مقالة منهجية

التصوير الفوري الخالي من العلامات والتحليل الكمي لمورفوديناميكا البلعم باستخدام التصوير المقطعي الحيود البصري

DOI:

10.3791/71209

⸱

يونيو 9, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sichuan Provincial Key Laboratory of Innovation and Efficient Utilization of Chinese Medicine Germplasm Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Yangtze Delta Institute of Optoelectronics, Peking University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول سير عمل قائم على التصوير المقطعي الحيود البصري الخالي من العلامات للتصوير في الوقت الحقيقي والتحليل الكمي لمورفوديناميكا البلعميات. تمكن هذه الطريقة من تتبع شكل الخلية الواحدة وهجرتها باستمرار، مما يوفر قياسات محددة زمنيا للمساحة المتوقعة، والمحيط، ومتوسط سرعة الهجرة أثناء التصوير طويل الأمد للخلايا الحية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تؤسس هذه الدراسة سير عمل يعتمد على التصوير المقطعي الحيود البصري (ODT) الخالي من العلامات لتصوير الخلايا الحية والتحليل لمراقبة التغيرات الشكلية المعتمدة على الزمن في البلعميات. تتيح الطريقة التسجيل المستمر لشكل الخلية المفردة وحركتها على مدى فترات طويلة تحت ظروف بيئية مستقرة، وتسمح باستخراج المعلمات الكمية، بما في ذلك المساحة المتوقعة، والمحيط، ومتوسط سرعة الهجرة. يوفر هذا السير عمليا نهجا عمليا لالتقاط السلوكيات الخلوية الديناميكية على مستوى الخلية المفردة دون وضع علامات خارجية. باستخدام نماذج البلاعم RAW264.7، تم إجراء تصوير تايم لابس تحت تحفيز بوليبوبوليسكاريد مع معالجة مبدئية ببايكالين لالتقاط التغيرات الخلوية الديناميكية تحت ظروف مختلفة. تم اختيار خلايا ممثلة للتتبع والتحليل الكمي. تظهر النتائج أن هذا السير يدعم تتبع خلية واحدة مستقرة طويلة الأمد ويعكس التغيرات الزمنية في شكل الخلية وحركتها. يوفر هذا النهج طريقة خالية من التسمية لمراقبة السلوكيات الخلوية الديناميكية استجابة لمحفزات مختلفة، ويمكن أن يكون مكملا مفيدا للاختبارات التقليدية القائمة على نقاط النهاية. قد يكون هذا الأسلوب أيضا قابلا للتطبيق على أنواع الخلايا الملتصقة الأخرى لدراسات مورفوديناميكا الخلية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب البلاعم دورا مركزيا في الاستجابات المناعية الفطرية وتوازن الأنسجة، ويمكن أن تتغير حالتها الوظيفية ديناميكيا استجابة للمحفزات البيئية الدقيقة. تقليديا، وصفت البلاعم بأنها تتبنى أنماط ظاهرية مؤيدة للالتهابات أو مضادة للالتهابات/الإصلاحمرتبطة ب 1,2. ومع ذلك، تشير الأدلة المتزايدة إلى أن تنشيط البلاعم هو عملية مستمرة ومرنة وليس حالة ثنائية منفصلة. تحت محفزات مختلفة، تخضع البلاعم لتغيرات تدريجية مع مرور الوقت، مصحوبة بتغيرات في شكل الخلايا وسلوك الهجرة5. لذلك، يوفر التوصيف الزمني للتغيرات الشكلية والهجرة على مستوى الخلية الواحدة نهجا مهما لدراسة الاستجابات الخلوية الديناميكية.

تعتمد الأساليب الحالية لدراسة حالات البلعم بشكل رئيسي على التلوين المناعي، وقياس تدفق الخلايا الخلوي، والتحليلات الترانسكريبتومية أو البروتيومية6. تعتمد هذه الطرق عادة على عينات ثابتة أو نقاط زمنية منفصلة، مما يحد من قدرتها على تتبع التغيرات المستمرة في نفس الخلية تحت ظروف الحياة7. يتيح التصوير الحيوي القائم على الفلورة المراقبة الديناميكية لكنه قد يتأثر بالسمية الضوئية والتبييض الضوئي خلال التجارب طويلة الأمد 8,9. التصوير المقطعي الحيود البصري (ODT) هو تقنية تصوير خالية من العلامات تعيد بناء توزيع معامل الانكسار ثلاثي الأبعاد للخلايا لتوفير معلومات بنيوية كمية10. وبما أنه لا يتطلب وضع علامات خارجية، فإن ODT مناسب لتصوير الخلايا الحية طويل الأمد ويقلل من الاضطراب في سلوك الخلية. في السنوات الأخيرة، تم تطبيق ODT في دراسات ديناميكية في نماذج خلايةمختلفة 11، مع تركيز الدراسات السابقة بشكل أساسي على قدرة التصوير وتوصيف البنيو. على النقيض من ذلك، تؤسس الدراسة الحالية سير عمل موحد وخال من العلامات لتحليل خلية واحدة طويلة الأمد ومحددة زمن لمورفوديناميكا البلاعم تحت حالة تحفيز مختبر محددة.

يتم عرض سير العمل باستخدام نموذج بلاعم RAW264.7 في المختبر مع تحفيز عديمة السكريات الدهنية (LPS) ومعالجة مسبقة لبايكالين (BAI). تم استخدام BAI كمعدل تجريبي ممثل لتحديد شرط محدد لعرض سير العمل. يتيح التصوير المستمر استخراج معلمات خلية واحدة كمية، بما في ذلك المساحة المتوقعة، والمحيط، ومتوسط سرعة الهجرة، مما يسمح بتوصيف زمني للتغيرات الشكلية والسلوكية. يهدف هذا النهج إلى تقديم تحليل وصفي للتغيرات الظاهرية الديناميكية بدلا من تعريف الحالات الوظيفية أو الاستقطاب، وقد يكون طريقة مكملة للاختبارات القائمة على النهاية من خلال توفير معلومات زمنية. يتم التحقق من صحة سير العمل في هذا النظام النموذجي ويمكن تطبيقه على أنواع الخلايا الملتصقة الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ثقافة البلاعم

تحذير: قم بجميع الإجراءات في خزانة السلامة البيولوجية وارتداء قفازات مختبر ومعطف مختبر.

  1. جهز وسط الزراعة الكامل (وسط النسر المعدل (DMEM) المعدل من Dulbecco عالي الجلوكوز مع 10٪ مصل أبقار الجنين (FBS) و1٪ بنسلين–ستربتومايسين).
  2. قم بإذابة قارورة من خلايا بلاعم RAW264.7 في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة أقل من دقيقة واحدة.
  3. انقل نظام الخلية إلى DMEM عالي الجلوكوز مع 10٪ FBS و1٪ بنسلين-ستريبتومايسين.
  4. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق.
  5. تخلص من السوبرناتانت.
  6. أعد تعليق الخلايا في وسط جديد وكامل.
  7. زرع الخلايا في أطباق بحجم 60 مم عند 2–5 × 10إلى 5 خلايا لكل طبق.
  8. حضانة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
  9. لا تغير الوسط خلال 12–24 ساعة بعد الذوبان.
  10. استبدل الوسيط كل يومين إلى ثلاثة.
  11. مراقبة شكل الخلايا باستخدام مجهر مقلوب.
  12. خلايا المرور عند التقاء 80–90٪ عن طريق التوصيل اللطيف بالماصة.
    ملاحظة: تجنب استخدام التربسين. استخدم الخلايا في الفقرات 6–18. اختر خلايا ذات شكل موحد وبدون تفريغ للتجارب التلفزيونية. تم التحقق من صحة خط الخلية بواسطة تحليل STR وخضوعها لاختبارات مراقبة الجودة. يتم توفير تقارير مفصلة وملخص باللغة الإنجليزية في الملفات التكميلية.

2. العلاج الخلوي

  1. اجمع الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمي عن طريق التوصيل اللطيف بالماصة.
  2. أعد تعليق الخلايا في وسط كامل.
  3. قس كثافة الخلايا باستخدام عداد الخلايا.
  4. اضبط كثافة الخلايا إلى 4 × 104 خلايا/مل.
  5. ضع 2 مل من تعليق الخلية في كل طبق 35 مم.
  6. تعيين الأطباق لمجموعتين: (1) مجموعة LPS، (2) مجموعة BAI + مجموعة LPS.
  7. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ لمدة 12–16 ساعة.
  8. جهز محلول مخزون BAI بسعة 50 مللي مولار في DMSO. تخزين محلول مخزن BAI عند −20 درجة مئوية.
  9. أضف BAI إلى مجموعة BAI + LPS إلى تركيز نهائي 100 ميكرومولار. تخفيف محلول مخزون BAI مباشرة في وسط الزراعة لتحقيق التركيز النهائي للعمل.
  10. أضف حجما متساويا من DMSO إلى مجموعة LPS.
  11. حضر محلول LPS (1 ملغ/مل) في وسط كامل.
  12. أضف LPS إلى كلا المجموعتين إلى تركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل. قم بتخفيف محلول LPS مباشرة في وسط الزراعة لتحقيق تركيز العمل النهائي.
  13. تابع فورا إلى التصوير ولا تغير الوسط أثناء التصوير.

3. اكتساب التصوير المقطعي الحيود البصري

  1. شغل نظام التصوير ODT وشغل وحدة التحكم البيئي.
  2. اضبط درجة حرارة المسرح على 37 درجة مئوية.
  3. اضبط تركيز ثاني أكسيد الكربون على 5٪.
  4. دع النظام يتوازن لمدة لا تقل عن 20 دقيقة.
  5. افتح برنامج الاستحواذ.
  6. ضع طبق الزراعة على منصة التصوير.
  7. استخدم هدفا 60x (NA = 1.42) لتحديد موقع الخلايا.
  8. اختر خلايا معزولة ذات حدود واضحة للتصوير.
  9. اضبط فترة التصوير على 8 دقائق.
  10. اضبط العدد الإجمالي للإطارات إلى 181.
  11. تمكين وظيفة التركيز التلقائي للحفاظ على التركيز أثناء تصوير التايم لابس.
  12. ابدأ في اقتناء التايم لابس.
  13. راقب استقرار النظام أثناء الاستحواذ.
    ملاحظة: تم تطبيق تثبيت التركيز التلقائي طوال التجربة لتقليل انحراف البؤرة.

4. إعادة بناء الصورة والتحليل الكمي

  1. بعد التقاط الصورة، يقوم البرنامج تلقائيا بإعادة بناء الصورة.
  2. باستخدام الخوارزمية القياسية المدمجة.
  3. انتظر حتى يكتمل شريط التقدم.
  4. افتح برنامج التحليل (Intellyseg، v2.1.0).
  5. استيراد مجموعة البيانات الخام باختيار استيراد البيانات الخام.
  6. التصفح إلى المجلد المستهدف.
  7. اختر الملف المستهدف واستورد مجموعة البيانات.
  8. انقر على "خلية" لإجراء التقسيم التلقائي باستخدام إعدادات متسقة عبر مجموعات البيانات13.
  9. اختر الخلايا بناء على المعايير التالية: (1) عدم وجود تداخل مع الخلايا المجاورة، (2) عدم الاتصال بحدود الصورة، (3) قابلة للتتبع باستمرار طوال السلسلة الزمنية.
  10. اختر عددا ثابتا من الخلايا (n = 8) لكل مجال رؤية لتحليل متسق عبر مجموعات البيانات.
  11. افتح وحدة "التتبع طويل الأمد".
  12. هنا يأتي دور إطار البداية والإطار النهائي.
  13. انقر على "تتبع" لبدء التتبع، والذي يعتمد على اتساق موقع الخلية بين الإطارات المتتالية14.
  14. تصحيح أخطاء التتبع يدويا إذا لزم الأمر لضمان استمرارية المسار: (1) انقر بزر الفأرة الأيمن على الأقنعة الخاطئة واختر "حذف العنصر"، (2) فتح "تقسيم يدوي"، (3) اختيار "خلية" واضغط على "إضافة"، (4) استخدم "نقر" أو "صندوق" لإضافة الأقنعة الصحيحة.
  15. انقر على "تصدير"، ثم اختر "تصدير البيانات".
  16. اختر "تصدير الفيديو" واختر عناصر الإخراج.
  17. هنا يأتي دور إطارات البداية والنهاية.
  18. اختر مسار الحفظ وتنسيق الملف.
  19. انقر على "موافق" لتصدير الفيديو.
  20. انقر على "تصدير"، ثم اختر "نظام الخرائط".
  21. اختر "مخطط الأغاني".
  22. اختر "الخلية" كفئة للتقسيم.
  23. هنا يأتي دور نطاق إطار التتبع.
  24. اختر معلمات الإخراج (مثل المساحة، المحيط).
  25. انقر على "تصدير الصورة أو إكسل" واحفظ الملف.
  26. احسب متوسط سرعة الهجرة (ميكرومتر/ساعة) لكل خلية بناء على إزاحة مركز المركز عبر كامل السلسلة الزمنية.

5. عرض البيانات

  1. تعرض القياسات الكمية بشكل وصفي. لم يتم إجراء أي استنتاج إحصائي. تضمنت كل مجموعة علاج خمس عينات مستقلة.
    يظهر الشكل 1 نظرة عامة على سير العمل التجريبي. المواد الكيميائية المميزة والأدوات والبرمجيات مدرجة في جدول المواد. تلخص حالات التصوير في الجدول 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتقييم أداء سير العمل القائم على ODT، تم إجراء تصوير زمني لمجموعتين علاجيتين (LPS وBAI + LPS)، مع خمس عينات مستقلة لكل مجموعة. تم جمع جميع العينات تحت ظروف تصوير متطابقة. نظرا للعبء العالي المرتبط بتتبع خلية واحدة طويلة الأمد والتحليل الكمي، تم اختيار عينة ممثلة واحدة من كل مجموعة لتحليل الخلية الواحدة والتصور. تعرض النتائج بشكل وصفي وليست مخصصة للاستدلال الإحصائي.

ديناميكيات المورفولوجيا الزمنية

أظهر تصوير ODT بالتايم لابس أن هذه الطريقة تتيح التسج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تؤسس هذه الدراسة سير عمل خال من العلامات قائم على ODT للتصوير المستمر والتحليل الكمي لمورفوديناميكا البلاعم على مستوى الخلية الواحدة. يتيح هذا النهج القياس الزمني للمساحة المتوقعة، والمحيط، ومتوسط سرعة الهجرة خلال تصوير الخلايا الحية طويل الأمد. كثافة بذور الخلايا عامل رئيسي يؤثر على أداء التجزئة وتتبعها. الكثافة العالية تؤدي إلى تداخل الخلايا، بينما الكثافة المنخفضة تقلل عدد الخلايا القابلة للتحليل. لذلك، يجب تحسين ظروف التلقيح قبل التصوير. تم تحديد فترة التصوير بناء على تجارب أولية لتح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أن جي-جي تشو ويانغ-تشينغ يانغ مرتبطان بشركة بيلوسيد أوبتيكس (نانتونغ) المحدودة. نظام التصوير ODT المستخدم في هذه الدراسة مرتبط بهذه الشركة. ومع ذلك، لم يؤثر هذا الانتماء على تصميم التجارب أو جمع البيانات أو تحليلها أو تفسير النتائج. المؤلفون الباقون يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعمت هذه الدراسة المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (U24A20790)، ووزارة العلوم والتكنولوجيا (2022YFF0712500 و2023YFF0722600)، وإدارة العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة جيانغسو (BK20250540).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ODT imaging systemPellucid OpticsMH-PanoViewيستخدم للتصوير المباشر للخلايا الحية بدون تسمية
Acquisition softwarePellucid Optics Lucida-Pano v2.1.0يستخدم للحصول على الصور
Analysis softwarePellucid Optics Intellyseg v2.1.0يستخدم لإعادة بناء الصور والفصل والتتبع
RAW264.7Wuhan Zishan Biotechnology STCC20020Pسلالة خلية كروية فئرانية تستخدم لتجارب الاستقطاب والتصوير في المختبر.
Baicalin (BAI)Shanghai Yuanye JB246114يستخدم لمعالجة الخلايا
Lipopolysaccharide (LPS)SolarbioL8880يستخدم لتحفيز الخلايا الكروية
DMEM mediumGibcoC11995500BTوسط زراعة الخلايا
Fetal bovine serumProcell164210مكمل لزراعة الخلايا
Penicillin–Streptomycin (100x)ProcellPB180120مضادات حيوية لزراعة الخلايا
60 mm culture dishCorningCLS430166يستخدم لزراعة الخلايا
35 mm glass-bottom dishCellvisD35-10-1.5-Nيستخدم للتصوير ODT
Inverted microscopeOLYMPUSCKX53يستخدم لمراقبة الخلايا الروتينية والمراقبة أثناء التكاثر.
Cell counterRWD Life ScienceC100يستخدم لتحديد كثافة الخلايا

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RAW264 7
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة