايات DSB61 أولا ويربط بينها. يقوم هذا المجمع بتجنيد وحدة تحفيزية لبروتين كيناز معتمد على الحمض النووي (DNA-PKcs)، مما يؤدي إلى تنشيط إشارات الكينازيم وبدء NHEJ. تقوم إنزيمات المعالجة النهائية، بما في ذلك النوكلياز والفوسفاتازات، بمعالجة الأطراف التالفة للحمض النووي قبل أن يقوم مركب XRCC4-DNA ليغاز IV بالتوسط في ربط الطرف62 للحمض النووي. نظرا لأن المعالجة النهائية غالبا ما تؤدي إلى فقدان النيوكليوتيدات أو إعادة الربط غير الدقيقة، يعتبر NHEJ مسار إصلاح طفرا63˒64.
  2. التلدين أحادي السلسلة (SSA)
    يقوم التلدين أحادي السلسلة (SSA) بإصلاح DSBs التي تحدث بين تسلسلات متماثلة متكررة. بعد تكوين DSB، تقوم النوكليازات بقطع أطراف الحمض النووي بطول 5 أقلاط، مما يولد نتجابات ssDNA ممتدة بطول 3′. RAD52 يتوسط التلدين بين التكرارات المتملة المتماثلة65. بعد ذلك، يقوم مركب النيوكلياز XPF-ERCC1 بإزالة شرائح الحمض النووي غير المتزاوقة، وقد يشارك مركب SLX1-SLX4 أيضا في المعالجة النهائية. ثم يقوم ليغاز الحمض النووي بإغلاق الفجوات المتبقية. نظرا لأن التسلسلات الموجودة بين التكرارات المتماثلة تحذف أثناء الإصلاح، يعتبر SSA آلية إصلاح سريعة لكنها بطبيعتها طفرة66.
  3. الربط النهائي بوساطة الميكروهومولوجيا (MMEJ)
    الربط النهائي بوساطة الميكروهومولوجيا (MMEJ)، المعروف أيضا باسم NHEJ البديل (Alt-NHEJ)، هو مسار إصلاح DSB آخر معرض للأخطاءرقم 67. في MMEJ، تستخدم التسلسلات الدقيقة القصيرة الدقيقة الواقعة بالقرب من نهايات كسر الحمض النووي لمحاذاة الأطراف المكسورة قبل الإصلاح. بعد التعرف على هذه المناطق الدقيقة المتماثلة، يتم ربط نهايات الحمض النووي من خلال عملية شبيهة بإعادة التركيب68. نظرا لأن MMEJ يعتمد على تسلسلات متجانسة قصيرة جدا، تحدث عمليات حذف وإعادة ترتيب جينومي عادة أثناء الإصلاح.
    يمكن تقييم كفاءة NHEJ كميا باستخدام أنظمة تقرير EJ5-GFP في اختبارات جينات المبلغ. بدلا من ذلك، يمكن تقييم نشاط الإصلاح بشكل غير مباشر من خلال تحليل Western blotting وتحليل التألق المناعي للبروتينات المرتبطة ب NHEJ.

8. إصلاح الربط بين الخيوط (ICL)

الروابط بين الخيوط (ICLs) هي آفات شديدة السمية في الحمض النووي تربط تساهميا بين خيطي الحلزون المزدوج للحمض النووي، مما يمنع تكرار الحمض النووي ونسخه. إصلاح ICL معقد ميكانيكيا ويشمل بشكل أساسي مسار فقر الدم فانكوني (FA) ومسارNEIL3 رقم 69.

في مسار FA، يتعرف FANCM على آفات ICL ويعزز المونيوبيكوتينات لمركب FANCI-FANCD2، مما ينشط بروتينات الإصلاح في الأسفل70. تقوم النوكلياز الخاصة بالبنية بعد ذلك بقطع الحمض النووي بالقرب من الرابط المتقاطع لفصل شيطي الحمض النووي، ويتم إصلاح النوكلياز الناتج عبر مسارات HR أو NHEJ.

في مسار NEIL3، يقوم NEIL3 من إنتاج الحمض النووي بقطع الروابط الجليكوزيدية المرتبطة بآفة ICL، مما يولد مواقع AP يتم تجاوزها لاحقا بواسطة تخليق النقل (TLS) بوليميراز71. نظرا لأن ICLs تمنع فصل الخيوط اللازمة للتكاثر والنسخ، فإن هذه الآفات شديدة السمية للخلايا وتساهم في الشيخوخة والتنكس العصبي والسرطان72˒73.

يمكن تقييم كفاءة إصلاح ICL باستخدام اختبارات الإصلاح القائمة على البلازميدات، واختبارات الجين المبلغ، واختبارات إعادة تنشيط خلايا المضيف، وأنظمة الإصلاح المعاد تشكيلها في المختبر .

9. تخليق الترانزليشن (TLS)

تخليق الانتقال (TLS) هو آلية تحمل لتلف الحمض النووي تتيح استمرار التكاثر عبر آفات الحمض النووي غير الإصلاحية74. يشمل TLS بشكل أساسي البوليميراز المتخصص في الحمض النووي، بما في ذلك البوليميراز κ و η وι و ζ. عندما يتوقف تكرار الحمض النووي في المواقع التالفة، تتجاوز بوليميراز TLS الآفة وتسمح بالتكرار، مما يحافظ على استقرار الجينوم75.

على عكس BER وNER وMMR وHR وNHEJ التي تزيل أو تصلح آفات الحمض النووي مباشرة، فإن TLS لا يقضي على تلف الحمض النووي. بدلا من ذلك، يتجاوز الآفات غير المعالجة أثناء تكرار الحمض النووي، وبالتالي يصنف كآلية تحمل للضرر بدلا من مسار إصلاح DNA تقليدي76.

يمكن تقسيم TLS إلى مسارات تجاوز خالية من الأخطاء ومعرضة للأخطاء. TLS الخالي من الأخطاء يدخل النيوكليوتيد الصحيح مقابل الآلة، بينما TLS المعرض للأخطاء غالبا ما يدخل نيوكليوتيدات غير صحيحة ويساهم في الطفرات. يعتبر TLS المعرض للأخطاء آلية رئيسية من خلالها تسبب المواد المسرطنة البيئية طفرات جينومية. وبالتالي، قد يمثل تعديل مسارات TLS المعرضة للأخطاء استراتيجية محتملة للوقاية من السرطان وعلاجه.77.

طرق تقييم كفاءة TLS

  1. عزل البروتينات على الحمض النووي الناشئ (iPOND)
    عزل البروتينات على الحمض النووي الناشئ (iPOND) هو تقنية تستخدم لتحليل البروتينات المرتبطة بالحمض النووي المصنع حديثا عند نقاط التكاثر المتوقفة. نظرا لأن نشاط TLS يحدث كثيرا عند التفرعات المتوقفة، فإن iPOND يتيح التحليل الديناميكي لتجنيد وتجميع بوليميراز TLS وبروتينات استجابة تلف الحمض النووي (DDR) أثناء إجهاد التكرار. لذلك يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم نشاط TLS وعمليات الإصلاح المرتبطة بالتكرار.
    يمكن أيضا تقييم كفاءة TLS باستخدام بلازميدات المراسلة التي تحتوي على آفات DNA خاصة ب TLS في اختبارات جينات المبلغ. بالإضافة إلى ذلك، قد توفر اختبارات Western blotting وImmunofluorescence التي تستهدف البروتينات المرتبطة ب TLS تقييما غير مباشر لنشاط المسار.

10. اعتبارات مراقبة الجودة وقابلية التكرار في تصميم التجارب

  1. التكرار البيولوجي والتكرار التقني
    التمييز الواضح بين النسخ البيولوجية والتكرارات التقنية أمر ضروري لضمان الموثوقية وقابلية التكرار في دراسات إصلاح الحمض النووي. بشكل عام، يجب تضمين ثلاثة نسخ بيولوجية مستقلة على الأقل لكل تجربة، بينما يجب تحديد عدد النسخ التقنية بناء على تغير منصة الكشف.
    بالنسبة للاختبارات على الخلايا الواحدة، مثل اختبار كوميت وتحليل البؤر المناعي الفلوري، يجب تحليل ما لا يقل عن 50–100 خلية لكل نسخة بيولوجية لتقليل تحيز العينات. في اختبارات التقرير المعتمدة على قياس تدفق الخلايا الخلوي، بما في ذلك اختبارات DR-GFP وFM-HCR، يجب جمع ما لا يقل عن 10,000 حدث خلية حية لكل عينة لضمان المتانة الإحصائية.
  2. استراتيجية التوحيد القياسي
    تتطلب المقارنة الكمية الدقيقة لكفاءة الإصلاح عبر عينات مختلفة أو دفعات تجريبية إجراءات تطبيع صارمة لتقليل التفاوت المنهجي الناتج عن اختلافات في كفاءة النقل الخلوي، واستمرارية الخلايا، وتحميل العينة، وأداء الأجهزة. تشمل استراتيجيات التطبيع الشائعة ما يلي:
    1. التحويل المشترك لبلازميدات التطبيع
      في اختبارات HCR، واختبارات الإصلاح المعتمدة على التقارير، واختبارات الإصلاح المعتمدة على البلازميدات، يوصى بالتنقل المشترك مع بلازميد تطبيع غير متأثر بتلف الحمض النووي. تشمل الضوابط الشائعة استخدام بلازميدات pRL-TK رينيلا لوسيفيراز أو متجهات GFP المعبر عنها بشكل تركيبي. يتم تطبيع كفاءة الإصلاح بحساب النسبة بين إشارة المراسل التجريبي وإشارة المبلغ التحكمي.
    2. التطبيع باستخدام بروتينات تنظيف المنزل أو التلوين الكلي للبروتين
      في تحليلات ويسترن بلوت التي تقيم تعبير البروتين الإصلاحي أو مستويات CPD المتبقية، يجب إجراء التطبيع باستخدام بروتينات تنظيف المنزل، مثل GAPDH، β-أكتين، أو هيستون H3، أو من خلال طرق التلوين الكامل للبروتين، بما في ذلك صبغة بونسو S أو REVERT.
    3. أدوات التحكم السليمة
      في اختبارات الإصلاح المعتمدة على qPCR، يجب تضخيم المناطق الجينومية غير المتضررة كعناصر تحكم داخلية، ويجب حساب مستويات الضرر النسبية باستخدام طريقة ΔCt. وبالمثل، يجب أن تتضمن اختبارات HCR ضوابط بلازميدية غير تالفة تمثل أقصى تعبير للتقرير، مما يسمح بالتعبير عن كفاءة الإصلاح مقارنة بالبلازميدات المرجعية السليمة.
    4. تطبيع عدد الخلايا
      في اختبارات قياس تدفق السيارة، بما في ذلك اختبارات FM-HCR وDR-GFP، يجب تحليل عدد متساو من الخلايا الحية عبر العينات. يجب الإبلاغ عن كفاءة الإصلاح لاحقا كنسبة الخلايا الإيجابية أو التغيرات النسبية في شدة الفلورة.
  3. البعد الحركي لقياس كفاءة الإصلاح
    إصلاح الحمض النووي هو عملية ديناميكية، وقد تفشل القياسات المأخوذة من نقطة زمنية واحدة في التمييز بين الإصلاح المتأخر والنقص الكامل في المسار. لذلك، ينصح بشدة بتصاميم التجارب بمسار زمن.
    بعد استثناء تلف الحمض النووي، يجب جمع العينات في عدة نقاط زمنية متتابعة، مثل 0، 0.5، 1، 2، 4، 8، 12، و24 ساعة، لمراقبة تراكم وإزالة علامات التلف أو منتجات الإصلاح. توفر حركية اختفاء الإشارة معلومات مهمة حول معدل الإصلاح، سلامة المسار، وكفاءة الإصلاح بشكل عام.
  4. تصحيح اختبار الفرضيات المتعددة:
    غالبا ما تتضمن الأساليب عالية الإنتاجية والمتعددة الإرسال تحليلا متزامنا لمسارات إصلاح متعددة أو ظروف تجريبية، مما يزيد من خطر النتائج الإيجابية الكاذبة بسبب المقارنات الإحصائية المتعددة. تشمل الأمثلة التقييم المتزامن لأنشطة BER وNER والموارد البشرية وNHEJ باستخدام اختبارات FM-HCR؛ تحليل DSB على مستوى الجينوم باستخدام BLESS أو BLISS; وتحليل مصفوفات qPCR لتعبير جينات إصلاح DNA.
    وبناء عليه، يجب أن تكون طرق التصحيح الإحصائي لاختبار الفرضيات المتعددة محددة مسبقا أثناء تصميم التجارب. يجب الإبلاغ بوضوح عن طرق التصحيح المختارة وعتبات الدلالة المعدلة في أقسام المواد والأساليب والتحليل الإحصائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الاستنتاجات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكشف الدقيق والتحليل الكمي لعمليات إصلاح تلف الحمض النووي ضروريان لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء إصلاح الحمض النووي، وتقييم التأثيرات البيولوجية للتعرضات البيئية، وتقييم الاستجابات العلاجية78. لذلك، فإن التحقيق المعمق في مسارات إصلاح تلف الحمض النووي وكفاءة الإصلاح له أهمية كبيرة في كل من البحث الأساسي والتطبيقات السريرية79.

أظهرت العديد من الدراسات أن الخلايا الورمية يمكن أن تكتسب مقاومة للعلاج الكيميائي من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصرح المؤلفون بعدم وجود مصالح مالية متنافسة أو علاقات شخصية قد تكون أثرت على العمل المبلغ عنه في هذه الدراسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل مركز أبحاث الهندسة في مقاطعة جيانغسو لتطوير وترجمة التقنيات الرئيسية للوقاية من الأمراض المزمنة والسيطرة عليها؛ فريق البحث المبتكر في مؤسسة جيانغسو للتعليم العالي للعلوم والتكنولوجيا (2021)؛ برنامج مركز أبحاث التكنولوجيا الهندسية في كلية جيانغسو المهنية (2023)؛ ومؤسسة العلوم الطبيعية الرئيسية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو في الصين (منحة رقم 24KJA310008)؛ البرنامج الرئيسي لكلية الصحة المهنية في سوتشو (رقم منحة szwzy202406)؛ ومختبر الدولة الرئيسي لطب الإشعاع والحماية من جامعة سوتشاو (منحة رقمية) GZK1202506).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة