الكشف عالي الدقة لمواقع تحرير الحمض النووي الريبي باستخدام ماسح تحرير الحمض النووي الريبي التفاضلي المعاير

ملخص

يصف هذا البروتوكول استخدام ماسح تحرير الحمض النووي الريبي التفاضلي المعاير (CADRES)، وهو سير عمل حسابي يدمج استدعاء التغيرات المشتركة بين DNA–RNA، وإعادة المعايرة المحسنة للإشارة، والنمذجة الإحصائية الواعية بالتكرار لتحديد مواقع تحرير الحمض النووي الريبي التفاضلي بدقة عالية.

الملخص

لا يزال تحديد تحرير الحمض النووي الريبي بدقة تحديا تقنيا لأن التعديلات الحقيقية بعد النسخ يجب تمييزها عن المتغيرات الجينومية والقطع الأثرية التسلسلية. تتضح هذه الصعوبة بشكل خاص في تحرير السيتيدين إلى اليوريدين الذي يحفزه إنزيمات APOBEC، حيث تخفي التغيرات المتداخلة في الحمض النووي والحمض النووي الريبي إشارة التحرير الحقيقية. يوفر ماسح تحرير الحمض النووي الريبي التفاضلي المعاير (CADRES) إطار عمل حسابي منظم لمعالجة هذه القيود من خلال استجواب متداخل بين الحمض النووي والحمض النووي الريبي والحفاظ المستهدف على توقيعات التحرير الحقيقية. يقدم هذا البروتوكول سير عمل CADRES، بما في ذلك إعداد البيانات، واستدعاء متغير RNA المشترك، وإعادة معايرة جودة الأساس للحفاظ على الإشارة، وترشيح التشكيلات، والتقييم التفريقي لتحرير RNA بين الظروف التجريبية. يدعم CADRES تسلسل تسلسل RNA-seq وتسلسل الجينوم الكامل أو الإكسوم الكامل مع التكرار البيولوجي.  استراتيجية التصفية متعددة المراحل، بما في ذلك إزالة البوليمرات المتجانسة وفحص البارالوج المعتمد على PBLAT، تقلل بشكل منهجي من الإيجابيات الكاذبة مع الحفاظ على أحداث التحرير منخفضة التردد. من خلال دمج المعايرة مع النمذجة الواعية بالتكرار، يزيد CADRES من دقة وقابلية إعادة إنتاج تحليل تحرير الحمض النووي الريبي، مما يمكن من استكشاف ديناميكيات التحرير عبر سياقات بيولوجية متنوعة. مقارنة بالطرق المعتمدة، تم تصميم CADRES لتحسين الدقة في كشف تحرير الحمض النووي الريبي، خاصة للأحداث C-to-U التي تتوسطها APOBEC.

المقدمة

يشكل تحرير الحمض النووي الريبي طبقة ديناميكية من التنظيم بعد النسخ تتيح استبدالات النيوكليوتيدات الخاصة بالموقع داخل نسخ الحمض النووي الريبي دون تغيير تسلسل الحمض النووي الأساسي. في الميتازويات، يكون إزالة الأامينات من الأدينوسين إلى الإينوزين (A>I) التي تتوسط بواسطة إنزيمات ADAR هي الشكل السائد، وتساهم في تنوع النسخ النصي، واستقرار mRNA، والتعديل المناعي الفطري، ووظيفة الخلايا العصبية ^1,2. السيتيدين إلى يوريدين (C>U) (فيما يلي "C>U" في السياق البيولوجي؛ إزالة الأمينات "C>T" في سياق التسلسل)، التي تحفزها أعضاء عائلة APOBEC، تعمل جنبا إلى جنب مع هذه المسارات وترتبط بعملية أيض الدهون، وتقييد الفيروس، والطفرات، والأدوار التنظيمية الناشئة في بيولوجيا المناعة والسرطان 3,4,5,6,7. أظهرت الدراسات الحديثة أن عدة إنزيمات APOBEC، بما في ذلك APOBEC1 و APOBEC3A و APOBEC3B (A3B)، تحفز تحرير الحمض النووي الريبي عبر السياقات الفسيولوجية والمرضية 3,4,7,8,9,10. APOBEC3 إنزيمات تحفز أيضا تحرير الحمض النووي، مما ينتج توقيعات طفرية متداخلة تعقد التمييز بين تحرير الحمض النووي الريبي والتغيرات الجينومية 8,10,11,12.

لقد مكنت التسلسل من الجيل القادم من تحديد مواقع تحرير الحمض النووي الريبي المحتمل على مستوى النسخ، ومع ذلك لا يزال التمييز بين التعديلات الحقيقية وبين SNVs الجينومية أو الضوضاء التقنية أمرا صعبا. تظهر أحداث A>I و C>U كبدائل A>G و C>T في مكتبات cDNA ويمكن أن تخلط في التمهيد الخاطئ، وأخطاء البوليميراز، وعيوب الخرائط، وتغيرات التعبير الخاصة بالسياق. تقوم الموارد العامة مثل REDIportal¹³ بفهرسة ملايين مواقع A>I، بينما تظل تعليقات C>U نادرة، تعكس القيود البيولوجية والتحليلية. لذلك، يبقى التعرف الموثوق على تحرير C>U—وخاصة التغيرات عبر الظروف—حاجة تحليلية غير ملباة.

الهدف العام للطريقة المعروضة هنا، وهو ماسح تحرير الحمض النووي الريبي التفاضلي المعاير (CADRES)، هو التحديد الدقيق للمتغيرات التفاضلية على الحمض النووي الريبي (DVRs): وهي مواقع تحرير تخضع لتغيرات ذات دلالة إحصائية في عمق التحرير بين حالتين أو أكثر معرفتين¹⁴. عند تطوير هذا البروتوكول، سعينا لمعالجة عقبتين مستمرتين. أولا، يجب التمييز بين تعديلات RNA الحقيقية والنسخ المشفرة بالحمض النووي. ثانيا، يجب قياس فروق التحرير بطريقة إحصائية قوية عبر مجموعات بيانات RNA-seq مكررة بيولوجيا. يكمن الابتكار المركزي في CADRES في دمجها لاستدعاء متغيرات الحمض النووي الريبي المشترك مع معالجة معايرة لأنواع الحمض النووي الريبي أثناء إعادة معايرة الدرجات الأساسية (BQSR). تحافظ استراتيجية "إعادة المعايرة المعززة" هذه على مواقع تحرير الحمض النووي الريبي الجديد المكتشفة خلال BQSR، مما يمنع تقليل الجودة المنهجي الذي غالبا ما يضعف الحساسية للتعديلات منخفضة التردد 15,16,17. يقلل هذا النهج من السلبيات الكاذبة ويحسن الخصوصية مقارنة بخطوط الأنابيب التي تعتمد فقط على قواعد بيانات تحرير الحمض النووي الريبي غير المكتملة.

يقع CADRES ضمن مشهد من الأساليب التي تعالج جوانب مختلفة من تحليل تحرير الحمض النووي الريبي. SNPiR¹⁸ وRVboost¹⁹ تتشويش تصفية من مجموعات متغيرة تعتمد فقط على RNA؛ يدمج VaDiR²⁰ مقارنات بين DNA–RNA لكنه لا يصنع بنية مكررة؛ يقوم rMATS-DVR²¹ بإجراء اختبارات تفاضلية قائمة على GLMM لكنه يعتمد حصريا على RNA-seq؛ وJACUSA/^{JACUSA2 22,23} يدعمان الكشف الواعي بالتكرار لكنه لا يدمج استراتيجيات مشتركة للاستجواب أو إعادة المعايرة بين الحمض النووي والحمض النووي الريبي. يوحد CADRES النمذجة الإحصائية الواعية بالتكرار، واستدعاء متغيرات DNA/RNA المشتركة، وإعادة المعايرة المثرية لمواقع التحرير الجديدة، موفرة سير عمل واحد محسن لاكتشاف تحرير RNA المعتمد على الشرط—بما في ذلك أحداث C>U المرتبطة بنشاط APOBEC 10,11,12.

في هذا السياق، قد يعتبر المستخدمون CADRES مناسبين عندما يفي نظامهم التجريبي بالمعايير التالية. أولا، يتوفر تسلسل RNA-seq مزدوج وتسلسل جينوم كامل أو إكسوم كامل من نفس العينات، مما يمكن من تقسيم دقيق للأحداث المشتقة من RNA من المتغيرات المشفرة بالحمض النووي. ثانيا، السؤال البيولوجي يتعلق بالتغيرات في تحرير الحمض النووي الريبي عبر الظروف—مثل تحفيز الإنزيم، الإجهاد البيئي، مراحل التطور، أو حالات المرض—حيث يكون النمذجة الإحصائية لعمق الأليل الخاص عبر النسخ ضرورية. ثالثا، يسعى الباحث إلى تحسين التخصص في اكتشاف تحرير C>U، حيث يكون التمييز بين أحداث الحمض النووي الريبي والطفرات المدفوعة ب APOBEC أمرا لا غنى عنه. تعد CADRES ذات قيمة خاصة في الأنظمة التي يؤدي فيها نشاط APOBEC إلى تعديلات على كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي، كما هو موضح في نماذج A3B المحفزة 10,11,12 وحيث تظهر الطرق التقليدية التي تعتمد فقط على الحمض النووي الريبي معدلات إيجابية كاذبة مرتفعة بسبب التشويش في SNVs أو تشوهات التسلسل المتكرر.

