مقالة منهجية

الفحص المتوازي في الجسم الحي لإزالة الجينات وتفعيله في غدة ثديي الفأر

DOI:

10.3791/71115

⸱

يوليو 24, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول نهج فحص CRISPR القابل للتوسع داخل القنوات، مما يتيح دراسات موازية لإزالة وتنشيط الجينات في الجسم الحي في غدة الثدي الفأرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم شاشات الوراثة الأمامية بشكل روتيني لتشويش آلاف العناصر الجينية بشكل مشترك بهدف إنتاج خرائط وراثية إلى نمط وراثي واسع النطاق. وعلى الرغم من أنها غالبا ما تجرى في أنظمة زراعة الخلايا، إلا أن تراكم الأدلة تدعم أن الشاشات في الجسم الحي لديها القدرة على كشف بيولوجيا جديدة لا يمكن تلخيصها في المختبر. ومع ذلك، فإن التطبيق الواسع لهذا النهج كان محدودا بتحديين رئيسيين: التركيز السائد على اضطرابات فقدان الوظيفة بدلا من تنشيط الجينات، والعقبات التقنية الكبيرة في توصيل المكتبات الجينية المعقدة إلى أنسجة محددة في الجسم الحي. لتجاوز هذه التحديات، نصف استراتيجية حقن داخل القنوات بسيطة ومتعددة الاستخدامات تتيح فحصا جينوميا وظيفيا فعالا وسريعيا في غدة ثديية الفأر، من خلال توليد عشرات الآلاف من النسخ الظهارية المنفصلة. علاوة على ذلك، نوفر جميع التفاصيل اللازمة لتوليد المكتبات، والحقن داخل القنوات، وإزالة التفاف الشاشة، وتحليل مكتبات CRISPR-Knockout and Activation للحصول على شاشات شاملة داخل الجسم . باستخدام هذه الأدوات، التي أطلقنا عليها اسم CRISPR-KOALA (اختبار الضربة والتفعيل المرتبط)، حددنا مثبطات وأورام جديدة وجينات أورام داخل الجينوم المشفر وغير المشفرة في مكتبات مجمعة تتراوح من 46 موقعا إلى خمس الجينوم. من المهم أن هذا النهج والتحليل يمكن تطبيقه على أعضاء أخرى لدراسة الوظيفة البيولوجية لأي جين أثناء التوازن الداخلي أو المرض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر شاشات الجينوم الوظيفية إطارا قويا لفحص وظيفة الجينات على المستوى1. لقد مكن تطوير تقنيات تحرير الجينات من CRISPR-Cas من الاضطراب المنهجي لمئات إلى آلاف الجينات بالتوازي، وأصبحت الشاشات المجمعة القائمة على كريسبر في خطوط خلايا الثدييات حجر الزاوية في أبحاث علم الأحياء السرطانيالحديثة 2. وقد حددت هذه الأساليب في المختبر الجينات الأساسية3، ومثبطات الأورام4، والتفاعلات القاتلة الاصطناعية5 عبر سياقات سرطانية متنوعة. ومع ذلك، هناك قيد رئيسي واحد وهو عدم القدرة على التقاط الخصائص البيولوجية المعقدة للأورام في الجسم الحي، بما في ذلك التفاعلات مع الجهاز المناعي والجد، وتدرجات العناصر الغذائية، وبنية الأنسجة داخل البيئة الدقيقة2. تماشيا مع هذا القيد، أظهرت دراسات حديثة أن العديد من جينات الدافع الحقيقي للسرطان تفشل في ممارسة تأثيرات قابلة للقياس في المختبر، خاصة عندما تعتمد وظيفتها على إشارات بيئية دقيقة غائبة في زراعة الخلايا 6,7,8,9,10.

توفر غدة الثدييات الفأرية سياقا نسيجيا فريدا وميزة لفحص الجينوم الوظيفي في الجسم الحي. خلايا الظهارة الثديية شديدة التجدد، وتخضع لجولات من التوسع النسني أثناء دورة الشبق، وتنظم في شبكة قنوات متفرعة يمكن الوصول إليها بسهولة وتعديلها وراثيا 11,12,13. دعمت هذه الميزات عقودا من التحليلات الجينية الفسيفسائية وتجارب تتبع النسب، وأثبتت أن الغدة الثديية نظام قابل للبحث عن وظائف الجينات الجوهرية للخلايا والمعتمدة على البيئة الدقيقة خلال توازن الأنسجة والأمراض14، 15، 16، 17، 18، 19، 20، 21، 22، 23، 24، 25، 26، 27، 28، 29، 30، 31، 32، 33. من المهم أن الاضطرابات الجينية يمكن حصرها في الحجرة الظهارية، مما يتيح دراسة مباشرة للمحركات الخاصة بالتحول في الظهارة، وتنافس الخلايا، وجودة السلالة، وتطور الورم في سياق نسيج سليم.

بينما تم تطوير عدة استراتيجيات لنقل الاضطرابات الجينية مباشرة إلى الغدة الثديية البالغة في الموقع، لا تزال هناك عقبات تقنية كبيرة أمام التطبيقات عالية الإنتاجية. تم استخدام إنزيم Cre recombinase عبر الفيروس اللاديدي على نطاق واسع لتحفيز إعادة التركيب الجسدي للأليلات الشرطية في الغدة الثديية البالغة 34,35,36,37، مما يوفر وسيلة فعالة للتلاعب بوظيفة الجينات دون الحاجة إلى تكاثر الجرثومة المعقد المطلوب لنماذج الفئران المعدلة وراثيا التقليدية (GEMMs). بينما يمكن لفيروس الغدي عالي التيتر أيضا توصيل مكونات CRISPR-Cas9 إلى الخلايا المقيمة في الأنسجة، إلا أن هذه الناقلات لا تندمج في جينوم المضيف 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. هذا يحد بشدة من حجم الشاشات إلى ~10–55 جينا، حيث يجب تسلسل كل موقع هدف ل gRNA بشكل فردي باستخدام مجسات الانعكاس الجزيئي 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 . علاوة على ذلك، تتيح طرق التوصيل داخل القنوات الحالية الوصول المباشر إلى جهاز القنوات الثدية، لكنها تتطلب إما تعرضا جراحيا غازيا للغدة الثديية50 أو الاعتماد على استخدام حقن هاميلتون الكبيرة نسبيا وهي51 الثقيلة. على الرغم من فعاليتها في نقل الفيروس محليا، إلا أن هذه الأساليب تدخلية نسبيا، وتحديات تقنية، وغير محسنة لتوصيل المكتبات المجمعة للفيروسات اللينتيفيرالية القابلة للتوسع القابلة للتوسع القابلة للتطوير. تظهر هذه الدراسات مجتمعة أن الاضطرابات الفيروسية في الموقع ممكنة، لكن الأدوات الحالية لا تدعم الاضطرابات المستقرة والمجمعة والقابلة لاسترجاع التسلسل المطلوبة لفحص كريسبر عالي الإنتاجية في الجسم الحي.

لمعالجة هذه القيود، لجأنا نحن وآخرون إلى دمج ناقلات الفيروسات العدسية، التي تمكن من تعديلات جينية مستقرة وقابلة للوراثة. على عكس أنظمة زراعة الخلايا، تفرض الأنسجة في الجسم الحي قيودا صارمة على عدد الخلايا المضطربة التي يمكن توليدها داخل عضو واحد، مما يجعل الفحص الجينومي بأكمله غير عملي. وبالتالي، تتطلب شاشات كريسبر في الحياة تصميم مكتبات مستهدفة ومستهدفة مبنية على علم بيولوجي توازن بين التغطية والجدوى. علاوة على ذلك، ركزت معظم فحوصات CRISPR في الجسم الحي، والتي تمت مراجعتها هنا2، بشكل شبه حصري على اضطرابات فقدان الوظيفة الناتجة عن الفيروسات العدسية، رغم تزايد الأدلة على أن تنشيط الجينات يمكن أن يكشف عن رؤى بيولوجية مكملة وغير متداخلة 52,53,54,55. لقد أظهرنا نحن وآخرون سابقا أن دمج اضطرابات كريسبر الفيروسي في ظهارة الثدي البالغة يتيح تعديلا وراثيا مستقرا وقابلا للوراثة في الموقع، ويمكن استعادتها وقياسها من الحمض النووي الجينومي 36,55,56,57,58. باستخدام هذا النهج، أجرينا فحوصات CRISPR مجمعة في الجسم الحي حددت محركات جديدة للتحول المسرحي 36,55، مما أثبتت جدوى وملاءمة توصيل الفيروسات العدسية وفحص كريسبر البيولوجي. ومع ذلك، سلطت هذه الدراسات الضوء أيضا على الحاجة إلى بروتوكول بسيط وموحد وقابل للتوسع يمكن اعتماده وتوسيعه على نطاق واسع ليشمل نماذج فحص فقدان وزيادة الوظيفة ضمن نفس الغدة.

هنا، نصف استراتيجية حقن قنواتي بسيطة ومتعددة الاستخدامات تتيح الفحص المتوازي في الجسم الحي لمكتبات إزالة وتنشيط كريسبر، المسماة كريسبر-كوالا، داخل الغدة الثديية للفأر البالغ. يستخدم CRISPR-KOALA إما RNA تقليدي بقدرة 20-21 bp 'مرشد واحد' (sg) لقدرات CRISPR-KO أو RNA 'مرشد ميت' (dg)RNA بمعدل 14 bp ل CRISPR-A. يوجه dgRNA كاس9 بكفاءة إلى موقعه المستهدف، لكنه يمنع نشاط النوى الداخلية في كاس9 59,60,61، وبالتالي يسمح باستخدام فأر واحد يعبر عن كاس9 النشط لطرق الإطاحة والتفعيل. إدخال دبوسين شعريين PP7 في tcr dgRNA يتيح تجنيد بروتين طبقة PP7:P65:HSF1 التحويلي62 ويؤدي إلى فرط فعال في التعبير الجيني في الجسم الحي55 (الشكل 1). من خلال الجمع بين تصميم مكتبة gRNA المستهدف مع إنتاج فيروسات عدسية عالية التيتر وتوصيل القنوات غير الجراحية باستخدام الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاجية، ينتج هذا النهج عشرات الآلاف من النسخ الظهارية المنفصلة مكانيا مع الحفاظ على بنية الأنسجة والتفاعلات البيئية الدقيقة. ومن المهم أن دمج فيروسات لينتيفيرال في جينوم المضيف يمكن من استعادة وقياس gRNA من خلال تسلسل عالي الإنتاجية، مما يتيح فحوصات جينومية وظيفية مجمعة في الجسم الحي. معا، يسمح هذا بحدوث اضطرابات متوازية أو متزامنة (في نفس الخلية) من CRISPR-KO وCRISPR-A داخل نفس الغدة الثديية لفأر يعبر عن Cas9.

نقدم بروتوكولا تفصيليا خطوة بخطوة يشمل تصميم مكتبة gRNA، إنتاج وتركيز الفيروسات العدسية، التوصيل داخل القنوات، فك الالتفاف في المكتبة، وتحليل البيانات (الشكل 1). معا، توفر هذه الطريقة إطارا عمليا وقابلا للتوسع لفحص إزالة وتنشيط كريسبر في الغدة الثديية للفأر داخل الجسم الحي ، ويمكن تكييفها لدراسة وظيفة الجينات أثناء توازن الأنسجة، وسياقات الأمراض المختلفة، والأنسجة الأخرى، وأنواع أخرى مثل الفئران.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع إجراءات الحيوانات وفقا لإرشادات المجلس الكندي لرعاية الحيوانات وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوانات في مركز الظاهرة الوراثية (البروتوكول 26-0272H).

1. استنساخ مكتبة كريسبر

ملاحظة: يصف هذا القسم الاستنساخ المجمع لمكتبات إزالة وتنشيط كريسبر من الأوليغونوكليوتيدات المصنعة في المصفوفات إلى العمود الفقري الفيروسي العدسي. نقوم بتوليد مكتبات تحتوي بشكل روتيني على ما يصل إلى 4000 gRNA، ويمكن فحصها بتغطية 400X-1000X في 8-20 فأرة. يمكن تعديل عدد gRNA والتغطية حسب الحاجة، مما يؤثر على عدد الفئران المطلوبة للحفاظ على القوة الإحصائية. نوصي بالحفاظ على تغطية دنيا تبلغ 400X، والتي قد تكون كافية لأنماط كسب وظيفية قوية.

  1. تصميم مكتبة RNA الدليل
    1. تجميع قائمة بجميع جينات الفئران التي سيتم فحصها ضمن تجربة واحدة لتصميم مكتبة CRISPR لاحقا، مع الحفاظ على قوائم أهداف منفصلة لمكتبات CRISPR Offout (CRISPR-KO) وتفعيل CRISPR (CRISPR-A).
      ملاحظة: مكتبات كريسبر-كو وكريسبر-أ تولد بشكل منفصل ويمكن دمجها في مرحلة تحويل الفيروسات العدسية للفحص المتزامن.
    2. بالنسبة لمكتبات CRISPR-KO، اختر من أربعة إلى خمسة RNA مفردة (sgRNAs) لكل جين باستخدام خوارزميات التنبؤ عالية النقاط مثل CRISPick62,63، CHOPCHOP64، أو VBC Score65.
      ملاحظة: مؤشر VBC Score يعطي فعالية عالية جدا ونشاطا على الهدف66. بغض النظر عن الأداة، أعط الأولوية للأدلة التي لديها نشاط مرتفع متوقع نحو الهدف، وإمكانات منخفضة خارج الهدف، ونقاط إكسونات ترميز استهداف.
    3. بالنسبة لمكتبات CRISPR-A، اختر من ثمانية إلى عشرة أدلة لكل جين باستخدام CRISPick62,63 أو CHOPCHOP64. بالنسبة للأدوات التي تسمح بأطوال دليل يحددها المستخدم (مثل CHOPCHOP)، اضبط طول الدليل إلى 14 قاعدة أساس قبل توليد الدليل. إذا كنت تستخدم أداة تولد أدلة بسعة 20 نقطة توقف فقط، قم بتحويل هذه التسلسلات إلى RNA موجهة ميتة (dgRNAs) عن طريق الاحتفاظ بتسلسل 14 bp مباشرة على بعد 5 أقدام من نمط البروتوسبايس المجاور، والذي يستهدف مناطق المحفز في الجينات.
      ملاحظة: dgRNAs هي تسلسلات إرشادية مقطوعة مصممة لتمكين تنشيط النسخ المعتمد على كريسبر بنسبة تقارب 50-85٪ من فعالية sgRNAs كاملة الطول55 دون تحفيز انقسام الحمض النووي 59,60,61.
    4. تجميع جميع sgRNAs أو dgRNAs المقابلة لتجربة واحدة في قوائم منفصلة لتمكين الاستنساخ الموحد، وإنتاج الفيروس، والفحص الحي .
      ملاحظة: سيتم فحص sgRNA و dgRNA معا بعد إنتاج الفيروس.
    5. إنشاء مكتبات تحكم سلبية مجمعة لشاشات CRISPR-KO وCRISPR-A، بما في ذلك تسلسلاتgRNA غير مستهدفة 55,67 وتسلسلات gRNA غير جينية68، كما هو موضح سابقا، للتحكم في التأثيرات الخلفية المستقلة عن اضطراب أو تنشيط الجينات.
      ملاحظة: إذا رغبت، يمكن إنشاء مكتبات منفصلة من gRNA غير المستهدف وغير الجيني لإنشاء مكتبتين مستقلتين للتحكم السلبي.
  2. تصميم وتضخيم بركة الأوليجونكليوتيدات
    1. صمم الأوليجونوكليوتيدات المجمعة بحيث يحتوي كل gRNA على تسلسل الاستهداف، وظهور إنزيمات التقييد المتوافقة مع العمود الفقري الفيروسي اللينتيفيروس الوجهة، وتسلسلات تمهيد خاصة بالمكتبة لتمكين التضخيم الانتقائي من تجمع أوليجونكليوتيدات معقد (الشكل 1، الجدول 1).
    2. تعيين زوج برايمر فريد لكل مكتبة gRNA للسماح بالتضخيم المستقل للمكتبات الفردية من تجمع أوليجونكليوتيدات مشترك. أزواج البرايمر الفريدة مدرجة في الجدول 1.
    3. ترتيب مكتبات الأوليجونكليوتيدات المجمعة من منصة تصنيع مصفوفة تجارية، مما يضمن تمثيلا متساويا لجميع gRNA داخل كل مجموعة.
    4. تضخيم مكتبات gRNA الفردية من قالب الأوليجونكليوتيدات المجمع باستخدام بادئات خاصة بالمكتبة في خليط التفاعل التالي. يمكن تعديل التفاعل ليلتزم بالتركيبة الموصى بها من البوليميراز المحدد. جهز ثلاث تفاعلات باستخدام قالب أوليجونكليوتيد مجمع وتفاعل تحكم سلبي واحد بدون قالب.
      4 ng قالب أوليجونكليوتيد مجمع
      2.5 ميكرولتر 10 ميكرومولار برايمر مخصص لمكتبة فورورد
      2.5 ميكرولتر 10 ميكرومولار برايمر عكسي مخصص للمكتبة
      10 ميكرولتر 5x مخزن تفاعل
      0.5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة
      X μL ماء خال من النوكلياز
      حجم إجمالي 50 ميكرولتر
    5. قم بتضخيم PCR باستخدام ظروف الدورة التالية، مع ضبط درجة حرارة التلدين بناء على درجة انصهار البرايمر الخاصة بالمكتبة:
      دورة واحدة بطول 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
      18 دورة بدرجة حرارة 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، و62–65 درجة مئوية لمدة 20 ثوان، و72 درجة مئوية لمدة 3 ثوان
      دورة واحدة بدرجة حرارة 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق
      ملاحظة: لا تتجاوز 18–19 دورة تضخيم للحفاظ على تمثيل gRNA متساو داخل المكتبة.
    6. حل منتجات PCR على جل أغاروز بنسبة 2.5٪ عند 120 فولت لمدة تقارب 45 دقيقة وإزالة الشريط المطابق لحجم إدخال gRNA المتوقع (حوالي 100 بيس لكل حركة، حسب تصميم البرايمر؛ الشكل 2A).
    7. منتجات PCR تنقية باستخدام مجموعة استخراج هلامية وسحب الماء في 20 ميكرولتر من الماء فائق النقاء خلال الخطوة النهائية للاستبعاد.
      ملاحظة: (نقطة توقف) يمكن تخزين إدخالات gRNA المنقاة عند -20 درجة مئوية قبل الاستنساخ.
  3. تحضير وهضم العمود الفقري الفيروسي العدسي
    1. جهز بلازميدات العمود الفقري الفيروسي اللينتيفيروس التي تحتوي على تسلسل حشو قابل للإزالة لاستنساخ إدخالات gRNA. بالنسبة للمكتبات الحية CRISPR-KO وCRISPR-A تستخدم pLKO-Cre (بلازميد Addgene #158032 أو 256774) و pXPR502-PPH-Cre (بلازميد Addgene #256776) على التوالي.
    2. هضم 5–10 ميكروغرام من الحمض النووي للعمود الفقري الفيروسي في حجم تفاعل إجمالي يبلغ 200 ميكرولتر باستخدام إنزيم التقييد المناسب والعازل. استخدم Esp3I للعمود الفقري pLKO-Cre CRISPR-KO وSapI للعمود الفقري pXPR502-PPH-Cre CRISPR-A.
      بلازميد العمود الفقري 5–10 ميكروغرام
      مخزن إنزيم 20 ميكرولتر 10x
      إنزيم تقييد 5 ميكرولتر
      X μL ماء خال من النوكلياز
      الحجم الكلي 200 ميكرولتر
    3. حضن تفاعلات الهضم لمدة 2–3 ساعات عند 37 درجة مئوية.
    4. أضف 2 ميكرولتر من الفوسفاتاز القلوي المؤتلف إلى كل تفاعل هضم وحضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية لإزالة الفسفور من العمود الفقري المهضوم.
    5. حل المنتجات المهضومة على هلام أغاروز بنسبة 1٪ وإزالة الشريط المقابل للعمود الفقري الخطي (الشكل 2B,C)
      ملاحظة: بالنسبة لكلا العمودين الفقريين، يظهر جزء الحشو كشريط مميز عند حوالي 2000-2500 نقطة أساس متكاملة، حسب المتجه.
    6. قم بتنقية الحمض النووي للعمود الفقري المستخرج باستخدام مجموعة استخراج هلامية وسحب كمية قليلة جدا من الماء فائق النقي للحفاظ على تركيز الحمض النووي العالي (عادة 20 ميكرولتر).
      ملاحظة: (نقطة توقف) يمكن تخزين العمود الفقري المهضوم المنقاة عند -20 درجة مئوية قبل الربط.
  4. الهضم والربط لمكتبات gRNA
    1. قم بإعداد تفاعلات هضم وربط شاملة باستخدام 750 نانوغرام من حمض نووي العمود الفقري النفاذي للفيروسات، و43 نانوغرام من الحمض النووي المضغوط في مكتبة gRNA، و3 ميكرولتر من إنزيم التقييد، و7.5 ميكرولتر من ليغاز T4 DNA، و15 ميكرولتر من 10 ملليمولار ATP، والكمية المناسبة من محلول التفاعل والماء المقطر المعقم للوصول إلى حجم تفاعل إجمالي يبلغ 150 ميكرولتر.
      ملاحظة: استخدم نفس إنزيم التقييد الذي استخدم في البداية في خطوة هضم العمود الفقري للبلازميد. نسبة 750 نانوغرام من العمود الفقري الفيروسي النقي إلى 43 نانوغرام من الحمض النووي المدرج في المكتبة تعطي نسبة مولية تقريبية بين الناقل إلى الإدخال عند استخدام العمود الفقري الموصى به.
    2. قسم كل خليط ربط إلى ثلاثة أليكوات متساوية لزيادة كفاءة التحويل وتعقيد المكتبة.
    3. جهز تفاعل تحكم سلبي واحد يحتوي على حمض نووي للعمود الفقري دون إدخال gRNA لتقييم الربط الخلفي.
    4. حضن تفاعلات الهضم والربط خلال الليل عند 30 درجة مئوية.
    5. في صباح اليوم التالي، أضف 1 ميكرولتر من إنزيم التقييد المناسب لكل مقطر تفاعل وحضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية لدفع إكمال هضم العمود الفقري.
    6. أضف 2 ميكرولتر من 10 ملليموتر ATP و2 ميكرولتر من ليغاز الحمض النووي T4 إلى كل تفاعل واحتضن عند 25 درجة مئوية لمدة 2–3 ساعات حتى اكتمال الربط.
    7. تجميع تفاعلات الهضم والربط الثلاثة الفردية في كل مكتبة، ونقية التفاعلات باستخدام طريقة تنظيف الأوليجونكليوتيدات القائمة على الأعمدة، وفرج كل منها في 21 ميكرولتر من الماء المقطر فائق النقاء المعقم. يتم إخراج تفاعل التحكم السلبي المنقى الوحيد في 7 ميكرولتر من الماء المقطر النقي والمعقم فائق النقي.
      ملاحظة: لا تدهن منتجات الربط في مخازن تحتوي على الملح أو EDTA، لأنها تقلل بشكل كبير من كفاءة التقشير الكهربائي للبكتيريا. (نقطة توقف) يمكن تخزين منتجات الربط المنقاة عند -20 درجة مئوية قبل التثقيف الكهربائي.
  5. التوزيع الكهربائي والتوسع في المكتبة
    1. كوفيتات التثقيف الكهربائي المبدعة مسبقا 0.1 سم، وأنابيب الطرد المركزي الدقيق التي تحتوي على 2 ميكرولتر من منتجات الربط المنقي، وأنابيب زراعة البولي بروبيلين ذات القاع المستدير بسعة 14 مل على الجليد لمدة لا تقل عن 20 دقيقة قبل التثقيف الكهربائي.
    2. قم بإذابة الخلايا البكتيرية الكهروفية على الجليد وامزج 25 ميكرولتر من الخلايا بلطف مع 2 ميكرولتر من منتج الربط المنقى في أنبوب الطرد المركزي الدقيق المبرد مسبقا عن طريق التنبيه.
    3. انقل خليط الخلية والحمض النووي إلى كوفيت كهربائي مبرد مسبقا بقطر 0.1 سم وقم بالتقطيع الكهربائي عند 1.8 كيلو فولت، 25 ميكروفاراد و200–600 Ω.
      ملاحظة: عادة ما ينتج عن التعرض الكهربائي الناجح ثابت زمني بين 4.6 مللي ثانية و4.9 مللي ثانية.
    4. أضف فورا 1 مل من وسط استرداد مسبق التسخين بدرجة حرارة 37 درجة مئوية المزود بالخلايا الكهربائية إلى الكوفيت، وأعد تعليق الخلايا بلطف، وانقل التعليق إلى أنبوب بولي بروبيلين دائري قاع بسعة 14 مل.
    5. حضن الخلايا المستخرجة عند 30 درجة مئوية مع هز 180 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة.
    6. يتم تخفيف الطبق 10 ميكرولتر من الخلايا المستخرجة في 90 ميكرولتر من مرق LB على ألواح LB-agar تحتوي على الأمبيسيلين ويحتضن طوال الليل عند 30 درجة مئوية لتقييم كفاءة التحول والربط الخلفي.
      ملاحظة: يجب أن يؤدي الاستنساخ الناجح إلى مئات المستعمرات على الصفيحة مع إدخال وعدد قليل (> 30) مستعمرة على لوحة التحكم السلبية ذات العمود الفقري فقط (الشكل 3).
    7. تحقق من صحة المكتبة بشكل إضافي عن طريق اختيار ~10 مستعمرات لتسلسل miniprep وSanger للأمام من مروج U6. المكتبات المستنسخة بنجاح ستحتوي على < 90٪ من التحضيرات الصغيرة التي تحتوي على تسلسل واضح ل gRNA، دون تكرار الأدلة عبر العشرة تحضيرات صغيرة. بالإضافة إلى ذلك، يقوم إنزيم التقييد بهضم المينيبريبس ومكتبة البلازميدات المجمعة (الخطوة 1.5.10) ويعمل على جل أغاروز لفحص أحجام الأشرطة والتأكد من أن البنى الفيروسية العسرية لم تمر بإعادة تركيب شاذة.
      ملاحظة: يمكن تقييم تمثيل المكتبة من خلال مقارنة عدد المستعمرات من ألواح التخفيف مع إجمالي عدد gRNA في المكتبة، مستهدفا تغطية 1000 ضعف. يمكن استخدام عدة تخفيفات تسلسلية للمساعدة في هذا الحساب.
    8. إذا كانت كفاءة التحول كافية، قم بتغليف الخلايا المستردة المتبقية على ألواح LB-Agar بقطر 15 سم تحتوي على المضاد الحيوي المناسب، وحضنها طوال الليل عند 30 درجة مئوية لتوليد عشب كثيف من المستعمرات.
      ملاحظة: ضع لوحة بحجم 100 ميكرولتر من الخلايا المسترجعة على كل من عشرة صفائح أجار بقطر 15 سم لاستعادة عدد كاف من المستعمرات.
    9. في اليوم التالي، استخدم مكشطة الخلايا لكشط مستعمرات بكتيرية إلى 500 مل من مرق LB مع الأمبيسيلين لتوليد مزرعة بكتيرية واحدة تمثل مكتبة gRNA المستنسخة.
    10. قم بتوسيع الزراعة البكتيرية المجمعة عند درجة حرارة 30 درجة مئوية مع الرج لمدة تقارب 3 ساعات وعزل حمض البلازميد النووي باستخدام مجموعة ماكسيبرب.

2. إنتاج لينتيفيرال للعرض في الجسم الحي

ملاحظة: للولادة داخل القنوات والفحص المجمع في الجسم الحي ، يجب تركيز مستحضرات الفيروسات العدسية لتحقيق عدادات عالية (ويفضل بين 1 × 108 pfu/mL و1 × 109 pfu/mL) لضمان نقل فعال لخلايا الظهارة الثدية. البروتوكول التالي يصف إنتاج فيروسات عدس عالية التيتر المحسنة للاستخدام الحي .

  1. تحضير الخلايا المنتجة للفيروسات العدسية
    1. الحفاظ على HEK293TN الخلايا في وسط إيغل المعدل (DMEM) من دولبيكو مع 10٪ مصل بقري جنيني، 1٪ بنسلين-ستريبتومايسين، وخلايا زرعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    2. يتم تمرير الخلايا كل 2-3 أيام للحفاظ على النمو اللوغاريتمي وضمان عدم تجاوز الخلايا 90٪ من التلاكم. استخدم الخلايا في الممرات <20 لتحقيق إنتاج فيروسي مثالي.
    3. قبل يوم واحد من عملية النقل الصناعي، غط ألواح زراعة الأنسجة بحجم 15 سم بطبقة بولي-إل-ليسين (0.02 ملغ/مل) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. جهز تسع أطباق لدفعة واحدة من تحضير الفيروس.
    4. قم بإزالة محلول البولي-إل-ليسين وغسل الألواح مرتين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات.
    5. زرع الخلايا بحجم 1.1 ×10 7 HEK293TN على كل من تسعة ألواح زراعة أنسجة مغطاة ب poly-L-lysine بطول 15 سم، مما يضمن وصول الخلايا إلى ~90٪ من التقاء الخلايا عند النقل.
      ملاحظة: بالنسبة للتطبيقات التي لا تتطلب أقصى درجات الفيروس، يمكن تقليل إنتاج الفيروسات العدسية إلى عدد أقل من الصفائح (مثل ثلاث أو ست صفائح) مع انخفاض نسبي في الإنتاجية. قم بتصغير الكواشف (DNA البلازميد، PEI، وDMEM) للنقل وفقا لذلك.
  2. النقل الفيروسي اللينتيفيروسي القائم على PEI
    1. تحضير حمض البلازميد النووي لإنتاج الفيروسات العدسية باستخدام نظام ثلاثي البلازميدات يتكون من 95 ميكروغرام من بلازميد مكتبة gRNA، و95 ميكروغرام من بلازميد psPAX2 (بلازميد Addgene #12260)، و65 ميكروغرام من بلازميد غلاف VSV-G pMD2.G (بلازميد Addgene #12259).
    2. ادمج البلازميدات الثلاثة لإنتاج فيروسات عدسة في 10.8 مل من DMEM الخالي من المصل وامزج جيدا عن طريق الدوامة لمدة تقارب 10 ثوان.
    3. أضف 366 ميكرولتر من 1 ملغ/مل بولي إيثيلينيمين (PEI) بشكل قطري إلى محلول الحمض النووي المخفف، وامزجه جيدا عن طريق الدوامة لمدة تقارب 10 ثوان، وحضن مركبات DNA-PEI في درجة حرارة الغرفة لمدة 10–30 دقيقة.
    4. أثناء التكوين المعقد، يتم سحب وسط الزراعة من صفائح HEK293TN وإضافة 14 مل من DMEM الخالي من المصل.
      ملاحظة: مصل الأبقار الجنيني يمكن أن يثبط امتصاص البلازميدات من قبل الخلايا.
    5. وزع 1.2 مل من مركب DNA-PEI بشكل انخفاضي عبر الصفيحة والصخور لضمان توزيع متساو.
    6. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربونلمدة 6 –8 ساعات.
    7. استبدل الوسط في كل طبق ب 20 مل DMEM مسخن مسبقا مع 10٪ مصل بقري جنيني (بدون 1٪ بنسلين-ستريبتومايسين) واستمر في زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
      ملاحظة: لا ينصح بالنقل الطبي خلال الليل، لأن التعرض المطول لمرض PEI ونقص المصل يقلل من إنتاج الفيروس.
  3. الحصاد الفيروسي والطرد المركزي الفائق
    1. تحضير 200 مل من محلول وسادة السكروز بدمج 40 جرام من السكروز، و11.7 جرام من كلوريد الصوديوم، و4 مل من 1 ميل HEPES (درجة الحموضة 7.4)، و1 مل من 0.5 M EDTA (pH 7.9) في حجم مناسب من الماء المقطر المعقم، ثم قم بتعقيم الفلتر عبر وحدة ترشيح بولي إيثير سلفون منخفضة الارتباط بالبروتين بحجم 0.45 ميكرومتر. يمكن تخزين هذا المحلول عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
    2. اجمع الفائق الفيروسي اللينتيفيروس بعد 48–72 ساعة من النقل.
    3. مرر 10 مل من DMEM مع 10٪ مصل أبقار جنيني عبر وحدة ترشيح البولي إيثير سلفون منخفضة البروتين بحجم 0.45 ميكرومتر. تخلص من تدفق المرور. حمل الفائق على الفلتر وطبق المكنسة الكهربائية.
      ملاحظة: إذا لم يكن بالإمكان إجراء التركيز فورا، خزن الفائق الفيروسي المصفى عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    4. أضف 30 مل من المادة الفائقة الفيروسية المصفية إلى أنبوب الطرد المركزي فوق المطلوب.
    5. ضع ببطء طبقة طبقة السوبر الفيروسيات المصفية بمحلول 4 مل من محلول وسادة السكروز.
    6. ضع أنبوب الطرد المركزي الفائق في محول متوافق لدوار الدلو المتأرجح ووازن الأنابيب بدقة.
    7. قم بطرد المركزي بالأنابيب عند 104,000 × جرام لمدة لا تقل عن ساعتين عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يجب استخدام دوار دلو متأرجح، مثل دوار بيكمان JS24.38، لدفع الفيروس بشكل صحيح عبر وسادة السكروز.
    8. قم بإخراج السوبرينت بعناية دون إزعاج الحبيبات الفيروسية، التي قد تظهر كطبقة بيضاء باهتة أو شفافة في أسفل الأنبوب.
    9. اترك الأنابيب تجف في الهواء لمدة لا تقل عن 10 دقائق واستخدم ممسحة مختبرية لإزالة أكبر قدر ممكن من السائل المتبقي من داخل الأنبوب دون الإزعاج بالحبيبة.
      ملاحظة: التجفيف الصحيح للأنبوب أمر بالغ الأهمية لتحقيق تركيزات فيروسية عالية، لأنه يقلل من حجم الاسترداد النهائي.
    10. أعد تعليق حبيبات الفيروسات في 20 ميكرولتر من محلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات واستخدم الماصة بعناية صعودا وهبوطا، مع التأكد من تجنب فقاعات الهواء.
    11. حضن الأنابيب على الثلج لمدة ساعتين مع تحريك خفيف لإعادة تعليق الحبيبات الفيروسية بالكامل.
    12. انقل الفيروس المركز إلى أنبوب ميكروفوج نظيف وقم بتنقية المحلول عن طريق الطرد المركزي عند حرارة 2000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: هذا الدوران يزيل الحطام والجسيمات المتبقية التي تسد إبرة الحقن أثناء الجراحة.
    13. أليكوت الفيروس المركز في أحجام للاستخدام مرة واحدة لتجنب تكرار التجمد والذوبان وتخزينه عند -80 درجة مئوية.
  4. تعايير الفيروسات اللينتي باستخدام LSL-tdTomato Tomato ليفية الأجنة (MEFs)
    1. طبق 100,000 من LSL-tdTomato MEFs (مشتقة من Rosa-LSL-tdTomato [JAX# 007909]) في طبق بست آبار قبل يوم واحد من العدوى في DMEM مع 10٪ مصل أبقار جنيني، 1٪ بنسلين-ستربتومايسين، وزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. ضع بئر إضافي لعد الخلايا.
      ملاحظة: يعمل موظفو LSL-tdTomato MEFs كمراسلين لقناة Cre ضمن فيروس العدس. يمكن استخدام أي نظام تقرير مناسب لقياس العمود الفقري الفيروسي الآخر.
    2. في اليوم التالي، عد عدد LSL-tdTomato MEFs من بئر إضافي لقياس عدد الخلايا الموجودة وقت الإصابة.
    3. جهز مخففات متسلسلة من فيروس لينتي المركز المشفر CR recombinase بمجموع 2 مل من وسط Eagle المعدل من Dulbecco مع 10٪ مصل أبقار جنيني. بشكل عام، تعطي 0.4 ميكرولتر، 0.1 ميكرولتر، و0.025 ميكرولتر من الفيروس المركز نطاقا ديناميكيا خطيا نظيفا (الشكل 4A–D).
    4. أضف 2 مل من مخففات الفيروسات إلى كل بئر من MEFs LSL-tdTomato وأضف 2 ميكرولتر من 10 ملغ/مل بوليبرين لكل بئر.
    5. أصيب MEFs بالدوران عند 400 × جرام لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    6. استبدال الوسط الفيروسي ب 2 مل من DMEM مع 10٪ مصل أبقار جنيني، 1٪ بنسلين-ستريبتومايسين، وزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 48–72 ساعة.
    7. قم بقياس الخلايا الموجبة للطماطم الموجبة بواسطة المجهر الفلوري أو قياس التدفق الخلوي لتحديد نسبة الخلايا المصابة عند كل تخفيف.
    8. احسب العيار الوظيفي بناء على نسبة الخلايا المصابة وعدد الخلايا الموجودة وقت العدوى.
      ملاحظة: يتم إنتاج وفيروسات كريسبر-كو وكريسبر-أ وتركيزها وتعديلها بشكل منفصل. تستخدم عيارات وظيفية تحدد باستخدام MEFs من LSL-tdTomato لخلط فيروسات CRISPR-KO وCRISPR-A بنسبة محددة قبل الحقن داخل القنوات.
  5. تقييم الجودة لمكتبات البلازميدات واللينتيفيروس
    1. للتأكد من أن مكتبات gRNA مستنسخة بعمق وتغطية كافية وأن جميع gRNA يتم الحفاظ عليها أثناء الاستنساخ وإنتاج الفيروسات، ينصح بشدة بتسلسل تجمع البلازميدات وكذلك MEFs المحولة.
    2. لتقييم تغطية الفيروسات العدسية، قم بنقل MEFs مع اللينتيفيروس عند تغطية >1000× بناء على عيار الفيروس المحسوب. ليس من الضروري ضمان عدوى واحدة للخلايا خلال هذه الخطوة.
    3. بعد 48–72 ساعة، يتم فصل الخلايا باستخدام التربسين أو مكشطة الخلايا وتقوم بعمل الحبيبات على الخلايا. استخلاص الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي التجارية.
    4. تسلسل 1 ميكروغرام من البلازميد و3 ميكروغرام من حمض النووي MEF المستخرج باستخدام البروتوكول الموضح في القسم 5. التسلسل العميق لعدد 5 ملايين قراءة كاف لمعظم المكتبات المخصصة التي تحتوي على <5000 gRNA.
      ملاحظة: هناك ارتباط قوي (R2> 0.6) بين قراءات تجمع البلازميدات وتمثيل الأدلة المتساوي نسبيا (>70٪ من الأدلة ضمن عقد لوغاريتم) دون وجود دليل فردي يهيمن على عدد المكتبات يشير إلى جودة جيدة (الشكل 4E).

3. حقن فيروسي عدسي عبر القنوات في غدة ثديية الفأر

  1. تخفيف الإبر والفيروس
    1. سحب إبر الشعيرات الدموية الدقيقة الزجاجية باستخدام جهاز سحب إبر الماصي الدقيقة لتوليد شعيرات شعرية دقيقة الأطراف مناسبة للحقن داخل القنوات بحجم 9–10 ميكرولتر. استخدم ملقطا دقيقا لكسر طرف الإبرة تماما.
      ملاحظة: الموقع الأمثل يخلق حجم إبرة كبير بما يكفي لتحميله بالسائل لكنه رقيق بما يكفي ليتناسب بسهولة في فتحة الحلمة.
    2. تخفيف مستحضرات الفيروسات العدسية إلى تركيز نهائي 1 × 107 pfu/mL في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات مع تغذية 0.05٪ (بدون زجاج) صبغة Fast Green FCF.
    3. إذا تم خلط فيروسات CRISPR-KO و CRISPR-A لفرزهما ضمن نفس المجموعة المعقدة، قم بضبط المكتبتين إلى عيار فيروسي متساو مع محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات وامزجهما بنسبة لضمان تمثيل متساو لجرار الحمض النووي الريبي المغناطيسي بين كلتا المكتبتين.
  2. تحضير الفئران للحقن داخل القنوات
    1. قم بتخدير فأر أنثى بالغة (عمرها 8–20 أسبوعا) تحت 4٪ من الإيزوفلوران مع 1 لتر/دقيقة من الأكسجين ووضع زيت عيون معقم على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية أثناء الإجراء.
      ملاحظة: الحقن داخل القنوات هو إجراء غير جراحي ولا يتطلب تسكنات الألم. استخدم فئران Rosa26-LSL-Cas9، H11-Cas9، أو Rosa-LSL-tdTomato لهذه التجارب.
    2. ثبت الفأر في وضعية الاستلقاء على وسادة تدفئة مغطاة مضبوطة على منخفضة للحفاظ على درجة حرارة الجسم، وحافظ على التخدير باستخدام إيزوفلوران 2٪ مع 1 لتر/دقيقة أكسجين عبر مخروط الأنف طوال الإجراء.
    3. أزيل الفراء المحيط بالحلمات الثالثة للصدر والرابعة باستخدام كريم إزالة الشعر بمسحة قطنية معقمة في منطقة دائرية بنصف قطر حوالي 0.5 سم لمدة 10–15 ثانية. أزل الكريم فورا باستخدام شاش معقم وماء معقم لمنع تهيج الجلد.
      ملاحظة: الغدتان الثديتان الثالثة والرابعة عادة ما تكون الأسهل في الحقن. بدلا من ذلك، يمكن تجهيز الغدتين الثانية والخامسة للحقن بنفس الطريقة.
    4. قم بتعقيم الجلد المحيط بكل حلمة عن طريق مسح الجلد بشكل متسلسل باستخدام 70٪ كحول إيزوبروبيل واليود باستخدام الشاش المعقم.
    5. ضع الفأر تحت مجهر تشريح داخل خزانة أمان حيوي للسماح برؤية الحلمات بوضوح.
    6. باستخدام ملقط ناعم منظف بنسبة 70٪ إيثانول، قم بإزالة أي جلد ميت فوق الحلمة بلطف لكشف فتحة القنوات.
      ملاحظة: هذه الطبقة الميتة المكيراتينية متصلة بشكل فضفاض وقد تعيق دخول الإبر. يجب ألا تضر الإزالة بالجلد السليم أو الأنسجة الواقعة تحتها.
  3. الحقن داخل القنوات
    1. تحميل 8 ميكرولتر من الفيروس المخفف في شعيرات دموية دقيقة زجاجية مسحوبة.
    2. أمسك منطقة الحلمة بملقط ناعم، وأدخل طرف الإبرة بلطف في فتحة الحلمة (الشكل 5A). إبرة موضوعة بشكل مناسب تدخل القناة بمقاومة قليلة. قم بإخراج التعليق الفيروسي ببطء إلى القناة الثديية خلال 5–10 ثوان.
      ملاحظة: 8 ميكرولتر من فيروس عدس بوزن 1 × 107 pfu/mL سيؤدي إلى حوالي 30٪ من عدوى الخلايا الظهارية للثدييات اللومية و5٪ لخلايا الظهارة القاعدية في الثدي، مع إصابة ضئيلة (< 0.5٪) من السدى36. يمكن تعديل عيار الفيروس لتحقيق معدل عدوى أعلى أو أقل.
    3. راقب انتشار صبغة فاست جرين أثناء الحقن من خلال المجهر التشريح. تأكد من نجاح التوصيل داخل القنوات من خلال ملاحظة انتشار الصبغة في شبكة القنوات تحت الجلد (الشكل 5B).
    4. حدد الحقن الفاشلة عن طريق تجميع الصبغة داخل وسادة الدهون الثديية المجاورة للحلمة بدلا من طول شجرة القناة (الشكل 5C).
    5. كرر إجراء الحقن للغدتين الثدييتين الصدرية الثالثة والرابعة البطنية على كلا الجانبين، مع حقن ما مجموعه أربع غدد لكل فأر.
      ملاحظة: مع الخبرة، يتم تحقيق الولادة الناجحة عبر القنوات في >95٪ من الحقن. الحقن الفاشلة المحصورة في وسادة الدهون لا ترتبط بآثار جانبية، وقد لا تزال الغدد المتبقية مستخدمة. يمكن إجراء المزيد من التحقق من صحة الحقن من خلال الكيمياء المناعية وقياس خلوية التدفق (الشكل 5D,E).
    6. أوقف التخدير وانقل الفأرة إلى قفص تعافي نظيف.
    7. راقب الفأر حتى يصبح قادرا على الحركة بالكامل وأعده إلى مكان السلامة البيولوجية المخصص بمجرد ملاحظة السلوك الطبيعي.
    8. بعد ثلاثة أيام من الحقن، قم بتغيير القفص بالكامل، وتخلص من أي حواجز أو فراش كنفايات فيروسية، وانقل الفأر إلى قفص نظيف يمكن إعادته إلى الهيكل القياسي.

4. عزل الحمض النووي الجيني من الغدد الثديية والأورام

ملاحظة: قم بقتل الفئران منخلال التعرض لثاني أكسيد الكربون 2 أو جرعة زائدة من المخدر تليها خلع عنق الرحم، وفقا لإرشادات رعاية الحيوانات. احصد الغدد الثديية أو الأورام الثديية في النقاط الزمنية المطلوبة أو عند النهاية الإنسانية وفقا للإرشادات التنظيمية. تم جمع الخلايا المصابة في وقت مبكر يصل إلى 48 ساعة بعد الإصابة بفيروس عدس36.55 أو حتى 5+ أشهر بعد الحقن في فئران النوعالبري 36، أو >24 شهرا في الخلفيات المسرحية55. يجب تنفيذ الخطوات التالية في مساحة منظفة بمسح الحمض النووي وبمعدات خالية من البلازميدات التي تحتوي على أشرطة sgRNA/dgRNA. حتى الكميات الضئيلة من حمض البلازميد النووي كافية لتؤدي إلى تلوث عينات الأنسجة، ويجب إجراء اختبارات PCR العميقة اللاحقة وضوابط سلبية (بدون أنسجة) لضمان التحضيرات النظيفة.

  1. تفكك الأنسجة
    1. بالنسبة للغدد الثديية، هضم كل غدة ثديية في 2 مل من وسط إبيكولت-ب الكامل (فأر) مع 0.2 مل من الكولاجيناز/الهيالورونيداز اللطيف في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل، وحضن الليلة عند 37 درجة مئوية.
    2. الحبيبات تفكك الخلايا عند 450 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. انقل بعناية الطبقة الدهنية العليا باستخدام طرف ماصة مغطاة بالألبومين في مصل البقر إلى أنبوب مخروطي جديد بحجم 15 مل وتخلص من الفائق المتبقي.
      ملاحظة: غالبا ما تحتوي الطبقة الدهنية العليا في هذه المرحلة على عضويات ظهارية متبقية لم يتم فصلها ولا تزال مرتبطة بالنسيج الدهني. معالجة هذا الجزء في أنبوب منفصل تزيد بشكل كبير من تعافي الخلايا الظهارية.
    4. اغسل كل من الجزء الدهني وحبيبات الخلية مرة واحدة ب 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات، ثم استخدم الطرد المركزي عند 450 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم تخلص من المواد الفائقة.
    5. ادمج الجزء الدهني المغسول وحبيبات الخلية من نفس الغدة الثدية في أنبوب مخروطي واحد بحجم 15 مل يحتوي على 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات.
    6. قم بتسخين المادة المجمعة عند 450 × جرام لمدة 5 دقائق ثم تخلص من السوبرناتانت.
    7. بالنسبة لأورام الثدي، قم بتقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة باستخدام مقص معقم أو مشرط ونقلها مباشرة إلى أنبوب ميكروفوج بسعة 2 مل.
  2. عزل الحمض النووي الجيني
    ملاحظة: يمكن استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام مجموعة Qiagen DNEasy Blood and Tissue وفقا لتعليمات الشركة المصنعة أو باستخدام بروتوكول الفينول-كلوروفورم التالي.
    1. تحضير مخزن تحلل الحمض النووي بدمج 5 مل من 1 M Tris-HCl (رقم الهيدروجينات 8.0)، 1 مل من EDTA (درجة الحموضة 8.0)، 25 مل من 5 M NaCl، و50 مل من 10٪ SDS، ورفع الحجم النهائي إلى 500 مل باستخدام ماء مقطر معقم.
    2. أضف 1 مل من مخزن تحلل الحمض النووي و10 ميكرولتر من بروتيناز K (20 ملغ/مل) إلى كل عينة وامزج جيدا عن طريق الانعكاس.
    3. حضن العينات عند درجة حرارة 56 درجة مئوية طوال الليل للسماح بالتحلل الكامل.
    4. يقوم الطرد المركزي بتحلل 16,000 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة الحطام غير القابل للذوبان.
    5. انقل المادة الفائقة المصفية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 2 مل.
      تحذير: الفينول: الكلوروفورم: الكحول الأيزوأميل سام ومسبب للتآكل. قم بجميع الخطوات المتعلقة بالمذيبات العضوية في غطاء بخار كيميائي وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.
    6. أضف حجما متساويا من الفينول: الكلوروفورم، الكحول الأيزوأميلي وامزج بقوة عن طريق الدوامة لمدة تقارب 15 ثانية حتى يتكون خليط متجانس.
    7. الطرد المركزي عند 16,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لفصل المرحلتين العضوية وغير العضوية.
    8. انقل الطور المائي العلوي بعناية إلى أنبوب جديد دون إزعاج الطور البيني.
      ملاحظة: تجنب سحب المواد من الطور الأبيض لتقليل تلوث البروتين والحمض النووي الريبي.
    9. أضف 0.7 حجم من الإيزوبروبانول إلى الطور المائي المستعاد وامزج بقوة عن طريق الدوامة لمدة تقارب 15 ثانية.
    10. الطرد المركزي عند 16,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    11. تخلص من المادة الفائقة بعناية وشطف حبيبة الحمض النووي ب 500 ميكرولتر من 70٪ إيثانول.
    12. استخدم الطرد المركزي بحرارة 16,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة الإيثانول بالكامل.
    13. جفف حبيبات الحمض النووي في الهواء على درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    14. أعد تعليق حبيبة الحمض النووي في 50 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم.
    15. حضن العينات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة أو 4 درجات مئوية طوال الليل لتسهيل إعادة التعليق الكامل للحمض النووي الجيني.
    16. قس تركيز ونقاء الحمض النووي بواسطة القطرات النانوية أو القياس الفلورومتري.

5. تسلسل الجيل القادم لمكتبات كريسبر


ملاحظة: أنشئ عينة مرجعية لتمكين حساب تغيرات طية gRNA مع مرور الوقت. يمكن استخدام MEFs المحولة (القسم 2) أو الغدد الثديية (القسم 4) التي تم جمعها بعد 3 أيام من العدوى، بالإضافة إلى ماكسيبرب البلازميد الأصلي، لتحديد تمثيل الدليل في المكتبة الابتدائية ومخزون الفيروس.

  1. تضخيم PCR لأشرطة gRNA من الحمض النووي الجينومي
    1. استخدم أزواج البادئات المدرجة في الجدول 2 لتحديد العينات بشكل فريد، مما يمكن من التعدد والإزالة لما يصل إلى 306 عينات بعد التسلسل.
    2. تحضير تفاعلات PCR باستخدام 1 ميكروغرام من الحمض النووي الجينومي كقالب في حجم تفاعل إجمالي قدره 50 ميكرولتر يحتوي على 25 ميكرولتر من 2x Q5 Master Mix، و2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومولايت أمامي، و2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومولار من البرايمر العكسي.
    3. أضف تفاعل تحكم بدون قالب بالتوازي لمراقبة التلوث.
    4. قم بتضخيم PCR باستخدام ظروف الدورة التالية، مع ضبط درجة حرارة التلدين بناء على درجة انصهار البرايمر الخاصة بالمكتبة:
      دورة واحدة بطول 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
      5 دورات بدرجة حرارة 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، و68 درجة مئوية (-1 درجة مئوية/دورة) لمدة 10 ثوان، و72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية
      20 دورة بدرجة حرارة 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان، و63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية
      دورة واحدة بدرجة حرارة 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين
    5. استخدم منتجات PCR على جل أجاروز بنسبة 2.5٪ للتحقق من حجم الأمبليكون الصحيح.
    6. تأكيد وجود نطاقات عند حوالي 306 بت لكل من مكتبات sgRNA المبنية على pLKO و430 بت لمكتبات dgRNA المبنية على pXPR502 (الشكل 6).
      ملاحظة: التحكم الواضح بدون قالب يضمن نقاء الكواشف ويؤكد أن الاختبار خال من التلوث المتبادل.
    7. قم بتنقية منتجات PCR باستخدام طريقة مناسبة لتنقية الحمض النووي وقياس تركيز الحمض النووي باستخدام القياس الفلورومتري.
  2. تسلسل الجيل القادم
    1. تحديد عمق التسلسل المطلوب بناء على تعقيد المكتبة المتوقع واستنساخ العينة.
      ملاحظة: بالنسبة للأورام المشتبه في كونها نسخية، فإن حوالي مليون قراءة لكل عينة كافية لقياس تمثيل الدليل بدقة. لحساب عمق التسلسل من الغدد الثديية، اضرب عدد الأدلة في المكتبة في 1000 ضعف من التغطية، ثم اضرب في 6 بيغرام من الحمض النووي الجيني/الخلية لحساب الكتلة الكلية للحمض النووي الجيني لكل عينة يجب تضخيمها بنظام PCR. إجمالي عدد القراءة المطلوبة للتسلسل يساوي عدد الأدلة في المكتبة مضروبة في 1000.
    2. تجميع مكتبات منقاة من عينات مختلفة بتركيزات متساوية الضغط.
    3. تجمع المكتبات التسلسلية باستخدام منصة تسلسل Illumina قصيرة القراءة.
  3. تحليل البيانات
    1. Demultiplex لتسلسل الخام لملفات FASTQ باستخدام مؤشرات خاصة بالعينة.
    2. تقرأ التريم إلى تسلسل الفضاء الأولي gRNA باستخدام تريموماتيك69. بالنسبة لعينات CRISPR-A، يقرأ التريم إلى 14 نقطة أساس (14 نقطة اصل)، وفي CRISPR-KO، يقرأ التريم إلى 20 نقطة قوة من نهاية البرايمر الأمامي.
    3. تقرأ محاذاة المقطوعة إلى مكتبة المراجع gRNA المقابلة باستخدام Bowtie70. استخدم معاملات المحاذاة -v 2 و -m 1 ل CRISPR-KO و-v 2 و -m 2 ل CRISPR-A والمجموعات المختلطة.
      ملاحظة: عادة ما يتم محاذاة أكثر من 90٪ من القراءات بنجاح. عادة ما ينتج انخفاض المحاذاة عن أخطاء في التقليم، أو تنسيق غير صحيح لملفات الإدخال، أو تلوث العينة أثناء PCR.
    4. قم بقياس القراءات المحازمة لكل gRNA باستخدام دالة العد في MAGeCK72 لتوليد جداول عد gRNA النهائية للتحليل اللاحق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكولا لفحص CRISPR المجمع في الجسم الحي في غدة ثديي الفأر. يمكن استخدام هذا الخط من البداية إلى النهاية لتصميم وتضخيم مكتبات gRNA المجمعة من مصفوفات الأوليجونوكليوتيدات، واستنساخ مكتبات gRNA إلى عمود فقري للفيروسات، وإنتاج لينتيفيروس عالي التردد، وإجراء توصيل عبر القنوات لمكتبات اللينتيفيروسات المجمعة إلى الغدة الثديية البالغة، واستعادة gRNA لإجراء فك الالتفاف القائم على التسلسل لتمثيل المكتبة (الشكل 1).

يتم ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اعتبار رئيسي لفحص CRISPR المجمع في الجسم الحي هو تحقيق تغطية مكتبية كافية مع الحفاظ على نقل خلية واحدة متفرقة للحفاظ على دقة الاستنساخ2. في غدة الثديي في الفأر، تتكون الحجرة الظهارية بشكل تحفظي من حوالي 3.5 × 10إلى 5 خلايا لكل غدة36. بمعدل نقل فيروسي عدسي متوسط يبلغ 15٪، مما يقلل من تكرار العدوى المتعددة لكل خلية، يؤدي التوصيل عبر القنوات إلى حوالي 5 × 104 خلايا ظهارية منقولة لكل غدة36.55

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

د.س. هو مستشار ومؤسس لشركة ViVerita Therapeutics، وقد رعى مختبره اتفاقيات أبحاث واتفاقيات خدمة مع ViVerita Therapeutics.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جميع أعضاء مختبراتنا على تعليقاتهم المفيدة والنقاشات المتعلقة بهذا العمل. كما نشكر ونشكر مركز علم الظواهر الوراثية على كل المساعدة والخبرة في العمل على الفئران في معهد لونينفيلد-تانينباوم للأبحاث (LTRI) في تورونتو، كندا. وقد دعمت هذه الدراسة منحة مشروع من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (PJT462506) ومنحة مشاريع برنامج معهد تيري فوكس للأبحاث إلى وزارة الصحة (مشروع TFRI #1107) إلى د.س. ومؤسسة عائلة نيكول. حظيت مؤسسة E.R.L. بدعم من جائزة التدريب البحثي من الجمعية الكندية للسرطان وصندوق فرانك فليتشر التذكاري. حظيت جمعية K.N.A. بدعم من جائزة ه. ل. هولمز لما بعد الدكتوراه ومنح 1318698 و26089 من جمعية أبحاث السرطان. حصل جي. إن. على دعم منحة الدراسات العليا من معاهد أبحاث الصحة الكندية – الماجستير وجائزة أبحاث الدكتوراه من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (#193389). تلقت ي.ل. دعم زمالة التميز البحثي والتنوع والاستقلال التابعة للمعاهد الكندية لأبحاث الصحة (#ED6-190718).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.45 ميكرون فلترSigmaS2HVU02RE
12k أو 92k oligo chipCustomarray Inc. (Genscript)
صفائح زراعة الخلايا مقاس 15 سمCorningCLS353004
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
الفوسفاتاز القلويNEBM0290L
الأمبليسيلينFisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
ATPNEBP0756S
محلول CutsmartNEBB6004S
التسلسل العميق (Next-Seq أو Hi-Seq)Illumina
مجموعة استخراج DNA من الدم والأنسجة DNAesyQiagen69506
وسط Dulbecco’s المعدّل EagleWisent319-015-CL
خلايا Endura الكهربائيةLucigen60242-1
مجموعة وسط EpiCult-B MouseStemcell Technologies05610
Esp3INEBR0734L
مصل البقر الجنينيWisent090-150
مجموعة تنظيف الحمض النووي الهلاميZymo ResearchD4008
أكواب Electroporation Gene Pulser/MicroPulserBioRad1652089
Collagenase/Hyaluronidase اللطيفStemcell Technologies7919
H11-Cas9Jackson LabratoriesJAX#028239
الطرد المركزي عالية السرعةBeckman CoulterMLS-50
Kim-wipeKimberly-Clark34155
LB AgarWisent Technologies800-011-LG
سحب الماصة الدقيقةSutter InstrumentP97
مجموعة Mini-prep plasmidFrogga BioPDH300
NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI)NEBR0580L
مجموعة تنظيف OligoZymo ResearchD4061
مجموعة تنظيف OligoZymo researchD4060
مسبق التسلسل illumina المنقّى في PAGEIDT DNA
الماصات الدقيقة لـ PCRDrummond5-000-1001-X10
PEI (polyethyleneimine)Sigma408727-100ML
البنسللين والستريبتوميسينWisent450-201-EL
pLKO-CreAddgene158032
pMD2.GAddgene12259
Poly-L-LysineSigmaP2636-100MG
psPAX2Addgene12260
pXPR502-PPH-CreAddgene256776
Q5 Polymerase 2x Master mixNEBM0494L
القياس الفلوري QubitInvitrogenQ33327
R26-LSL-Cas9-EGFPJackson LabratoriesJAX#024857
Fئران R26-LSL-TdTomatoJackson LabratoriesJAX#007909
SapINEBR0569L
T4 DNA ligaseNEBM0202L
أنابيب الطرد المركزي الفائقBeckman Coulter344058
وحدات مرشح التفريغFisher ScientificSCHVU02RE

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moresco, E. M. Y., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics. Am J Pathol. 182 (5), 1462-1473 (2013).
  2. Santinha, A. J., Strano, A., Platt, R. J. Methods and applications of in vivo CRISPR screening. Nat Rev Genet. 26 (10), 702-718 (2025).
  3. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nat Biotechnol. 34 (6), 631-633 (2016).
  4. Michels, B. E., et al. Pooled in vitro and in vivo CRISPR-Cas9 screening identifies tumor suppressors in human colon organoids. Cell Stem Cell. 26 (5), 782-792.e7 (2020).
  5. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  6. Han, K., et al. CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities. Nature. 580 (7801), 136-141 (2020).
  7. Lyu, J., et al. DORGE: discovery of oncogenes and tumor suppressor genes using genetic and epigenetic features. Sci Adv. 6 (46), eaba6784(2020).
  8. Martin, T. D., et al. The adaptive immune system is a major driver of selection for tumor suppressor gene inactivation. Science. 373 (6561), 1327-1335 (2021).
  9. Uijttewaal, E. C. H., et al. CRISPR-StAR enables high-resolution genetic screening in complex in vivo models. Nat Biotechnol. 43, 1848-1860 (2024).
  10. Lowden, C. CRISPR-StAR to transform in vivo functional genomic screening. Nat Rev Cancer. 25 (6), 395-395 (2025).
  11. Brisken, C., Duss, S. Stem cells and the stem cell niche in the breast: an integrated hormonal and developmental perspective. Stem Cell Rev. 3 (2), 147-156 (2007).
  12. Fridriksdottir, A. J. R., Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L. Mammary gland stem cells: current status and future challenges. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 719-729 (2011).
  13. Visvader, J. E., Stingl, J. Mammary stem cells and the differentiation hierarchy: current status and perspectives. Genes Dev. 28 (11), 1143-1158 (2014).
  14. Wuidart, A., et al. Quantitative lineage tracing strategies to resolve multipotency in tissue-specific stem cells. Genes Dev. 30 (11), 1261-1277 (2016).
  15. Rios, A. C., Fu, N. Y., Cursons, J., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The complexities and caveats of lineage tracing in the mammary gland. Breast Cancer Res. 18 (1), 116(2016).
  16. Van Keymeulen, A., et al. Lineage-restricted mammary stem cells sustain the development, homeostasis, and regeneration of the estrogen receptor positive lineage. Cell Rep. 20 (7), 1525-1532 (2017).
  17. Mahendralingam, M. J., et al. Mammary epithelial cells have lineage-rooted metabolic identities. Nat Metab. 3 (5), 665-681 (2021).
  18. Casey, A. E., et al. Mammary molecular portraits reveal lineage-specific features and progenitor cell vulnerabilities. J Cell Biol. 217 (8), 2951-2974 (2018).
  19. Kim, H., et al. Differential DNA damage repair and PARP inhibitor vulnerability of the mammary epithelial lineages. Cell Rep. 42 (10), 113256(2023).
  20. Waas, M., et al. Droplet-based proteomics reveals CD36 as a marker for progenitors in mammary basal epithelium. Cell Rep Methods. 4 (4), 100741(2024).
  21. Dravis, C., et al. Epigenetic and transcriptomic profiling of mammary gland development and tumor models disclose regulators of cell state plasticity. Cancer Cell. 34 (3), 466-482.e6 (2018).
  22. Giraddi, R. R., et al. Single-cell transcriptomes distinguish stem cell state changes and lineage specification programs in early mammary gland development. Cell Rep. 24 (6), 1653-1666.e7 (2018).
  23. Trejo, C. L., Luna, G., Dravis, C., Spike, B. T., Wahl, G. M. Lgr5 is a marker for fetal mammary stem cells, but is not essential for stem cell activity or tumorigenesis. npj Breast Cancer. 3 (1), 16(2017).
  24. Dravis, C., et al. Sox10 regulates stem/progenitor and mesenchymal cell states in mammary epithelial cells. Cell Rep. 12 (12), 2035-2048 (2015).
  25. Boulanger, C. A., Wagner, K. U., Smith, G. H. Parity-induced mouse mammary epithelial cells are pluripotent, self-renewing and sensitive to TGF-β1 expression. Oncogene. 24 (4), 552-560 (2005).
  26. Matulka, L. A., Triplett, A. A., Wagner, K. U. Parity-induced mammary epithelial cells are multipotent and express cell surface markers associated with stem cells. Dev Biol. 303 (1), 29-44 (2007).
  27. Feng, Y., Manka, D., Wagner, K. U., Khan, S. A. Estrogen receptor-α expression in the mammary epithelium is required for ductal and alveolar morphogenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (37), 14718-14723 (2007).
  28. Hanasoge Somasundara, A. V., et al. Parity-induced changes to mammary epithelial cells control NKT cell expansion and mammary oncogenesis. Cell Rep. 37 (10), 110099(2021).
  29. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), dev169862(2020).
  30. Twigger, A. J., Khaled, W. T. Mammary gland development from a single cell ‘omics view. Semin Cell Dev Biol. 114, 171-185 (2021).
  31. Bach, K., et al. Time-resolved single-cell analysis of Brca1 associated mammary tumourigenesis reveals aberrant differentiation of luminal progenitors. Nat Commun. 12 (1), 1502(2021).
  32. Twigger, A. J., et al. Transcriptional changes in the mammary gland during lactation revealed by single cell sequencing of cells from human milk. Nat Commun. 13 (1), 562(2022).
  33. Ciwinska, M., et al. Mechanisms that clear mutations drive field cancerization in mammary tissue. Nature. 633 (8028), 198-206 (2024).
  34. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. J Virol. 77 (10), 5801-5809 (2003).
  35. Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage tracing of mammary epithelial cells using cell-type-specific Cre-expressing adenoviruses. Stem Cell Rep. 2 (6), 770-779 (2014).
  36. Langille, E., et al. Loss of epigenetic regulation disrupts lineage integrity, induces aberrant alveogenesis, and promotes breast cancer. Cancer Discov. 12 (12), 2930-2953 (2022).
  37. Bu, W., et al. Efficient cancer modeling through CRISPR-Cas9/HDR-based somatic precision gene editing in mice. Sci Adv. 9 (19), eade0059(2023).
  38. Li, C., et al. Quantitative in vivo analyses reveal a complex pharmacogenomic landscape in lung adenocarcinoma. Cancer Res. 81 (17), 4570-4580 (2021).
  39. Foggetti, G., et al. Genetic determinants of EGFR-driven lung cancer growth and therapeutic response in vivo. Cancer Discov. 11 (7), 1736-1753 (2021).
  40. Cai, H., et al. A functional taxonomy of tumor suppression in oncogenic KRAS–driven lung cancer. Cancer Discov. 11 (7), 1754-1773 (2021).
  41. Wang, G., et al. CRISPR-GEMM pooled mutagenic screening identifies KMT2D as a major modulator of immune checkpoint blockade. Cancer Discov. 10 (12), 1912-1933 (2020).
  42. Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nat Genet. 50 (4), 483-486 (2018).
  43. Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Sci Adv. 4 (2), eaao5508(2018).
  44. Rogers, Z. N., et al. A quantitative and multiplexed approach to uncover the fitness landscape of tumor suppression in vivo. Nat Methods. 14 (7), 737-742 (2017).
  45. Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nat Neurosci. 20 (10), 1329-1341 (2017).
  46. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  47. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  48. Wertz, M. H., et al. Genome-wide in vivo CNS screening identifies genes that modify CNS neuronal survival and mHTT toxicity. Neuron. 106 (1), 76-89.e8 (2020).
  49. Xu, C., et al. piggyBac mediates efficient in vivo CRISPR library screening for tumorigenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (4), 722-727 (2017).
  50. Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of Cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. J Vis Exp. (148), e59502(2019).
  51. Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), e50692(2013).
  52. Wangensteen, K. J., et al. Combinatorial genetics in liver repopulation and carcinogenesis with a in vivo CRISPR activation platform. Hepatology. 68 (2), 663-676 (2018).
  53. Jia, Y., et al. In vivo CRISPR screening identifies BAZ2 chromatin remodelers as druggable regulators of mammalian liver regeneration. Cell Stem Cell. 29 (3), 372-385.e8 (2022).
  54. Borrelli, C., et al. In vivo interaction screening reveals liver-derived constraints to metastasis. Nature. 632 (8024), 411-418 (2024).
  55. Al-Zahrani, K. N., Langille, E. R., Nurtanto, J., et al. Aneuploidy selects for the acquisition of driver genes in breast cancer. Nature. , Available from: https://doi.org/10.1038/s41586-026-10752-9 (2026).
  56. Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes Dev. 30 (12), 1470-1480 (2016).
  57. Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nat Commun. 10 (1), 397(2019).
  58. Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO J. 39 (5), embj.2019102169(2020).
  59. Dahlman, J. E., et al. Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9 nuclease. Nat Biotechnol. 33 (11), 1159-1161 (2015).
  60. Kiani, S., et al. Cas9 gRNA engineering for genome editing, activation and repression. Nat Methods. 12 (11), 1051-1054 (2015).
  61. Liao, H. K., et al. In vivo target gene activation via CRISPR/Cas9-mediated trans-epigenetic modulation. Cell. 171 (7), 1495-1507.e15 (2017).
  62. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nat Commun. 9 (1), 5416(2018).
  63. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  64. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  65. Michlits, G., et al. Multilayered VBC score predicts sgRNAs that efficiently generate loss-of-function alleles. Nat Methods. 17 (7), 708-716 (2020).
  66. Lukasiak, S., et al. A benchmark comparison of CRISPRn guide-RNA design algorithms and generation of small single and dual-targeting libraries to boost screening efficiency. BMC Genomics. 26 (1), 198(2025).
  67. Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).
  68. Morgens, D. W., et al. Genome-scale measurement of off-target activity using Cas9 toxicity in high-throughput screens. Nat Commun. 8 (1), 15178(2017).
  69. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  70. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
  71. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biol. 15 (12), 554(2014).
  72. Veltmaat, J. M., Ramsdell, A. F., Sterneck, E. Positional variations in mammary gland development and cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 18 (2), 179-188 (2013).
  73. Esmaeili Anvar, N., et al. Efficient gene knockout and genetic interaction screening using the in4mer CRISPR/Cas12a multiplex knockout platform. Nat Commun. 15 (1), 3577(2024).
  74. Griffith, A. L., et al. Optimization of Cas12a for multiplexed genome-scale transcriptional activation. Cell Genomics. 3 (9), 100387(2023).
  75. Sack, L. M., et al. Profound tissue specificity in proliferation control underlies cancer drivers and aneuploidy patterns. Cell. 173 (2), 499-514.e23 (2018).
  76. Yanchus, C., et al. A noncoding single-nucleotide polymorphism at 8q24 drives IDH1-mutant glioma formation. Science. 378 (6615), 68-78 (2022).
  77. Martinez, S., et al. In vivo CRISPR screens reveal SCAF1 and USP15 as drivers of pancreatic cancer. Nat Commun. 15 (1), 5266(2024).
  78. Lü, Y., et al. Genome-wide CRISPR screens identify novel regulators of wildtype and mutant p53 stability. Mol Syst Biol. 20 (6), 719-740 (2024).
  79. Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils Myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343 (6168), 309-313 (2014).
  80. Bu, W., Li, Y. Advances in immunocompetent mouse and rat models. Cold Spring Harb Perspect Med. 14 (3), a041328(2024).
  81. Ben-Jonathan, N., LaPensee, C. R., LaPensee, E. W. What can we learn from rodents about prolactin in humans? Endocr Rev. 29 (1), 1-41 (2008).
  82. Sánchez-Criado, J. E., et al. Biological role of pituitary estrogen receptors ERα and ERβ on progesterone receptor expression and action and on gonadotropin and prolactin secretion in the rat. Neuroendocrinology. 79 (5), 247-258 (2004).
  83. LaPensee, C. R., et al. The prolactin-deficient mouse has an unaltered metabolic phenotype. Endocrinology. 147 (10), 4638-4645 (2006).
  84. Kinoshita, Y., et al. Similarity of GATA-3 expression between rat and human mammary glands. J Toxicol Pathol. 27 (2), 159-162 (2014).
  85. Nicotra, R., Lutz, C., Messal, H. A., Jonkers, J. Rat models of hormone receptor-positive breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 12(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

233 233
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة