النقل الميتوكوندري الخارجي في الخلايا الدهنية البنية المتمايزة والخلايا الدهنية الخالية من AGPAT2

Antonio Moreno; Claudia Parra-Ruiz; Francisca Stolzenbach; Víctor Cortés

doi:10.3791/71223

مقالة منهجية

النقل الميتوكوندري الخارجي في الخلايا الدهنية البنية المتمايزة والخلايا الدهنية الخالية من AGPAT2

DOI:

10.3791/71223

⸱

يونيو 26, 2026

Antonio Moreno , Claudia Parra-Ruiz¹ , Francisca Stolzenbach¹ , Víctor Cortés¹

¹Department of Nutrition, Diabetes and Metabolism, School of Medicine, Pontificia Universidad Católica de Chile

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن استيعاب الميتوكوندريا الخارجية ذات الأصل البشري والفأري من خلال تمايز الخلايا ما قبل الدهون وتتبعها خلال التمايز الدهني باستخدام التصوير والأدوات الجينية. بينما تتفاعل هذه الميتوكوندريا فعليا مع الشبكة الميتوكوندرية الداخلية، إلا أنها لا تزيد من تعبير العلامات المرتبطة بالخلايا الدهنية البنية الناضجة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا هي مراكز رئيسية للإشارة؛ ومع ذلك، يبقى سؤال مفتوح ما إذا كان توسع كتلة الميتوكوندريا مطلوبا ميكانيكيا للتمايز. يحفز AGPAT2 تحويل حمض الليسوفوسفاتيديك إلى حمض الفوسفاتيديك، ويؤدي نقصه إلى نقص في الأنسجة الدهنية وضعف تكوين الدهون المرتبط بانخفاض كتلة الميتوكوندريا. تم تقييم تأثير توسع كتلة الميتوكوندريا على تكوين الدهون من خلال نقل الميتوكوندريا الخارجية إلى الخلايا الدهنية البنية المتمايزة. كما تم التحقيق فيما إذا كان نقل الميتوكوندريا يمكن أن ينقذ ضعف تكوين الدهون في الخلايا التي تفتقر إلى AGPAT2. تم نقل الميتوكوندريا البشرية والفئران بنجاح ودمجها في شبكة الميتوكوندريا الداخلية لخلايا الفئران التمايزية قبل الدهنية، واستمرت طوال تكوين الدهون البني. كان التمايز المبكر مطلوبا للاحتفاظ بالميتوكوندريا المنقولة. لم يغير النقل الميتوكوندري التعبير عن العلامات الجزيئية للخلايا الدهنية البنية الناضجة أو محتوى قطرات الدهون، رغم أنه أثر على التوزيع النسبي لحجم قطرات الدهون بطريقة تعتمد على النوع. في الخلايا ما قبل الدهون في Agpat2^-/- فشلوا في إنقاذ تكوين الدهون، مما يشير إلى أن توسع كتلة الميتوكوندريا وحده غير كاف لعكس الآليات التي تؤدي إلى الحثل الدهني في هذا النموذج. تشير هذه النتائج إلى أنه، رغم إمكانية دمج الميتوكوندريا الخارجية البشرية والفئران في شبكة الخلايا الدهنية المتمايزة، إلا أنها لا تؤثر مباشرة على البرنامج الدهني المنشأ.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعيدا عن أدوارها الحيوية الأساسية، تعمل الميتوكوندريا كمراكز إشارة في عمليات خلاية متعددة، بما في ذلك تمايز الخلايا 1,2,3,4. يمتلك نسيج الدهون البنية (BAT) كتلة ميتوكوندرية عالية بشكل ملحوظ لدعم نشاطه الحراري، مما يبرز دوره في توازن الطاقة في الجسم كله وفي سبب السمنة^. بينما تنظم كتلة الميتوكوندريا بالتوازن بين التكوين الحيوي والميتوفاجي، يبقى من غير الواضح ما إذا كان توسع كتلة الميتوكوندريا أثناء تمايز الخلايا الدهنية البنية مطلوبا وظيفيا لتكوين الدهون أم مجرد نتيجة للعملية.

تم توثيق انتقال الميتوكوندريا الفسيولوجي بين الخلايا في المختبر والجسم، حيث يساهم في تكيف الأنسجة تحت ظروف مرضية، بما في ذلك خلل الأنسجة الدهنية المرتبط بالسمنة ومقاومة الأنسولين ^6,7. علاوة على ذلك، ثبت أن النقل الصناعي للميتوكوندريا في المختبر يعزز القدرة التنفسية للخلايا المتلقية⁸. تدعم هذه النتائج معا فكرة أن انتقال الميتوكوندريا يمكن أن يغير وظيفة الأيض الخلوية وقد يساهم في تكيف الأنسجة تحت ظروف الإجهاد الحيوي ^9,10,11. مقارنة بالاستراتيجيات الدوائية أو الجينية التي تحفز التكوين الحيوي للميتوكوندريا من خلال تنشيط برامج النسخ النووية والميتوكوندرية، فإن النقل الميتوكوندري يوصل العضيات مباشرة إلى الخلايا المستقبلة، مما يمكن التعديل السريع للكتلة الميتوكوندرية بشكل مستقل عن التلاعبات النسخية^12,13. هذا النهج ضروري لتصحيح العيوب في أمراض الميتوكوندريا، كما يسمح بدراسة تأثيرات الميتوكوندريا دون التأثيرات المحتملة غير المستهدفة للطرق الدوائية أو الوراثية¹⁴.