تقدم CADRES عدة مزايا عملية. النداء المشترك بمتغير DNA/RNA يقلل من الإيجابيات الكاذبة المدفوعة ب SNV. يحافظ إعادة معايرة التعزيز على إشارات التحرير الحقيقية، بما في ذلك الأحداث الجديدة التي غائبة عن قواعد البيانات المرجعية. يوفر GLMM المشتق من rMATS إطارا مبدئيا إحصائيا لتحليل التحرير التفاضلي عبر النسخ المكررة. معا، توفر هذه الميزات منصة معايرة وعالية الدقة لدراسة تحرير الحمض النووي الريبي الديناميكي عبر بيئات تجريبية ومرضية. في دراستنا^{السابقة 14}، تم مقارنة CADRES بدقة مع طرق كشف تحرير الحمض النووي الريبي المعتمدة باستخدام مجموعات بيانات محاكاة في السيليكو ونماذج الخلايا A3B القابلة للتحفيز في العالم الحقيقي. في تقييم السيليكو، حقق CADRES باستمرار درجات دقة تتراوح بين 0.85–0.95 ودرجات دقة من 0.92–0.98 عبر الأرقام المكررة. يتم توضيح سير العمل العام ل CADRES في الشكل 1.

البروتوكول

يصف هذا البروتوكول سير عمل معلوماتية حيوية حسابية بحت لتحديد أحداث تحرير الحمض النووي الريبي C>U باستخدام إطار عمل CADRES. تتم جميع الخطوات داخل بيئة لينكس باستخدام سطر الأوامر. تستخدم فقط مجموعات بيانات التسلسل المتاحة للجمهور، ولا يشارك أي أشخاص أو فقاريات.

1. إعداد البيئة وتثبيت البرمجيات

ملاحظة: الحد الأدنى من المتطلبات الحسابية لسير عمل CADRES هو كالتالي: وحدة المعالجة المركزية ≥ 8 أنوية (16 نواة موصى بها)، ذاكرة RAM ≥ 32 جيجابايت (64 جيجابايت موصى بها لمجموعات بيانات الجينوم الكامل)، ومساحة القرص ≥ 100 جيجابايت.

1. تأكد من توفر نظام تشغيل لينكس. افتح نافذة طرفية وتأكد من توفر إذن للتثبيت في بيئة المستخدم الحالية.
2. قم بتثبيت مدير حزم كوندا إذا لم يكن موجودا بالفعل على النظام. قم بتحميل مثبت لتوزيع كوندا بسيط من موقعها الرسمي. نفذ سكريبت التثبيت باتباع التعليمات الظاهرة على الشاشة.
3. تحقق من أن كوندا نشطة بإدخال الأمر التالي وتأكد من أن الأمر يطبع رقم إصدار صالح.
   $ كوندا --نسخة
4. أنشئ دليل عمل لسير عمل CADRES. تصفح هذا الدليل باستخدام:
   $ قرص مضغوط /path/to/working_directory
5. قم بتحميل شفرة مصدر CADRES عن طريق تنفيذ ما يلي:
   $ git clone -- Branch v1.0.0 https://github.com/junsun-hash/CADRES
6. ادخل الدليل المستنسخ عن طريق تشغيل:
   $ سي دي كادرز
7. إنشاء بيئة كوندا مخصصة باستخدام ملف environment.yml المقدم داخل مستودع CADRES. نفذ الأمر التالي والسماح لعملية التثبيت بالإكمال دون انقطاع.
   $ conda env create -f environment.yml
8. فعل البيئة الجديدة بإدخال الأمر التالي. تأكد من أن البيئة قد تم تفعيلها من خلال التحقق من أن موجه الطرفية يعرض اسمها الآن.
   $ كوندا تفعيل الكادرز
9. تحقق من أن أدوات سطر الأوامر المطلوبة قد تم تثبيتها بشكل صحيح. نفذ كل أمر أدناه وتأكد من أنه يعيد رقم الإصدار بدلا من رسالة الخطأ:
   $ python --version
   $ samtools --version
   $ gatk -- المساعدة
   $ أدوات السرير --نسخة
   $ pblat
   ملاحظة: قد تختلف مجموعة الأدوات الدقيقة المضمنة في بيئة CADRES قليلا حسب التحديثات على ملف environment.yml. إذا كانت هناك أداة مفقودة، أعد إنشاء البيئة أو قم بتحديث قائمة التبعيات حسب الحاجة.
10. تأكد من توفر مساحة كافية على القرص. تأكد من وجود مساحة فارغة لا تقل عن 100 جيجابايت للجينومات المرجعية، ومؤشرات المحاذاة، وملفات BAM الوسيطة من خلال إدخال:
    $ df -h
11. تأكد من توفر صلاحيات الكتابة في جميع الأدلة العاملة، والمخرجات، والمؤقتة عن طريق إنشاء ملف اختبار:
    $ لمس test_file.txt
12. احذف الملف بعد ذلك بإدخال:
    $ rm test_file.txt

