تحليل الدواء الشبكي ونموذج الفئران لحبوب يوغوي في التهاب البروستاتا الناتج عن كاراجينان

ملخص

تدمج هذه الدراسة علم الأدوية الشبكي والتجارب في الجسم الحي لدراسة التأثيرات المحتملة لحبة يوغوي في علاج التهاب البروستاتا. أشارت تحليلات الدواء الشبكي وعلاج YGP في نموذج التهاب البروستاتا لدى الفئران إلى أن التأثيرات العلاجية ل YGP قد تكون مرتبطة بتنظيم الاستجابات الالتهابية، مما يشير إلى أن YGP يمارس تأثيرات مضادة للالتهاب في التهاب البروستاتا.

الملخص

التهاب البروستاتا هو اضطراب مسالك بولية شائع له خيارات علاجية محدودة. أظهرت حبوب يوغوي (YGP) قيمة علاجية محتملة، خاصة في الحالات المرتبطة بالالتهابات. هدفت هذه الدراسة إلى تقييم تأثيراته واستكشاف الآليات الكامنة المحتملة. تم فحص المكونات النشطة ل YGP من TCMSP باستخدام معايير التوافر البيولوجي الفموي (OB ≥ 30٪) ومعايير الشبه الدوائي (DL ≥ 0.18)، وتم جمع الأهداف المقابلة. تم الحصول على أهداف مرتبطة بالتهاب البروستاتا من خلال GeneCards، وتم تحليل الأهداف المتداخلة باستخدام شبكات تفاعل البروتين والبروتين (PPI) وموسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG). تم تحديد ما مجموعه 126 مركبا نشطا و208 أهدافا محتملة، مع 180 هدفا متداخلا مرتبطا بالتهاب البروستاتا. حدد تحليل مثبطات مضخة البروتون TP53، IL6، AKT1، TNF، وIL1B كجينات محورية رئيسية. أشارت إثراء KEGG إلى تورط مسارات مرتبطة بالالتهابات، بما في ذلك مسارات إشارات IL-17، TNF، MAPK، وPI3K-Akt. تم تأسيس نموذج الجرذان لالتهاب البروستاتا عن طريق حقن الكاراجينان داخل البروستاتا. تم إجراء فحص نسيجي وقياس عامل نخر الورم-ألفا (TNF-α) والإنترلوكين-6 (IL-6) لتقييم التأثيرات العلاجية. حسن علاج YGP من علم النسيجة البروستاتي وخفض مستويات TNF-α وIL-6 عند مستويات البروتين والmRNA. تشير هذه النتائج إلى أن YGP يمارس تأثيرات مضادة للالتهابات في التهاب البروستاتا، بينما لا تزال الآليات الجزيئية المحددة بحاجة إلى التحقق من صحتها بشكل أكبر.

المقدمة

التهاب البروستاتا هو حالة تتكون فيها غدة البروستاتا ملتهبة مع تورم وتهيج¹. يمثل حوالي 25٪ من التجارب السريرية العالمية في المسالك البولية². قسم المعاهد الوطنية للصحة (NIH) التهاب البروستاتا إلى أربع تصنيفات: البكتيري الحاد، البكتيري المزمن، التهاب البروستاتا المزمن/متلازمة ألم الحوض المزمن (CP/CPPS)، والتهاب البروستاتا بدون أعراض³. من بين هذه الحالات، يعد CP/CPPS الشكل الأكثر انتشارا ويرتبط ارتباطا وثيقا بالالتهاب المستمر واضطراب تنظيم المناعة. على الرغم من التقدم في فهم الطبيعة الالتهابية لالتهاب البروستاتا، لا تزال الاستراتيجيات العلاجية الحالية محدودة، خاصة للأنواع الفرعية غير البكتيرية ^4,5. تستخدم المضادات الحيوية بشكل شائع في الممارسة السريرية؛ ومع ذلك، فإن فعاليتها في التهاب البروستاتا غير البكتيري مثيرة للجدل بشدة⁶. تشمل العلاجات الأخرى، التي تتراوح بين حاصرات α إلى الأدوية المضادة للالتهابات غير الستيرويدية (NSAIDs)، بشكل أساسي تخفيف الأعراض لكنها غالبا ما تظهر نتائج غير مثالية، مع مخاطر لا يمكن تجاهلها من اضطرابات الجهاز الهضمي، انخفاض ضغط الدم الانتصابي، وهكذا ^7,8,9,10. تسلط هذه القيود الضوء على الحاجة إلى طرق علاجية بديلة يمكنها تنظيم الالتهاب في التهاب البروستاتا بفعالية.

قد يقدم الطب الصيني التقليدي (TCM) مجموعة أوسع من الفوائد العلاجية مع ملف أمان وتحمل أكثر ملاءمة¹¹. حبوب يوغوي (YGP)، وهي صيغة كلاسيكية موثقة في جينغيوي تشوانشو، تم استخدامها تجريبيا لقرون لتجديد اليانغ الكلى واليانغ وتخفيف الاضطرابات المرتبطة^بها. أفادت دراسات سابقة أن بعض مكوناته تمتلك أنشطة مضادة للالتهابات^{13، 14، 15، 16}. تشير الأدلة السريرية إلى أن YGP يمكن أن يخفف بفعالية أعراض التهاب البروستاتا، رغم أن الآلية الأساسية لا تزال غير واضحة¹⁷. تعد علم الأدوية الشبكي نهجا قويا وتكامليا يجمع بين علم الأحياء المنظومي وعلم الأدوية لكشف الآليات المعقدة للطب التقليدي^. تم افتراض أن YGP قد يمارس تأثيرات مضادة للالتهابات من خلال تعديل عدة أهداف ومسارات مرتبطة بالالتهابات. تم تقييم هذه التنبؤات بشكل إضافي باستخدام نموذج التهاب البروستاتا في الجسم الحي، حيث تم تحفيز التهاب البروستاتا عن طريق حقن كاراجينان. بعد تأسيس النموذج، تم علاج الحيوانات باستخدام YGP. تم جمع أنسجة البروستاتا للفحص النسيجي المرضي عبر تلوين الهيماتوكسيلين والإيوسين (HE)، وكذلك للتقييم الكمي للمؤشرات الالتهابية باستخدام اختبار التوربنت المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR).

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة بكين للطب الصيني (BUCM-2024110107-4103).

جمع المكونات والأهداف النشطة
يتكون YGP من Rehmannia glutinosa، Aconitum carmichaelii، Cinnamomum cassia، Dioscorea opposita، Cornus officinalis، Cuscuta chinensis، Angelica sinensis، Eucommia ulmoides، Cervi Cornus Colla، وLycium barbarum. تم إدخال أسماء هذه الأعشاب في قاعدة بيانات وتحليل أنظمة الطب الصيني التقليدية (TCMSP) لاسترجاع مركباتها. تم فحص المركبات الفعالة باستخدام معايير التوافر الحيوي الفموي (OB ≥ 30٪) ومعايير الشبه الدوائي (DL ≥ 0.18) 19,20,21. تم الحصول على الأهداف المقابلة لكل مركب من TCMSP وتوحيدها على رموز جينية باستخدام قاعدة بيانات UniProt. تم استرجاع الأهداف المتعلقة بالتهاب البروستاتا من قاعدة بيانات GeneCards باستخدام كلمة "التهاب البروستاتا" ككلمة مفتاحية، وتم اختيار جينات ذات درجة ذات صلة أعلى من المتوسط للإدراج في الدراسة.

بناء شبكة تنظيمية لبرنامج YGP ضد التهاب البروستاتا
تم تحديد وتعريف التقاطع بين الأهداف المرتبطة ب YGP ومرتبط بالتهاب البروستاتا كمجموعة من الأهداف العلاجية المحتملة. تم استيراد هذه الأهداف إلى Cytoscape (الإصدار 3.9.1) لبناء شبكة مركبة وهدف مرضية. تم إجراء تحليل طوبولوجيا الشبكة باستخدام إضافة CytoHubba، وتم تحديد المكونات الرئيسية بناء على قيم مركزية الكليك القصوى (MCC)²².

تحليل شبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI)
تم استيراد الأهداف المتداخلة إلى قاعدة بيانات STRING (الإصدار 11.5)، مع تعيين الكائن الحي على الإنسان العاقل. تم تعيين الحد الأدنى لدرجة التفاعل المطلوبة إلى ≥ 0.7، وتم إخفاء العقد غير المتصلة²³. تم تصدير بيانات التفاعل بصيغة TSV وعرضها في Cytoscape. تم تحديد جينات المركز أيضا باستخدام إضافة CytoHubba بناء على مركزية الدرجة.

تحليل مسار KEGG وتحليل إثراء GO
تم رفع الأهداف المشتركة إلى منصة Metascape لتحليل مسار موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG). تم تعيين أنواع المدخلات والتحليل على الإنسان العاقل. تم إجراء تحليل إثراء مسار KEGG. تم تصفية المسارات بشكل أكبر بناء على صلتها بالتهاب البروستاتا، كما حددتها الأدبيات المنشورة والتعليقات التوضيحية في قواعد البيانات. تم ترتيب المسارات المتبقية وفقا لقيم Log P الخاصة بها. تم تصور مسارات KEGG الأعلى المثرية باستخدام مخططات الفقاعات.

الالتحام الجزيئي
تم اختيار الأهداف الرئيسية من شبكة PPI بناء على مركزية الدرجة، وتم تحديد المركبات الفعالة من شبكة تنظيم YGP-التهاب البروستاتا بناء على قيم MCC لتحليل الالتحام لاحقا. تم الحصول على هياكل البروتين من قاعدة بيانات AlphaFold لبنية البروتين بصيغة PDB، وتم تحميل هياكل الليغاند من TCMSP بصيغة mol2²⁴. تم إجراء الالتحام الجزيئي باستخدام منصة CB-Dock2 الإلكترونية^{رقم 25}. قبل التحم، كانت هياكل البروتينات تتم معالجتها مسبقا تلقائيا عن طريق إزالة جزيئات الماء، وإضافة ذرات الهيدروجين، وإكمال البقايا المفقودة. تم تسجيل تقارير الربط، وتم إنشاء خرائط حرارة باستخدام GraphPad Prism (الإصدار 10.1.2). تم تصور البنى ثلاثية الأبعاد لمجمعات الليغاند-البروتين ذات أدنى درجات فينا باستخدام كيميراكس، وتم إنشاء مخططات تفاعلية ثنائية الأبعاد باستخدام LigPlus.

تحضير المستخلص المائي من YGP
تم تحضير المكونات العشبية في YGP وفقا لنسبة التركيب التقليدية، بما في ذلك 24 جرام من الجذر المعالج لريهمانيا غلوتينوزا (شوديهوانغ)، 6 جرام من الجذر الجانبي المعالج لأكونيتوم كارميكايلي (فوزي)، 6 جرام من لحاء سيناموموم كاسيا (روغوي)، 12 جرام من جذور ديوسكوريا المقابل (شانياو)، 9 جرام من ثمرة كورنوس أوفيسيناليس (شانزويو)، 12 جرام من بذور Cuscuta chinensis (توزيزي)، 12 جرام من جيلاتين قرون المعالجة من Cervi Cornus colla (Lujiaojia)، 12 جرام من ثمرة Lycium barbarum (غوكي)، 9 جرام من جذر Angelica sinensis (دانغغوي)، و12 جرام من لحاء Eucommia ulmoides (دوجونغ). تم نقع جميع الأعشاب باستثناء Aconitum carmichaelii وCervi Cornus Colla في 6 أضعاف وزنها الكلي للماء المقطر لمدة 30 دقيقة، بينما تم نقع Aconitum carmichaelii بشكل منفصل في 6 أضعاف وزنه من الماء المقطر. تم إخراج أكونيتوم كارميكايلي أولا باستخدام جهاز تسخين كهربائي لمدة ساعة واحدة، وبعد ذلك تضاف الأعشاب المتبقية باستثناء سيرفي كورنوس كولا وتتقط مرتين لمدة ساعة في كل دورة. تم إذابة Cervi Cornus Colla لاحقا في حمام ماء عند 60–70 درجة مئوية حتى تذوب بالكامل وتدمج في المستخلص. بعد التبريد، كان يتم ترشيح المحلول عبر شاش مزدوج الطبقات، ثم يرفع على الكوكوت، ويجمد عند -20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة، ثم يزرع بالليوفيبيلات للحصول على مستخلص مسحوق.

نموذج الحيوان وتصميم التجارب
تم تربية ذكور فئران سبراج-داولي (عمرها 8 أسابيع، وزنها 200–220 جرام) في ظروف خالية من الممرضات مع دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة وسهولة الوصول إلى الطعام والماء. بعد أسبوع واحد من التكيف، تم تقسيم الفئران عشوائيا إلى ثلاث مجموعات (n = 6 لكل مجموعة): مجموعة الضابطة، النموذج، ومجموعات YGP. تم تحفيز التهاب البروستاتا المزمن عن طريق حقن محلول كاراجينان بنسبة 3٪ داخل البروستاتا²⁶. لفترة وجيزة، تم تخدير الفئران بالأيزوفلوران (3–4٪ للتحفيز و1.5–2٪ للصيانة)، وأجري شق بطني في منتصف الخط لكشف البروستاتا. تم حقن ما مجموعه 25 ميكرولتر من محلول كاراجينان بنسبة 3٪ في كل فص بطني من البروستاتا. تلقت مجموعة الضابطة حقنا داخل البروستاتا بمحلول ملحي طبيعي (محلول ملحي فسيولوجي) فقط. تم إعطاء البنسلين بعد العملية (2.5 ×^{10 5} يو/كجم) عن طريق العضلات لمدة 3 أيام.

تم تحضير مسحوق المستخلص المحمر من الليوفيل من المحلول الصناعي وأعيد تشكيله في محلول ملحي عادي معقم بنسبة 0.9٪ للحصول على تعليق موحد للجفاف الفموي (10.54 جم/كجم/يوم). تلقت الفئران في مجموعة YGP إعطاءا فمويا لمستخلص YGP (10 مل/كغ)، بينما حصلت مجموعات الضابطة والنماذج على حجم مكافئ 0.9٪ من محلول ملحي طبيعي معقم. بعد 4 أسابيع، تم تخدير الفئران بالبنتوباربيتال الصوديوم (50 ملغ/كجم، حقن داخل الصفاق)، وتم جمع أنسجة البروستاتا بعد التضحية بها وفقا للإرشادات الأخلاقية.

الفحص النسيجي المرضي
تم تثبيت أنسجة البروستاتا في 4٪ بارافورمالديهيد لمدة 24 ساعة، ثم تم تجفيفها عبر الإيثانول الدرج (75٪ كحول لمدة 4 ساعات، 85٪ كحول لمدة ساعتين، 90٪ كحول لمدة ساعتين، 95٪ كحول لمدة ساعة واحدة، إيثانول مطلق لمدة ساعة واحدة)، وتم تطهيرها في الزيلين، ودمج البارافين. ثم خضعت الأقسام (4–5 ميكرومتر) لتلوين انفجارات عالية وفق الإجراءات القياسية²⁷. لفترة وجيزة، تم إزالة البارافين، وإعادة ترطيبها، وصبغها بالهيماتوكسيلين، وتمييزها، وصبغها بالإيوزين. بعد الجفاف والتثبيت، تمت ملاحظة المقاطع تحت المجهر الضوئي لتقييم نسيجي مرضي.

تم تقييم الالتهاب النسيجي المرضي باستخدام نظام تسجيل شبه كمي يعتمد على تسرب الخلايا الالتهابية، وتكاثر الخلايا الليفية، وشكل الأسينار، وحالة الإفراز في الجسم. تم تقييم تسرب الخلايا الالتهابية بأنه 0 (عدم تسلل)، 2 (تسرب خفيف)، 4 (تسرب متوسط)، و6 (تسرب شديد). تم تصنيف تكاثر الأرومات الليفية إلى 0 (غائب)، 1 (خفيف)، 2 (متوسط)، و3 (شديد). تم تقييم شكل التجويف الأكيناري على النحو التالي: 0 (تجويف حزينة كبير)، 1 (حجم تجويف منخفض بشكل متوسط)، 2 (حجم التجويف منخفض بشكل ملحوظ)، و3 (انسداد أو اختفاء الحرابة الأكينارية). تم تقييم حالة الإفراز على النحو التالي: 0 (إفراز وفير)، 1 (إفراز متوسط)، 2 (إفراز قليل)، و3 (غياب الإفراز). تم حساب الدرجة النسيجية الكلية كمجموع لجميع المعايير الأربعة، مع المؤشرات الأعلى التي تشير إلى إصابة نسيج البروستاتا الأكثر شدة والتهاب²⁸.

إليسا
تم شطف أنسجة البروستاتا (100 ملغ) بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد (PBS) وتم توحيدها في محلول تحلل مع مكمل مثبطات للبروتيياز. تم حضن التجانسات عند 4 درجات مئوية لمدة 30–120 دقيقة وطرد مركزها عند 5000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية لجمع المواد الفائقة. تم قياس مستويات البروتين في TNF-α وIL-6 باستخدام مجموعات ELISA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تمت إضافة المعايير والعينات إلى صفائح 96 بئرا وحضنتها عند 37 درجة مئوية، تلتها حضانة متتالية مع الأجسام المضادة البيوتينيلية والإنزيمات المترافقة. بعد الغسيل، أضيف محلول الركيزة لتطوير اللون، وتم إنهاء التفاعل بمحلول الإيقاف. تم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ ميكروبلايت. تم حساب تركيزات السيتوكين بناء على منحنيات قياسية.

qRT-PCR
تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من أنسجة البروستاتا باستخدام طريقة عمودية وقياسه بقياس الامتصاص عند 260 و280 نانومتر لتقييم النقاء. تم نسخ عينات الحمض النووي الريبي عكسي إلى cDNA عند 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة باستخدام مجموعة النسخ العكسي. تم إجراء qRT-PCR باستخدام جهاز دورة حرارية تحت الشروط التالية: إزالة الطبيعة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان و60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. تسلسلات البادئات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في الجدول التكميلي 1. تم جمع إشارات الفلورة خلال خطوة التلدين/التمديد. تم تطبيع مستويات تعبير TNF-α وIL-6 إلى الجين المرجعي الداخلي GAPDH. تم حساب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2^−ΔΔCt .

التحليل الإحصائي
تعرض جميع البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم إجراء تحليلات إحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism (الإصدار 10.1.2). تم تقييم توزيع البيانات للاستقرار قبل التحليل. تم تحليل الفروقات بين مجموعات متعددة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) تلاه اختبار توكي بعد الوقوع للمقارنات المتعددة. تم اعتبار قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

تحديد المكونات النشطة حيويا والجينات المستهدفة
تم تحديد ما مجموعه 126 مكنا حيويا نشطا في YGP تستوفي المعايير (≥ التوليد 30٪ وDL ≥ 0.18). وهو ما يتوافق مع 208 جينات مستهدفة متوقعة. أظهرت قاعدة بيانات GeneCards 9,845 جينا مرتبطا بالتهاب البروستاتا. كشف تحليل فين عن وجود 180 جينا متداخلا بين الأهداف المتوقعة ل YGP والجينات المرتبطة بالتهاب البروستاتا، مما يشير إلى أن هذه الأهداف المشتركة قد تتوسط في التأثيرات العلاجية ل YGP ضد التهاب البروستاتا (الشك...

المناقشة

يعرف التهاب البروستاتا مرضيا بزيادة وجود الخلايا الالتهابية داخل نسيج البروستاتا أو الميزنشيم^28,29. في دراسة شملت أكثر من 5 ملايين رجل كوري تابعوا لمدة تسع سنوات، أكد كيم وآخرون من خلال تحليل متعدد المتغيرات أن التهاب البروستاتا يزيد بشكل كبير من خطر الإصابة بسرطان البروستاتا³⁰. ومع ذلك، لا تزال الإدارة السريرية الحالية محدودة، خاصة في حالات التهاب البروستاتا غير البكتيري، حيث لا تزال خيارات العلاج غير مثا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
4٪ paraformaldehyde	بيوتايم	P0099-3L
قاعدة بيانات بنية البروتين ألفا فولد	قاعدة بيانات بنية البروتين ألفا فولد	https://alphafold.ebi.ac.uk/
مزيج QPCR ب BeyoFast SYBR Green (مرتين)	بيوتايم	D7260
منصة المعلوماتية الحيوية عبر الإنترنت	منصة المعلوماتية الحيوية عبر الإنترنت	http://www.bioinformatics.com.cn/
كاراجينان	أورليف	S30559
CB-DOCK2	CB-DOCK2	http://183.56.231.194:8001/cb-dock2/php/blinddock.php
سيتوسكيب	سيتوسكيب	https://cytoscape.org/
بطاقات الجين	بطاقات الجين	https://www.genecards.org/
الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&) ه) مجموعة التلوين	بيوتايم	C0105S
ميتا سكيب	ميتا سكيب	https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1
بلسام المحايد	سيرفيسبيو	WG10004160
شمع البارافين (للتضمين)	سيرفيسبيو	RP-15
كوكتيل مثبط البروتياز (100X)	إبيزيم	GRF101
مجموعة RAT IL-6 ELISA	بيوتايم	PI328
رات TNF-&; طقم	بكين   4A  شركة بيوتك المحدودة	CRE0003
طقم عزل RNA طويل من RNAeasy Animal مع عمود الدوران	بيوتايم	R0026
الوتر	الوتر	https://string-db.org/
TCMSP	TCMSP	https://www.tcmsp-e.com/#/database
يونيبروت	يونيبروت	https://www.uniprot.org/