في هذه الدراسة، درسنا تأثير زيادة كتلة الميتوكوندريا بشكل صناعي عن طريق النقل الخارجي للميتوكوندريا في الخلايا الدهنية البنية المتمايزة. مكن هذا النهج من تقييم تأثير كتلة الميتوكوندريا على البرنامج الدهني الخلقي. لتحقيق ذلك، تم تكييف بروتوكولات نقل الميتوكوندريا التي تم تطويرها أصلا للخلايا الجذعية الميزنكيمية^{باستخدام} كل من خلايا كبد بشرية وخلايا الفئران المجهولة كمانحين للميتوكوندريا. تم تطوير طريقة لتتبع الميتوكوندريا البشرية في خلايا الفئران المتمايزة باستخدام أدوات جينية مدمجة مع تقنيات التصوير، مما يثبت أن الميتوكوندريا من كلا المصدرين مدمجة في شبكة الميتوكوندريا الداخلية وتستمر طوال التمايز الأدديبوجيني.

لنمذجة تكوين الدهون المعيب المرتبط بانخفاض كتلة الميتوكوندريا، تم استخدام الخلايا الدهنية البنية المتمايزة المستمدة من فئران 1-أسيل جليسرول-3-فوسفات-أو-أسيل ترانسفيراز 2 (AGPAT2) - ناقص (Agpat2-^/-). يعبر AGPAT2 بشكل كبير في الأنسجة الدهنية، حيث يحفز تكوين حمض الفوسفاتيديك في مسار تخليق الدهون الجليسروليبيدية. يسبب نقص AGPAT2 استثلالا شحونا شديدا لدى البشر والفئران ويعيق تكوين الدهون في نماذج الخلايا الدهنية البيضاء والبنية بالتزامن مع انخفاض كتلة الميتوكوندريا 16,17,18. دمج الميتوكوندريا الخارجية في الخلايا الدهنية التمايزية غير توزيع حجم قطرات الدهون قليلا لكنه لم يزيد من تعبير علامات الخلايا الدهنية البنية الناضجة أو ينقذ الضعف الناتج عن الدهون المنشأ في خلايا Agpat2^/- ما قبل الدهون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على إجراءات الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في الجامعة البابوية الكاثوليكية في تشيلي، بموجب بروتوكول 210609003. تم استخدام فئران حديثي الولادة من النوع البري وAgpat2^-/- P0.5 من كلا الجنسين، مشتقة من خلفية جينية مختلطة C57BL/6J و129J، في هذه الدراسة. معدات الحماية الشخصية (PPE): ارتد معطف مختبر ونظارات أمان وقفازات نيتريل. انظر الملف التكميلي 1 لمزيد من تفاصيل البروتوكول والجدول 1 للمخزونات المخازن المطلوبة لهذا البروتوكول.

يجب فصل جميع النفايات الكيميائية السامة الناتجة أثناء تحضير المجهر الإلكتروني، وتثبيت البارافورمالديهايد، واستخراج الأحماض النووية بشكل صارم في جداول محددة ومحددة بوضوح وفقا للوائح الصحة والسلامة البيئية المؤسسية (EHS). تحت أي ظرف من الظروف، يجب تصريف أي من هذه المواد في حوض المختبر أو نظام الصرف الصحي العام. يجب فصل جميع النفايات الكيميائية الخطرة الناتجة وفقا لتصنيفات EHS المؤسسية.

1. زراعة الخلايا

عزل وتمييز وصيانة الخلايا الدهنية الأولية (iBAT)
ملاحظة: راجع الملف التكميلي 1 لوصف موجز للإجراءات والجدول 1 لتكوين الحلول المطلوبة. يمكن العثور على شرح كامل ومفصل لبروتوكول التمايز البني الدهني في المختبر في فيغيروا ^{وآخرون.}
1. عزل الخلايا الدهنية من النسيج الدهني البني بين لوح الكتف (iBAT) لفئران حديثي الولادة (P0.5) بعد الإجراءات الجراحية والهضمية الإنزيمية التي وصفها فيغيروا وآخرون^.
2. تمييز والحفاظ على ثقافة الخلايا الدهنية البنية وفقا لكوكتيل التمايز وجدول تبادل الوسائط.
  ملاحظة: لتحقيق تمايز أديبوجيني ناجح، من الضروري جدا أن تصل الثقافات إلى التقاء بنسبة 90–100٪ قبل بدء التحفيز الدهني.
ثقافة HepG2
1. زراعة خلايا HepG2 في DMEM مع 10٪ مصل البقر الجنيني، 100 U/mL بنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين، و0.25 ميكروغرام/مل أمفوتيرسين B. حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.
  ملاحظة: تنمو هذه الخلايا في مجموعات وقد تبدو متقاربة رغم الكثافة العالية بسبب النمو متعدد الطبقات.

2. عزل ونقل الميتوكوندريا

عزل الميتوكوندريا
ملاحظة: قم بجميع الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية عند درجة حرارة 4 درجات مئوية أو على الثلج. استخدم التحضير خلال ساعتين.
1. بذور 2 × 10^خلايا مانحة (HepG2 أو الخلايا الدهنية المبكرة) في أطباق زراعة بحجم 100 مم. نما الخلايا حتى تصل إلى 80٪ (HepG2) أو 100٪ (خلايا ما قبل الدهون).
2. خلية التبرع بالصبغة باستخدام 100 نانومتر MitoTracker Deep Red FM في وسط خال من FBS لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪_CO2 .
3. اغسل الخلايا مرتين بوسط نمو لإزالة الصبغة الزائدة.
4. افصل الخلايا باستخدام التربسين، اجمع التعليق، واستخدم الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. أعد تعليق الحبيبة في 1 مل من محلول عزل الميتوكوندريا (MIB) مع مكمل BSA، مثبطات البروتيياز، ومثبطات الفوسفاتاز. تعطيل غشاء البلازما بتمرير التعليق عبر حقنة توبركولين 5 مرات. قم بتجانس التعليق عن طريق تمريره عبر حقنة الأنسولين على الأقل 10 مرات حتى يصبح المحلول بني فاتح اللون ويفقد الكتل الظاهرة.
  ملاحظة: لتحليل البقعة الغربية، قم بتقسيم 50 ميكرولتر من إجمالي الليزات وخزنها عند -20 درجة مئوية.
قم بالطرد المركزي بالطرد المركزي عند 900 × جرام لمدة 11 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: إذا لم يكن الفائق بعد دوران 900 × جرام عكما، فمن المحتمل أن يكون التحلل الخلوي غير مكتمل.
1. اجمع المادة الفائقة والطرد المركزي عند 10,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لتفجير الميتوكوندريا. اغسل حبيبات الميتوكوندريا ثلاث مرات مع MIB مع مكمل BSA.
2. قم بإعادة تعليق نهائية بسعة 100 ميكرولتر من MIB الخالي من BSA. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام اختبار بروتين BCA.
اختبار نقل الميتوكوندريا (MTA) في الخلايا ما قبل الدهونية
1. الخلايا الدهنية المتقدمة لمستقبل البذور عند 5 × 10⁵ خلايا/بئر في 12 صفيحة بئر (مع غطاء 18 مم للمجهر) قبل 24 ساعة من الاختبار.
2. أضف الميتوكوندريا المعزولة المانحة مباشرة إلى وسط المستقبل بنسبة 10 ميكروغرام من بروتين الميتوكوندريا لكل 10^{أو 5} خلايا. اهز الصفائح بلطف لتوزيع الميتوكوندريا. حضن الخلايا لمدة 24–120 ساعة (تتوافق مع الأيام 1 و3 و5 من التمايز) عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون قبل التحليل.

3. استهلاك الأكسجين الميتوكوندري وكفاءة MTA

قياس التنفس الميتوكوندري
1. اضبط حمام الماء الدائر الخارجي على 25 درجة مئوية وتأكد من التوازن الحراري المستقر في غلاف الحجرة قبل بدء أي قياسات.
2. قم بإجراء معايرة الطور السائل ذات نقطتين باستخدام برنامج الاستحواذ الخاص بالجهاز.
  1. معايرة تشبع الهواء (نقطة عالية): أضف 500 ميكرولتر من الماء المشبع بالهواء إلى الحجرة. اضبط المحرك المغناطيسي على 60 دورة في الدقيقة وسجل الإشارة حتى تستقر عند هضبة (>1,500 مللي فولت).
  2. معايرة بدون أكسجين (نقطة منخفضة): أضف كمية صغيرة (~3 مم قطر) من كبريتيت الصوديوم إلى الحجرة لإزاحة أي هواء متبق. سجل حتى تنخفض الإشارة إلى هضبة أساسية مستقرة (~1٪ من الإشارة الأساسية، ~20 مللي فولت).
3. ابدأ التسجيل في الوقت الحقيقي (إجمالي مدة العرض: ~10 دقائق).
4. سجل لمدة 3 دقائق حتى يتم تحقيق قراءة خطية مستقرة.
5. أعد تعليق الميتوكوندريا المعزولة في 200 ميكرولتر من محلول التحليل الميتوكوندري (MAS)²⁰ مع إضافة 5 مللي مولار جلوتامات و2.5 ملليمولار مالات.
  ملاحظة: في العمل الحالي، تم استخراج حبيبة الميتوكوندريا الكلية من صفيحتين خلويتين بحجم 100 مم.
6. انقل التعليق إلى غرفة الأوكسيغراف وأغلق مكبس إغلاق الحجرة بإحكام، لضمان عدم بقاء فقاعات هواء.
7. استهلاك الأكسجين القياسي لمدة 3 دقائق.
8. أضف 150 ميكرومولار ADP لتحفيز التنفس الميتوكوندري المقترن وقاس التنفس المقترن بتخليق ATP لمدة 3 دقائق.
9. حدد يدويا المقاطع المستقرة والخطية المقابلة لكل مرحلة تنفسية. استخرج قيم الميل التلقائية المحسوبة بواسطة البرنامج، معبرا عنها بمعدلات استهلاك الأكسجين بوحدة nmol∙^mL-1∙^min-1.
  ملاحظة: لتنظيف غرفة الألواح الداخلية، اشطف الحجرة مرتين بسعة 1 مل من الماء منزوع المعادن وتأكد من جفاف الداخل تماما. أضف 100 ميكرولتر من PBS إلى الحجرة قبل الانتقال إلى اللوحة التالية.
قياس التدفق الخلوي
ملاحظة: احتفظ بجميع العينات في الثلاجة طوال العملية للحفاظ على سلامة الخلايا والطاقة الحيوية.
1. عزل الميتوكوندريا وإجراء اختبار نقل الميتوكوندريا (MTA)، كما هو موصوف في القسمين 2.1 و2.2 على التوالي، في أطباق زراعة بحجم 35 مم، باستخدام خلايا مانحة كانت موسومة سابقا ب MitoTracker Deep Red FM.
2. استنشق وسط الزراعة وغسل طبقة الخلية الأحادية مرة واحدة ب 1 مل من PBS المعقم.
3. أضف 500 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين-إيدتا وحضن الصحون عند 37 درجة مئوية حتى يلاحظ انفصال كامل للخلية تحت المجهر.
4. قم بتحييد التربسين بإضافة 1 مل من وسط النمو الكامل (DMEM مع 10٪ FBS). انقل الحجم بالكامل إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. تخلص من المادة الفائقة عن طريق الشفط واحتفظ بحبيبات الخلية. أعد تعليق الحبيبة في 500 ميكرولتر من PBS البارد جدا عن طريق التوصيل اللطيف بالماصة.
6. تحليل العينات باستخدام مقياس تدفق خلوي مزود بليزر 640 نانومتر (انظر الملف التكميلي 1 لمزيد من التفاصيل حول اكتساب وتحليل قياس التدفق الخلوي).
  1. حدد عدد الخلايا باستخدام مخططات التبعثر الأمامي (FSC) مقابل مخططات التشتت الجانبي (SSC) وتطبيق استراتيجية بوابة لاستبعاد الحطام وقطع الخلية.
  2. قم بقياس شدة الفلورة في القناة الحمراء البعيدة (مرشح انبعاث 670/30 نانومتر) للكشف عن الميتوكوندريا الموسومة ب MitoTracker داخليا.
  3. قم بالتحليل باستخدام Floreada.io (انظر الملف التكميلي 1 لتفاصيل بروتوكول البوابة).
    ملاحظة: أضف جهاز تحكم سلبي (الخلايا المستقبلة بدون MTA) لضبط خط الأساس للتوهج التلقائي في الخلفية.
المجهر الكونفوكالي والإلكتروني
1. اختبار تصوير الخلايا الحية
  1. استلقاء الخلايا الدهنية الأولية المشتقة من فئران حديثة الولادة P0.5 إلى صفائح بئر 12 بئر تحتوي على انزلاق غطاء بقطر 18 مم، وفقا لمتطلبات كثافة الخلايا والوسائط المحددة في القسم 1.
  2. عزل الميتوكوندريا وتنفيذ اختبار نقل الميتوكوندريا (MTA) باستخدام خلايا مانحة تم تصنيفها سابقا ب MitoTracker Deep Red FM، كما هو محدد في القسم 2.
  3. حافظ على زراعة المستلم في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_لمدة 24 ساعة للسماح بامتصاص الميتوكوندريا.
  4. حضر محلول MitoTracker الأخضر بقدرة 70 نانومتر عن طريق تخفيف المخزون في وسط زراعة خال من FBS.
  5. استنشق وسط النمو من صفائح 12 بئر واستبدله بمحلول MitoTracker Green 70 نانومتر. حضن الصفائح لمدة 25 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لتعويض شبكة الميتوكوندريا الكاملة.
  6. أزل محلول التلوين واغسل الغطاء مرتين مع 1 مل من وسط الزراعة الدافئ والكامل.
  7. استبدل المجلد النهائي بوسط كامل خال من الفينول الأحمر لتقليل التألق الذاتي في الخلفية أثناء الاكتساب.
  8. انقل الغطاء أو اللوحة إلى مرحلة المجهر الكونفوكي. اضبط غرفة الحضانة في المجهر للحفاظ على بيئة ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.
  9. التقط الصور فورا باستخدام إعدادات الإثارة/الانبعاث المناسبة لكل من قنوات الحمراء البعيدة (MitoTracker، Deep Red FM) والخضراء (MitoTracker Green). راجع الملف التكميلي 1 لمزيد من التفاصيل.
    ملاحظة: قم بجميع خطوات التلوين والتعامل تحت ظروف الإضاءة المنخفضة لمنع التبييض الضوئي للفلوروفورات. استخدم هدف غمر الزيت عالي الفتحة الرقمية (NA) (60x أو 100x) للحصول على دقة مثلى لمورفولوجيا الميتوكوندريا.
2. اختبار التألق المناعي الكونفوكلي مع خلايا ثابتة
  ملاحظة: بعد تثبيت الخلية، تصنف محاليل البارافورمالديهيد السامة والجلوتارالديهيد كمواد عضوية غير هالوجينية. تتطلب المنتجات الثانوية لاستخراج الأحماض النووية فصلا صارما: يجب التخلص من خلطات الفينول/الكلوروفورم كمواد عضوية هالوجينة، بينما تصنف المخازل القائمة على الجوانيدينيوم كمواد عضوية تآكلية.
  1. بذور الخلايا الدهنية الأولية المشتقة من فئران حديثة الولادة P0.5 في صفائح بئر 12 بئر تحتوي على انزلاقات غلاف بقطر 12 مم، كما هو موضح في القسم 1.
  2. عزل الميتوكوندريا وإجراء اختبار نقل الميتوكوندريا (MTA) وفقا للإجراءات المحددة في القسم 2.
  3. حضن الثقافات لمدة 24 ساعة للسماح بامتصاص الميتوكوندريا.
  4. تحفز التمايز البني الدهني باتباع البروتوكول الموضح في الملف التكميلي 1 والرجوع إلى الجدول 1 لتركيب المخازم المطلوبة.
  5. ثبت الخلايا في اليوم السابع من التمايز (168 ساعة). استنشق وسط الزراعة وأضف 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) لكل بئر. حضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. اغسل الغطاء مرتين بإضافة 1 مل من PBS البارد جدا لكل بئر. يقوم بنفاذ الخلايا وحجبها عن طريق حضانة الغطاء في PBS التي تحتوي على 0.05٪ سابونين و0.2٪ BSA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ضع اللوحة على هزاز مداري تحت تحريك خفيف.
  7. اغسل الخلايا مرتين بمحلول 1 مل من PBS. صبغ النوى وقطرات الدهون في نفس الوقت. ضع 1 ميكروغرام/مل Hoechst 33342 و1 ميكروغرام/مل BODIPY المحضر في مخزن الحجب/نفاذ. حضن الطبق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع التأكد من حماية اللوحة من الضوء.
  8. اغسل الغطاء مرتين بمحلول 1 مل من PBS البارد جدا. ثبت الغطاء على شرائح زجاجية نظيفة. قم بتوزيع 10 ميكرولتر من التركيب على السلايد وضع جانب خلية الانزلاق الغطاء على وسط التثبيت. اترك العينات تجف طوال الليل في بيئة مظلمة ودرجة حرارة الغرفة قبل التصوير.
  9. التقاط الصور باستخدام المجهر الكونفوكلي. استخدم قناتين فلوريتين معايرتين لأطياف الانبعاث في Hoechst وBODIPY. راجع الملف التكميلي 1 لمزيد من التفاصيل التصويرية.
  10. قم بتحليل قطرات الدهون باستخدام ImageJ v1.54s. افتح قناة قطرات الدهون، وحدد القطرات الفردية يدويا باستخدام أدوات الاختيار الحرة وأدوات ROI Manager ، وحساب مساحة القطرات باستخدام تحليل | قيس، أمرك.
  11. معالجة وتحليل البيانات الناتجة باستخدام سكريبتات R المقدمة في الملف التكميلي 2 ضمن بيئة RStudio v4.5.2.
    ملاحظة: احصل على خمس صور بالضبط لكل غطاء بزاوية تكبير 10 أضعاف لضمان أخذ عينات تمثيلية. استخدم الإصدار 4.5.2 من R أو أعلى للتوافق مع السكريبتات المرفقة.
3. المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)
  ملاحظة: بالنسبة للمنتجات الثانوية للمجهر الإلكتروني، يجب جمع رباعي أكسيد الأوزميوم عالي السمية ومخازن كاكوديلات الصوديوم المحتوية على الزرنيخ كنفايات معدنية ثقيلة سامة، بينما تدار أسيتات اليورانيل بشكل منفصل كنفايات معدنية ثقيلة مشعة بموجب بروتوكولات السلامة المؤسسية من الإشعاع.
  1. قم بطرد المركزي على الميتوكوندريا المعزولة من القسم 2 عند 10,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على حبيبات مدمجة.
  2. ثبت الحبيبات بإضافة 2.5٪ جلوتارالديهيد في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M (درجة حموضة 7.0). احتضن لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: دائما تعامل مع محاليل الجلوتارالديهايد وقم بخطوات التثبيت الأولية داخل غطاء أبخرة كيميائي. ارتد قفازات ونظارات نيتريل لحماية العين. تجنب أي ملامسة مع مصادر التسخين، لأن الجلوتارالديهايد المسخن يطلق أبخرة شديدة التهيج.
  3. اغسل تحضير الميتوكوندريا لمدة 3 × 10 دقائق باستخدام محلول كاف كاكوديلات الصوديوم 0.05 مل، ثم استخدم الطرد المركزي لفترة وجيزة للحفاظ على الحبيبات بين تغييرات الحاجز.
  4. بعد تثبيت العينة بإضافة 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم المائي (OsO₄). حضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يجب فتح رباعي أكسيد الأوزميوم والتعامل معه فقط داخل غطاء بخار كيميائي معتمد ويعمل بالكامل. ارتد معطف مختبر أو نظارات أمان أو درع وجه كامل، وقفازات سميكة أو مزدوجة النيتريل (بدل القفازات فورا إذا حدث أي رش، لأن OsO₄ يمكنه اختراق النتريل الرقيق مع مرور الوقت).
  5. اغسل العينة لمدة 3 × 5 دقائق بماء مقطر مرتين. صبغ الحبيبات بأسيتات يورانيل مائي بنسبة 1٪ لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: اعمل على ورق طاولة بلاستيكي قابل للتخلص منه. خصص منطقة محددة في المختبر للتلوين الإشعاعي. ارتد قفازات مزدوجة، ومعطف مختبر، ونظارات أمان. اغسل اليدين جيدا بعد إتمام الإجراء.
  6. جفف التحضير باستخدام سلسلة إيثانول متدرجة. حضن الحبيبات في 30٪، 50٪، 70٪، 95٪، و100٪ إيثانول لمدة 5 دقائق في كل تركيز.
  7. دمج الكسور الميتوكوندرية. حضن في محلول إيبون/إيثانول بنسبة 1:1 لمدة 30 دقيقة، ثم استخدم راتنج إيبون نقي لمدة ساعة واحدة.
  8. انقل العينات إلى قوالب مدمجة وقم ببلمرة في فرن بدرجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  9. قم بتثبيت كتل الراتنج على الميكروتوم الفائق وقطع أجزاء رفيعة جدا (80 نانومتر).
  10. اجمع الأقسام على شبكات. صبغ الشبكات بأسيتات اليورانيل المائي بنسبة 1٪ لمدة 4 دقائق. اشطفه بماء مقطر مزدوج.
  11. صبغ سترات الرصاص لمدة 5 دقائق وفقا لطريقة رينولدز²¹. اشطف الخليط جيدا. تصور الشبكات باستخدام TEM. راجع الملف التكميلي 1 لمزيد من التفاصيل حول طريقة رينولدز والتقاط الصور من TEM.

4. القياس الجزيئي

منحنى الحمض النووي الميتوكوندري (mtDNA) القياسي
1. بذور خلايا HepG2 في خمسة أطباق زراعة بحجم 100 مم. حضن الثقافات حتى تصل إلى 80٪ من التقاء الجو.
2. عزل الميتوكوندريا من الخلايا المحصودة باتباع الإجراءات الفنية المفصلة في القسم 2.
3. استخلاص الحمض النووي الكلي من الحبيبات الميتوكوندرية الناتجة باستخدام طريقة الحمض-الجوانيدينيوم-الفينول-الكلوروفورم كما هو موضح في القسم 4.2.6. قياس تركيز الحمض النووي وتقييم النقاء ((A₂₆₀/_{A 280} و (A 260/_{A 230}) باستخدام مطياف UV-Vis ميكروحجم.
4. جهز سلسلة تخفيف متسلسلة باستخدام ماء خال من النوكلياز كمخفف. قم بتخفيف مخزون الحمض النووي لتحقيق كميات نهائية 1، ^10-1، ^10-2، ^10-3، ^10-4، ^و10-5 نانوغرام لكل حجم تفاعل. قم بدوامة كل تخفيف لمدة 5 ثوان لضمان التجانس الكامل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية في السلسلة.
  ملاحظة: قم بضبط نطاق تركيز المنحنى القياسي بناء على تركيز العينة المحددة وحجم تفاعل PCR النهائي.
اكتشاف mtDNA البشري في الخلايا المستقبلة
1. استبعاد الخلايا الدهنية الأولية المشتقة من فئران حديثي الولادة P0.5 في أطباق زراعة بحجم 60 مم، وفقا للكثافة وظروف الوسط المحددة في القسم 1.
2. عزل الميتوكوندريا من خلايا HepG2 المانحة وتنفيذ اختبار نقل الميتوكوندريا (MTA) كما هو موضح في القسم 2.
3. احتضن الزرعات لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.
4. تحفز التمايز البني الدهني لمدة 24–120 ساعة (في الأيام 1 و3 و5) باتباع بروتوكول تبادل الوسائط الموضح في القسم 1.
5. استنشق وسط الزراعة واغسل الخلايا مرتين بمحلول 2 مل من PBS البارد جدا.
6. استخلاص الحمض النووي الكلي باستخدام طريقة الحمض-الجوانيدينيوم-الفينول-الكلوروفورم²².
  ملاحظة: دائما قم بفصل الطور داخل غطاء الأبخرة لتجنب استنشاق أبخرة الفينول السامة. استخدم قفازات مزدوجة النتريل أو قفازات قوية مقاومة للمواد الكيميائية.
7. قم بفصل الطور وتخلص من الطور المائي بالكامل الموجود فوق الطور التفاعلي.
  خطوة حرجة: إزالة الطور المائي بالكامل لمنع التلوث وضمان نقاء عالي للحمض النووي لعملية qPCR في المرحلة النهائية.
8. أضف 0.3 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لكل 1 مل من مادة الاستخراج الأولية. أغلق الأنبوب وامزج بقوة عن طريق الانقلاب.
9. اتركه واقفا لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة واستخدم الطرد المركزي على 2000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لإطلاق الحمض النووي.
10. انقل الفائق الفينول-الإيثانول إلى أنبوب منفصل لعزل البروتين المحتمل. أعد تعليق حبيبة الحمض النووي في 1 مل من سترات الصوديوم 0.1 مولار (في 10٪ إيثانول، pH 8.5) لكل 1 مل من مادة الاستخراج المستخدمة.
11. اتركه واقفا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مع قلبه بلطف عدة مرات، واستخدم الطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت.
12. كرر خطوات غسل سترات الصوديوم مرتين إضافيتين.
13. اغسل الحبيبة الناتجة ب 2 مل من الإيثانول بنسبة 75٪ لكل 1 مل من مادة الاستخراج الأولية.
14. اتركه واقفا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وجهاز الطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
15. تخلص من المادة الفائقة وجفف الحبيبة في الهواء لمدة 10 دقائق. قم بإذابة الحمض النووي بإضافة 0.3–0.6 مل من 8 ملليمويل NaOH واستخدام الأنابيب صعودا وهبوطا مرارا حتى تختفي الحبيبة.
16. الطرد المركزي بحرارة 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة أي حطام غير قابل للذوبان. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب معقم واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7–8 باستخدام HEPES.
17. قس تركيز ونقاء الحمض النووي ((A(260)/A(280) و (A(260)/A(230)) باستخدام مطياف UV-Vis ميكروحجم.
18. قم بتخفيف القالب إلى كمية نهائية تبلغ 15 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي في ماء خال من النوكليز. إجراء عملية PCR كمية في الوقت الحقيقي (qPCR) للحمض النووي البشري باستخدام ألواح بصرية ذات 96 بئر كما هو محدد في القسم 4.3.
19. حلل نتائج التضخيم بتطبيق نموذج الانحدار اللوغاريتمي.
  ملاحظة: إجراء تحليل الانحدار اللوغاريتمي باستخدام تركيز الحمض النووي وقيم دورة العتبة المقابلة (Ct) كمتغيرات في الاعتبار.
RT-qPCR للتعبير الجيني
1. تحضير الخلايا والتمايز
  1. الخلايا الأولية للدهنية المشتقة من فئران حديثي الولادة P0.5 في أطباق زراعة بحجم 60 مم كما هو موضح في القسم 1.1.
  2. عزل الميتوكوندريا وإجراء اختبار نقل الميتوكوندريا (MTA) وفقا للإجراءات في القسم 2. احتضن الثقافات لمدة 24 ساعة.
  3. تحفز تكوين الدهون البنية لمدة 24–120 ساعة (أخذ عينات في الأيام 1 و3 و5 من التمايز) وفقا للبروتوكول في القسم 1.
2. العزل الكلي للحمض النووي الريبي
  1. قم بإزالة وسط الزراعة وإضافة 1 مل من كاشف مستخلص الحمض-جوانيدينيوم-الفينول-كلوروفورم لكل 1 ×^10.6 خلايا مباشرة إلى الطبق. توحيد العينات عن طريق تكرار استخدام الماصات حتى يصبح الليزات متساويا.
    ملاحظة: دائما قم بفصل الطور داخل غطاء الأبخرة لتجنب استنشاق أبخرة الفينول السامة. استخدم قفازات مزدوجة النتريل أو قفازات قوية مقاومة للمواد الكيميائية.
  2. أضف 0.2 مل من الكلوروفورم لكل 1 مل من مادة الاستخراج المستخدمة. أغلق الأنابيب بإحكام وهز يديك بقوة لمدة 15 ثانية. اتركه واقفا لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة وجهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. انقل الطور المائي العلوي بعناية إلى أنبوب جديد خال من النوكلياز. تجنب الاتصال بالطور الداخلي. احتفظ بالعينات على الثلج.
  4. أضف 0.5 مل من الأيزوبروبانول لكل 1 مل من كاشف الاستخراج المستخدم. اخلط بلطف عن طريق الانقلاب وحضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. الطرد المركزي عند 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لدفع الحمض النووي الريبي. تخلص من الفائق عن طريق الانقلاب.
  6. اغسل حبيبة RNA ب 1 مل من الإيثانول 75٪. دوامة لفترة وجيزة وجهاز طرد مركزي عند 7,500 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. تخلص من المادة الفائقة وجفف حبيبة RNA في الهواء لمدة 10 دقائق على درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الحبيبة في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. حضن العينات عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لضمان الذوبان الكامل.
  8. تحديد تركيز ونقاء الحمض النووي الريبي (نسب₂₆₀/A₂₈₀ ) باستخدام مطياف UV-Vis ميكروحجم.
  9. تحقق من سلامة الحمض النووي الريبي عبر الرحلان الكهربائي بجل الأغاروز.
3. علاج DNase
  1. أضف 0.1 حجم من 10× مخزن DNase و1 ميكرولتر من إنزيم DNase إلى كل عينة RNA. اخلط بلطف عن طريق استخدام الماصات. حضن التفاعلات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. أعد تعليق مادة تعطيل DNase عن طريق التحريك أو الدوامة حتى يصبح الخليط متجانسا. أضف مادة الإيقاف (0.1 حجم من عينة الحمض النووي الريبي أو 2 ميكرولتر، أيهما أكبر) وامزج جيدا. حضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. حرك الأنابيب ثلاث مرات خلال هذه الفترة للحفاظ على التعليق في الكاشف.
  3. الطرد المركزي عند 10,000 × جرام لمدة 1.5 دقيقة. انقل المادة الفائقة التي تحتوي على RNA إلى أنبوب جديد.
    خطوة حرجة: تأكد من عدم نقل أي كاشف لتعطيل DNase لأنه يثبط تخليق cDNA لاحقا.
4. النسخ العكسي (RT)
  1. قم بقياس كمية الحمض النووي الريبي المعالج وتخفيفه في مياه خالية من النوكلياز لاستخدام ما يصل إلى 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لكل تفاعل بحجم 20 ميكرولتر.
  2. حضر خليط RT الرئيسي على الثلج وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وزع الخليط في أنابيب التفاعل وأضف عينات RNA.
  3. قم بتحميل جهاز تدوير حراري وتشغيل برنامج النسخ العكسي كما يحددها مصنع المجموعة.
5. PCR الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)
  1. استخدم cDNA الناتج في القسم 4.3.4 كقالب PCR. تخفيف cDNA في ماء خال من النوكلياز إلى تركيز عمل 20 نانوغرام لكل تفاعل 10 ميكرولتر. احتفظ بجميع المواد المتفاعلة في الثلج.
  2. حضر خلطة رئيسية تحتوي على SYBR الأخضر، والبرايمر، وماء خال من النوكلياز. أضف الحجم الزائد لفقدان التنبيه. توزيع 10 ميكرولتر من خليط التفاعل في كل بئر من صفيحة qPCR بصرية.
  3. أغلق اللوحة بفيلم لاصق بصري وجهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لجمع السائل في الأسفل. قم بتحميل اللوحة في جهاز PCR في الوقت الحقيقي وقم بتنفيذ التضخيم باستخدام وضع التدوير السريع.
  4. تحديد قيم دورة العتبة (Ct) وإجراء القياس النسبي باستخدام طريقة ΔΔCt. أضف تحليل منحنى الانصهار في نهاية الجولة للتحقق من خصوصية التضخيم.
    ملاحظة: تطبيع وفرة mRNA المستهدفة إلى مستويات mRNA 36B4 كجين منزلي داخلي. شغل لوحات qPCR ضمن ساعتين من الإعداد؛ وإلا، خزن الألواح المغلقة عند 4 درجات مئوية.
البقعة الغربية
1. قم بقياس تركيز البروتين من مستخلصات الخلايا الكاملة والميتوكوندريا (راجع الأقسام 2.1.8 و2.1.12) باستخدام اختبار BCA.
2. جهز 30 ميكروغرام من البروتين لكل عينة وأضف الحجم المناسب من مخزن تحميل العينة SDS-PAGE (مثل مخزن Laemmli).
3. قم بتغيير طبيعة العينات عن طريق التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (أو اتباع متطلبات درجة حرارة محددة للبروتينات الغشائية).
4. حمل العينات في آبار هلام البولي أكريلاميد. يتم فصل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي الهلام الدوديسيل كبريت-بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE) بجهد ثابت (مثلا 80–120 فولت) حتى يصل مقدمة الصبغة إلى قاع الهلام.
5. فعل غشاء PVDF بغمره في 100٪ ميثانول لمدة دقيقة واحدة، ثم التوازن في مخزن النقل.
6. قم بتجميع ساندويتش النقل، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء بين الجل والغشاء.
7. انقل البروتينات إلى غشاء PVDF عن طريق الارتداد الكهربائي عند 400 مللي أمبير لمدة ساعتين. حافظ على النظام عند 4 درجات مئوية طوال العملية.
8. قم بحجب مواقع الارتباط غير المحددة عن طريق حضنة الغشاء في حليب خالي من الدسم 5٪ محضر في محلول ملحي مخبأ بتريس يحتوي على 0.1٪ Tween 20 (TBS-T) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
9. حضن الغشاء بالأجسام المضادة الأولية (مخففة بنسبة 1:1,000 في محلول الانسداد) طوال الليل عند حرارة 4 درجات مئوية تحت تحريك لطيف.
10. اغسل الغشاء 3 × 15 دقيقة باستخدام TBS-T.
11. حضن الأجسام المضادة الثانوية المتوافقة مع بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
12. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBS-T، ثم غسل نهائي لمدة 5 دقائق ب 1× ملعقة تراكيب في الثانية.
13. تصور أشرطة البروتين باستخدام ركيزة الإضاءة الكيميائية المعززة (ECL). التقاط الإشارة باستخدام نظام تصوير رقمي.
  ملاحظة: قم بضبط نسبة جل البولي أكريلاميد (مثلا 8٪، 10٪، أو 12٪) بناء على الوزن الجزيئي للبروتينات المستهدفة. إذا كان جهاز النقل الكهربائي يفتقر إلى نظام تبريد نشط، استبدل حاويات الثلج كل ساعة وأبق الحجرة مغمورة في حمام ثلج. تخزين الأغشية في 1× TBS عند 4 درجات مئوية إذا تأخر التصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخراج الميتوكوندريا والسلامة الهيكلية والتنفسية

لتقييم تأثير زيادة كتلة الميتوكوندريا على تكوين الدهون البني، تم إجراء اختبار نقل الميتوكوندريا (MTA) في الخلايا الدهنية غير المتمايزة (الشكل 1A). تم عزل الميتوكوندريا من خلايا الفئران الأولية (mMito) ومن سلسلة خلايا HepG2 البشرية الكبدية (hMito). أظهر تحليل البقعة الغربية أن كلا التحضيرين كانا مغنيين بدرجة عالية في علامة الميتوكوندريا TOMM20 مقارنة بمستخلصات الخلا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الآثار البيولوجية لنقل الميتوكوندريا في تكوين الدهون

تظهر نتائجنا أنه رغم إمكانية دمج الميتوكوندريا الخارجية من مصادر بشرية وفأرية في شبكة الميتوكوندريا الداخلية للخلايا قبل الدهنية المتمايزة، إلا أن زيادة الكتلة الميتوكوندرية الاصطناعية غير كافية لدفع البرنامج الأديبوجيني البني. تشير هذه النتائج إلى أن التوسع الميتوكوندري المميز في تكوين الدهون البنية هو نتيجة للتمايز الخلوي وليس عاملا ميكانيكيا محددا أو دافعا أساسيا. تتناقض هذه الملاحظات مع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر أبهيمانيو غارغ، أنيل أغاروال، وجاي هورتون من مركز UT Southwestern الطبي على ^{توفير فئران} Agpat2 لنا. أندريا ديل كامبو وغونزالو ألمارزا من كلية الكيمياء والصيدلة في الجامعة البابوية الكاثوليكية في تشيلي لمنحنا حق الوصول إلى الأوكسيغراف. وقد دعم هذا العمل وحدة المجهر المتقدمة لنواة القياس الخلوي الجريان في جامعة البابوية الكاثوليكية في تشيلي. وقد دعم هذا العمل 1221146 و 1261504 FONDECYT وFONDEQUIP 230130 وACT 210039 جميعها من ANID، تشيلي، ومنحت ل V.C. تم إنشاء الشكل 1A مع BioRender.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
100 mm plate	SPL Life Science	10101SPL
10x Tris/Glycine Buffer	BioRad	1610734
12 mm glass coverslips	Marienfeld	111520
12-well plate	SPL Life Science	30012SPL
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution	Invitrogen	28908
18 mm glass coverslips	HART	-
24-well plate	SPL Life Science	30024SPL
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt (T3)	Sigma	T6397
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Calbiochem	410957
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	1610158
35 mm plate	SPL Life Science	20035SPL
6-well plate	SPL Life Science	30006SPL
60 mm culture dish	SPL Life Science	20060SPL	استخدمت لتجارب الخلايا الأولية preadipocyte وDNA/qPCR؛ لم يتم توفير المورد/الرقم المرجعي
AccuRuler RGB Plus Pre-stained Protein Ladder	Maestrogen	02102-250
ACK lysing buffer	Gibco	A10492-01
Actrapid 100 UI/mL (Insulin)	Novo Nordisk	A10AB01
ADP	Merck	117105
Agarose	FERMELO BIOTEC	FER00AL200G	استخدمت للتحقق من سلامة RNA؛ لم يتم توفير المورد/الرقم المرجعي
Ammonium Persulfate	BioRad	1610700
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074
Anti-rat IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7077
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
Axio Observer inverted microscope stand	Carl Zeiss	431007-9901-000	أضيف من الطرق التكميلية
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	D49328
BD Cytometer Setup and Tracking beads	BD Biosciences	-	أضيف من الطرق التكميلية؛ لم يتم توفير الرقم المرجعي
BD FACSDiva Software v8.0.3	BD Biosciences	-	أضيف من الطرق التكميلية
BD LSRFortessa X-20 cell analyzer	BD Biosciences	-	تم توحيد الإدخال الحالي ليتناسب مع الملف التكميلي
BioRender	BioRender	-	استخدم لإنشاء مخطط سير عمل الشكل 1
Blotting-grade blocker	BioRad	170-6404
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A1470
CaCl2	Calbiochem	208291
cDNA Reverse Transcription Kit	Invitrogen	4374966
Cell Strainer 100 μm, nylon	Falcon	352360
Cell Strainer 40 μm, nylon	Falcon	352340
Collagenase type II	Gibco	17101-015
Dexamethasone	Sigma	D4902
DMEM Powder, High Glucose, Pyruvate	Thermo Scientific	12800017
DMEM/F-12, no phenol red	Thermo Scientific	21041025
DMEM/F-12, powder	Gibco	12500062
DMSO	Sigma	D8418	المذيب لمتوسط الحث؛ لم يتم توفير المورد/الرقم المرجعي
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)	Electron Microscopy Sciences	14120
Ethanol absolute	Merck	100983
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA)	Merck	324626
FAST SYBR MASTER MIX	Thermo Scientific	4385612
FCCP	Sigma	C2920
Fetal bovine serum	Capricorn Scientific	BS-16A
Floreada.io	Floreada.io	-	برنامج تحليل التدفق الخلوي
Fluoromount-G	Thermo Scientific	7984-25
GAPDH Antibody	Santa Cruz	sc-32233
Glucose	Gibco	15023-021
Glutamate	Sigma	G1626
Glutaraldehyde 25% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	16210
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Invitrogen	62-6520
GraphPad Prism v10.6.1	GraphPad Software	-	برنامج التحليل الإحصائي/الانحدار اللوغاريتمي
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X	Thermo Scientific	78442
HEPES	Biological Industries	41-122-100
Histone H3 (1G1)	Santa Cruz	sc-517576
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
ImageJ v1.54s	NIH	-	برنامج تحليل قطرات الدهون
Immun-Blot PVDF Membrane	BioRad	1620177
Indomethacin	Sigma	I7378
Insulin syringe	Cranberry	AAJECIN3	استخدمت لتجانس الخلايا؛ لم يتم توفير المورد/الرقم المرجعي
KCl	Calbiochem	529552
KH2PO4	Calbiochem	529568
KHCO3	Sigma	60339
LAMP-1 Antibody	Abcam	ab25245
Lane Marker Reducing Sample Buffer	Thermo Scientific	39000
Malate	Sigma	M1000
MgCl2	Calbiochem	208291	مكون من محلول تحليل الميتو

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

232 232

النقل الميتوكوندري الخارجي في الخلايا الدهنية البنية المتمايزة والخلايا الدهنية الخالية من AGPAT2

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة