يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة بحثية
* These authors contributed equally
في مرضى إصابات الحبل الشوكي (SCI)، يرتبط ارتفاع تنظيم CASC11 بشدة الإصابة. في المختبر، خفف انخفاض تنظيم CASC11 من الموت المبرمج والالتهاب، مما يشير إلى ارتباط بمحور miR-130b-5p/SPP1 . تشير هذه النتائج إلى الدور المحتمل ل CASC11 كمرشح مؤشر حيوي في مسببات مرض الحبل الشوكي.
إصابة الحبل الشوكي (SCI) هي إصابة شديدة في الجهاز العصبي المركزي. بحثت هذه الدراسة ذات المركز الواحد، الرصدي والمختبري ، في الإمكانات التشخيصية ل CASC11 وآلياته التنظيمية المحتملة في حالات الحبل الشوكي باستخدام عينات مصل سريرية ونماذج خلايا محفزة بالدهون البولي سكاريد. تم قياس مستويات CASC11 وmiR-130b-5p وSPP1 بواسطة تفاعل بوليميراز متسلسل كمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR). تم تقييم وظائف الخلايا وعلاقات الاستهداف من خلال مجموعة عد الخلايا 8 (CCK-8)، وقياس تدفق الخلية، والضربة الغربية، واختبار المقاومة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA)، وتقرير اللوسيفيراز، واختبارات التقرب المناعي للحمض النووي الريبي (RIP). كان CASC11 معبر عنه بشكل كبير في إصابات الحبل الشوكي ومرتبطا بالالتهاب كمؤشر حيوي تشخيصي محتمل. في الخلايا PC-12 المعالجة بالدهون (LPS)، أدى إخماد CASC11 إلى تخفيف كبح نشاط الخلايا المبرمج، والموت المبرمج، والالتهاب، والذي تم عكسه بواسطة مثبط miR-130b-5p. تشير هذه النتائج إلى أن CASC11 مرتبط بشدة الحبل الشوكي، بينما تشير بيانات المختبر إلى تورطه في الاستجابات الالتهابية والاستماتة عبر محور CASC11/miR-130b-5p/SPP1 . هذه الدراسة محدودة بتصميمها المركزي الواحد ونقص التحقق الداخلي .
تشير إصابة الحبل الشوكي (SCI) إلى اضطراب جهازي مؤقت أو دائم ينشأ عن تلف في الحبل الشوكي ناتج عن قوى أو أمراض خارجية، مما يؤدي إلى ضعف وظائف الجهاز العصبي الحركي والحسي والانعكاسي والجهاز العصبي اللاعضوي 1,2. غالبا ما يواجه المرضى عجزا ومضاعفات وظيفية جسدية مدى الحياة، مما يفرض معاناة وأعباء كبيرة على الأفراد والعائلات. يصنف سبب حدوث الحبل الشوكي بشكل عام إلى أصول صادمة وغير صادمة3. تمثل الإصابات الرضحية، التي تنتج غالبا عن كسور العمود الفقري الناتجة عن قوى خارجية مثل حوادث المرور، والسقوط من الارتفاع، والحوادث الرياضية، تحديا متزايدا في الإدارة السريرية لمرض إصابات الحبلالشوكي 4. وفي الوقت نفسه، تعتبر سلسلة الإصابات الثانوية التي تبدأ بعد الإصابة الأولية، خاصة اختلال تنظيم الاستجابة الالتهابية واستماتة الخلايا العصبية، عوامل حاسمة تساهم في التدهور المستمر للوظيفة العصبية. سلطت الدراسات الحديثة الضوء على الدور الحاسم للالتهاب العصبي، والتجدد، والتعافي الوظيفي في الفيزيولوجيا المرضية وإصلاح التهاب الحبلالشوكي 5. كاستجابة ثانوية مركزية، يلعب التهاب الأعصاب دورا مزدوجا في عملية إصابة الأنسجة وإصلاحها. نظرا لمحدودية القدرة التجديدية للحبل الشوكي المصاب، هناك حاجة إلى نهج علاجي متآزر يجمع بين العلاج المضاد للالتهابات، وزراعة الخلايا، وإعادة التأهيل، والتدخلات الجزيئية. بينما تم وضع مجموعة من الاستراتيجيات التشخيصية والعلاجية لسرطان الحبل الشوكي، تعتمد الممارسة السريرية الحالية بشكل رئيسي على الفحوصات التصويرية7. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات مقيدة بمتطلباتها العالية للمعدات المتقدمة، والمتطلبات الصارمة للمرضى، والنفقات المالية الكبيرة8. وبالتالي، هناك حاجة ملحة وغير ملباة لمؤشر بيولوجي مختبري مريح ودقيق وغير جراحي. سيسمح تحديد مثل هذه العلامة بالتشخيص المبكر لمرض الحبل الشوكي دون تعطيل بروتوكولات العلاج التقليدية، مما يسهل تطوير تدخلات علاجية أكثر فعالية وسرعة في الوقت المناسب.
يمثل الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل (lncRNA) فئة رئيسية من جزيئات الحمض النووي الريبي الوظيفية التي، رغم افتقارها لإمكانات ترميز البروتين، إلا أنها جزء لا يتجزأ من مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية، بما في ذلك تنظيم الالتهاب والاستماتة المبرمجة. تعمل LncRNA كإسفنجة جزيئية للميكروRNA (miRNAs)، مما يعيق هذه الميكروRNA من الارتباط وإسكات mRNA المستهدفة10. على سبيل المثال، يقوم lncRNA MAGI2-AS3 بتوسطه miR-223-3p لتسريع شفاء الكسور11. استهداف شبكة lncRNA OIP5-AS1/miR-128-3p/Nrf2 يقدم نهجا علاجيا واعدا لتحسين التعافي في الإصابة بالحبلالشوكي 12. يتميز CASC11 بنسخة 872 قطعة أساس موجود على كروموسوم 8q24.21، ويعرف كجزيء له تعبير غير منظم في أنواع مختلفة من سرطانات بشرية13. يظهر CASC11 تعبيرا إيجابيا لدى مرضى هشاشة العظام بعد انقطاع الطمث، وله القدرة على التمييز بين الأفراد المصابين والأشخاص الأصحاء الضابطين14. علاوة على ذلك، يظهر CASC11 نمط تصحيح مماثل وإمكانات علاجية مشابهة لدى المرضى المصابين بالكسور15. استنادا إلى هذه التقارير، قد ينظم CASC11 الاستجابات الالتهابية ونشاط الخلايا. على الرغم من هذه الرؤى، لا يزال نمط التعبير والدور البيولوجي ل CASC11 في الإصابة بالحبل الشوكي غير معروف تماما. نظرا لأن فرط الالتهاب واستماتة المبرمج هما من المحركات الرئيسية لحدوث الحبل الشوكي الثانوي، افترضنا أن CASC11 قد يكون المؤشر البيولوجي المرشح والعامل التنظيمي في الحبل الشوقي. بحثت هذه الدراسة في الارتباط السريري والإمكانات البيولوجية لمؤشر CASC11 في الخلايا الشوكية من خلال تحليل مجموعات المرضى ونماذج الخلايا المخبرية (الشكل 1). علاوة على ذلك، استكشفنا آلية جزيئية محتملة ل CASC11، بما في ذلك دوره المحتمل في تعديل الاستجابة الالتهابية بعد الحبل الشوكي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تسجيل المواد
تم اختيار وتصنيف المرضى الذين يعانون من إصابات شوكية حادة (عدد = 300) الذين عولجوا في المستشفى من يناير 2023 إلى مايو 2025 إلى مجموعة إصابات الحبل الشوكي الكاملة (CSCI) (الدرجة A، n = 98)، ومجموعة إصابات الحبل الشوكي غير المكتملة (ISCI) (الدرجات B وC وD؛ n = 95)، ومجموعة الوظائف العصبية الطبيعية (NNF) (الدرجة E، n = 107) وفقا لمقياس إعاقة إصابات العمود الفقري الأمريكي (تصنيف AIS). بالنسبة للمرضى في مجموعة NNF، تم تأكيد الأدلة الإشعاعية على وجود الحبل الشوكي مثل الوذمة أو الكدمات أو الضغط، بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، لكن لم تظهر أي عيوب حسية أو حركية. تم اختيار 90 مشاركا أصحاء آخرين تم تجنيدهم خلال نفس الفترة كمجموعة ضابطة. كانت معايير الإدراج: (1) تشخيص إصابة الحبل الشوكي مؤكد بالتصوير (الرنين المغناطيسي أو الأشعة المقطعية)، وفقا للإرشادات الإدارية السريرية المعتمدة16؛ (2) الإصابة التي تعرضت لها خلال 24 ساعة قبل دخول المستشفى؛ و(3) مشاركون بالغون لديهم بيانات سريرية كاملة. كانت معايير الاستبعاد: (1) تاريخ الجراحة السابقة المتعلقة بكسر أو الحبل الشوكي؛ (2) مرض شريان تاجي شديد أو مرض قلبي رئوي كبير؛ (3) إصابة شديدة حادة في القمجمة والدماغ؛ و(4) الأورام الخبيثة، أمراض القلب والأوعية الدموية الدماغية، أو أمراض المناعة. تم الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات في مستشفى الشعب الرابع في شنتشن على هذه الدراسة، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من المشاركين. التزمت الإجراءات المستخدمة في هذه الدراسة بمبادئ إعلان هلسنكي.
مجموعة العينات
تم جمع عينات دم وريدية (5 مل) من المشاركين عند دخولها باستخدام أنابيب فاصل المصل خلال 24 ساعة من الإصابة. تم السماح للدم بالتخثر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ثم تم تمركزه المركزي عند 3,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تم فصل المصل الفائق بعناية، وتم تجميعه في أنابيب دقيقة خالية من RNase، وتخزين عند -80 درجة مئوية حتى إجراء المزيد من التحليل.
زراعة الخلايا وتحفيز LPS
تم زراعة خلايا الورم الورمي الغرمي للفئران (PC-12) وخلايا الميكرودبقية في المورس (BV-2) في وسط إيغل المعدل من دولبيكو مع إضافة 10٪ مصل أبقار جنيني عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. لوضع نماذج إصابات التهابية في المختبر ، تعرضت خلايا PC-12 وBV-2 لبوليبوليسكاريد (LPS) بتركيزات 0، 1، 5، و10 ميكروغرام/مل لمدة 12 ساعة17. تم اختبار كل تركيز في ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة.
RT-qPCR
تم عزل الحمض النووي الريبي الكلي من العينات باستخدام بروتوكول استخراج الفينول-كلوروفورم، تلاها ترسيب باستخدام الإيزوبروبانول. تم تقييم نقاء الحمض النووي الريبي بواسطة القياس الطيفي الضوئي (spectrophotome)، واستخدمت عينات بنسبةA 260/280 نانومتر ضمن نطاق 1.8–2.1 للتحليل اللاحق. تم نسخ RNA عكسيا إلى cDNA وفقا لبروتوكول مجموعة النسخ العكسي، واستخدم cDNA الناتج كقالب لتفاعلات RT-qPCR مع خلطة SYBR Green على جهاز PCR. تم استخدام إنزيم الجلسرا الديهيدريد 3-فوسفات ديهيدروجيناز (GAPDH) كجين مرجعي لmRNA ل CASC11 وSPP1 ، بينما استخدم الحمض النووي الريبي الصغير (U6) كجين مرجعي ل miR-130b-5p. بالنسبة لعينات المصل، تم إدخال سيل-مير-39 الصناعي في المصل قبل استخراج الحمض النووي الريبي للتحكم في التغيرات في استعادة الرنا. كانت المقدمات كما يلي: CASC11 للأمام 5'-ACCCTATGGAGAACCGAGAC-3' والخلف 5'-GAGGACCAACTCAGTAGGAAT-3'; miR-130b-5p أمامي 5'-ATCCATGGTTGAGCTTCCCG-3' والخلف 5'-TAGTGCAACCTCGTCAGAGC-3'; وSPP1 mRNA للأمام 5'-GTTAAACAGGCTGATCTGG-3' والخلف 5'-CATGGTCATCATCATCTTCA-3'. تم حساب التعبير باستخدام طريقة 2-ΔΔCt . تم إجراء كل تفاعل RT-qPCR في نسخ تقنية ثلاثية مع ثلاث نسخ بيولوجية.
النقل المتبادل
تم تصنيع وتحويل كاسكيد CASC11 (si-CASC11)، ومثبط miR-130b-5p، وبلازميد فرط التعبير SPP1 (ov-SPP1)، وضائعهم السلبية (NC) وتحويلها إلى خلايا PC-12 وBV-2 باستخدام كاشف نقل. تم تقييم كفاءة النقل بعد 48 ساعة من النقل في النسخ البيولوجية الثلاثية.
اختبار التكاثر وموت المبرمج
لاختبار بقاء الخلايا، تم زرع الخلايا في صفائح بئر 96 بئر بحجم 5 ×10 إلى 3 خلايا في كل بئر وزرعت لمدة 24 ساعة للسماح بالالتصاق. بعد هذه الحضانة، تم ضخ 10 ميكرولتر من كاشف CCK-8 في كل بئر، تلاها الحضانة لمدة ساعتين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. ثم تم تسجيل الكثافة البصرية عند 450 نانومتر باستخدام قارئ ميكرولبيت. لاكتشاف الاستماتة، تم فصل الخلايا بالتربسين، وشطفها مرتين بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)، وتعليق في مخزن الارتباط حتى تركيز نهائي من 1 ×10 6 خلايا/بئر. بعد ذلك، تم وضع 100 ميكرولتر من التعليق في أنبوب قياس خلوي بسعة 5 مل، تلاه إضافة محلول تلوين 5 ميكرولتر من Annexin V-FITC و5 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم (PI). تم خلط العينات بلطف والاحتفاظ بها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء. ثم أضيف مخزن الارتباط إلى حجم إضافي نهائي قدره 400 ميكرولتر لكل أنبوب، وتم قياس الخلايا المبوتجة بواسطة قياس خلوي التدفق. تم تحليل جميع الحالات باستخدام ثلاث نسخ تقنية في ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة.
اختبار نشاط اللوسيفيراز المزدوج
تم التنبؤ بالأهداف اللاحقة ل CASC11 وmiR-130b-5p من خلال مواقع المعلوماتية الحيوية (lncRNASNP2 و TargetScan). تم تصنيع واستنساخ شظايا تحتوي على تسلسلات مكملة من النوع البري (wt) أو المتحولة (mut) إلى متجه مراسل مزدوج اللوسيفيراز لبناء بلازميدات wt وMut reporter. تم زرع خلايا PC-12 وتحويلها معا مع مثبط/مقلد miR-130b-5p، وبلازميدات wt/mut المبنية باستخدام كاشف نقل يعتمد على الدهون. بعد 48 ساعة، تم قياس نشاط اللوسيفيراز لتقييم التفاعل. تكونت كل مجموعة من ثلاث نسخ تقنية وثلاث نسخ بيولوجية.
اختبار التكرار المناعي للحمض النووي الريبي (RIP)
تم إجراء عملية RIP باستخدام مجموعة توصيل مناعية مرتبطة بالحمض النووي الريبي. تم تحلل الخلايا باستخدام مخزن التحلل وحضانتها بأجسام مضادة مضادة Ago2 أو أجسام مضادة IgG طبيعية. تم إثراء مركبات البروتين الريبي باستخدام خرز مغناطيسي. بعد الغسيل، تمت إزالة البروتينات المرتبطة، وتم عزل الحمض النووي الريبي المناعي المثقل بالمشاهد. تم قياس مستويات التخصيب في CASC11 وmiR-130b-5p بواسطة RT-qPCR. تكونت كل مجموعة من ثلاث نسخ تقنية وثلاث نسخ بيولوجية.
البقعة الغربية
تم تحضير محللات البروتين من خلايا PC-12 وBV-2 باستخدام مخزن تحلل الخلية، وتم قياس محتوى البروتين الكلي باستخدام اختبار BCA. لكل عينة، تم تحميل 30 ميكروغرام من البروتين على هلام SDS-PAGE بنسبة 12٪ ونقلها إلى أغشية PVDF بعد الفصل الكهربائي. تم حجب الأغشية لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في حليب خالي الدسم بنسبة 5٪ مخفف في TBST ثم حضنتها طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد Bcl-2، باكس، الكاسباز-3 المشقوق، وGAPDH بتخفيف 1:1,000. بعد الغسل، تم حضن الأغشية بأجسام مضادة ثانوية متقاربة ب HRP لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تحليل إشارات البروتين باستخدام برنامج تحليل الصور، واستخدمت كثافات النطاقات لتقييم تعبير البروتينات المرتبطة بالموت المبرمج. شملت تجارب البقعة الغربية ثلاث نسخ بيولوجية، مع ثلاث نسخ تقنية لكل مجموعة.
إليسا
تم قياس تركيزات السيتوكينات الالتهابية TNF-α وIL-1β وIL-6 في مصل المرضى والخلايا الفائقة PC-12 وBV-2 باستخدام مجموعات ELISA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تم حضن العينات في آبار مطلية مسبقا، وأضيفت أجسام مضادة للكشف لمزيد من الحضانة. تمت إضافة واحتضان ترافق الإنزيم. بعد الغسيل، أضيفت ركائز لتطوير اللون، وتم إنهاء التفاعلات. تم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الميكروبليت وتحويله إلى تركيزات عوامل التهابية بناء على المنحنى القياسي المقدم. تم إجراء كل اختبار ELISA في نسخ تقنية ثلاثية عبر ثلاثة نسخ بيولوجية مستقلة.
التحليل الإحصائي
تم الإبلاغ عن المتغيرات المستمرة كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD)، وتم عرض المتغيرات التصنيفية كأرقام ونسب مئوية (n, ٪). تم إجراء مقارنات بين مجموعتين باستخدام اختبار t الخاص بالطالب. للمقارنات التي تشمل أكثر من مجموعتين، تم تطبيق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA)، تلاه اختبار توكي بعد الاختبار. تم تقييم قدرة CASC11 على التمييز بين المجموعات السريرية باستخدام تحليل منحنى خصائص تشغيل المستقبل (ROC). تم فحص الروابط بين متغيرين من خلال تحليل الارتباط من بيرسون. بالنسبة للتجارب القائمة على الخلية، احتوت كل مجموعة على ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة، وتم تكرار كل قياس في ثلاث نسخ تقنية. تم تعريف الدلالة الإحصائية بأنها P < 0.05.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البيانات الأساسية للمشاركين
تعرض الخصائص الأساسية للمرضى في مجموعات الضابطة، وNNF، وISCI، وCSCI في الجدول 1. كشف التحليل الإحصائي عن عدم وجود فروق ذات دلالة كبيرة بين المجموعات في المتغيرات، مثل الجنس، العمر، مؤشر كتلة الجسم (BMI)، أسباب الإصابة، ووقت الإصابة (P > 0.05). لوحظت فروقات ذات دلالة إحصائية بين المجموعات الأربع في مدة الإقامة، ودرجة ASIA، وتركيزات عامل نخر الورم المضاد للالتهابات (TNF-α)، والإنترلوكين-1بيتا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إصابات الحبل الشوكي هي حالة مدمرة للجهاز العصبي المركزي تؤدي غالبا إلى نقص كبير في الإحساس، والتحكم الحركي، والوظائف الذاتية، مما يقلل بشكل كبير من جودة حياة المريض وتوقعات الحالة طويلة الأمد. قد يظهر المرضى مع ضعف وظيفي وفقدان حسي بعد إصابة العمود الفقري، ويمكن استخدام دراسات تصويرية (مثل الرنين المغناطيسي) لتقييم حدوث إصابات الحبلالشوكي 19. يؤدي ظهور الحبل الشوكي إلى سلسلة إصابة ثانوية ضارة، تتميز بالتهاب عصبي شديد، وذمة، وتسلل الخلايا ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| BCA protein assay kit | Yeasen, China | P0010 | |
| CCK-8 solution | Sigma-Aldrich, USA | 96992 | |
| Dual-luciferase reporter vector | Promega, USA | E133A | pmirGLO vector |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | ATCC, Manassas, VA, USA | 30-2002 | |
| ELISA kit for IL-1β | R&D Systems, USA | DY401 | |
| ELISA kit for IL-6 | R&D Systems, USA | HS600B | |
| ELISA kit for TNF-α | R&D Systems, USA | DTA00C | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand Island, NY, USA | 10099141 | |
| Flow cytometer | BD FACSCalibur, USA | FACS101 | |
| Image analysis software | NIH, Bethesda, MD, USA | version 1.44p | ImageJ software |
| Isopropanol | Beijing Chemical Factory, China | 32064 | |
| Lipid-based transfection reagent | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | L3000008 | Lipofectamine 3000 |
| Lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich, USA | L2880 | |
| Lysis buffer | Beyotime, China | P0013D | RIPA lysis buffer |
| Microplate reader | Reagen, China | RNE90002 | |
| PC-12 and BV-2 cells | ATCC, Manassas, USA | ||
| Phenol-chloroform reagent | Thermo, USA | 15596026 | Trizol reagent |
| Reverse transcription kit | Takara, Japan | RR047A | PrimeScript RT Kit |
| RNA-binding protein immunoprecipitation kit | Millipore, USA | 17-700 | Magna RIP Kit |
| RNase-free microtubes | Axygen, Corning, NY, USA | MCT-150-C-S | |
| Serum separator tubes | Terumo, Tokyo, Japan | VP-AS109K60 | |
| Statistical analysis software | San Diego, USA | version 9.0 | GraphPad Prism |
| SYBR Green premix | Takara, Japan | RR420A | SYBR Premix Ex Taq |