2. تحضير البيانات

ملاحظة: تتكون مجموعة البيانات الممثلة المستخدمة في هذا البروتوكول من: HEK293T خلايا تحتوي على A3B–GFP المحفز للدوكسيسيكلين؛ WGS عند 33×؛ تسلسل RNA مزدوج النهايات الخاصة بالخيوط (2×150 bp، ≥60 M قراءات/عينة); n = 3 نسخ بيولوجية لكل حالة (DMSO مقابل دوكسيسيكلين 72 ساعة). البيانات الكاملة: SRA PRJNA1211186. يتم توفير مجموعة فرعية من العرض التوضيحي ل chr22 في مستودع CADRES.

يتطلب الكادر: (1) WGS (≥33×) أو WES (≥33×); (2) تسلسل RNA خاص بالخيوط (≥60 مليون قراءة لكل عينة)؛ (3) حالتان تجريبتان مع ≥2 نسخة بيولوجية لكل منهما.

1. جهز الجينوم المرجعي والتعليقات التوضيحية.
   1. قم بتنزيل ملف الجينوم المرجعي (FASTA) وملف التعليقات التوضيحية GTF من Ensembl أو من مستودع مماثل. الجينوم المرجعي الموصى به هو التجميع الأساسي Ensembl GRCh38: https://ftp.ensembl.org/pub/release-111/fasta/homo_sapiens/dna/ والتعليق الموصى به على GTF هو الإصدار 45 من GENCODE:
      https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_45/.
   2. فهرس FASTA المرجعي:
      $ samtools faidx FASTA_FILE.fa
      تأكد من أن اتفاقيات تسمية الكروموسومات (مثل "chr1" مقابل "1") متسقة عبر جميع المواد المرجعية.
2. احصل على بيانات التسلسل.
   1. احصل على ملفات FASTQ (WGS أو WES) بعمق ≥33× في تسلسل DNA.
   2. احصل على ملفات FASTQ خاصة بالخيوط ذات نهايات RNA-seq مزدوجة مع ≥60 مليون قراءة لكل عينة، عبر حالتين بيولوجيتين وعلى الأقل نسختين بيولوجيتين لكل مجموعة.
3. محاذاة قراءات تسلسل الحمض النووي باستخدام BWA-MEM.
   1. بناء مؤشر BWA:
      مؤشر ال BWA دولار Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa -p bwaindex -a bwtsw
   2. محاذاة وتحويل إلى BAM:
      $ bwa mem -R '@RG\tID:ID\tPL:platform\tLB:library\tSM:sample_name' bwaindex wgs_R1.fq.gz wgs_R2.fq.gz | Samtools View -b > WGS.BAM
4. محاذاة قراءات تسلسل الحمض النووي الريبي باستخدام STAR.
   1. إنشاء مؤشر جينوم STAR:
      $ STAR --runMode genomeGenerate \
      --جينوم فاستا Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      --جينوم دير STAR_index \
      --sjdbGTFملف Homo_sapiens. GRCh38.gtf
   2. قراءات محاذاة RNA
      $ نجمة \
      --جينوم دير STAR_index \
      --readFilesCommand zcat \
      --readFilesIn rna_sample1.fq.gz rna_sample2.fq.gz \
      --sjdbGTFملف Homo_sapiens. GRCh38.gtf \
      --outSAMtype BAM غير مرتب \
      --outSAMmapqUnique 60 \
      --outFileNamePrefix pass1_
      ملاحظة: ينتج عن ذلك ملف ربط (pass1_SJ.out.tab) يحتوي على كل من الروابط المشروحة والجديدة.
   3. أعد توليد مؤشر جينوم STAR الذي يتضمن وصلات جديدة:
      $ cat pass1_SJ.out.tab > SJ_all.tab
      $ STAR --runMode genomeGenerate \
      --جينوم فاستا Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      --جينوم دير STAR_index_2pass \
      --sjdbGTFملف Homo_sapiens. GRCh38.gtf \
      --sjdbFileChrStartEnd SJ_all.tab
   4. قم بمحاذاة التمرير الثاني باستخدام الفهرس المحدث:
      $ نجمة \
      --جينوم دير STAR_index_2pass \
      --readFilesCommand zcat \
      --readFilesIn rna_sample1.fq.gz rna_sample2.fq.gz \
      --sjdbGTFملف Homo_sapiens. GRCh38.gtf \
      --outSAMtype BAM مرتب حسب الإحداثيات \
      --outSAMmapqUnique 60 \
      --outFileNamePrefix output_name
5. جهز موارد مرجعية مساعدة.
   1. (موصى به) الحصول على dbSNP VCF
      قم بتنزيل ملف DBSNP البشري GRCh38 (على سبيل المثال، dbSNP build 150) من خادم NCBI FTP:
      https://ftp.ncbi.nih.gov/snp/latest_release/VCF/ وضع الملف المحمل (على سبيل المثال، dbsnp_150.vcf.gz) في الدليل العامل.
      ملاحظة: قد تخفي المدخلات المشتقة من الحمض النووي الريبي (molType="cDNA") في dbSNP مواقع تحرير الحمض النووي الريبي الحقيقي. استثناؤها من استخدام:
      $ bcftools view -i 'INFO/molType!="cDNA"' dbsnp.vcf.gz -Oz -o dbsnp_no_cDNA.vcf.gz
   2. (موصى به) فرز dbSNP VCF
      قم بفرز VCF بحيث يكون متوافقا مع الجينوم المرجعي وGATK:
      $ gatk SortVcf \
      -dbsnp_150.vcf.gz \
      -أو dbsnp_150.sorted.vcf.gz \
      --قاموس التسلسلات Homo_sapiens. GRCh38.dict
   3. (موصى به) فهرسة dbSNP VCF المرتب
      أنشئ فهرسا ل dbSNP VCF المرتب:
      $ gatk IndexFeatureFile -I dbsnp_150.sorted.vcf.gz
      ملاحظة: هناك حاجة إلى قاموس مرجعي مطابق. إذا كان الملف Homo_sapiens. GRCh38.dict مفقود، قم بتولده كما يلي:
      $ gatk CreateSequenceDictionary \
      -آر Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
      -يا Homo_sapiens. GRCh38.dna.primary_assembly.dict
   4. (موصى به) الحصول على خط جرثومي gnomAD VCF
      حمل مواقع متغيرات الخط الجرثومي GRCh38 gnomAD VCF من: https://gnomad.broadinstitute.org/downloads استخدم الجينوم VCF المناسب لخط الأنابيب (على سبيل المثال، gnomad.genomes.vX.X.sites.vcf.gz).
   5. (موصى به) فرز ملف gnomAD VCF
      قم بفرز VCF في gnomAD باستخدام نفس قاموس المرجع لضمان التوافق:
      $ gatk SortVcf \
      -أنا gnomad.vcf.gz \
      -يا gnomad.sorted.vcf.gz \
      --قاموس التسلسلات Homo_sapiens. GRCh38.dict
   6. (موصى به) فهرسة gnomAD VCF المرتب
      أنشئ فهرسا لملف gnomAD VCF المرتب:
      $ gatk IndexFeatureFile -I gnomad.sorted.vcf.gz
      ملاحظة: تأكد من أن تسمية الكروموسومات (على سبيل المثال، "chr1" مقابل "1") تطابق مع FASTA المرجعي قبل تشغيل SortVcf.
6. احصل على مرجع تحرير RNA معروف.
   ملاحظة: ملف مرجعي متوافق من بوابة REDIportal (rediportal.txt) مناسب ل CADRES يتم تنسيقه داخل مستودع CADRES ويمكن تنزيله مباشرة من:
   https://github.com/junsun-hash/CADRES/releases/tag/v1.0.0. يستخدم هذا الملف لتوضيح أحداث التحرير المعروفة في الخطوة 3.
7. جهز تعليقات الجينات بصيغة RefGene. قم بتحميل تعليق RefGene (على سبيل المثال، refGene.txt.gz من جامعة UCSC). قم بفك الضغط إذا لزم الأمر وتأكد من أن أسماء الكروموسومات تتوافق مع تلك الموجودة في الجينوم المرجعي.
   ملاحظة: مثال مناسب ل CADRES تم تنسيقه ضمن مستودع CADRES ويمكن تنزيله مباشرة من:
   https://github.com/junsun-hash/CADRES/releases/tag/v1.0.0

3. تنفيذ سير العمل التحليلي ل CADRES

ملاحظة: يتم تنفيذ القسم 3 في محطة لينكس مع تفعيل بيئة CADRES Conda.

1. المعايرة وإعادة معايرة التعزيز
   ملاحظة: الخطوة الأولى توحيد ملفات BAM وتقوم بإعادة معايرة Boost — وهي BQSR محسنة تدمج dbSNP وgnomAD ومجموعة أولية من مرشحي تحرير RNA للحفاظ على إشارات التحرير الحقيقية. قم بإدراج جميع ملفات RNA BAM المفصولة حسب المسافات. المخرجات: مواقع مرشحة لإعادة معايرة BAMs (لاحقة: _recalibration.bam) ومواقع مرشحة Boost.
   1. لتنفيذ الخطوة 3.1:
      $ بايثون pipeline_step1_calibration.py \
      --rna_bams /path/to/rna_sample1.bam /path/to/rna_sample2.bam ... \
      --dna_bam /path/to/wgs_normal.bam \
      --جينوم /path/to/hg38.fa \
      --known_snv /path/to/dbsnp.sorted.vcf.gz \
      --output_dir ./output/step1_calibration \
      --بادئة project_demo
      ملاحظة: يتم بناء مرشحي التعزيز من استدعاء مشترك أولي مشترك بين DNA وRNA Mutect2 (--max-events-in-region-4، فلتر PASS فقط؛ لا توجد عتبات تركيز أو جودة إضافية). يتم التعامل مع الترشيح المتجانس وتكرار البوليمر في الخطوة 3.2.
2. النداء المتغير، تقدير التلوث، والترشيح
   ملاحظة: الخطوة 3.2 تقوم بإجراء استدعاء مشترك لمتغير DNA-RNA مع تقدير التلوث (عبر gnomAD)، ثم تصفية المرشحين حسب سياق البوليمر المتماثل وإعادة محاذاة PBLAT. المخرج: {بادئة}.final.vcf.
   1. لتنفيذ الخطوة 3.2:
      $ بايثون pipeline_step2_variant_calling.py \
      --rna_bams ./output/step1_calibration/rna_sample1_split_recalibration.بام ... \
      --dna_bam ./output/step1_calibration/DNA_processed_recalibration.bam \
      --جينوم /path/to/hg38.fa \
      --جنوماد /path/to/gnomad.sorted.vcf.gz \
      --output_dir ./output/step2_variant_calling \
      --بادئة project_demo
      ملاحظة: تنتج هذه الخطوة مجموعة النداء النهائية (project_demo.final.vcf) التي تصفى بدقة في النداء المتغير، والتي تمثل فروقا عالية الثقة بين RNA-DNA عبر جميع العينات. المعلمات الرئيسية: Mutect2 ---الحد الأدنى للوسيط الأساس بجودة 12، --أقصى أحداث في المنطقة 4؛ PBLAT minbasequal 5; جميعها معدة مسبقا في سكريبت خط الأنابيب.
3. الاختبار الإحصائي والتعليق الوظيفي
   ملاحظة: الخطوة 3.3 تحدد التحرير التفاضلي للحمض النووي الريبي باستخدام GLMM مقتبس من rMATS (تصحيح بنجاميني-هوشبرغ FDR)، وتحدد كل موقع بمنطقة الجين، ورمز الجين، وحالة التحرير المعروفة. المخرج: {بادئة}_Result.txt (DVRs بقيم P وFDR).
   يقوم مرشح إعادة محاذاة PBLAT بإزالة المرشحين الذين يختفون إلى مواقع جينومية متعددة، مما يعزز الخصوصية في المناطق المتكررة. يتم التحكم في THREAD_COUNT داخلي بواسطة علم --threads في pipeline_step2_variant_calling.py.
   1. لتنفيذ الخطوة 3.3:
      $ بايثون pipeline_step3_statistical_test.py \
      --group1_rna_bams ./output/step1_calibration/control_rep1.بام ... \
      --group2_rna_bams ./output/step1_calibration/treated_rep1.بام ... \
      --final_vcf ./output/step2_variant_calling/project_demo.final.vcf \
      --جينوم /path/to/hg38.fa \
      --known_snv /path/to/dbsnp.sorted.vcf.gz \
      --known_editing /path/to/rediportal.txt \
      --gene_anno /path/to/refGene.txt \
      --output_dir ./output/step3_statistical_test \
      --الملصقات تم التعامل معها
      ملاحظة: المعلمات الرئيسية: mpileup في samtools -q 30 (جودة رسم الخرائط الأدنى)، -Q 17 (الحد الأدنى لجودة القاعدة); اختبار rMATS-GLMM نسبة الاحتمالية مع قطع Δψ = 0.0001، ورابط لوجيت ثنائي الحدين مع عقوبة طبيعية متعددة المتغيرات واعية بالتكرار (rho = 0.9); تصحيح بنجاميني-هوشبرغ روزفلت؛ جميعها معدة مسبقا في سكريبت خط الأنابيب
      تدعم جميع خطوات خط الأنابيب الثلاث التنفيذ متعدد الخيوط عبر علم --threads (الافتراضي: 4 في كل خطوة). الخطوة 2 تقبل أيضا --contamination_threads (الافتراضي: 2).

4. فحص النتائج وتصورها

1. بعد الانتهاء من سير عمل CADRES، انتقل إلى دليل الإخراج. يسرد ملف النتائج الرئيسي، {prefix}_Result.txt، جميع المتغيرات التفاضلية المكتشفة على الحمض النووي الريبي (DVRs)، بما في ذلك الإحداثيات الجينومية، والأليلات، وعدد الأليلات على مستوى التكرار، والكسور المعدلة، والفروق بين المجموعات، والمقاييس الإحصائية المرتبطة (قيمة P وFDR). كما تتضمن تعليقات على مستوى الجين (رمز الجين، المنطقة، السلسلة، نوع المتغير، حالة SNP/التحرير المعروفة). الملف الملخص المرفق، {prefix}_Result_summary.txt، يوفر أعداد كل نوع من أنواع الاستبدال وتصنيفها إلى DVRs SNP، وDVRs معروفة بتحرير RNA، وDVRs جديدة.
2. (اختياري) قم بتوليد تصورات قياسية عن طريق تشغيل سكريبت التحليل اللاحق. افتح جلسة R وادخل:
   وحدة تحكم R:
   المصدر ("ما بعد التحليل.R")
   النص Post-analysis.R مدرج في https://github.com/junsun-hash/CADRES/.
3. سيظهر مربع اختيار الملف؛ اختر {prefix}_Result.txt. ينتج النص ستة تماثيل من بابوا غينيا الجديدة.
   ملاحظة: مربع اختيار الملف يتطلب جلسة R على سطح المكتب. على الخوادم بدون رأس، قم بتحرير المتغير input_file مباشرة (السطر 10 من Post-analysis.R) وتشغيل Rscript Post-analysis.R.

النتائج

لتقييم CADRES في ظروف تجريبية واقعية، استخدمنا نظام APOBEC3B قابل للحث (A3B) في خلايا 293T. تم إدخال تركيب فيروسي عدسي مستجيب للدوكسيسيكلين يعبر عن A3B-GFP في خلايا 293T، وتم اختيار عناصر مستقرة باستخدام بورومايسين. أدى التحفيز بالدوكسيسيكلين لمدة 72 ساعة إلى إنتاج تعبير قوي من A3B-GFP، تم تأكيده بفلورة GFP وزيادة مستويات mRNA في A3B. ثم خضعت العينات المطابقة المستحثة وغير المحفزة لاستخراج DNA وRNA موحد، وتحضير المكتبة، والتسلسل لضمان أن الفروق الملحوظة بين RNA-DNA تعكس تحريرا حقيقيا يعت...

المناقشة

يوفر سير عمل CADRES المعروض هنا استراتيجية معايرة ومتسقة داخليا للكشف عن أحداث تحرير الحمض النووي الريبي التفاضلي ذات الخصوصية العالية، خاصة إزالة الأأمينات في C>U التي تحفزها إنزيمات APOBEC. تعد عدة خطوات داخل البروتوكول حاسمة لدقته. المطابقة بين التسلسل الجينومي والترجمي ضروري لتمييز تعديلات RNA الحقيقية عن تعدد أشكال DNA الأساسية، بينما تحمي عملية إعادة المعايرة المعزز المتحورات الحقيقية من التعرض للعقاب الخطأ أثناء إعادة معايرة الدرجة الأساسية. لا تقل أهمية عن مرشحات تركيب التسلسل وا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
BCFtools	Samtools project	N/A	الإصدار 1.21. استدعاء المتغير ومعالجة VCF. الرابط: https://github.com/samtools/bcftools
Bedtools	Quinlan Lab	N/A	الإصدار 2.31.1. عمليات حسابية على الجينوم. الرابط: https://github.com/arq5x/bedtools2
Biopython	Biopython project	N/A	الإصدار 1.85. أدوات بايثون لعلم الأحياء الجزيئية. الرابط: https://www.biopython.org
BWA-MEM	GitHub (lh3/bwa)	N/A	الإصدار 0.7.18. محاذاة DNA-seq. الرابط: https://github.com/lh3/bwa
CADRES source code	GitHub (junsun-hash/CADRES)	N/A	الإصدار 1.0.0. نصوص برنامج CADRES. الرابط: https://github.com/junsun-hash/CADRES
Conda or Miniconda	Anaconda Inc.	N/A	الإصدار 23.1. مدير الحزم والبيئة. الرابط: https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
dbSNP GRCh38 VCF	NCBI	N/A	الإصدار 155. قاعدة بيانات المتغيرات الجرثومية الشائعة. الرابط: https://ftp.ncbi.nih.gov/snp/
GATK4	Broad Institute	N/A	الإصدار 4.3.0.0. مجموعة أدوات تحليل الجينوم. الرابط: https://github.com/broadinstitute/gatk
Git	Software Freedom Conservancy	N/A	الإصدار 2.39. نظام التحكم في الإصدار. الرابط: https://git-scm.com
gnomAD GRCh38 VCF	Broad Institute	N/A	الإصدار 3.1. ترددات الأليلات السكانية. الرابط: https://gnomad.broadinstitute.org
GTF annotation file	Ensembl	N/A	الإصدار 109. تعليق الجينات لـ GRCh38. الرابط: https://www.ensembl.org
Human reference genome GRCh38	Ensembl/UCSC	N/A	الإصدار 109. تجميع الجينوم المرجعي. الرابط: https://www.ensembl.org أو https://hgdownload.soe.ucsc.edu
Linux workstation or server	Various	N/A	Ubuntu 20.04. مطلوب بنية x86_64. الرابط: https://ubuntu.com
pblat	UCSC Genome Browser	N/A	الإصدار 2.5.1. إعادة محاذاة BLAT المتوازية. الرابط: https://github.com/ucscGenomeBrowser/kent
Picard	Broad Institute	N/A	الإصدار 2.20.8. معالجة بيانات NGS. الرابط: https://github.com/broadinstitute/picard
Python	Python Software Foundation	N/A	الإصدار 3.9.19. لغة برمجة. الرابط: https://www.python.org
R	R Foundation	N/A	الإصدار 4.5.2. الحوسبة الإحصائية. الرابط: https://www.r-project.org
R package: forcats	CRAN	N/A	الإصدار 1.0.0. معالجة العوامل. الرابط: https://cran.r-project.org/package=forcats
R package: ggplot2	CRAN	N/A	الإصدار 4.0.1. تصور البيانات. الرابط: https://cran.r-project.org/package=ggplot2
R package: ggrepel	CRAN	N/A	الإصدار 0.9.5. تنافر التسمية النصية. الرابط: https://cran.r-project.org/package=ggrepel
R package: lme4	CRAN	N/A	الإصدار 1.1.35. النماذج الخطية ذات التأثيرات المختلطة. الرابط: https://cran.r-project.org/package=lme4
R package: readr	CRAN	N/A	الإصدار 2.1.5. قراءة الملفات السريعة. الرابط: https://cran.r-project.org/package=readr
R package: stringr	CRAN	N/A	الإصدار 1.6.0. معالجة السلاسل. الرابط: https://cran.r-project.org/package=stringr
REDIportal reference	University of Bologna	N/A	الإصدار 2.0. قاعدة بيانات مواقع تحرير RNA A-to-I. الرابط: http://srv00.recas.ba.infn.it/atlas/
RefGene annotation	UCSC Table Browser	N/A	الإصدار 109. تعليق بنية الجينات. الرابط: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables
Samtools	Samtools project	N/A	الإصدار 1.21. معالجة ملفات BAM. الرابط: https://github.com/samtools/samtools
STAR aligner	GitHub (alexdobin/STAR)	N/A	الإصدار 2.7.11b. محاذاة RNA-seq. الرابط: https://github.com/alexdobin/STAR