قياس خلوي التدفق متعدد المراكز لمرض اللوكيميا النخاعية الحاد القابل للقياس المتبقي باستخدام LAIP/DfN وCD34+CD38- مجموعات غنية بالخلايا الجذعية اللوكيمية

ملخص

يصف هذا البروتوكول سير عمل قياس تدفق الخلايا متعدد المراكز لقياس الأمراض المتبقية القابلة للقياس باستخدام تحليل نمط المناعة المرتبط باللوكيميا/الاختلاف عن الطبيعي (LAIP/DfN) وتحليل المجموعات الغنية بالخلايا الجذعية في الدم CD34⁺CD38⁻ المعرفة ظاهريا.

الملخص

يوصى بمتابعة الأمراض المتبقية القابلة للقياس (MRD) لتقييم استجابة العلاج في التجارب السريرية لسرطان الدم النخاعي الحاد (AML) وفقا لإرشادات ELN 2025. كان هدف هذه الدراسة تنفيذ متابعة موحدة للمرضى باستخدام نهج تدفق MRD متناغم عبر 30 مختبرا فرنسيا لأمراض الدم المشاركة في تجارب سريرية للغسل العضلي المعدني. للحصول على نتائج مماثلة، وضعت الشبكة توصيات من إجراءات المختبرات الرطبة إلى التقارير السريرية. صممنا لوحة من 3 أنابيب مع علامات شائعة إلزامية بثمانية ألوان لكل أنبوب، وفقا لتوصيات ELN، لتحديد أنماط نمط المناعة المرتبطة باللوكيميا/الاختلاف عن الطبيعي (LAIP/DfN) في الخلايا الكلية ومجموعات الخلايا الجذعية الغنية باللوكيميا (LSC) في نسبة CD34⁺CD38⁻ . تم استخدام عمود فقري من CD34/CD38/CD45/CD117، واكتمل بعلامات النسب للأنبوب الأول، وعلامات مرتبطة ب LSC للأنبوب الثاني، وعلامات وحيدة الخلية والتمايز للأنبوب الثالث. يمكن استخدام هذه اللوحة بصيغ 8 و10 و12 لونا وتطبيقها على منصات قياس تدفق تقليدية متعددة. نقترح إعدادات مقياس تدفق خلوي معدلة لكل منصة.

تم تنفيذ تنسيق الحساسية بين المنصات الأربع باستخدام خرز قوس قزح ذو 8 قمم. تم إجراء التلطيب المناعي بعد التحليل الجماعي. لاكتشاف التحيز بين المنصات، تم اختبار مؤشر التلوين باستخدام عينات نخاع عظم سليمة طازجة بالتوازي على المنصات الأربع. تم مشاركة عينات مراقبة جودة منتظمة من نخاع العظم بين المختبرات لتقييم الجودة الخارجية الرطبة (EQA) للتحقق من جميع خطوات البروتوكول. وأخيرا، تم تقييم توحيد استراتيجية تحليل البيانات التي تم الحصول عليها في المراكز باستخدام EQA جافة من خلال مشاركة ملفات بيانات MRD FCS. تتطلب جدوى هذا النهج متعدد المراكز توحيد حساسية الجهاز وتحضير العينات، بالإضافة إلى التدريب والتعليم المنهجي للمشغلين التحليليين.

المقدمة

يشير مرض البقي القابل للقياس (MRD) إلى العدد القليل من خلايا اللوكيميا التي تبقى أثناء أو بعد العلاج ولا يمكن اكتشافها من خلال الشكل الشكلي، خاصة في حالات الهدوء الكامل مع أقل من 5٪ انفجارات في نخاع العظم. يوصى بمراقبة MRD لتقييم استجابة العلاج في تجارب سرطان الدم النخاعي الحاد السريرية (AML) وفقا لإرشادات ELN 2025¹. بالإضافة إلى طرق علم الأحياء الجزيئي، بما في ذلك تحليل PCR للنسخ العكسي (RT-qPCR) والتسلسل من الجيل القادم (NGS)، يعد قياس تدفق الخلايا متعددة المعلمات (MFC) نهجا شائعا^{الاستخدام 2}.

للحصول على نتائج متسقة لاضطراب MRD، خاصة في التجارب السريرية، هناك استراتيجيتان ممكنتان: مركزية قياس MRD في مختبر واحد أو تنفيذ بروتوكول يضمن قابلية التكرار بين المختبرات المختلفة المشاركة في تحديد MRD. عدد العينات، حجم التجربة، وقدرة المختبرات على معالجة أحجام عينات أكبر أو أصغر يمكن أن يحدد الاختيار بين هذه الاستراتيجيات. إذا تم اختيار استراتيجية متعددة المراكز، يجب معالجة الفروقات بين منصات أجهزة قياس الخلايا والحاجة إلى تحليل قابل للمقارنة عبر المواقع.

لهذا الغرض، نصف نهج تدفق MRD متعدد المراكز والمنصات الموحد يجمع بين تحليل نمط المناعة المرتبط باللوكيميا/الاختلاف عن الطبيعي (LAIP/DfN) وتحليل الكشف المحظوى بالخلايا الجذعية اللوكيمية (LSC) المعرف ظاهريا CD34⁺CD38⁻، وتم تنفيذه في 30 مختبرا فرنسيا لأمراض الدم بناء على توصيات ELN والتقارير السابقة ^3,4.

تسمح قياس تدفق الخلايا بتعريف "توقيع" اللوكيميا عند التشخيص الذي يتضمن التعبير المحدد للعلامات على انفجارات المريض: LAIP. بعد العلاج، يسمح تدفق MRD بمراقبة ال LAIPs التي تم تحديدها عند التشخيص. نظرا لأن الانفجارات البيضاء يمكن أن تتطور وتعدل نمط المناعة تحت الضغط العلاجي، يجب تنفيذ استراتيجية ثانية بشكل منهجي: نهج DfN، الذي يعتمد على تحديد الخلايا ذات الخصائص التي تميزها عن التداخل الدموي الطبيعي. يمكن لهذه التقنية أيضا اكتشاف ظهور علامات جديدة على البلجارات أثناء المرض وعلاجه.

في مجموعة تدفق AML الفرنسية، استند تصميم اللوحة إلى دراسة HOVON المنشورة سابقا حول تعريف نمط الخلايا اللوكيمية. لا يوجد مؤشر عالمي ل LSC أو LAIP، لذا صممنا لوحة من 3 أنابيب تسمح بالتعرف المتزامن على مجموعات LAIP وDfN وCD34⁺CD38⁻ الغنية ب LSC. تم استخدام عمود فقري قائم على CD34/CD38/CD45/CD117 في جميع الأنابيب، مع اكتمال علامات النسب في الأنبوب الأول، وعلامات مرتبطة ب LSC في الأنبوب الثاني، وعلامات النسب أو التمايز الأحادية في الأنبوب الثالث لإكمال تعريف LAIP في AML مع انفجارات أحادية الخلية. يتم الحصول على جميع الأنابيب الثلاثة عند التشخيص وفي عينات المتابعة.

نظرا للفيزيولوجيا المرضية لتكوين اللوكيميا، تحول الاهتمام من دراسة كتلة الانفجار إلى تحديد أكثر الأجزاء غير الناضجة كمجموعات غنية بالخلايا الجذعية في اللوكيميا. أظهر ديك وزملاؤه تباين اللوكيميا من خلال وصف CD34⁺CD38⁻ LSCs التي لديها القدرة على توليد اللوكيميا في فئران تعاني من نقص المناعة ^5,6. في قياس LSC عند التشخيص والمتابعة، تبذل جهود لتوحيد لوحات الأجسام المضادة واستراتيجيات التحليل ضمن مجموعة العمل ^1,7 ل ELN DAVID. حاليا، تستخدم لوحتان، HOVON وALFA، علامات LSC ثنائية النسيج لتمييز التجمعات الغنية ب LSC عن الخلايا الجذعية المكونة للدم الطبيعية في مساحة CD34⁺CD38^{− 8,9}.

تجمع الطريقة الموصوفة هنا بين تحضير العينة الموحد، وتصميم لوحات الأجسام المضادة المشتركة، وإعدادات الحساسية المعدلة للمنصة، وتحليل LAIP/DfN وCD34⁺CD38⁻ الغني ب LSC، وتقييم الجودة الخارجي، والتقارير السريرية الموحدة لمراقبة تدفق AML MRD متعدد المراكز.

البروتوكول

يتبع البروتوكول توصيات وإرشادات لجان الأخلاقيات في مراكز مستشفيات الجامعة الفرنسية. جميع المرضى وقعوا على موافقة مستنيرة وفقا للتشريعات الفرنسية. تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات الإنسانية في CHU ليون ولجنة الأخلاقيات في مجلس مراجعة المؤسسات في جامعة Lille CHU وفقا لإعلان هلسنكي (مرصد HDF-AML، CNIL 2214454v0). بالنسبة للتجميد، تم تضمين المتبرعين في قاعدة بيانات ProMISE الأوروبية القائمة على الإنترنت وقدموا موافقتهم الواعية لجمع بياناتهم الشخصية. تم استخراج وتحليل البيانات وفقا للجنة الأخلاقيات المحلية (CNIL2093819). جميع ملفات تدفق FCS المستخدمة لمراجعة الشبكة تم إخفاء هويتها بالكامل باستخدام سكريبت بايثون.

1. إعداد جهاز قياس الخلايا

1. تحديد القيم المستهدفة المكيفة لكل جهاز قياس خلوي باستخدام خرز قوس قزح ذو 8 قمم.
2. اضبط كل آلة وفقا للقيم المستهدفة المعروضة في الجدول 1. تأكد من أن كل قناة تصل إلى القيمة المستهدفة ± 5٪. تحقق من هذا الإعداد بشكل منهجي للحفاظ على الحساسية الطولية لكل منصة.
3. إنشاء مصفوفة التعويض باستخدام أنابيب ملونة أحادية لكل جسم مضاد، باستخدام خرزات و/أو خلايا تعويضية حسب كل منصة.
4. احفظ مصفوفة الإعداد والتعويض كاختبار أو بروتوكول يعرف باسم MRD LAIP/DfN، LSC، وMonoGran (T1، T2، T3). استخدم هذا الاختبار أو البروتوكول للاكتساب لقياس تدفق AML MRD.

2. إجراء المختبر الرطب

1. شفط نخاع العظم
   1. اجمع 1-2 مل من نخاع العظم EDTA عند التشخيص وعند نقاط المراقبة، بما في ذلك MRD1، MRD2، MRD3، MRD4، والانتكاس.
   2. أرسل الأنابيب إلى مختبر التدفق المرجعي خلال 24-48 ساعة.
2. تحضير مسحة نخاع العظم للفحص الشكلي
   1. ضع قطرة من شفط نخاع العظم على شريحة زجاجية. افرد العينة بلطف باستخدام غطاء أو شريحة أخرى.
   2. بعد 30 دقيقة من التجفيف، قم بصبغ الطبقة ب May-Grünwald-Giemsa (الملف التكميلي 1).
3. التحلل الجماعي
   1. أضف 15 مل من محلول تحليل NH₄Cl إلى 1-2 مل من عينة نخاع العظم. اخلط بلطف وحضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   2. استخدم الطرد المركزي عند 450 × جرام في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ثم تخلص من السوبرناتان.
   3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من PBS/0.1٪ BSA. أضع الطرد المركزي عند 450 × جرام في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ثم تخلص من السوبرناتان.
   4. أعد تعليق الحبيبات الخلوية بتركيز 30 × 10⁶ كرات الدم البيضاء لكل مل في PBS.
4. صبغة المناعة لتعليق الخلية
   1. توزيع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في الأنابيب T1 وT2 وT3 حسب المنصة (الجدول 2). قدم النسخة المستنسخة، الحجم، مرجع الكتالوج، والمورد لكل جسم مضاد في جدول الأجسام المضادة.
      ملاحظة: لكل أنبوب يستخدم صبغات بنفسجية لامعة، استخدم محلول الصبغة اللامعة قبل إضافة الأجسام المضادة.
   2. أضف 2-3 ×10 خلايا^متحللة لكل أنبوب في 100 ميكرولتر من تعليق الخلية. حضن الخلايا بالأجسام المضادة لمدة 15 دقيقة في الظلام ودرجة حرارة الغرفة.
   3. اغسل الخلايا ب 3 مل من PBS. استخدم الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 450 × جرام ثم تخلص من السوبرناتانت.
   4. أعد تعليق الخلايا الملونة في 300 ميكرولتر من PBS.
      ملاحظة: قد تستخدم كوكتيلات الأجسام المضادة المختلطة مسبقا أو أنابيب الأجسام المضادة الجافة المثبتة.

3. الحصول على جهاز قياس التدفق الخلوي

1. افتح اختبار أو بروتوكول اكتساب MRD مع الإعداد المعدلة ومصفوفة التعويض لقياس MRD LAIP/DfN وLSC.
2. الحصول على حد أدنى من 500,000 إلى 1,000,000 خلايا الدم البيضاء في كل أنبوب عند التشخيص وفي عينات متابعة MRD لتحسين تجمع خلايا MRD وتحسين الثقة في MRD منخفض المستوى.
   ملاحظة: لقياس LSC، احصل على حد أدنى من 1,000,000 كتلة كتلة بيضاء في الأنبوب 2 للحصول على حساسية كافية لقياس LSC (LOQ 0.002٪ وLOD 0.001٪)^10,11.
3. احفظ ملفات بيانات FCS من عينات التشخيص وMRD. سجل تاريخ الاستحواذ وتحديد هوية المريض لتسهيل متابعة تحليل MRD وLSC.

4. استراتيجية التحليل

1. استخدم قالبا مشتركا وتسلسل مخطط نقاط مشترك يتضمن استراتيجية بوابة متناغمة محددة مسبقا متكيفة مع برنامج التحليل المستخدم في كل مركز.
2. تطبيق استراتيجية البوابة لتحديد خلايا اللوكيميا باستخدام ثلاث طرق: تحليل LAIP، DfN، وتحليل LSC ^{في جزء} CD34⁺CD38.
3. تحديد واستبعاد الأحداث غير المحددة المحتملة والتجمعات الفسيولوجية الطبيعية، بما في ذلك القاعديات، الخلايا التغصنية البلازمية، الدموجينات، خلايا البلازما، الخلايا الحمراء، كتل الصفائح الدموية، الحطام، والدم الأحمر غير المحلل.

5. تعريف LAIP/DfN والسكان الفسيولوجيين

1. لالتقاط LAIP في الانفجارات الجماعية، ارسم بوابة خلية واحدة بناء على FSC-W مقابل FSC-H.
2. ارسم بوابة خلية حية بناء على FSC مقابل SSC.
3. ارسم بوابة انفجار على CD45^{في وضع الظوام}/SSC.
4. ارسم بوابة العلامات البدائية باستخدام CD34/CD117.
5. استخدم مخططات نقطية ثنائية المعلمات الثابتة لرسم بوابات LAIP ذات الصلة، بما في ذلك LAIP1، LAIP2، LAIP3، LAIP4، LAIP5، LAIP6، LAIP7، وLAIP8.
6. التجمعات الفسيولوجية
   1. الهيماتوجون البوابات باستخدام التسلسل التالي: الخلايا الحية، MNC على مخطط FSC/SSC، مخطط CD19/SSC نقطتي، ومخطط CD34/CD38. البوابة الخلفية باستخدام CD45/SSC.
   2. تفتح القاعديات البوابية باستخدام التسلسل التالي: الخلايا الحية، MNC على مخطط FSC/SSC المنقطي، CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA^-)، باستثناء الهيماتوجون CD19⁺ . البوابة الخلفية باستخدام CD45/SSC.
   3. الخلايا التغصنية البلازمية باستخدام التسلسل التالي: الخلايا الحية، MNC على مخطط FSC/SSC، CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA⁺)، باستثناء الهيماتوجون CD19⁺ . البوابة الخلفية باستخدام CD45/SSC.
   4. حدد الخلايا الحمراء، وكتلات الصفائح الدموية، والحطام، وكريات الدم الحمراء غير المحللة باستخدام مخطط CD36/CD45. البوابة الخلفية باستخدام CD45/SSC و FSC/SSC.
7. نهج LAIP
   1. عرف MRD في AML البدائي CD34⁺ أو CD117⁺ باستخدام العوامل البوليانية كما يلي: LAIP1 وLAIP2 وLAIP3 وLAIP4 وLAIP5 وLAIP6 وLAIP7 وLAIP8 وليس CD36^{النظيف BRIGHT+}/CD45 والخلايا الأحادية والخلايا الحية وCD34^+/CD117^+/ العلامات البدائية AND (بوابة الانفجار CD45/SSC أو MNC CD34⁺) (الشكل 1).
   2. عرف MRD في CD34-CD117^- AML باستخدام المشغلات البوليانية كما يلي: LAIP1 وLAIP2 وLAIP3 وLAIP4 و LAIP5 و LAIP6 و LAIP7 و LAIP8 وNOT clean CD36^bright+/CD45 والخلايا المفردة والخلايا الحية و CD34CD117 و CD45/SSC (الشكل 2).
8. نهج DfN
   1. استخدم نفس القالب المستخدم في نهج LAIP وطبق الفراغ المعرف على عينات نخاع العظم المرجعية (الجدول 3).
   2. حدد مجموعات غير طبيعية عندما يتم فصل مجموعة الخلايا غير الطبيعية عن الخلايا الطبيعية بمقدار 0.5 عقد على مقياس لوغاريتيم¹².
   3. لالتقاط DfN في انفجارات جماعية، ارسم خلايا حية باستخدام FSC/SSC.
   4. ارسم خلايا مفردة عن طريق إزالة الدوبلتات بناء على ذروة FSC/منطقة SSC.
   5. ارسم بوابة MNC باستخدام FSC/SSC.
   6. ضع بوابة تنظيف لإزالة الخلايا اللمفاوية باستخدام CD45/CD36/SSC.
   7. ضع بوابة تنظيف لإزالة الريثروبلاست والحطام باستخدام CD45/CD36.
   8. استخدم بوابتين إدخال، CD34⁺/CD45/SSC و CD117⁺/CD45/SSC، لتعريف الصناديق الفارغة وفقا للمنشورات السابقة^12,13.
   9. ارسم كل صندوق DfN فارغا بناء على مجموعات التحكم الداخلية، بما في ذلك الخلايا اللمفاوية لمؤشرات الخطوط المتقاطعة والمقدمات الميلويدية الطبيعية لعلامات فقدان أو انخفاض أو زيادة التعبير.
   10. قارن الصناديق الفارغة مع عينات نخاع العظم المرجعية، بما في ذلك نخاع العظم المتجدد، الالتهابي، والصحي من المتبرع.

6. تعريف مجتمع LSC CD34⁺CD38^-

1. تحديد الخلايا الغنية ب LSC عند التشخيص في مساحة CD34⁺CD38^- بناء على مؤشرات LSC ذات تعبير ثنائي النسيج وغياب التعبير في الخلايا الجذعية المكونة للدم الطبيعية من نخاع العظم السليم.
2. عرف بوابة إدخال LSC ك MNC34⁺ باستخدام تسلسل البوابات التالي: الخلايا الحية، الخلايا الفردية، MNC، وCD34⁺ في مخطط CD45/CD34.
3. حدد الجزء من CD34⁺CD38^- (P6) باستخدام عتبة صارمة تعتمد على مستوى الفلورة ناقص واحد (FMO) في CD38.
4. تعريف الخلايا الغنية ب LSC في الأنبوب 1 في جزء P6 باستخدام العوامل البوليانية كما يلي: P6CD7⁺ أو P6CD33⁺ أو P6CD19⁺ أو P6CD56⁺ وليس CD36^{النظيفة المضيئة+} والخلايا الأحادية والخلايا الحية وMNC وMNC CD34⁺.
5. حدد الخلايا الغنية ب LSC في الأنبوب 2 في جزء P6 باستخدام العوامل البوليانية كما يلي: ^P6CD45RA+ أو P6MIX⁺ أو ^P6CD123+ وليس CD36^{المضيئة+} والخلايا الأحادية والخلايا الحية وMNC وMNC CD34⁺.
6. استخدم CD36 لتنظيف الأحداث غير المحددة في بوابة MRD LSC النهائية (الشكل 3).

7. ^{تعريف عتبة} CD38 في مجتمع CD34⁺

1. اضبط قناة CD38 عالية بما يكفي لتمييز ^{مجموعات} CD38 عن مجموعات ^CD38+/ ذات الدقة الجيدة.
2. عرف P6 ك CD34⁺CD38^-، P7 ك CD34⁺CD38^منخفض، وP8 ك CD34⁺CD38^مرتفع.
3. استند إعداد قناة CD38 إلى مجموعات ساطعة CD38، وتحديد خلايا البلازما كأكثر سكان سطوعا وهيماتوجونات حسب نطاق القياس لكل منصة.
4. تعريف مجموعة CD34⁺CD38^- (P6) باستخدام نهج CD38 FMO الذي تم التحقق منه بواسطة ضابط CD38 متساوي النحوية.
5. حدد مستوى السكان^{المنخفض} CD34⁺CD38 (P7) باستخدام المستوى السلبي للدم.
6. حدد عدد السكان^{المرتفع} CD34⁺CD38 (P8) باستخدام مستوى الإيجابية الدموية ومستوى سلبي لخلايا البلازما (الشكل 4).
7. استخدم نفس ^{مستوى عتبة} CD38 عبر المجموعة المتناغمة باستخدام طرق قوية مثل CD38-FMO أو التحكم متساوي اللونية CD38.
8. استخدم على الأقل نمط مناعي شاذ واحد ^{في جزء} CD34⁺CD38 لتعريف الخلايا الغنية ب LSC. يشمل علامات LSC مثل CLL1/TIM3/CD97/CD45RA/CD123 أو علامات النسب مثل CD7/CD19/CD56/CD33.
9. تطبيق العتبات التالية: حساسية الاختبار LOQ ^10-4 وLOD ^10-5؛ الإيجابية في LSC عند التشخيص ≥ 1٪ من انفجارات CD45/SSC؛ وإيجابية LSC في متابعة MRD ≥ 0.01٪ من الخلايا البيضاء (WBC).

8. تقرير التدفق السريري المتناغم

1. قدم المعلومات التالية مع كل نتيجة: جودة نخاع العظم، الاستراتيجية المستخدمة لتحديد MRD، وصف LAIP، LOD وLOQ، العتبات، وتفسير النتائج.
2. التخفيف الدموي وتمثيل نخاع العظم
   1. تقييم التخفيف الدموي لكل تقرير سريري لتدفق MRD لتقييم متانة النتيجة.
   2. استخدم إحدى طرق التخفيف المغناطيسي الموصوفة سابقا عند الاقتضاء (الجدول 4)7,14,15,16,17,18,19,20,21.
   3. كنهج تكميلي، احسب تمثيل نخاع العظم باستخدام نسبة CD34/WBC45 المرصودة مقارنة بالنسبة المتوقعة في عينات نخاع العظم المرجعية (الشكل 5).
   4. استخدم الصيغة التالية:
      P: النقاء ٪ = 100 × (n/L - s) / (m - s)
      s: نسبة خلايا MNC CD34⁺ في الدم المحيطي الطبيعي: 0.0005
      m: نسبة خلايا MNC CD34⁺ في نخاع العظم الطبيعي: 0.035
      L: عدد كريات الدم البيضاء WBC45⁺ في عينة مريض MRD
      n: عدد خلايا MNC CD34⁺ في عينة مريض MRD
   5. أبلغ عن تمثيل نخاع العظم كتقييم جودة للعينة. لا تستخدم هذه القيمة لتطبيع نتائج MRD.
   6. تفسير تمثيلية نخاع العظم كما يلي: 100٪ إلى 10٪، تأثير منخفض على نسبة خلايا CD34⁺ من نخاع العظم؛ 10٪ إلى 1٪، تحذير لتفسير نتائج اضطراب التفكيك المغناطيسي؛ و< 1٪، نتيجة غير قابلة للتفسير.
3. قياس الكمية في LSC عند التشخيص
   1. أبلغ عن الملف الشخصي المستخدم لتحديد الخلايا الغنية ب LSC، على سبيل المثال: CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. أبلغ عن نتائج LSC عند التشخيص كنسبة ملحوظة من انفجارات CD45/SSC.
   3. استخدم LSC ≥ 1٪ من إجمالي البلاستات كعتبة لسوء التشخيص.
4. متابعة MRD بواسطة LAIP/DfN
   1. أبلغ عن ملف تعريف LAIP المستخدم لتحديد MRD، على سبيل المثال، CD34⁺CD38^dim+CD13^+/-CD33⁺⁺CD117⁺CD7⁺.
   2. أبلغ عن حساسية التحليل كأقل قيمة حساسية بين العتبة التقنية وقيمة المتانة التي لوحظت لملف LAIP مقارنة بعينات نخاع العظم المرجعية.
   3. استخدم تجمع لا يقل عن 50 خلية بين أحداث الخلايا البيضاء المكتسبة كحد أقصى للقياس. على سبيل المثال، مع وجود 500,000 خلية خلايا كرون الدم البيضاء (WBC)، يكون LOQ 0.01٪ (1 × ^10-4).
   4. أبلغ عن نتائج LAIP/DfN كنتائج إيجابية، سلبية، قابلة للكشف ولكن تحت الحد السريري، أو غير قابلة للكشف.
   5. أبلغ عن إيجابية LAIP/DfN بنسبة ≥ 0.1٪، معبرة عنها كنسبة مئوية إجمالي الكريات البيضاء CD45⁺ .
   6. أبلغ عن سلبية LAIP/DfN < 0.1٪.
   7. للحصول على نتائج قابلة للكشف ولكن أقل من العتبة، أبلغ عن القيمة الممثلة وعتبة الحساسية.
   8. بالنسبة للنتائج غير القابلة للكشف، أبلغ عن أن النتيجة أقل من عتبة حساسية التحليل وأضف تعليقا إذا لزم الأمر، مثل التخفيف الدموي، أو انخفاض خصوصية LAIP، أو عدم كفاية العتبة التقنية.
5. متابعة MRD من قبل LSC
   1. أبلغ عن الملف الشخصي المستخدم لتحديد الخلايا الغنية ب LSC، على سبيل المثال: CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. استخدم تجمع لا يقل عن 20 خلية بين أحداث الخلايا البيضاء المكتسبة كحد أقصى للكمية. على سبيل المثال، مع وجود 1,000,000 خلية من الخلايا البيضاء للكرون الكربونية، يكون LOTQ بنسبة 0.002٪ (2 × ^10-5).
   3. أبلغ عن نتائج LSC كإيجابية أو سلبية أو قابلة للكشف ولكن تحت العتبة السريرية، أو غير قابلة للكشف.
   4. أبلغ عن إيجابية LSC بنسبة 0.01٪ ≥، معبرا عنها كنسبة من إجمالي الكريات البيضاء CD45⁺ .
   5. أبلغ عن سلبية LSC < 0.01٪.
   6. للحصول على نتائج قابلة للكشف ولكن أقل من العتبة، أبلغ عن القيمة الممثلة وعتبة الحساسية.
   7. بالنسبة للنتائج غير القابلة للكشف، أبلغ أن النتيجة أقل من عتبة حساسية التحليل وأضف تعليقا إذا لزم الأمر، مثل التخفيف الدموي، أو انخفاض خصوصية LSC، أو عدم العتبة التقنية.
6. دمج تفسير تدفق MRD مع نقاط المراقبة السابقة. يشير إلى تعديل الملف الظاهري أثناء العلاج وديناميكيات تدفق MRD، بما في ذلك إعادة الإيجابية، الزيادة، الاستقرار، أو النقصان.
7. أرسل النتائج إلى الطبيب والباحث الطلبين باستخدام تقرير التدفق السريري وفقا للإطار الزمني لمختبر التدفق المرجعي.
8. تلخيص تقرير التدفق السريري المتناغم باستخدام العناصر التالية: جودة نخاع العظم، استراتيجية تحديد MRD، وصف LAIP، LOD وLOQ، العتبات، والتفسير ك MRD إيجابي، MRD سلبي مع قيمة LOD، أو MRD قابل للكشف ولكن غير قابل للقياس.

النتائج

انعكاس المنصات

في المقارنة الأولية على منصتين بين CANTO وNAVIOS، تم تعديل إعدادات الجهد من خلال الحصول على خرز قوس قزح ذو 8 قمم غير معوضة للوصول إلى قيم MFI المحددة مسبقا. تم نقل قيم الأهداف من منصة CANTO المرجعية إلى منصة NAVIOS الثانية باستخدام التحويل التالي: هدف MFI جديد = هدف MFI مرجعي/256²². لاكتشاف التحيز بين المنصات، تم اختبار 10 عينات جديدة من نخاع العظم التجددي من EDTA بالتوازي. تمت مقارنة مؤشر التلوين بين السكان الإيجابيين والسلبيين بين العينات والمنصات وأظهر فصلا مماثلا (الملف التكميلي - الشكل S3).

خلال الدراسة، تم ترقية المنصات تدريجيا من تكوينات 8 و10 ألوان إلى تكوينات LYRIC وDxFLEX ب 12 و13 لونا (الملف التكميلي 1). تم توسيع العكس عبر أربع منصات باستخدام خرزات قوس قزح ذات 8 قمم وصبغة نخاع عظم صحي تم الحصول عليها بنفس اللوحة. تم التحقق من تداخل الذروة عن طريق تعديل المقاييس اللوغاريتمية للتمثيل فقط. بعد تطبيق الإعدادات المحددة، تداخلت أنماط تلوين الخلايا، مع الاختلاف الرئيسي في ترجمة سحب الخلايا على المقاييس اللوغاريتمية (الشكل 6 والملف التكميلي - الشكل S4 والشكل S5).

تقييم الجودة وقابلية التكرار عبر مختبرات التدفق

بعد تنفيذ إجراء التشغيل القياسي الأولي وتحديثاته أثناء ترقيات المنصة، تم إجراء تقييم الجودة الخارجية الرطبة (EQA) بانتظام باستخدام عينات مرجعية جديدة من نخاع العظم تم مشاركتها بين المراكز المشاركة. تم استخدام EQA الرطب للتحقق من إجراء المختبر الرطب، وإعدادات المنصة، واستراتيجية تحليل البوابات الشائعة. شملت التجمعات المبلغ عنها خلايا MNC CD34⁺ في مقام CD45⁺ في WBC وخلايا P6 CD34⁺CD38⁻ في مقام CD45⁺ في WBC. تم تحليل النتائج بواسطة درجة z و/أو تمثيل بياني (الشكل 7).

تم إجراء خمس جولات EQA رطبة منذ عام 2017، شارك فيها 22 و15 و17 و26 و25 مختبرا على التوالي. بالنسبة لخلايا ٪CD34⁺CD38⁻ في خلايا WBC CD45⁺ و٪MNC CD34⁺ في WBC CD45⁺، كانت النتائج كما يلي: EQA1، القيم المتوسطة 0.015٪ و1.01٪ (SD 0.09٪ و0.24٪); EQA2، 0.09٪ و1.02٪ (SD 0.046٪ و0.36٪)؛ EQA3، 0.097٪ و1.46٪ (SD 0.024٪ و0.32٪)؛ EQA4، 0.024٪ و2.16٪ (SD 0.015٪ و0.59٪)؛ وEQA5، 0.027٪ و1.9٪ (SD 0.008٪ و0.45٪).

لمعالجة توحيد استراتيجية تحليل MRD عبر المراكز، تم تعزيز EQA الرطب بتحليل EQA جاف باستخدام ملفات FCS مشتركة للتشخيص، ومتابعة MRD، ونخاع العظم المرجعي. تم تضمين أكثر من 90٪ من البيانات المحللة محليا ضمن الفترة المركزية بناء على متوسط السلسلة ± 2 SD: 95.6٪ و91.3٪ ل DryEQA2017، مع 22 من أصل 23 مختبرا مشاركا، و100٪ لمختبرا DryEQA2024، مع 24 من أصل 25 مختبرا مشاركا (الشكل 8). تم إجراء جولتين من EQA الجاف ل ٪MRD LAIP في WBC CD45⁺ ونسبة MRD LSC CD34⁺CD38⁻ في WBC CD45⁺. أظهر DryEQA2017 متوسط قيمة LAIP بنسبة 11.9٪ (SD 1.35٪) ومتوسط قيمة LSC بنسبة 0.16٪ (SD 0.05٪). أظهر DryEQA2024 متوسط قيمة MRD LAIP بنسبة 0.35٪ (SD 0.26٪) ومتوسط قيمة MRD LSC CD34⁺CD38⁻ 0.18٪ (SD 0.06٪).

مثال على قياس تدفق AML MRD متعدد الوسائط باستخدام استراتيجيات LAIP/DfN وLSC

لقياس اضطراب الدماغ المغناطيسي، تم استخدام ثلاث طرق بشكل منهجي. أنشأ النهج الأول رسم خرائط LAIP لانفجارات اللوكيميا عند التشخيص باستخدام البوابة البوليانية، وتم تطبيق هذا الخرائط على عينات نخاع العظم المتابعة (الشكل 9A). استخدم النهج الثاني تحليل DfN لتحديد الخلايا غير الطبيعية ذات أنماط التعبير غير النمطية التي لم تلاحظ في مناطق "الصندوق الفارغ" المعرفة من التمايز الطبيعي للنخاع (الشكل 9B). النهج الثالث قام بقياس الخلايا المغنية ب LSC في جزء CD34⁺CD38⁻ باستخدام علامات LSC ثنائية الشكل وبوابة بوليان (الشكل 10).

عينات مرجعية من نخاع العظم

تمت دراسة ما مجموعه 135 عينة مرجعية من نخاع العظم، بما في ذلك 25 عينة نخاع عظم متبرع سليمة، و34 عينة نخاع عظم التهابية، و76 عينة نخاع عظم متجددة. تم الحصول على نخاع العظم السليم من متبرعين أصحاء، بمتوسط عمر 31 سنة ونطاق 21–49 سنة. تم الحصول على نخاع العظم الالتهابي من مرضى أحيل لعلاج ضعف السيتوبينيا، بما في ذلك فقر الدم، أو العدلات، أو جلطات البوني، مع استنشاق نخاع العظم الذي لم يظهر فيه أي ورم خبيث دموي؛ كان متوسط العمر 52 سنة، مع نطاق يتراوح بين 25–82 سنة. تم الحصول على نخاع العظم المتجدد خلال متابعة AML في فترات زمنية مختلفة للعلاج الكيميائي، بما في ذلك بعد التحفيز أو التثبيت، مع سلبية تقييم MRD الجزيئي لنصوص NPM1 أو CBF؛ كان متوسط العمر 54 سنة، مع تراش 18–65 سنة.

تم التحقق من جودة هذه العينات من خلال الفحص المجهري. كما تم حساب النسبة النظرية المتوقعة لخلايا CD34⁺ في عينات نخاع العظم غير المخففة باستخدام صيغة برويمانز، وكانت النتائج >90٪ لجميع العينات. استخدمت هذه العينات لتحديد عتبات لتحليل LAIP/DfN وLSC ولحساب صيغة التخفيف والنقاء. تمت دراسة تغير المؤشرات المتوسطة في تعبير العلامات حسب حالة نخاع العظم لعينات متبرعة سليمة، والتهابية، وعينات نخاع العظم المتجددة (ملف تكميلي-الشكل S6). تم تحديد القيم المرجعية لأكثر المعلمات ملاءمة، بما في ذلك ٪MNC CD34⁺ من WBC، و٪P6 CD34⁺CD38⁻ في MNC CD34⁺، و٪P7 CD34⁺CD38^dim في MNC CD34⁺، و٪P8 CD34⁺CD38^مرتفع في MNC CD34⁺ (ملف تكميلي-شكل S6).

تقييم الحساسية والخطية

تم تقييم الحساسية لبوابات LAIP/DfN وبوابات LSC الخاصة بقياس عدد الأحداث غير الطبيعية في مجموعة من عينات نخاع العظم المرجعية، بما في ذلك نخاع العظم المتجدد، والالتهابي، والسليم من المتبرع. تم استخدام التخفيف التسلسلي لعدد معروف من الانفجارات في نخاع العظم السليم للتحقق من حد القياس والخطية لقياس MRD (الشكل 11 والشكل 12).

الشكل 1: استراتيجية البوابات لتحليل MRD LAIP في AML باستخدام علامات بدائية (CD34⁺/CD117⁺) في الأنبوب 1. الصف الأول: تقسيم الزمن التسلسلي، الخلايا الحية المبنية على FSC مقابل SSC، خلايا فردية تعتمد على FSC-W مقابل FSC-H، خلايا WBC CD45⁺ على CD45 مقابل SSC، انفجارات على CD45^dim/SSC، الخلايا أحادية النواة (MNC) على FSC-A/SSC-A، MNC CD34⁺ على مخطط CD45 مقابل CD34، وبوابة العلامة البدائية على مخطط CD34 مقابل CD117. الصفان الثاني والثالث: مخططات نقطية ثنائية المعيار ثابتة تستخدم لتعريف بوابات LAIP الأكثر صلة (LAIP1–LAIP8). تم تعريف MRD LAIP باستخدام الاستراتيجية البوليانية التالية: الزمن والخلايا الحية والخلايا المفردة AND (البلاستات أو MNC CD34⁺) والمؤشرات البدائية (CD34^+/−CD117^+/−) وLAIP1 وLAIP2 وLAIP3 وLAIP4 وLAIP5 وLAIP6 وLAIP7 وLAIP8. في الحالة المصورة، كان MRD 6.8٪ من WBC CD45⁺، مقارنة ب 0.04٪ ± 0.03 في نخاع العظم السليم. يمين: البوابة الخلفية لبوابة MRD النهائية المستخدمة في القياس، مما يسمح بتنظيف الأحداث غير المحددة، والخلايا السرية، والحطام. الاختصارات: AML = سرطان الدم النخاعي الحاد؛ MRD = مرض متبقي قابل للقياس؛ LAIP = نمط المناعة المرتبط بسرطان الدم؛ FSC = تشتت الأمامي; SSC = تشتت الجوانب; الدم الأبيض = خلايا الدم البيضاء؛ MNC = الخلايا أحادية النواة؛ hBM = نخاع عظم صحي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: استراتيجية البوابات لتحليل MRD LAIP في AML باستخدام الانفجارات الناضجة (CD34⁻CD117⁻) في الأنبوب 3. الصف الأول: تقسيم الزمن المتسلسل، الخلايا الحية المبنية على FSC مقابل SSC، الخلايا المفردة القائمة على FSC-W مقابل FSC-H، خلايا WBC CD45⁺ على CD45 مقابل SSC، انفجارات على CD45^خافت/SSC، الخلايا أحادية النواة (MNC) على FSC-A/SSC-A، MNC CD34⁺ على مخطط CD45 مقابل CD34، وبوابة الانفجار الناضجة في مخطط CD34 مقابل CD117.
الصفان الثاني والثالث: مخططات نقطية ثنائية المعيار ثابتة تستخدم لتعريف بوابات LAIP الأكثر صلة (LAIP1–LAIP8). تم تعريف MRD LAIP باستخدام الاستراتيجية البوليانية التالية: الزمن والخلايا الحية والخلايا المفردة والبلاستات وCD34⁻CD117⁻ والبلستات LAIP1 وLAIP2 وLAIP3 وLAIP4 وLAIP5 وLAIP6 وLAIP7 وLAIP8. في الحالة المصورة، كان MRD 15٪ من خلايا الدم البيضاء CD45⁺، مقارنة ب 0.09٪ ± 0.02 في نخاع العظم السليم.
يمين: البوابة الخلفية لبوابة MRD النهائية المستخدمة في القياس، مما يسمح بتنظيف الأحداث غير المحددة. الاختصارات: AML = سرطان الدم النخاعي الحاد؛ MRD = مرض متبقي قابل للقياس؛ LAIP = نمط المناعة المرتبط بسرطان الدم؛ FSC = تشتت الأمامي; SSC = تشتت الجوانب; الدم الأبيض = خلايا الدم البيضاء؛ MNC = الخلايا أحادية النواة؛ hBM = نخاع عظم صحي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: استراتيجية البوابة للخلايا الجذعية المكونة للدم الطبيعية (nHSCs) والخلايا الجذعية الغنية باللوكيميا (LSC) في جزء CD34⁺CD38⁻ (الأنبوب 2). (أ) الخلايا الجذعية المكونة للدم الطبيعية (nHSCs) و(ب) الخلايا الجذعية الغنية بالدم اللوكيمي (LSC) في الجزء CD34⁺CD38⁻ (الأنبوب 2). الصف الأول: تقسيم الزمن التسلسلي، الخلايا الحية القائمة على FSC مقابل SSC، الخلايا المفردة المبنية على FSC-W مقابل FSC-H، خلايا WBC CD45⁺ على CD45 مقابل SSC، البلاستات على CD45dim/SSC، الخلايا أحادية النواة (MNC) على FSC-A/SSC-A، وخلايا MNC CD34⁺ على مخطط CD45 مقابل CD34.
الصفوف من الثاني إلى الرابع: مخططات نقطية ثنائية المعيار ثابتة تستخدم لتعريف P6 (CD34⁺CD38⁻)، P7 (CD34⁺CD38^منخفض)، وP8 (CD34⁺CD38^مرتفع)، إلى جانب أكثر علامات LSC ثنائية الصلة، بما في ذلك MIX (CLL1/TIM3/CD97)، CD123، وCD45RA. تم تعريف MRD LSC باستخدام الاستراتيجية البوليانية التالية: الزمن والخلايا الحية والخلايا المفردة والبلاستات وMNC وMNC وMNC CD34+ وP6 و (P6 LSC MIX⁺ أو P6 LSC CD123⁺ أو P6 LSC CD45RA⁺).
يمين: البوابة الخلفية لبوابة MRD LSC النهائية المستخدمة في التكميم، مما يسمح بتنظيف الأحداث غير المحددة.
(أ) nHSCs في عينة صحية من نخاع العظم: nHSCs (الأحداث البنفسجية) كانت CD34⁺CD38⁻، MIX⁻ (CLL1/TIM3/CD97)، CD45RA⁻، CD123⁻، CD117⁺، HLA-DR⁺، CD36⁻، وCD90⁺. مثلت نسبة nHSC CD34⁺CD38⁻ 0.02٪ من نسبة CD45⁺ من خلية الدم البيضاء (WBC)، وكانت خلايا LSC CD34⁺CD38⁻ سلبية. كانت عتبات الفحص المبلغ عنها هي LOQ 0.0001٪ وLOD 0.001٪.
(B) الخلايا الغنية ب LSC في عينة AML: الخلايا الغنية ب LSC (الأحداث البرتقالية) كانت CD34⁺CD38⁻، MIX⁺ (CLL1/TIM3/CD97)، CD45RA⁺، CD123⁺، CD117⁺، HLA-DR⁺، CD36⁻، وCD90⁺. مثل نسبة LSC CD34⁺CD38⁻ 3.7٪ من نسبة WBC CD45⁺. الاختصارات: nHSCs = الخلايا الجذعية المكونة للدم الطبيعية؛ LSC = خلايا جذعية مصابة باللوكيميا؛ MNC = الخلايا أحادية النواة؛ الدم الأبيض = خلايا الدم البيضاء؛ SSC = تشتت الجوانب; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = مستضد كريات الدم البشرية-DR; LOQ = حد التكميم؛ LOD = حد الكشف. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: تعريف عتبة CD38⁻ في مجموعة CD34⁺ باستخدام قناة فلورية CD38 ناقص واحد (FMO). الصف الأول: تحديد مجموعات المرجع، بما في ذلك البلاسترات على خلايا CD45/SSC، وخلايا MNC CD19⁺ ، وخلايا MNC CD34⁺ .
الصف الثاني: مستوى الإشارة في قناة CD38 FMO. السطر الأول يعرض خلايا الانفجار، والسطر الثاني يعرض خلايا MNC CD19⁺ ، والسطر الثالث يعرض خلايا MNC CD34⁺ . الخط البرتقالي يشير إلى العتبة التي تحدد بوابة P6 CD34⁺CD38⁻ .
الصف الثالث: مستوى إشارة CD38 PE-Cy7. السطر الأول يظهر خلايا الانفجار، والسطر الثاني يظهر خلايا MNC CD19⁺ مع مستوى دموي CD38 المستخدم لتعريف P8 CD34⁺CD38^عالية، والسطر الثالث يظهر خلايا MNC CD34⁺ ، مع خلايا P6 CD34⁺CD38⁻ باللون البرتقالي، وP7 CD34⁺CD38^{خلايا منخفضة} باللون الأخضر، وP8 CD34⁺CD38^عالية خلايا زرقاء. الاختصارات: FMO = فلورة ناقص واحد؛ MNC = الخلايا أحادية النواة؛ SSC = تشتت الجوانب; PE-Cy7 = فيكوإيريثرين-سيانين 7; P6 = CD34+CD38− كسر; P7 = CD34+CD38 نسبة منخفضة؛ P8 = CD34+CD38 نسبة عالية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: تقييم تمثيل عينة نخاع العظم بناء على خلايا MNC CD34⁺. (أ) استراتيجية التداخل لخلايا MNC CD34⁺ والمعلمات المستخدمة في حساب الصيغة: n، عدد خلايا MNC CD34⁺؛ L، عدد خلايا WBC CD45⁺ s، نسبة خلايا MNC CD34⁺ في الدم المحيطي الطبيعي؛ ونسبة خلايا MNC CD34⁺ التي لوحظت في نخاع العظم الطبيعي المرجعي. (ب) تمثيل تخطيطي لتأثير تخفيف نخاع العظم بواسطة الدم المحيطي (PB) على أصل خلايا CD34⁺ في عينات BM. (ج) المعايير المستخدمة لتفسير نقاء الأخم الجنوي. الاختصارات: BM = نخاع العظم؛ PB = دم الطرفي؛ MNC = الخلايا أحادية النواة؛ كرات الدم البيضاء = خلايا الدم البيضاء. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: مقارنة أنماط التعبير عبر أربعة منصات قياس تدفق خلوي.
تم اختبار عينة نخاع العظم (BM) الطبيعية في نفس الوقت على أربع منصات قياس خلوي باستخدام الإعدادات المحددة لكل منصة وضبط المقياس. يظهر الصف الأول خلايا متعددة الجنسيات على مخطط CD45/CD33 المنقط؛ يظهر الصف الثاني خلايا MNC على مخطط النقطة CD34/CD117 البدائي للعلامة الأولية؛ الصف الثالث يظهر خلايا الانفجار على مخطط CD34/CD38 النقطي؛ ويظهر الصف الرابع خلايا P6 CD34⁺CD38⁻ على مخطط CD45RA/CD90 المنقط. الاختصارات: BM = نخاع العظم؛ MNC = الخلايا أحادية النواة؛ P6 = CD34⁺CD38⁻ كسر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: قابلية تكرار EQA في المختبرات الرطبة عبر مختبرات التدفق المشاركة. (أ) مخطط الكمان يوضح توزيع خلايا ٪P6 CD34⁺CD38⁻ في خلايا WBC CD45⁺ عبر خمس جولات EQA في المختبرات الرطبة ومختبرات التدفق المشاركة. (ب) مخطط الكمان الذي يوضح توزيع خلايا ٪MNC CD34⁺ في خلايا WBC CD45⁺ عبر خمس جولات EQA في المختبرات الرطبة ومختبرات التدفق المشاركة. الاختصارات: EQA = تقييم الجودة الخارجي؛ P6 = CD34+CD38− كسر; الدم الأبيض = خلايا الدم البيضاء؛ MNC = الخلايا أحادية النواة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 8: تقييم EQA الجاف لقياس LAIP/DfN وقياس MRD في LSC. (أ) تمرين EQA2017 جافة لقياس LAIP/DfN وLSC MRD باستخدام ستة ملفات FCS مشتركة من مجموعة لوحات مكونة من 8 ألوان، بما في ذلك تشخيص AML، وAML MRD، وملفات مرجعية طبيعية لنخاع العظم لتحليل أنبوب 1 LAIP وأنبوب 2 LSC. تم مشاركة التمرين مع 23 مختبرا مشاركا. (ب) تمرين EQA2024 جافة لقياس LAIP/DfN وLSC MRD باستخدام ستة ملفات FCS مشتركة من مجموعة لوحات مكونة من 12 لونا، بما في ذلك تشخيص AML، وAML MRD، وملفات مرجعية طبيعية لنخاع العظم لتحليل أنبوب 1 LAIP وأنبوب 2 LSC. تم مشاركة التمرين مع 24 مختبرا مشاركا. (ج) مقارنة بين المنصات بين خلايا ٪MNC CD34⁺ وخلايا ٪nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ في خلايا CD45⁺ التي تم قياسها خلال EQA2025 التخمير الرطب، وشاركت مع 25 مختبرا مشاركا. كانت القيم المتوقعة 1.6٪ لخلايا CD34⁺ في MNC و0.02٪ لخلايا nHSC P6 ^CD34+CD38⁻ . الاختصارات: EQA = تقييم الجودة الخارجي؛ LAIP = نمط المناعة المرتبط بسرطان الدم؛ DfN = مختلف عن الطبيعي؛ LSC = خلايا جذعية مصابة باللوكيميا؛ MRD = مرض متبقي قابل للقياس؛ FCS = معيار قياس خلوي التدفق؛ AML = لوكيميا النخاع الحادة؛ MNC = الخلايا أحادية النواة؛ nHSC = الخلايا الجذعية المكونة للدم الطبيعية؛ كرات الدم البيضاء = خلايا الدم البيضاء. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 9: قياس MRD التمثيلي باستخدام طرق LAIP/DfN. (أ) مثال على قياس MRD باستخدام طريقة LAIP/DfN. يظهر الجانب الأيسر رسم خرائط LAIP لخلايا اللوكيميا في عينة التشخيص، والجانب الأيمن يظهر تطبيق نفس رسم خرائط LAIP على العينة المتابعة، مع ظهور مجموعة MRD باللون الأسود. (ب) مثال على قياس MRD باستخدام طريقة DfN. كل زوج من مخططات النقاط يقارن نخاع العظم السليم (hBM؛ الرسم الطبيعي الأيسر) مع عينة نخاع العظم المتابعة لاضطراب العضلات المغناطيسية (DfN، الرسم الأيمن). يتم تعريف منطقة "الصندوق الفارغ" على نخاع العظم الطبيعي، ويتم تقييم وجود خلايا اللوكيميا في هذا الصندوق الفارغ في العينة المتابعة، مع عرض العدد غير الطبيعي باللون الأسود. الاختصارات: MRD = مرض متبقي قابل للقياس؛ LAIP = نمط المناعة المرتبط بسرطان الدم؛ DfN = مختلف عن الطبيعي؛ hBM = نخاع عظم صحي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 10: القياس التمثيلي للخلايا الغنية ب CD34⁺CD38⁻ عند التشخيص والمتابعة. (أ) مثال على قياس الخلايا الغنية ب LSC في عينة تشخيص AML. يظهر الجانب الأيسر الملف التعريفي المثرى ب LSC، مع مجموعة برتقالية تعبر عن MIX (CLL1/TIM3/CD97)، CD123، CD45RA، CD117، HLA-DR، وCD36 ضمن نسبة CD34⁺CD38⁻ .
(ب) عينة متابعة من نفس المريض تظهر استمرارية خلايا غنية ب MRD LSC بنفس الملف المناعي النمطي (مجموعة برتقالية). الاختصارات: LSC = الخلايا الجذعية اللوكيمية؛ AML = لوكيميا النخاع الحادة؛ MRD = مرض متبقي قابل للقياس؛ MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = مستضد كريات الدم البيضاء البشرية-DR. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 11: الحساسية التحليلية لاكتشاف LSC. (أ) تقييم حد الفراغ (LOB) لاكتشاف LSC. يظهر الجانب الأيسر قياس أحداث CD34⁺CD38⁻ في دمج خمسة ملفات FCS من خمس عينات صحية من نخاع العظم (تم الحصول على 5,148,000 حدث من خلايا الدم البيضاء المكتسب). يظهر الجانب الأيمن عدد الأحداث التي تنتمي إلى بوابة LSC البوليانية الخلفية على مخطط CD45/SSC النقطي (14 حدثا)، وهو ما يعادل LOB بنسبة <0.0005٪ (5 × ^10-6). (ب) تقييم الخطية لقياس LSC. يظهر الجانب الأيسر تخفيفا تسلسليا عن طريق زيادة الخلايا الغنية ب LSC في عينة نخاع عظم سليمة. يظهر الجانب الأيمن العلاقة بين قيم MRD المقاسة والقيم النظرية، والتي تتوافق مع حد القياس (LOQ) 2 × ^10-5 (0.002٪). الاختصارات: LSC = الخلايا الجذعية اللوكيمية؛ LOB = حد الفراغ؛ FCS = معيار قياس خلوي التدفق؛ الدم الأبيض = خلايا الدم البيضاء؛ MRD = مرض متبقي قابل للقياس؛ LOQ = حد التكميم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 12: الخطية ونطاق القياس لقياس MRD LAIP. (أ) تقييم الخطية لقياس MRD LAIP عن طريق التخفيف التسلسلي للانفجارات ذات LAIPs المختلفة في نخاع العظم السليم، مع إظهار الارتباط بين قيم MRD المقيسة والقيم النظرية، مع وجود LOQ متغير حسب LAIP المختلفة وLOQ <0.1٪). (ب) نطاق القياس وفقا لأنماط LAIP المختلفة. يشير الخط الأحمر إلى عتبة سريرية بنسبة 0.1٪. وصلت قائمة الرؤية إلى الحد السريري لجميع عمليات التحليل الوظيفي المختبرة. الاختصارات: MRD = مرض متبقي قابل للقياس؛ LAIP = نمط المناعة المرتبط بسرطان الدم؛ LOQ = حد التكميم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

فلورو كروم	الذروة	LYRIC12c	الذروة	DxFlex13c	الذروة	NAVIOS10c	الذروة	CANTO8c
FITC	P8	44618	P6	89916	P7	104	P8	56316
التربية البدنية	P8	84008	P6	110652	P7	136	P8	88803
تطوير الوجوع	x	x	P6	153011	P7	150	x	x
PerCPcy5,5 /PEcy5,5	P7	63610	P6	101791	P7	85	P7	75717
PC7/PEcy7	P8	32412	P6	21381	P8	88	P8	32003
ناقل الحركة الجنوية	P7	111628	P6	192708	P6	181	P7	143946
AA700/AP CR700	P7	25958	P6	237374	P7	182	x	x
A7A750/ APCH7	P8	77444	P6	158729	P7	150	P8	98311
BV421	P6	62031	P6	239208	P6	268	P6	68315
KO/V500	P7	159941	P6	293917	P6	179	P7	124919
BV605	P7	31688	P6	65337	x	x	x	x
BV711/ V660	P8	21816	P6	12107	x	x	x	x
BV786	P8	17560	P6	3795	x	x	x	x

الجدول 1: القيم المستهدفة لكل منصة باستخدام خرزات قوس قزح ذات 8 قمم. تعرض قيم الأهداف المحددة لكل منصة جهاز قياس خلوي (كانتو، ليريك، نافيوس، DxFlex). تم اختيار القمم المحتجزة لتكون قريبة من المؤشر المغناطيسي الملحوظ لخلايا الانفجار. وهذا مهم بشكل خاص لمقاييس الخلايا القائمة على PMT، حيث لا تزداد شدة الإشارة خطيا مع زيادة جهد PMT. على النقيض من ذلك، في أجهزة قياس الخلايا المعتمدة على APD، تزداد شدة الإشارة بشكل خطي مع الكسب، مما يسمح باستخدام نفس القمة لجميع الكواشف، بينما تتطلب قمم مختلفة لكل قناة في أجهزة قياس الخلايا المعتمدة على PMT. الاختصارات: MFI = شدة الفلورة الوسيطة؛ PMT = أنبوب مضاعف الضوئي; APD = صمام الانهيار الجليدي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

النشيد 8C /نافيوس 8c

FITC

التربية البدنية

تطوير الوجوع

PerCPC y5,5

PECy7

ناقل الحركة الجنوية

APC-R700 /AA700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

أنبوب 1 LAIP 8c

CD7 5 ميكرولتر /CD56 5 ميكرولتر

CD13 5 ميكرولتر

CD33 10 ميكرولتر

CD38 5 ميكرولتر

CD34 5 ميكرولتر

CD19 5 ميكرولتر

CD117 5 ميكرولتر

CD45 5 ميكرولتر

أنبوب 2 LSC 8c

CD90 5 ميكرولتر

MIX3(2) .5 ميكرولتر/أك)

CD123 5 ميكرولتر

CD38 5 ميكرولتر

CD34 5 ميكرولتر

CD45RA 5 ميكرولتر

CD117 5 ميكرولتر

CD45 5 ميكرولتر

T3 سوبل مينتير غراند 8c

CD15 5 ميكرولتر

CD56 5 ميكرولتر

HLADR 10 ميكرولتر

CD38 5 ميكرولتر

CD34 5 ميكرولتر

CD11b 5μL

CD117 5 ميكرولتر

CD45 5 ميكرولتر

T3 سوبلم entaire - مونوس 8c

CD36 5 ميكرولتر

CD64 5 ميكرولتر

CD14 10 ميكرولتر

HLADR 5μL

CD34 5 ميكرولتر

CD4 5μL

CD117 5 ميكرولتر

CD45 5 ميكرولتر

MIX3Ac =97 +TIM3+ CLL1

الكلمات 10-12c

FITC

التربية البدنية

تطوير الوجوع

PerCPCy5,5

PECy7

ناقل الحركة الجنوية

APC-R700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

أنبوب 1LAIP 12c

CD7 5 ميكرولتر

CD13 5 ميكرولتر

CD33 10 ميكرولتر

CD38 5 ميكرولتر

CD34 5 ميكرولتر

HLADR (5 ميكرولتر)

CD19 5 ميكرولتر

CD117 5 ميكرولتر

CD45 5 ميكرولتر

CD56 5 ميكرولتر

CD10 2 ميكرولتر

CD36 2 ميكرولتر

أنبوب 2 LSC 12c

CD90 5 ميكرولتر

MIX3(2. 5 ميكرولتر/مكيب)

CD123 5 ميكرولتر

CD38 5 ميكرولتر

CD34 5 ميكرولتر

HLADR (5 ميكرولتر)

CD45RA 5 ميكرولتر

CD117 5 ميكرولتر

CD45 5 ميكرولتر

CD200 5 ميكرولتر

CD19 5 ميكرولتر

CD36 2 ميكرولتر

T3 سوبل مينتير 12c-مونو

CD15 5 ميكرولتر

CD64 5 ميكرولتر

CD33 10 ميكرولتر

CD38 5 ميكرولتر

CD34 5 ميكرولتر

HLADR (5 ميكرولتر)

CD4 5μL

CD117 5 ميكرولتر

CD45 5 ميكرولتر

CD14 5 ميكرولتر

CD11b 5μL

CD36 2 ميكرولتر

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

نافيوس 10c

FITC

التربية البدنية

تطوير الوجوع

PEcy5,5

PECy7

ناقل الحركة الجنوية

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV711

BV786

T1 نافيوس 10c

CD7 10 ميكرولتر

CD13 10 ميكرولتر

HLADR 5μL

CD33 5 ميكرولتر

CD38 5 ميكرولتر

CD34 5 ميكرولتر

CD56 10 ميكرولتر

CD19 5 ميكرولتر

CD117 5 ميكرولتر

CD45 5 ميكرولتر

T2 نافيوس 10c

CD90 5 ميكرولتر

MIX3(2.5) μL/AC)

CD19 5 ميكرولتر

CD123 5 ميكرولتر

CD38 5 ميكرولتر

CD34 5 ميكرولتر

CD36 5 ميكرولتر

CD45RA 5 ميكرولتر

CD117 5 ميكرولتر

CD45 5 ميكرولتر

T3 سوبل مينتير 10c مونو

CD15 5 ميكرولتر

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5 ميكرولتر

CD11b 5μL

CD34 5 ميكرولتر

CD36 5 ميكرولتر

CD14 5 ميكرولتر

CD117 5 ميكرولتر

CD45 5 ميكرولتر

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

DxFLEX 10 -12/13ج

FITC

التربية البدنية

تطوير الوجوع

PEcy5,5

PECy7

ناقل الحركة الجنوية

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV650

BV786

T1 DxFLEX 12-13c

CD7 10 ميكرولتر

CD13 10 ميكرولتر

HLADR 5μL

CD33 5 ميكرولتر

CD38 5 ميكرولتر

CD34 5 ميكرولتر

CD56 10 ميكرولتر

CD19 5 ميكرولتر

CD117 5 ميكرولتر

CD45 5 ميكرولتر

CD36 5 ميكرولتر

CD10 2 ميكرولتر

/

T2 DxFLEX 12-13c

CD90 5 ميكرولتر

MIX3(2.5) μL/AC)

CD19 5 ميكرولتر

CD123 5 ميكرولتر

CD38 5 ميكرولتر

CD34 5 ميكرولتر

CD36 5 ميكرولتر

CD45RA 5 ميكرولتر

CD117 5 ميكرولتر

CD45 5 ميكرولتر

/

CD200 5 ميكرولتر

HLADR snv786 (3μL)

T3 سوبل مينتير 12c مونو

CD15 5 ميكرولتر

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5 ميكرولتر

CD38 5 ميكرولتر

CD34 5 ميكرولتر

CD36 5 ميكرولتر

CD14 5 ميكرولتر

CD117 5 ميكرولتر

CD45 5 ميكرولتر

CD64 5 ميكرولتر

CD11b 5μL

/

الجدول 2: تكوينات لوحات الأجسام المضادة لتحليل AML MRD LAIP/DFN وLSC. يلخص الجدول تكوينات الألواح ذات 8 و10 و12 و13 لونا وفقا لمنصة جهاز قياس السيتومتر. يستخدم الأنبوب 1 لتحليل LAIP/DfN، والأنبوب 2 لتحليل الخلايا الغنية ب LSC في CD34⁺CD38⁻ ، وأنبوب 3 لمؤشرات التمايز أحادي الخلية/الحبيبية. يتم عرض أحجام الأجسام المضادة وتوزيع الفلوروكروم لكل منصة. MIX3 يتوافق مع CD97 وTIM3 وCLL1. الاختصارات: AML = سرطان الدم النخاعي الحاد؛ MRD = مرض متبقي قابل للقياس؛ LAIP = نمط المناعة المرتبط بسرطان الدم؛ DfN = مختلف عن الطبيعي؛ LSC = خلايا جذعية مصابة باللوكيميا؛ MIX3 = CD97/TIM3/CLL1. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

فقدان كامل للعلامات المعبر عنها بشكل طبيعي على السلفات النقاعية

CD13++CD33-/CD34+ أو CD117+

CD13-CD33++/CD34+ أو CD117+

CD13+HLADR-/CD34+

CD13+CD117+CD34-

تعبير علامة لمفاوية عبر السلالة على المؤشرات الميلويدية

CD7+CD13+/CD34+ أو CD117+

CD7+CD33+/ CD34+ أو CD117+

CD56+CD13+/ CD34+ أو CD117+

CD56+CD33+/ CD34+ أو CD117+

CD19+CD117+/ أو CD13+ أو CD33+

الإفراط في التعبير على المواد السابقة النخاعية

CD34++/CD117+

CD117++/CD13+CD33+

انخفاض التعبير على المواد السلفية النخاعية

CD38loCD34+CD33+CD117+

الجدول 3: تعريفات DfN "الصندوق الفارغ" المبنية على LAIP. يسرد الجدول أنماط "صندوق فارغ" مختلفة عن الطبيعي (DfN) المحددة مسبقا تستخدم لتحديد تجمعات السلف الميلويدي غير الطبيعية. تشمل الفئات فقدان العلامات الطبيعية، والتعبير المفرط عن علامات العلامة اللمفاوية عبر السلالات، وزيادة التعبير عن العلامات، وانخفاض تعبير العلامات على المؤشرات السابقة النخاعية. الاختصارات: LAIP = نمط المناعة المرتبط باللوكيميا؛ DfN = مختلف عن الطبيعي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

هولدرينت وآخرون 17
برولمانز وآخرون 15
نقاء نخاع العظم = (1 − (GR MO/GRSG) × (GBSG/GB MO)) × 100	>80٪
بيورلوند وآخرون 19	المعدل التراكمي > 15٪
	الدائرة الثالثة < 20٪
لوكن وآخرون. 18	أعلى < 30٪ في اليوم السادس عشر
ثيونيسن وآخرون؛ Dworzak وآخرون. 21
التدفق أو Ctr DIL الخلوي: PNN < 40٪، Ebl > 5٪، Ly < 20٪	CD16++ CD11b++ < 40٪
	المعدل التراكمي > 5٪
	الدائرة الثالثة < 20٪
نقاء BM: MNC 34+/WBC45+	نقاء BM 100-10٪

الجدول 4: طرق التحكم في تخفيف نخاع العظم لتقرير تدفق اضطراب النخاع المعدني الداخلي. يلخص الجدول طرق تخفيف نخاع العظم والتحكم في التمثيل المنشورة التي قد تستخدم في التقارير السريرية لتدفق نخاع العظم الغناني العضلي السريري. يجب تطبيق طريقة واحدة على الأقل للتحكم في التخفيف لدعم تفسير نتائج MRD. يتم تضمين نهج نقاء نخاع العظم CD34/^WBC45+ كتقييم جودة تكميلي. الاختصارات: AML = سرطان الدم النخاعي الحاد؛ MRD = مرض متبقي قابل للقياس؛ BM = نخاع العظم; الدم الأبيض = خلايا الدم البيضاء؛ CD34/WBC45⁺ = خلايا CD34⁺ بين خلايا الدم البيضاء CD45⁺ . يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الملف التكميلي 1: خلفية إضافية، توحيد المنصة، نخاع العظم المرجعي، ومواد دعم التنبؤ. يحتوي هذا الملف التكميلي على أشكال وجداول داعمة تتعلق بتحديد LSC، وتباين النمطي الظاهري في AML، والنسخ بين المنصات، والتحسين الخاص بالمنصة، وملفات تعريف علامات نخاع العظم المرجعية، وتطور اللوحات الطولية، والعتبة التنبؤية المستخدمة لقياس LSC عند التشخيص. توفر هذه المواد سياقا إضافيا لسير عمل قياس تدفق MRD متعدد المراكز، بما في ذلك مبررات تقييم الخلايا المغنية ب LSC ل CD34⁺CD38⁻ ، والأساس التقني لتناغم المنصات، والبيانات الداعمة المستخدمة لتفسير خلفية النخاع المرجعي، وترحيل الألواح، واختيار العتبة السريرية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

خطوات حاسمة في البروتوكول

جودة العينة ضرورية لقياس دقيق لقياس MRD وLSC بدقة. يجب نقل عينات نخاع العظم الطازجة في درجة حرارة الغرفة ومعالجتها بشكل مثالي خلال 24–48 ساعة، وإذا لزم الأمر، خلال 72 ساعة بعد الجمع²³ ساعة. يجب تقييم التخفيف الدموي في كل نقطة زمنية وإدراجه في تقرير التدفق السريري. يجب على الطبيب تحديد وقت العلاج، على سبيل المثال، بعد التحفيز، التثبيت، العلاج المناعي المستهدف، العلاج الأقل كثافة مثل الأزاسيتيدين/فينيتوكلاكس، أو اللوغرافة. يرتبط مشهد التمايز ارتباطا وثيقا بالعلاج ونقطة الزمن، ومن المهم دمجه في تفسير MRD. خلال المتابعة الطولية، يجب الحفاظ على نفس حساسية الجهاز وموثوقية التحليل من خلال الفحوصات المنتظمة لقيم الأهداف باستخدام خرزات التحكم بألوان قوس قزح، وتقييم العين العاطفية المنتظمة، والمراجعة الجماعية لملفات FCS طوال الدراسة.

يتم الحفاظ على مستوى عال من التوحيد القياسي والموثوقية بين المراكز لقياس تدفق MRD من خلال التدريب التعليمي المنتظم عبر الإنترنت في مجموعة التدفق. تم إجراء جلسة تدريب ويب واحدة على الأقل شهريا، وتمت مناقشة ومراجعة أكثر من 100 حالة من MRD LAIP/DfN، MRD LSC، أو قياس التشخيص لمركز LSC خلال هذه السنوات. يعد هذا التعليم المستمر مهما لأن تفسير بيانات التدفق يتطلب عالم أحياء مؤهل تأهيلا عاليا، خصوصا للاضطرابات النسبية المنخفضة المستوى من الرجال، ومجموعات الخلفية الفسيولوجية، والنخاع المتجدد، والمفاتيح الظاهرية تحت العلاج.

يعد قياس التجمعات الغنية ب CD34⁺CD38⁻ خطوة حاسمة أخرى. لا يوجد مؤشر عالمي لالتقاط الخلايا الجذعية المكونة للدم أو LSCs الطبيعية. قدمت مجموعة HOVON مراقبة LSC في تشخيص ومتابعة AML باستخدام لوحة من 8 ألوان تشمل مجموعة من علامات LSC "الثنائية" ذات الصلة³. تعرف العلامات ثنائية الشكل بأنها لا تظهر أي تعبير في الخلايا الجذعية المكونة للدم الطبيعية ولكن تعبيرا إيجابيا في المجموعات الغنية ب LSC، مع أنماط خافتة أو متوسطة أو عالية أو غير متجانسة أو ثنائية النمط. هناك اهتمام بإدراج مزيج من علامات LSC ثنائية النمط محددة، مثل CLL1 وTIM3 وCD97، في قناة واحدة، لأنه إذا كان واحد فقط إيجابيا، يمكن الكشف عن الخلايا الغنية ب LSC. يجب استخدام علامات أخرى بشكل منفصل في قنوات محددة لأن تعبيرها قد يتداخل مع تعبير الخلايا الجذعية المكونة للدم الطبيعية، حسب حالة نخاع العظم، بما في ذلك النخاع²⁴ المتجدد أو المجهد. التعريف الكامل للخلايا الغنية ب LSC يعتمد على مؤثرات بوليانية، بما في ذلك التعبير الشاذ للعلامات في نسبة CD34⁺CD38⁻ . ونظرا لأن هذا يبقى تعريفا ظاهريا، يجب تفسير المجموعة كخلايا غنية ب LSC من CD34⁺CD38⁻ بدلا من أن تكون خلايا LSC مثبتة وظيفيا في كل عينة. هذا اللوحة للسرطان المنخفض قابلة للتطبيق أيضا على المرضى المصابين بمتلازمة الالتهاب المفرط مع زيادة الضربات وعلاج AML MRC باستخدام نفس البروتوكول.

التعديلات واستكشاف الأخطاء في الطريقة

خلال تطور المنصات واللوحات، يجب الحفاظ على نهج التوحيد والتوحيد داخل شبكة المختبرات، خاصة عند الانتقال من ألواح ب 8 إلى 10 ألوان إلى 12 إلى 13 لونا. مع تطور الآلات، هناك حاجة للحفاظ على عمود فقري مشترك للأجسام المضادة ونفس الحساسية في اكتشاف الشذوذات الظاهرية طوال الدراسة السريرية. خلال تطور المنصة، تبقى فلوروكرومات الأجسام المضادة في العمود الفقري مستقرة وشائعة عبر جميع الأجهزة (CD34/CD38/CD45/CD117). ومع ذلك، بالنسبة لبعض القنوات، يكون من الضروري تغيير الفلوروكروم بسبب البنك البصري الخاص بالآلة، والذي يتطلب نهج التوافق. عند الانتقال من جهاز قياس خلوي كاشف PMT إلى مقياس خلوي كاشف APD، يجب أخذ الحساسية العالية لكواشف APD عند الأطوال الموجية العالية في الاعتبار. لذلك، في بعض الحالات، يجب تعديل اختيار الفلوروكروم لبعض الأجسام المضادة للحفاظ على نفس مؤشر التلوين وتجنب الانتشار المفرط بين القنوات، وبالتالي اعتماد نهج التحسين. تدعم أجهزة قياس الخلايا السريرية الحالية لوحات من 12 إلى 13 لونا، مما يزيد من الخصوصية في اكتشاف LAIP ويحسن التفسير من خلال إضافة علامات تقضي على الخلايا الملوثة في بوابة MRD. ومع ذلك، هذا يزيد أيضا من تعقيد التحليل²³.

الترقية من الألواح ذات 8 ألوان إلى 12 لونا حسنت حساسية وخصوصية تقييم MRD في بعض الحالات (الملف التكميلي 1). في الأنبوب 1، أضيفت HLA-DR، CD36، CD10، وCD56، منفصلة عن CD7. في الأنبوب 2، أضيفت HLA-DR، CD36، CD200، وCD19. في الأنبوب 3، تم إضافة CD4، CD64، CD38، CD36، وCD14. HLA-DR، الذي تم دمجه الآن بشكل منهجي مع CD38 في كل أنبوب، يوفر تعريفا أوضح ل LAIP وأنماط التمايز المعدلة. يعد CD36، الذي يدرج الآن بشكل منهجي في كل أنبوب، علامة رئيسية لتحديد الخلايا الحمراء، وخلايا الدم الحمراء، والصفائح الدموية، والحطام، ولتحسين بوابة MRD النهائية. يساعد CD19 في أنبوب LSC أيضا في تحديد الدموجينات. الجمع بين علامات تمايز الخلايا الأحادية والحبيبية في أنبوب واحد يسمح بتحديد أنماط التمايز أحادية الخلية والحبيبية بشكل أفضل ويساعد في تمييز الشذوذات لتحديد LAIP. عند الانتقال من الألواح ذات 8 ألوان إلى 10 ألوان، جاء التحسن الرئيسي من اكتشاف LAIP، خاصة مع إضافة HLA-DR وCD56 المنفصلين عن CD7 في الأنبوب 1 وHLA-DR وCD19 في الأنبوب 2. عند الانتقال من ألواح بعشرة ألوان إلى 12 لونا، جاء التحسن من تنظيف أفضل لبوابات النفخ وLSC مع إضافة CD36 في كل أنبوب، وتم الانتهاء من CD10 في الأنبوب 1 وCD200 في الأنبوب 2. كان هذا مفيدا بشكل خاص للمرضى الذين يعانون من MRD منخفض المستوى فوق حد الكشف ولكن تحت حدود القياس. عند الأخذ معا، معظم المرضى الذين لديهم إيجابية MRD عند الحد السريري ≥ 0.1٪ تم تحديدهم بالفعل باستخدام لوحة 8 ألوان؛ ومع ذلك، فإن استخدام المزيد من العلامات في الأنابيب حسن من الخصوصية وتفسير تقييم MRD، خاصة للحساسية المنخفضة المستوى كما هو مذكور في إرشادات ELN 2025.

قيود الطريقة

اختيار نهج متعدد المراكز قد يكون تحديا. تتطلب جدوى هذا المفهوم خطوات إلزامية قبل تنفيذ تدفق MRD في التجارب السريرية لغسل غسل السوق: توحيد حساسية الجهاز وتحضير العينات، والتدريب والتعليم المنهجي لمشغلي التحليل²⁵. مع تطور المنصات، يجب تكييف استراتيجية المراكز المتعددة والمنصات للحفاظ على متانة وقابلية تكرار النتائج. يشمل ذلك التوحيد القياسي، واستخدام نفس اللوحة والإعدادات لنفس نوع المنصة؛ التوحيد باستخدام نفس اللوحة عبر منصات متعددة مع إعدادات متناغمة؛ والتحسين، باستخدام لوحة وإعدادات محددة معدلة لكل منصة.

يعد التخفيف من أكثر النقاط تحديا وأهمية لقياس تدفق MRD. يجب استخدام صيغة تمثيل CD34/WBC الموضحة في هذا البروتوكول كمقياس تكميلي لضبط الجودة لعينة نخاع العظم، ولا ينبغي استخدامها لتطبيع نتائج MRD. قد يتأثر تفسيره بتجدد النخاع، وتأثيرات العلاج، وبقايا المرض، والأنظمة الأقل كثافة. وبالمثل، لا ينبغي تفسير علامات مثل CD56 وCD123 وCD45RA كعلامات DfN أو LSC مستقلة. يجب تفسيرها ضمن استراتيجية البوابات الكاملة، وبوابات التنظيف، وخلفية نخاع العظم المرجعية، والسياق السريري.

أهمية الطريقة بالنسبة للطرق الحالية أو البديلة

وفقا لإرشادات ELN 2025، يعد MRD علامة تنبؤية رئيسية لدى مرضى AML، بغض النظر عن طريقة أو توقيت التقييم. استخدام تقنيات ومؤشرات تدفق MRD المختلفة يكمل بعضها البعض بشكل كبير. يعد تحليل MRD متعدد الوسائط، بما في ذلك تحليل LAIP/DfN وLSC، مفيدا بشرط أن يتم التحليل ضمن شبكة موحدة مع تقارير متناسقة للنتائج. تقييم MRD يسمح بتعريف أفضل للاستجابة العلاجية والانتكاس. سيلعب تدفق MRD متعدد المراكز ومتعدد الوسائط، إلى جانب MRD الجزيئي، دورا استراتيجيا في التجارب السريرية المستقبلية ضمن بيئة علاجية متزايدة التعقيد تشمل علاجات مستهدفة جديدة، وعلاجات من الخط الأول والثاني، والزراعة التطورية، والعلاجات منخفضة الشدة.

أهمية وتطبيقات هذه الطريقة في مجالات بحثية محددة

أفادت مجموعتا HOVON وALFA أن قياس كمية السكان المحصنين ب CD34⁺CD38⁻ الغنية ب LSC عند تشخيص AML له تأثير سريري (الملف التكميلي 1). يبدو من الضروري تحديد عتبات ذات دلالة سريرية لمنطقة LSC بناء على طريقة القياس. كما تم الإبلاغ عنه سابقا باستخدام الطريقة الموضحة هنا، كان عتبة LSC ≥1٪ مرتبطة بنتيجة غير مواتية (الملف التكميلي 1)²⁶. في إدارة AML، قد يساعد التكامل التفريقي بين MRD، ومراقبة LSC، وتداخل الدم النسيلي، في تحسين التفسير العلاجي. التحدي الرئيسي يكمن في التمييز بين MRD، الذي قد يتطلب علاجا إضافيا، عن النسخ المستقرة قبل اللوكيمية، والتي قد لا تكون²⁷. تم التوصية مؤخرا بنظام تقارير متكامل لحساب نسبة الانفجارات لمتابعة مكافحة غسل الأموال في إرشادات EHA/ELN^{لعام 2025 28}. يدمج نتائج MRD مع المقارنة الشكلية لتقييم موحد للبلاسترات ويسهل التقارير المتسقة في التجارب السريرية لتحديد فئات الاستجابة لدى مرضى AML.

تظهر كل من دراسة HOVON ودراسة ALFA/FILO BIG1 أن درجة تجمع بين نهجي LAIP/DfN وLSC سمحت بتصنيف المرضى إلى أربع مجموعات: LAIP⁻/LSC⁻، LAIP⁺/LSC⁻، LAIP⁻/LSC⁺، وLAIP⁺/LSC⁺، مع معدلات بقاء إجمالية مختلفة خلال 3 سنوات ^3,26,29. بشكل عام، توضح هذه النتائج التأثير التنبؤي السريري لمزيج MRD LAIP/DfN وحالة LSC. في سياق زراعة الخلايا الجذعية المكونة للدموية الألوجينية، تم الإبلاغ أيضا عن وجود خلايا غنية ب CD34⁺CD38⁻ ب LSC كمؤشر على فشل ما بعد الزراعة، حتى عندما يكون العدد الإجمالي للانفجارات أقل من 5٪³⁰. تدعم هذه البيانات السريرية أهمية استراتيجيات تدفق الديناميكيات المجمعة بين الأبحاث الذهنية، لكن البروتوكول الحالي يركز على توحيد سير العمل التقني والتقارير عبر المراكز.

كوافى، قد توسع تقنية التدفق الطيفي نطاق المؤشرات التي يتم اختبارها في نفس الوقت في نهج قياس خلوي متعدد الأبعاد، مما يزيد من خصوصية المؤشرات المراقبة ويقلل من الضوضاء الخلفية البيولوجية الناتجة عن التجدد المكون للدم. سيكون تقييم قابلية تكرار التدفق الطيفي عبر المنصات واللوحات والمراكز، كما هو مقترح هنا، تحديا للتنفيذ السريري. قد تسهل خوارزميات التحليل غير المراقب الجديدة، بما في ذلك FlowSOM وt-SNE وUMAP، التمييز بين تتكون الدم الطبيعي وحجرة اللوكيميا، من الجزء الغني ب LSC من CD34⁺CD38⁻ إلى كتلة الانفجار. التقاط أجزاء LSC بشكل أعمق قد يساعد في تحسين مراقبة الزرع في نماذج الزينوغرافات المشتقة من المرضى^31,32. تم إنشاء مجموعات عمل ELN للتحقق من صحة هذه الأساليب الجديدة وتوحيدها ^33,34.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Antibodies (CANTO 8C-LYRIC12C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7	FITC	BD Bioscience	332773
CD13	PE	BD Bioscience	347406
CD33	PerCPCy5,5	BD Bioscience	333146
CD117	BV421	BD Bioscience	563856
CD38	PeCy7	BD Bioscience	335825
CD34	APC	BD Bioscience	345804
CD45RA	APCH7	BD Pharmingen	560674
CD19	APCH7	BD Bioscience	641395
CD45	V500	BD Bioscience	560777
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PerCPcy5.5	BD Pharmingen	558714
CD15	FITC	BD Bioscience	332778
CD64	PE	BD Pharmingen	558592
CD11b	BV711	BD Bioscience	740771
CD4	APCH7	BD Bioscience	641398
HLADR	APC-R700	BD Horizon	565127
CD56	BV605	BD Horizon	562780
CD14	BV605	BD Horizon	564054
CD200	BV605	BD Biosciences	562853
CD10	BV711	BD Biosciences	740770
CD36	BV786	BD Biosciences	745554
CD19	BV711	BD Biosciences	563036
Antibodies (NAVIOS 10C/DxFlex 12C/13C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7 FITC	FITC	BC iotest	A07755
CD13	PE	BC iotest	A07762
CD33	PC5.5	BC iotest	B36289
CD117	SNV428	BC iotest	C76813
CD38	PEcy7	BDBioscience	335825
CD34	APC	BC iotest	IM2472
CD45RA	APCH7	BDBioscience	560674
CD19	AA750	BC iotest	A94681
CD45	KromeOrange	BC iotest	B36294
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PC5.5	BC iotest	B20022
HLADR	ECD	BC iotest	B92438
CD36	AA700	BC iotest	B46022
CD19	ECD	BC iotest	A07770
CD4	PE	BC iotest	A07751
CD11b	BV650	Bdhorizon	569704
CD14	AA750	BC iotest	B92421
HLADR	SNV786	BC iotest	C78087
CD56	AA700	BC iotest	B92446
CD64	BV605	Bdoptibuild	569172
CD36	BV605	BD Horizon	563518
CD10	BV650	Bdoptibuild	745390
CD15	FITC	BD	332778
CD200	BV650	Bdoptibuild	743085
BD FACSCanto II  (8-color, blue/red/violet)		BD Bioscience	338962
BD FACSLyric 3-Laser 12-Color Instrument		BD Bioscience	662383
BC NAVIOSNavios 10 Colors, 3 Lasers, B5-R3-V2 Configuration		Beckman Coulter	B47905
BC DxFLEX  13-Colors, 13 Detectors, 3 Laser,  B5-R3-V5		Beckman Coulter	C78505
BC Kaluza Software v 3.1		Bekman Coulter	A82959
BD FACSuite Software v1.6		BD  Bioscience	651360
BD FACSDiva software v 8.0.3 (Win 7 32 bit OS)		BD  Bioscience	659523
BD CST Beads		BD  Bioscience	656505
Multicolor COMPBEADS		BD  Bioscience	552843
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks), 3.0 - 3.4 µm		BD  Bioscience	559123
ClearL Lab Compensation Beads		Beckman Coulter	B99883
PharmLyse NH4Cl 100ml10x conc		BD  Bioscience	555899
DPBS, 1X		CORNING	21-031-CV
Brillant Stain Buffer Plus		BD  Bioscience	566385
MGG (May-Grünwald-Giemsa)		Sigma Aldrich	1014242500