يصف هذا البروتوكول نافذة جمجمة شفافة بصريا مثبتة على الرأس (HOTS) تعتمد على إجراء تنظيف الجماجم المكون من خطوتين محسن. ينتج هذا النهج جمجمة شفافة للغاية، مما يتيح تصوير القشرة المخية للفأر البالغ باستخدام فوتونين حتى أعماق تصل إلى ~800 ميكرومتر.
مقالة منهجية
نافذة جمجمة شفافة بصريا مثبتة على الرأس (HOTS) للتصوير العميق عبر الجمجمة لقشرة الفأر
Lina Liu1,2 , Yufeng Gao1,2 , Yuezhi He1 , Jiuling Liao1 , Shiwei Ye1 , Na Xiao1 , Xueming Cao1 , Ting Wu1 , Jia Yu1 , Wei Zheng1,3 , Hui Li1,3
1Research Center for Biomedical Optics and Molecular Imaging, Shenzhen Key Laboratory for Molecular Imaging, Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Optical Imaging Technology, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 2University of Chinese Academy of Sciences, 3Key Laboratory of Biomedical Imaging Science and System, Chinese Academy of Sciences, State Key Laboratory of Biomedical Imaging Science and System
يفتح في علامة تبويب جديدة
في هذه المقالة
ملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
الملخص
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
التصوير عالي الدقة بفوتونتين لقشرة دماغ الفأر البالغ محدود بشدة بسبب تشتت الضوء من الجمجمة، مما يخفف الإشارات ويحد من عمق التصوير في الجسم الحي. على الرغم من تطوير طرق إزالة الجماجم لتوفير وصول بصري إلى القشرة عبر الجمجمة السليمة، إلا أن أدائها العملي محدود بسبب وقت التنظيف المحدود وتركيبات التنظيف غير المثالية. هنا، نقدم بروتوكولا مفصلا لتنفيذ نافذة جمجمة شفافة بصريا مثبتة على الرأس (HOTS). في هذا النهج، تم استخدام غطاء مثبت على الرأس للحفاظ على تنظيف المحاليل فوق الجمجمة، مما يتجنب التخدير المطول أو القيود الجسدية ويسمح بتنظيف الجمجمة لفترة طويلة (عدة ساعات) في الفئران المستيقظة والمتحركة بحرية. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء إجراء تنظيف من خطوتين باستخدام المواد المختصة (HOTS-S1: 10٪ وزن/v EDTA، 15٪ وزن/وزن ضد D-manoz، 10٪ وزن/وزن سلفولان، 0.5٪ وزن/وزن في المراهقين 20؛ HOTS-S2: 70٪ وزن/وزن في D-manoz، 5٪ وزن/v سلفولان، 0.5٪ وزن/v في 20 سنة) تم تحسينها من خلال الفحص الكيميائي المنهجي. نوفر بروتوكولا خطوة بخطوة يشمل تعريض الجمجمة واستقرارها، وإنشاء وتركيب الغطاء المثبت على الرأس، وتسليم وتجديد كواشف التطهير، والتحضير اللاحق للتصوير. في الفئران التي تبلغ 6 أسابيع (~20 جرام)، ينتج بروتوكول HOTS بشكل روتيني جمجمة شفافة للغاية تدعم التصوير بفوتونين للهياكل القشرية حتى أعماق تصل إلى ~800 ميكرومتر تحت سطح البيا، مما يقترب من أداء نوافذ الجمجمة المفتوحة. تتيح نافذة HOTS التصوير الهيكلي في فئران Thy1-GFP-M والتصوير الوظيفي للكالسيوم في فئران Thy1-GCaMP6s. نعتقد أنه، كنهج مريح وقليل-توغلي، ستسهل نافذة HOTS بشكل كبير التصوير العميق عبر الجمجمة والتلاعب البصري والدوائي الضوئي وغيره من عمليات الضوء في الجسم الحي.
المقدمة
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
المراقبة داخل الحيوية للخلايا العصبية القشرية ضرورية لفهم بنية ووظيفة الدماغ1. المجهر ذو الفوتونين (TPM) هو أداة رئيسية لمثل هذه الدراسات في الجسم الحي 2,3. ومع ذلك، فإن جودة التصوير وعمقها محدودان بشدة بسبب تشتت الضوء القوي من الجمجمة المعتمة التي تغطي القشرة 4,5.
نوافذ Open-skull6 ونوافذ 7,8 ذات الجمجمة الرفيعة حسنت بشكل كبير الوصول البصري إلى القشرة وتستخدم على نطاق واسع، لكن كلا النهجين لهما قيود متأصلة. يمكن أن تسبب نوافذ الجمجمة المفتوحة إصابات دماغية حادة واستجابات التهابية9،10، بينما ترقق الجمجمة يتطلب تقنيا صعوبة في تحقيق سمك موحد11،12.
تقدم تقنيات تنظيف بصري الجمجمة في الجسم الحي، بديلا طفيف التوغل يتيح التصوير بفوتونين بدقة محورية في الفئران البالغة. ومع ذلك، يبقى عمق التصوير القابل للتحقيق محدودا (عادة 150–400 ميكرومتر تحت السطح) 12،13،14،15. في الواقع، عادة ما يقتصر تنظيف الجمجمة على فترة قصيرة تحت التخدير مع تثبيت صلب للرأس، وظل تحسين تركيب عظم الجمجمة بشكل منهجي في تركيب عظم الجمجمة غير مستكشف 12,13,14,15.
لتجاوز هذه القيود، طورنا سابقا نافذة جمجمة شفافة بصريا مثبتة على الرأس (HOTS) تدعم تنظيف الجماجم لفترة طويلة وغير متصلة في الفئران الحرة (الشكل 1A)16. يستخدم هذا النهج عملية تنظيف من خطوتين باستخدام الكواشف (S1 و S2)، والتي تم تحسينها من خلال الفحص الكيميائي المنهجي في عملنا السابق16. تم الإبلاغ عن تحسين منهجي لكواشف التنظيف وتوصيف فعالية التطهير، وقابلية العكس، والسلامة البيولوجية، وأداء التصوير الحي لنافذة HOTS في عملنا السابق16، والذي أظهر أيضا استجابة نجمية دبقية إيجابية بعد علاج HOTS. هنا، نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لإنشاء نافذة HOTS لتمكين التصوير العميق عبر الجمجمة بفوتونتين في الفئران البالغة. في التحضيرات التمثيلية، تصل أعماق التصوير إلى ~800 ميكرومتر تحت السطح، وهي تقريبا مماثلة لتلك الممكنة في نوافذ الجمجمة المفتوحة. تتيح نافذة HOTS التصوير الهيكلي العميق في فئران Thy1-GFP-M وتصوير الكالسيوم الوظيفي في فئران Thy1-GCaMP6s المستيقظة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت الموافقة على جميع إجراءات العناية بالحيوانات والتجارب من قبل لجنة العناية والاستخدام الحيواني في مقاطعة قوانغدونغ، وتم تنفيذها وفقا لإرشادات لجنة أخلاقيات التجارب الحيوانية في معهد شنتشن للتكنولوجيا المتقدمة، الأكاديمية الصينية للعلوم. المواد والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد.
ملاحظة: هذا البروتوكول محسن للفئران التي تبلغ 6 أسابيع (وزن الجسم ~20 جم)، والتي يبلغ سمك جمجمتها حوالي 100 ميكرومتر.
1. تحضير محاليل إزالة الجماجم
- تحضير محلول إزالة الجمجمة S1 (10٪ وزن/فولت EDTA، 15٪ وزن/فول D-مانوز، 10٪ وزن/فول سلفولان، 0.5٪ وزن/فول في Tween 20؛ RI: 1.38; الرقم الهيدروجيني النهائي: 7.0-7.4)
- يزن 0.35 جرام من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH). أضف إلى 20 مل من الماء منزوع الأيونات في كأس وحركه حتى يذوب تماما. هذا يرفع درجة الحموضة للمحلول، مما يسهل حل EDTA لاحقا.
ملاحظة: NaOH يسبب التآكل. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة (قفازات، معطف مختبر، واقي للعين) ومسكها بغطاء بخار كيميائي. - أضف 4 جرام من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) إلى محلول NaOH. ضع الكأس في حمام ماء بدرجة حرارة 40 درجة مئوية وحرك الكوب باستمرار حتى يذوب EDTA بالكامل.
- برد الخليط إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 6 جرام من D-mannose، و4 جرام من السلفولان، و0.2 جرام من Tween 20 إلى المحلول. حرك على درجة حرارة الغرفة حتى تذوب جميع المكونات تماما.
- أضف ماء منزوع الأيونات ليصل الحجم النهائي إلى 40 مل. اخلط جيدا للحصول على S1.
ملاحظة: يمكن تخزين S1 في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
- يزن 0.35 جرام من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH). أضف إلى 20 مل من الماء منزوع الأيونات في كأس وحركه حتى يذوب تماما. هذا يرفع درجة الحموضة للمحلول، مما يسهل حل EDTA لاحقا.
- تحضير محلول إزالة الجمجمة S2 (70٪ وزن/وزن ضد D-manos، 5٪ وزن/v سلفولان، 0.5٪ وزن/وزن في Tween 20؛ RI نهائي: 1.44؛ الرقم الهيدروجيني النهائي: 7.0-7.4)
- وزن 28 جرام من D-manoz، و2 جرام من السلفولان، و0.2 جرام من Tween 20 وانقلها إلى كأس نظيف.
- أضف ماء منزوع الأيونات إلى حوالي 30 مل وحرك في درجة حرارة الغرفة حتى تذوب جميع المكونات تماما.
- أضف ماء منزوع الأيونات ليصل الحجم النهائي إلى 40 مل وامزج جيدا للحصول على S2.
ملاحظة: التسخين اللطيف (25–30 درجة مئوية) والتحريك المستمر يسرعان من ذوبان المانوز D. يمكن تخزين S2 في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
2. التحضير للجراحة
- قم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية وقم بتعقيم مساحة العمل جيدا بنسبة 75٪ كحول.
- تخدير الفأر عن طريق حقن الصوديوم بنتوباربيتال 1٪ داخل الصفاق (150–200 ميكرولتر لكل 20 جرام من وزن الجسم).
ملاحظة: يمكن استخدام مخدرات عكسية أخرى كبدائل لبنتوباربيتال الصوديوم. - راقب عمق التخدير باستخدام اختبار رد فعل القرص والضغط على إصبع القدم وتأكد من أن الفأر مخدر بالكامل قبل بدء الجراحة.
- ضع الفأرة في إطار ستيريوتاكسي وثبت الرأس بقضبان أذن.
- حافظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة تدفئة.
- ضع مرهم العيون على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية.
ملاحظة: راقب التنفس وردود الفعل عن كثب لتجنب جرعة زائدة من التخدير واكتئاب التنفس.
3. الجراحة وتركيب لوحة الرأس
- تعرض الجمجمة وتنظيف (الشكل 1Bأ)
- قم بإزالة فروة الرأس فوق كامل سطح الجمجمة الظهري باستخدام ملقط ناعم ومقص جراحي. قم بقص الجلد جانبيا لكشف حواف العضلات الصدغية وخلفها نحو عضلات الرقبة.
- قم بإزالة الشغاق بلطف من سطح الجمجمة باستخدام ملقط ناعم.
- نظف سطح الجمجمة باستخدام أداة تطبيق رطبة ذات طرف قطني وجفف الجمجمة بتدفق هواء لطيف.
- إذا كان هناك حاجة إلى تحديد موقع دقيق للمناطق الوظيفية في القشرة الدماغية، قم بتحديد نقاط مرجعية بمسافة 1 مم على سطح الجمجمة باستخدام جهاز تفريقي تدريجي.
- تطبيق الأسمنت السني ولوح الرأس (الشكل 1Bb)
- جهز الأسمنت السني وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يوصى باستخدام أسمنت الأسنان ذو التصاق قوي ومتانة جيدة، مناسبة للتثبيت طويل الأمد، لضمان تثبيت مستقر.
- ضع طبقة رقيقة من الأسمنت السني على سطح الجمجمة المكشوفة والأنسجة المحيطة للحماية، مع ترك المنطقة المخصصة لنافذة التنظيف غير مغطية.
ملاحظة: بعد خلط مكونات المسحوق والسائل في الأسمنت السني بنسبة حجم 1:1، انتظر حوالي 10 ثوان حتى يلتصق الأسمنت بطرف عود الأسنان قبل التطبيق. هذا يقلل من سيولته ويحسن من التحكم. أثناء التطبيق، ضع الأسمنت من الأطراف باتجاه نافذة التنظيف المخصصة، وحافظ على منطقة النافذة خالية تماما من الأسمنت. تعرف المنطقة الخالية من خلال حدود مادة السد السني (أسمنت الأسنان ومادة البطانة الناعمة) على سطح الجمجمة. لذلك، يمكن تعديل حجمه، لكنه محدود بالغرز القحفية أو حجم الغطاء. للتطبيق الشائع في نصف الكرة الواحد، يكون قطر المنطقة المزيفة عادة ~3–5 مم. - ثبت لوحة رأس صغيرة من التيتانيوم (لتثبيت الرأس على حامل مخصص أثناء التصوير اللاحق) على الجمجمة باستخدام أسمنت الأسنان.
ملاحظة: يمكن استخدام تصاميم مختلفة لألواح الرأس لتثبيت الرأس. في هذه الدراسة، تم استخدام كل من ألواح الرأس المتوفرة تجاريا وألواح التيتانيوم ذات الثقبتين المخصصة بنجاح. بغض النظر عن التصميم، يجب أن توفر لوحة الرأس استقرارا ميكانيكيا كافيا للتصوير اللاحق ولا تعيق نافذة التصوير المقصودة.
4. إنشاء نافذة HOTS
- أغلق الجمجمة بمادة بطانة سنية ناعمة ذاتية التصلب (الشكل 1Bc)
- بعد أن يتصلب الأسمنت السني بالكامل لمدة تقارب 5 دقائق، غط طبقة الأسمنت، باستثناء منطقة نافذة التنظيف، بطبقة رقيقة من مادة بطانة سنية ناعمة ذاتية التجفيف لتشكيل ختم مستمر فوق الجمجمة.
ملاحظة: مادة البطانة الناعمة تحسن الإغلاق وتقلل من التسرب أثناء التعرض المطول لمواد التنظيف المستمرة. - شكل مادة البطانة الناعمة ذات المعالجة الذاتية بسلاسة حول هامش نافذة التنظيف المخطط لها، مما يخلق سطحا مسطحا لإغلاق الغطاء.
- بعد أن يتصلب الأسمنت السني بالكامل لمدة تقارب 5 دقائق، غط طبقة الأسمنت، باستثناء منطقة نافذة التنظيف، بطبقة رقيقة من مادة بطانة سنية ناعمة ذاتية التجفيف لتشكيل ختم مستمر فوق الجمجمة.
- تركيب الغطاء (الشكل 1Bd)
- اقطع رأس ماصة بلاستيكية قابلة للاستخدام مرة واحدة (بولي إيثيلين، PE) لإنشاء غطاء أسطواني صغير بغطاء مغلق من الأعلى وأسفل مفتوح. يظهر PE استقرارا كيميائيا جيدا ولا يظهر أي تحلل أو تفاعل مرئي مع محاليل التصفية S1 أو S2 أثناء عملية التنظيف.
ملاحظة: الغطاء المقطوع من رأس مصباح ماصة النقل بسعة 1 مل عادة ما يكون قطره ~12 مم وارتفاعه ~10–14 مم. - ضع الغطاء فوق منطقة نافذة التنظيف المخصصة واضغط عليها برفق على مادة البطانة الناعمة.
ملاحظة: الغطاء أكبر من المنطقة التي تم إزالتها، ويمكن تطبيق جزء من الجمجمة تحت الغطاء غير المستخدم للمنطقة النظيفة باستخدام مادة سدادية الأسنان لحماية الجمجمة من الفتح. - ثبت الغطاء في مكانه باستخدام مادة بطانة ناعمة إضافية حول قاعدته، لضمان إغلاق الوصلة بين الغطاء والجمجمة بالكامل.
- استخدم حقنة بسعة 1 مل مع إبرة 26 جيلون لثقب واحد أو أكثر من الفتحات الصغيرة في جدار الغطاء لتكون منافذ لحقن وسحب محاليل التطهير.
- دع مادة البطانة الناعمة لتصلب تماما. تحقق من أن الغطاء مثبت بإحكام وأنه لا توجد فجوات ظاهرة عند الواجهة.
- أزل الفأر من إطار التخدير وضعه في قفص دافئ حتى يتعافى تماما من التخدير.
ملاحظة: هذه نقطة توقف مناسبة. قم بإجراء إزالة الجمجمة بعد أن يلتفت الأسمنت السني والمادة الناعمة تماما. في عيادتنا، يمكن تركيب نافذة HOTS في فترة بعد الظهر، تليها تنظيف الجمجمة في صباح اليوم التالي، بعد تعافي الفأر تماما من الجراحة. بدلا من ذلك، يمكن بدء إزالة الجماجم بعد حوالي 15 دقيقة من تركيب نافذة HOTS. أثناء تركيب نافذة HOTS، تبقى الجمجمة سليمة هيكليا، رغم إزالة الشاحاح.
- اقطع رأس ماصة بلاستيكية قابلة للاستخدام مرة واحدة (بولي إيثيلين، PE) لإنشاء غطاء أسطواني صغير بغطاء مغلق من الأعلى وأسفل مفتوح. يظهر PE استقرارا كيميائيا جيدا ولا يظهر أي تحلل أو تفاعل مرئي مع محاليل التصفية S1 أو S2 أثناء عملية التنظيف.
5. تنظيف الجماجم في فئران مستيقظة وحرة التصرف
ملاحظة: خلال مرحلة التطهير، يبقى الفأر مستيقظا ويتصرف بحرية في قفصه المنزلي. استخدم تخدير الإيزوفلوران لفترة وجيزة فقط لحقن المحلول وتبادله عبر غطاء الرأس.
- التحميل الأولي ل S1
- ضع الفأر في غرفة تحفيز وقم بتحفيز تخدير قصير بنفس نسبة إيزوفلوران 3–4٪ في الهواء بمعدل تدفق يتراوح بين 300–500 مل/دقيقة حتى يصبح الفأر غير قادر على الحركة. لم يتم استخدام أي تخدير صيانة.
- قيد الفأرة بلطف وثبت الغطاء المثبت على الرأس يدويا.
- استخدم حقنة بسعة 1 مل مع إبرة 26 جيلون لحقن حوالي 1 مل من S1 ببطء في غطاء الرأس.
- أعد الفأر إلى قفص منزلي ودع S1 يتحرك على الجمجمة لمدة ساعتين.
ملاحظة: خلال حضانة S1 و S2، ضع الفأر بشكل فردي في قفص قياسي.
- الموسم الأول المنعش
- بعد ساعتين من تحميل S1 الأولي، قم بتخدير الفأر لفترة وجيزة مرة أخرى بالإيزوفلوران.
- استنشق S1 من الغطاء باستخدام حقنة بسعة 1 مل.
- أعد تعبئة الغطاء بمادة S1 جديدة باستخدام حقنة سعة 1 مل.
- أعد الفأرة إلى القفص ودع S1 يتصرف لمدة ساعتين إضافيتين.
- كرر الخطوات 5.2.1–5.2.4 بعد 4 ساعات من التحميل الأولي لإجراء استبدال S1 ثان.
- بعد الاستبدال الثاني، اسمح ل S1 بالاستمرار في العمل حتى يتم الوصول إلى زمن التعريض الكلي ل S1 يبلغ 6 ساعات.
ملاحظة: هذا البروتوكول (1 مل S1 لمدة 6 ساعات) محسن للفئران التي تبلغ 6 أسابيع (~20 جرام). بالنسبة للحيوانات الأكبر سنا ذات الجماجم السميكة، قد يتم تمديد وقت حضانة S1 تدريجيا. يجب أن يصاحب أي تعديل مراقبة دقيقة لرفاهية الحيوانات وجودة التصوير النهائي لتجنب التليين المفرط للجمجمة.
- تطبيق S2
- بعد 6 ساعات من علاج S1، قم بتخدير الفأر لفترة وجيزة بالإيزوفلوران.
- استنشق S1 من الغطاء باستخدام حقنة 1 مل واستبدله ب 0.7 مل من S2.
- أعد الفأرة إلى القفص ودع S2 يتحرك على الجمجمة لمدة ساعة لتعزيز الشفافية وتوفير تطابق معامل الانكسار.
ملاحظة: في هذه الظروف، عادة ما تكتمل مرحلة التنظيف المجمعة بين S1 و S2 خلال 7 ساعات (6 ساعات S1 + 1 ساعة S2). يشير التنظيف الناجح إلى وجود سطح شفاف للجمجمة دون نزيف. قد تصبح الجمجمة أكثر ليونة قليلا بعد التنظيف؛ عند لمسها بلطف بملقط دقيق، يجب أن تظهر عليها امتثالا طفيفا لكنها تبقى سليمة من الناحية الهيكلية. تجنب الضغط المفرط على سطح الجمجمة.
6. التحضير للتصوير
- التخدير وتثبيت الرأس للتصوير
- في نهاية حضانة S2، قم بتخدير الفأر عن طريق حقن 1٪ (مع ضج) بنتوباربيتال الصوديوم داخل الصفاق عند 150–200 ميكرولتر لكل 20 جرام من وزن الجسم.
- تأكد من وجود تخدير كاف باستخدام اختبار رد فعل القرص على إصبع القدم.
- ثبت رأس الفأرة عن طريق تثبيت لوحة الرأس المصنوعة من التيتانيوم على حامل رأس مصمم خصيصا.
- ضع مرهم العيون على كلتا العينين لمنع الجفاف أثناء التصوير.
- حافظ على درجة حرارة الجسم عند ~37 درجة مئوية باستخدام وسادة التدفئة.
- كشف سطح الجمجمة المصفى (الشكل 1Bه، Bf)
- استنشق محلول S2 من الغطاء باستخدام حقنة.
- اقطع الغطاء البلاستيكي بعناية بمقص دقيق وأزله باستخدام الملقط، لتجنب الضغط الزائد على الجمجمة.
- قم بتقشير المادة الناعمة حول نافذة التنظيف بلطف لتكشف منطقة الجمجمة التي تم تنظيفها بالكامل.
- ضع قطرة صغيرة من محلول S2 مباشرة على الجمجمة التي تم تنظيفها لتكون وسط غمر مطابقة لمعامل الانكسار أثناء التصوير.
ملاحظة: تم استخدام أهداف الغمر في الماء القياسية في هذه الدراسة، بما في ذلك هدف 16×/NA 0.8 (N16XLWD-PF، نيكون) وهدف 25×/NA 1.1 (N25X-APO-MP، نيكون). عند استخدام S2 كوسيط للغمر، قم بضبط طوق تصحيح الهدف، إذا كان متاحا، إلى الإعداد المناسب لمعامل الانكسار ل S2 لتقليل الانحرافات الكروية. في التجارب هنا، حافظت الجمجمة المنقية على وضوح بصري كاف لحوالي ساعتين من تصوير فوتونين، دون تدهور واضح في جودة الصورة أثناء مراقبة العمود الفقري التغصني. بعد حوالي يومين، تطلب الأمر إعادة التنظيف لمزيد من التصوير، وكان وقت إعادة التنظيف أقصر بكثير من التنظيف الأولي، مما سمح بتصوير متكرر فعال من نفس الحيوان.
- تصوير مثبت الرأس مستيقظ (اختياري)
ملاحظة: للتصوير اليقظ، اعتد الفأر على تثبيت الرأس قبل التجربة. تخدير الفأر لفترة وجيزة بالإيزوفلوران، ثم ثبت لوحة الرأس المزروعة على الحامل لمدة 15–30 دقيقة في كل جلسة، وكرر ذلك لمدة 2–3 أيام.- استخدم تخدير إيزوفلوران قصير لتسهيل التعامل معه. ثبت فقط لوحة الرأس المزروعة على الحامل، مما يسمح للجسم بالتحرك بحرية على عجلة الركض أو المنصة.
- اتبع الخطوات 6.2.1–6.2.4 لكشف سطح الجمجمة المصفى وتطبيق S2 قبل التصوير.
7. التعافي
- بعد التصوير، استنشق بلطف وأزل أي محلول S2 متبقي من سطح الجمجمة.
- اشطف منطقة الجمجمة التي تم تنظيفها بمحلول ملحي مخفي بالفوسفات (PBS) عدة مرات لتعزيز الاستعادة التدريجية للحالة المعتمة الأصلية للجمجمة.
- جفف السائل المتبقي من الجمجمة والأنسجة المحيطة بلطف باستخدام مسحات قطنية معقمة، لتجنب التلف الميكانيكي للعظم.
- إذا تم الاحتفاظ بالحيوان على قيد الحياة للتجارب اللاحقة، ضع طبقة من المادة المانعة المقاومة الحيوية Kwik-Cast (WPI) فوق نافذة الجمجمة لحماية العظم خلال فترة البقاء.
- دع الطبقة الواقية تتجف تماما.
- افصل الفأر عن حامل الرأس وضعه في قفص دافئ. راقب الحيوان حتى يتعافى تماما من التخدير، ثم أعده إلى قفصه المنزلي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
وفقا للبروتوكول، تتيح نافذة الجمجمة الشفافة بصريا (HOTS) المثبتة على الرأس التصوير العميق عبر الفوتونتين عبر الجمجمة في الفئران البالغة مع الحفاظ على سلامة الجمجمة. يشير التحضير الناجح إلى نتيجتين رئيسيتين: (1) تصبح الأوعية الدموية القشرية واضحة من خلال الجمجمة عند التنظيف (الشكل 1Bf)، و(2) تظهر الجمجمة المنقحة انبعاجا طفيفا تحت ضغط لطيف، مما يشير إلى إزالة الكالسية الفعالة وتخفيف الكولاجين. يجب وضع نافذة HOTS فوق الجمجمة السليمة وبعيدا عن ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تستخدم طريقة HOTS نافذة جمجمة شفافة بصريا مثبتة على الرأس (HOTS) تجمع بين غطاء يحتوي على كواشف تنظيف مع إجراء من خطوتين لتنظيف الجمجمة لتعزيز شفافية الجمجمة لدى الفئران البالغة مع الحفاظ على سلامة الجمجمة. وفقا للبروتوكول القياسي (6 ساعات في S1 و1 ساعة في S2 للفئران ذات العمر 6 أسابيع)، دعمت النافذة الناتجة بشكل موثوق التصوير العميق عبر الفوتونتين عبر الجمجمة وسمحت برؤية الهياكل حتى ~800 ميكرومتر تحت الطبقة البحرية.
تعد عدة خطوات إجرائية حاسمة للحصول على نافذة...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.
شكر وتقدير
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
وقد دعم هذا العمل برنامج البحث والتطوير الرئيسي للابتكار العلمي والتكنولوجي في تشونغتشينغ (CSTB2024TIAD-STX0004)، وصندوق شنتشن للأبحاث الطبية (D2404004)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (62475278، 62305369، 62405351، 92359303)؛ مؤسسة البحوث الأساسية والتطبيقية في مقاطعة قوانغدونغ (2024A1515012517، 2020B121201010)؛ جمعية تعزيز الابتكار الشبابي في الأكاديمية الصينية للعلوم (2023377)؛ برنامج البحث الأساسي في شنزن (RCJC20200714114433058، RCYX20210609104445093، JCYJ20241202124924033، ZDSY20130401165820357). نشكر البروفيسور يانغ تشان (معهد إدراك الدماغ وأمراض الدماغ، معاهد شنتشن للتكنولوجيا المتقدمة، الأكاديمية الصينية للعلوم، شنتشن، الصين) على توفير فئران Thy1-GFP-M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ماصة ذات استخدام واحد بسعة 1 مل | بكين بيولوجي Science & التكنولوجيا شركة المحدودة. | لا يوجد | |
| الأسمنت السني | شركة شنغهاي رونغشيانغ لمواد الأسنان المحدودة. | لا يوجد | |
| دي-مانوز | ماكلين | D813082 | |
| EDTA | علاء الدين | إل 16428 | |
| إيزوفلوران | الدفع الخلفي | لا يوجد | |
| كويك-كاست | WPI | لا يوجد | مادة سدادية متوافقة حيويا |
| لا أوه | ماكلين | S832169 | |
| المعالجة الذاتية دنتال مادة البطانة الناعمة | شركة يانغماهو للتكنولوجيا الحيوية (هيبي) المحدودة. | لا يوجد | |
| الصوديوم بنتوباربيتال | بيوبايك | لا يوجد | |
| جهاز الستيريوتاكسيك | الدفع الخلفي | لا يوجد | |
| حقنة معقمة قابلة للتخلص من مرة واحدة | مينانك | لا يوجد | 1 مل؛ إبرة 26 G |
| سولفولان | ماكلين | S817950 | |
| فئران Thy1-GFP-M | لا يوجد | مقدم بقلم البروفيسور يانغ زان | |
| Thyl-GCaMP6s الفئران | مختبر جاكسون | ||
| 20 سنة | سيغما-فيتيك | V900548 | |
| هدف الغمر في الماء | نيكون | N25X-APO-MP | هدف 25×/NA 1.1 |
| هدف الغمر في الماء | نيكون | N16XLWD-PF | 16&00;/NA 0.8 الهدف |
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن