تصوير فوتونيين في الوقت الحقيقي لأيض NAD+ بطانة الدماغ في الفئران

ملخص

يتيح هذا البروتوكول المراقبة الفورية لأيض نيكوتيناميد أدينين ثنائي نيوكليوتيد بطانة الدماغ في الفئران الحية باستخدام التعبير الحيوي المستهدف للبطانة، وتحضير نافذة الجمجمة، والتصوير بفوتونين.

الملخص

نقدم سير عمل قابل للتكرار لرؤية استجابات قناة النيوتيناميد أدينين ثنائي النيوكليوتيد (^NAD+) في خلايا بطانة الدماغ الدقيقة الوعائية في الفئران الحية باستخدام مجهر ثنائي فوتون بنافذة الجمجمة ومستشعر NAD⁺ فلوري موجه للبطانة. يشمل البروتوكول (1) التعبير الانتقائي بوساطة الفيروسات الملحقة (AAV) لحساس NAD⁺ في بطانة الأوعية الدموية الدماغية باستخدام AAV-X1.1 تحت محفز Cdh5 (كاديرين بطانة الأوعية الدموية)، (2) تحضير جراحي لنافذة قشرية قشرية مستقرة بقطر 3 مم × 3 مم، و(3) تصوير ثنائي الطول الموجي لالتقاط إشارة قناة المستشعر الخضراء المثارة بتردد 920 نانومتر، و1040 نانومتر داخل الأوعية الدموية المثيرة رباعي ميثيلرودامين (TMR)–ديكستران قناة مرجعية. توفر قناة TMR–dextran مرجعا للفجوة الوعائية وتدعم اختيار الأوعية، وتقييم الحركة، وتقييم سلامة الأوعية الدموية. كمثال تطبيقي، نصف التغيرات المرتبطة بالنيكوتيناميد مونونيوكليوتيد في فلورة قناة الاستشعار البطانية بعد شرب الماء، أو الفم الفومي، أو التوصيل الوريدي. يركز هذا البروتوكول على خطوات حاسمة، واعتبارات الجرعات الفيروسية الموصى بها واعتبارات العداد، وحل المشكلات، واستراتيجيات التحليل الكمي، مما يمكن المختبرات من تنفيذ المراقبة الحية لديناميكيات قنوات NAD⁺ البيولوجية في الأوعية الدموية الدماغية لدراسات الأيض العصبي في الصحة والمرض. 

المقدمة

يعد نيكوتيناميد أدينين ثنائي نيوكليوتيد (NAD⁺) عامل مركزي لتوازن الأكسدة والاختزال، والنشاط الميتوكوندري، وإصلاح الحمض النووي، والإشارات المستجيبة للإجهاد. في الأوعية الدموية الدماغية، يعرف بشكل متزايد ب NAD⁺ الداخلي الداخلي كمنظم نشط لسلامة الحاجز، والنغمة الوعائية، والترابط العصبي الوعائي، بدلا من قراءة أيضية سلبية¹. تم ربط اضطراب أيض NAD⁺ بطانة الرحم بتسرب الحاجز الدموي الدماغي المرتبط بالشيخوخة وضعف التوازن العصبي الوعائي، مما يبرز الحاجة إلى طرق يمكنها حل ديناميكيات الأيض البطانية مباشرة في نسيج الدماغ الحي².

تعتمد معظم الطرق المستخدمة حاليا لقياس NAD⁺ على قياسات النقاط النهائية الكيميائية الحيوية، أو التلوين النسجي الثابت، أو قراءات مستشعرات خارج الجسم الحي. على الرغم من معلوماتها، لا تحافظ هذه الأساليب على بنية الأوعية الدقيقة سليمة، ولا تستطيع التمييز بسهولة بين التغيرات السريعة داخل الحيوانات مع مرور الوقت، وتوفر نوعية محدودة من نوع الخلايا عند تطبيقها على أنسجة دماغية غير متجانسة. على النقيض من ذلك، يتيح التصوير المزمن بثنائية الفوتون من نافذة الجمجمة التصوير المتكرر للأوعية الدقيقة القشرية في الفئران الحية بدقة مكانية وزمنية عالية، مما يجعله مناسبا جدا لمراقبة الإشارات البطانية المستجيبة أيضيا تحت تدخلات فسيولوجية أو دوائية محددة ^3,4,5.

الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير سير عمل شامل من البداية إلى النهاية لمراقبة ديناميكيات NAD⁺ بطانة الدماغ في الوقت الحقيقي داخل الجسم الحي. تجمع الطريقة بين توصيل جهازي لمستشعر NAD⁺ مبني على الباطفة السطحية ومثبت ببروتينات فلورية خضراء مسننة (eGFP)، معبأ في فيروس مرتبط بالأدينو-X1.1 ويعمل بواسطة محفز Cdh5، ونافذة قحفية مستقرة بحجم 3 مم × 3 مم للوصول البصري ^6,7,8، وتصوير ثنائي فوتون ثنائي الطول الموجي مع قناة مرجعية داخل الأوعية الدموية (TMR)–دكستران¹. تم توضيح آلية الاستشعار كما يلي: كامبرون وآخرون. مستشعر NAD⁺ السيتوبلازمي LigA-cpVenus هو حساس قائم على الكونكونوس باستجابة عكسية. ارتباط NAD⁺ يقلل من الفلورة الشبيهة بcpVenus/eGFP في قراءة الإثارة القياسية 488 نانومتر، في حين أن قناة الإثارة 405 نانومتر تعمل كمرجع لتطبيع النسب. لذلك، لا ينبغي تفسير التألق الأخضر الخام كمقياس إيجابي مباشر لتركيز NAD⁺. في هذا التطبيق المكون من فوتونين، يستخدم الإثارة بمقدار 920 نانومتر لاكتساب إشارة قناة المستشعر الخضراء، بينما يستخدم الإثارة بمقدار 1040 نانومتر لقناة المرجعية الوعائية TMR–dextran؛ لذا، فإن اكتساب 920/1040 نانومتر الحالي لا يعادل قياسا بنسبة معايرة 488/405 نانومتر. تم اختيار مستشعر كامبرون وآخرون لأنه تم التحقق منه بشكل واسع لمراقبة ديناميكيات NAD⁺ داخل الخلية وهو متوافق مع تكوين التصوير ذو الطول الموجي المزدوج الحالي. على الرغم من أن مؤشرات أحدث مثل FiNad توفر طرقا بديلة لمراقبة ديناميكيات NAD⁺، إلا أن تنفيذها يتطلب تعديل قناة الفلورة الحمراء المستخدمة حاليا في وسم TMR–dextran المرجعي الوعائي. يبلغ حساس كامبرون عن تغيرات نسبية في توفر NAD⁺ ضمن نطاق ديناميكي محدود وتم التحقق منه في التطبيقات الخلوية وتحت الخلية؛ ومع ذلك، قد يتأثر تفسير الإشارة بمستوى التعبير، ودرجة الحموضة، والتبييض الضوئي، وتباين المسار البصري، كما أن القياس المطلق ^{ل NAD+} يتطلب معايرة أو التحقق الكيميائي الحيوي المتعامد. تم اختيار AAV-X1.1 لأن متغيرات AAV البطانية الاستوائية أبلغ عن أنها تنقل الأوعية الدموية المركزية للجهاز العصبي المركزي بكفاءة ^6,7. في مقارنتنا الأولية لعدة أنماط مصلية لفيروس AAV، بما في ذلك AAV9 وAAV-BR1 وAAV-ENT وAAV-X1.1، باستخدام تعبير بروتين فلوري أخضر معزز مدفوع ب CAG أو Cdh5 كمراسل، أنتج AAV-X1.1 نمط التعبير المرتبط بالأوعية الدموية الأكثر ملاءمة بين الأنماط المصلية المختبرة. تم استخدام محفز Cdh5 لاحقا لتقييد تعبير الجينات المنقولة في الخلايا البطانية الوعائية، بما يتوافق مع تقارير سابقة أظهرت تعبيرا انتقائيا للجينات المنقولة بطانة الرحم في الجسم الحي⁶.

مقارنة باختبارات NAD⁺ خارج الجسم الحي، يحافظ هذا النهج على الشبكة الوعائية السليمة، ويتيح القياسات الطولية في نفس الحيوان، ويسمح بتقييم إشارات الأيض البطانية في نفس الوقت ومرجع التجويف الوعائي. يعد هذا السير مفيدا بشكل خاص لدراسات الشيخوخة، والإجهاد الالتهابي، وخلل وظائف BBB، والاستجابات السريعة للتدخلات الأيضية مثل إعطاء نيكوتيناميد مونونيوكليوتيد (NMN) 9,10,11,12,13. تكون هذه الطريقة أكثر ملاءمة عندما يتطلب السؤال التجريبي تكرارا لرؤية الأوعية الدقيقة القشرية في الفئران الحية والتغيرات النسبية في إشارة قناة الاستشعار البطانية. وهو أقل ملاءمة للقياس المطلق ^{ل NAD+} بدون معايرة نسبية إضافية أو التحقق الكيميائي الحيوي. تشمل القيود العملية سهولة الوصول البصري القشري، وقيود عمق التصوير، والاعتماد على نجاح نقل AAV بطانة البطانة، واحتمال الالتهاب المرتبط بنافذة الجمجمة، والحاجة إلى مجهر ثنائي الفوتون ذو طول موجي مزدوج. يمكن أن يؤدي الانغراس المزمن في نافذة الجمجمة إلى التهابات موضعية، أو تفاعل الأوعية الدموية، أو الدبق، أو العتامة، أو إعادة تشكيل الأنسجة، وكلها قد تؤثر على فسيولوجيا البطانة وقياسات قنوات الحواس ^1,3,4. لتقليل هذه العوامل المربكة، يتطلب البروتوكول جراحة معقمة، وحفر متقطع مع تبريد متكرر، واستقرار دموي دقيق، وتجنب ملامسة اللاصق مع الجافة، وتخفيف الألم بعد العملية، والمراقبة اليومية، واستبعاد الحيوانات التي تعاني من عتامة مستمرة، أو حطام التهابي، أو عدوى، أو شكل وعائي غير مستقر، أو ضعف استقرار الإشارة الأساسية.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة علوم الصحة وإعادة التأهيل ضمن المشروع المعنون "الدراسة الميكانيكية للمراقبة المعتمدة على المسبار الأيضي لسلامة حاجز الدم والدماغ" (رقم الموافقة KFDX: رقم 2023-1023). إجراء جميع العمليات تحت ظروف معقمة وتقديم مسكنات الألم ورعاية داعمة أثناء العمليات وفقا لبروتوكول الحيوانات المعتمد. في سير العمل التمثيلي، يعطى البوبرينورفين هيدروكلوريد (0.05–0.1 ملغ/كجم، تحت الجلد) قبل أو مباشرة بعد الجراحة ثم كل 8–12 ساعة لمدة 24–48 ساعة حسب الحاجة. استعاد الفئران في قفص دافئ وراقبها حتى تستعيد وضعيتها الطبيعية، والحركة التلقائية، والتنفس المستقر من الوضعية.

1. نظرة عامة تجريبية

1. استخدم فئران C57BL/6J بالغة بعمر 10–12 أسبوعا ووزنها 23–25 جرام للتجارب التمثيلية.
2. الحفاظ على الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض المحددة مع دورة ضوء/ظلام تتراوح بين 12 ساعة، ودرجة حرارة محيطة بين 22°C–24°C، ورطوبة نسبية بين 40٪–60٪، وإمكانية الوصول إلى الغذاء والماء.
3. تأقلم الحيوانات مع الحياة الطبيعية لمدة لا تقل عن 7 أيام قبل الإجراءات.
4. استخدم أي من الجنسين حسب المناسب لتصميم التجربة. أبلغ عن الجنس، وأعداد الحيوانات، وتوزيع المجموعات لكل تجربة. مجموعة بيانات التصوير التمثيلي المعروضة هنا استخدمت N = 3 فئران.
5. أعط الحمض النووي الجهازي أولا وترك فترة تعبير تتراوح بين 3–4 أسابيع قبل التصوير.
6. إجراء جراحة نافذة الجمجمة قبل 3–5 أيام من التصوير.
7. قم بتخدير الفئران في يوم التصوير، وحقن TMR–dextran عن طريق الوريد، وإجراء التصوير بعد تدفق الدم المتتبع الكافي.
8. إعطاء NMN وفقا لجدول التدخل المختار. قدم مكملات ماء الشرب لمدة 5 أيام قبل التصوير، وإجراء التشويش الفموي في الفترة المحددة مسبقا قبل التصوير، أو إعطاء NMN عن طريق الوريد أثناء جلسة التصوير بعد اكتساب الوضع الأساسي.
   ملاحظة: أوقف البروتوكول مؤقتا بعد إعطاء AAV خلال فترة التعبير التي تستمر من 3 إلى 4 أسابيع وحافظ على الحيوانات تحت مراقبة صحية روتينية وظروف سكن قياسية. أوقف البروتوكول بعد جراحة نافذة الجمجمة خلال فترة التعافي التي تستمر 3–5 أيام. قبل البدء في التصوير، تأكد من استقرار وزن الجسم، والعناية والنشاط الطبيعيين، وعدم وجود عدوى أو التهاب مفرط، ونافذة جمحية واضحة.

2. جراحة نافذة الجمجمة للتصوير القشري الطولي

1. التحضير قبل الجراحة
   1. قم بتعقيم جميع الأدوات الجراحية وإنشاء مجال معقم قبل التحفيز بالتخدير.
   2. ضبط نظام التدفئة الهوميال الحراري للحفاظ على درجة حرارة الجسم بين 36.5°م و37.5°م، ويفضل استخدام وحدة تحكم تغذية راجعة مستقيمة من نوع مسبار مستقيم.
   3. جهز معدات مراقبة التنفس وتأكد من استقرار العملية قبل الجراحة.
   4. جهز محلول ملحي معقم، ومسحات ماصة، ومواد دموستاتية، وغطاء زجاجي معقم رقم 1.5، ولوحة رأس معدنية، وأسمنت سناني قبل بدء الإجراء.
   5. استخدم غطاء زجاجي معقم بحجم 1.5 لتغطية نافذة الجمجمة بمقاس 3 مم × 3 مم بالكامل واجلس بشكل مستو على حافة الجمجمة.
   6. جهز مثقاب دقيق عالي السرعة مزود بحافة 0.5–1.0 مم.
   7. شغل المثقاب بسرعة تقارب نصف السرعة القصوى وتأكد من إمكانية تطبيق الري بالمحلول الملحي المعقم فورا أثناء تخفيف الجماجم.
   8. ضع محلول ملحي معقم بدرجة حرارة الغرفة باستخدام قطعة قماش قطنية أو قطارة أثناء الحفر لتبريد الجمجمة وإزالة غبار العظام.
2. التخدير، تحضير فروة الرأس، والتعرض للجمجمة
   1. تخدير الفئران بمحلول أفرتين جاهز حديثا (1.25٪، 12.5 ملغ/مل) عن طريق الحقن داخل الصفاق بمعدل 200–250 ملغ/كغ.
      1. تحضير محلول العمل لأفرتين من 2,2,2-تريبروموإيثانول و2-ميثيل-2-بوتانول وفقا لإجراءات التشغيل القياسية المؤسسية، حماية المحلول من الضوء، وتخلص من التحضيرات التي تظهر هطول أو تغير لون.
   2. تأكد من استقرار المستوى الجراحي عن طريق فقدان رد فعل سحب الدواسات وثبات التنفس.
   3. ضع مرهم العيون على كلتا العينين مباشرة بعد تحفيز التخدير.
   4. إذا تم استخدام تخدير استنشاقي، احفز التخدير باستخدام 3٪–4٪ إيزوفلوران.
   5. حافظ على التخدير مع 1٪–2٪ إيزوفلوران في الأكسجين بمعدل 0.5–1.0 لتر/دقيقة وضبط التخدير حسب التنفس وردود الفعل.
      تحذير: تعامل مع عوامل التخدير وفقا لإجراءات السلامة المؤسسية واستخدم أنظمة التنظيف المناسبة عند إعطاء التخدير الاستنشاقي.
   6. ثبت الفأرة في إطار ستيريوتاكسي أو حامل رأس مخصص يوفر وصولا مستقرا إلى الجمجمة الظهرية.
   7. حافظ على درجة حرارة الجسم بين 36.5°م و37.5°م باستخدام وسادة تدفئة محكومة بالتغذية الراجعة ومسبار مستقيم عند توفرها.
   8. احلق فروة الرأس وأزل الشعر المتساقط من مجال الجراحة.
   9. عقم فروة الرأس باستخدام محلول بوفيدون-يود أو يودوفور بالتناوب مع 70٪ إيثانول لمدة ثلاث دورات.
   10. تجنب السماح للمطهر بالدخول إلى العينين أو فتحة الجمجمة.
   11. قم بعمل شق في منتصف فروة الرأس واسحب الجلد بلطف.
   12. كشف الجمجمة بشكل كاف للسماح بإنشاء نافذة الجمجمة وتثبيت لوحة الرأس.
   13. قم بإزالة الشغاق والأنسجة الضامة المتبقية باستخدام ملقط ناعم أو شفرة مشرط.
   14. جفف الجمجمة بلطف باستخدام عشاش قطنية معقمة لمدة تقارب 10–20 ثانية حتى يبدو السطح غير لامع بدلا من أن يكون رطبا.
   15. تجنب الجفاف المفرط للأنسجة المكشوفة.
3. تحديد عملية فتح الجمجمة بعرض 3 مم × 3 مم
   1. حدد البريغما واللامبدا تحت المجهر الجراحي.
   2. استخدم هذه المعالم التشريحية لتوجيه الخط الأوسط والمنطقة القشرية المستهدفة.
   3. ضع علامة مربعة بحجم 3 مم × 3 مم فوق نصف كرة من القشرة الحسية الجسدية الظهرية.
   4. ضع الحافة الأمامية تقريبا 0.5 مم خلف البريغما، والحافة الوسطى تقريبا على بعد 1.0 مم جانبيا من الخط الأوسط.
   5. تجنب غرز الجمجمة الكبيرة والأوعية السطحية الكبيرة كلما أمكن.
4. الحفر وإزالة الألواح العظمية
   1. قم بترقيع الجمجمة على طول المحيط المحدد باستخدام تلامس مثقاب متقطع بدلا من الضغط المستمر.
   2. ضع محلول ملحي معقم بشكل متكرر أثناء الحفر لمنع الإصابة الحرارية.
   3. قدم حوالي 20–50 ميكرولتر من محلول ملحي معقم في كل تطبيق أو ما يكفي للحفاظ على سطح الجمجمة رطبا وباردا.
   4. كرر الري كل 10–20 ثانية أو كلما تراكم غبار العظام أو اشتبه بتراكم الحرارة.
   5. استمر في التقييق حتى يصبح العظم شفافا بشكل موحد ومرنا قليلا.
   6. تأكيد الترقيق الكافي من خلال ملاحظة الأوعية الجافية المرئية، ونبض الجاف المحفوظ، وغياب ضغط القشور أو تغير اللون الحراري.
   7. توقف عن الحفر فورا إذا تراكم الحرارة الزائدة أو النزيف أو انخفاض النبض الجافية.
   8. قم بري المنطقة وإعادة تقييم العملية قبل الاستمرار.
   9. ارفع غطاء العظم بلطف من زاوية واحدة باستخدام ملقط ناعم أو طرف إبرة.
   10. أعد تصغير المحيط إذا بقيت مقاومة.
   11. حافظ على الجافة سليمة أثناء إزالة رفرفة العظام.
   12. اشطف غبار العظام باستخدام محلول ملحي معقم.
   13. تحكم في النزيف الطفيف باستخدام الري الخفيف بمحلول ملحي لطيف ومسحات ماصة.
   14. اعتبر النزيف مقبولا إذا اختفى خلال دقيقة إلى دقيقتين بعد الري والاتصال بالمسحة الممتصة.
   15. استبعد الحيوان أو أوقف الإجراء إذا استمر النزيف لأكثر من حوالي 5 دقائق.
   16. استبعد الحيوان أو أوقف الإجراء إذا تمزق الجافة، أو حدث ضغط قشري، أو حجب الدم منطقة التصوير.
       ملاحظة: قد يتم إيقاف الإجراء مؤقتا بعد التعقيم الكامل وقبل وضع الغطاء الداخلي. حافظ على الجافية المكشوفة في حالة رطبة باستخدام محلول ملحي معقم واستأنف الدورا فقط بعد التأكد من عدم وجود نزيف نشط.
5. إغلاق النوافذ وتثبيت لوحة الرأس
   1. تأكد من أن الجافة المكشوفة نظيفة ورطبة وخالية من النزيف النشط.
   2. ضع غطاء معقم فوق فتحة الجمجمة.
   3. ضع غطاء الجمجمة على حافة الجمجمة المحيطة بقطع الجمجمة دون ضغط الجافة.
   4. تحقق من الموقع الصحيح بتأكيد سطح غطاء الانزلاق المتساوي، وغياب فقاعات الهواء المحبوسة، ونبض جافية محفوظ، ومسار بصري واضح.
   5. جهز إسمنت الأسنان أو لاصق من نوع Super-Bond C&B وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      1. لتحضير C&B النموذجي Super-Bond، اخلط ملعقة واحدة من المسحوق مع قطرة واحدة من المحفز وأربع قطرات من المونومر في طبق خزفي مبرد مسبقا يحافظ على درجة حرارة تقارب −20°C قبل التطبيق مباشرة.
   6. ضع المادة اللاصقة فقط حول الحافة الخارجية للجمجمة المحيطة بغطاء الدرجات.
   7. تجنب ملامسة اللاصق مع الجافة وتجنب الفتيل الشعري تحت الزجاج.
   8. اترك اللاصق ليتصلب لمدة تتراوح بين 5–10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      تحذير: قد تحتوي مكونات الأسمنت واللاصق السني على مواد كيميائية متطايرة أو مهيجة. تعامل معها وفقا لإجراءات السلامة المؤسسية واستخدم التهوية المناسبة.
   9. ضع لوحة رأس مخصصة من التيتانيوم حول نافذة الجمجمة.
   10. استخدم لوحة رأس تحتوي على فتحة مركزية بحجم حوالي 10 مم متوافقة مع حامل رأس التصوير.
   11. مركز النافذة القحفية داخل فتحة لوحة الرأس.
   12. ضع الأسمنت السني فقط على المناطق التي تلامس الجمجمة خارج النافذة البصرية.
   13. اترك الأسمنت ليتصلب تماما لمدة تتراوح بين 5 إلى 10 دقائق قبل تحريك الحيوان.
6. التعافي بعد العملية ومراقبة جودة النوافذ
   1. أعط مسكنات بعد العملية وفقا لبروتوكول الحيوانات المعتمد.
   2. في سير العمل التمثيلي، يتم إعطاء هيدروكلوريد البوبرينورفين بمعدل 0.05–0.1 ملغ/كجم تحت الجلد كل 8–12 ساعة لمدة 24–48 ساعة.
   3. استعادة الفئران في قفص دافئ.
   4. راقب التنفس، وضعية الجسم، الحركة، العناية البدنية، ووزن الجسم يوميا.
   5. اقبل نوافذ الجمجمة التي تظهر سطحا زجاجيا شفافا، وأوعية قشرية مرئية، وجافة سليمة، ودم متبقي قليل، ولا يوجد لاصق تحت الغطاء اللاصق، ولا عدوى، وتثبيت صفيحة الرأس مستقرة.
   6. استبعد الحيوانات التي تعتيم بشكل ملحوظ، أو نزيف مستمر، أو حطام التهابي، أو عدوى، أو إزاحة النوافذ، أو فقدان وزن شديد (>15٪)، أو سوء العناية والنشاط الطبيعي.
   7. تابع التصوير بعد 3-5 أيام من التعافي.
   8. تأكد من النشاط الطبيعي، وسلوك العناية الطبيعي، ووزن الجسم المستقر، وغياب الألم أو العدوى، ونافذة قمجمة شفافة مع أوعية مرئية بوضوح قبل التصوير.
      ملاحظة: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا خلال فترة التعافي بعد العملية. حافظ على الفئران في ظروف السكن القياسية، وراقب وزن الجسم ووضوح النوافذ يوميا، واستأنف التصوير فقط بعد استيفاء جميع معايير التعافي.

3. تعبير مستشعر NAD⁺ بطانة بطانة الدفاع بواسطة AAV

1. البناء الفيروسي والتحضير
   1. استخدم مستشعر حيوي مشفر جينيا NAD⁺ مبني على eGFP/cpVenus ويعمل بواسطة محفز Cdh5 بطاني.
   2. استخدم كامبرون وآخرين. تسلسل مستشعر حيوي سيتوبلازمي من LigA-cpVenus ^NAD+ (على سبيل المثال، بلازميد Addgene #186787 أو إدخال معادل تم التحقق منه من التسلسل).
   3. استنساخ محفز Cdh5 في أعلى تسلسل ترميز مستشعر NAD⁺ باستخدام العمود الفقري المتجه CV232.
   4. تغليف شريط التعبير في كابسيد AAV-X1.1 كتحضير فيروسي مخصص.
      1. سجل مزود إنتاج الفيروس، طريقة التنقية، طريقة قياس الجينوم الفيروسي، رقم دفعة الإنتاج، وشهادة التحليل لكل تحضير AAV.
   5. سجل خريطة البلازميدات، ونتائج التحقق من التسلسل، ومعلومات إنتاج الفيروس، ومعلومات التنقية، ومؤشر الجينوم الفيروسي، وشهادة التحليل لكل تحضير فيروسي
      1. سجل خريطة البناء، تقرير التحقق من التسلسل، رقم دفعة إنتاج الفيروس، تقرير عيار تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)، توثيق التنقية، وشهادة التحليل لكل تحضير فيروسي مستخدم في الدراسة.
   6. راجع جدول المواد لجميع تفاصيل البناء.
   7. استخدم مستحضرات AAV عالية القياس مع عيارات qPCR خاصة بالدفعة، عادة ما تكون أكبر من 2 ×^{10 13} vg/m.
   8. تخزين البطاقات لمرة واحدة عند −80°C.
   9. تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان.
   10. سجل كمية الإنتاج، عيار qPCR، مدة التخزين، والتفاوت المقبول بين الدفعة قبل الاستخدام.
2. إدارة AAV النظامية
   1. إذابة الليكوت الفيروسي على الثلج.
   2. تخفيف الفيروس في محلول ملحي معقم بفوسفات (PBS) إلى حجم حقن نهائي يتراوح بين 100–200 ميكرولتر لكل فأر.
   3. حافظ على جرعة نهائية 2 ×^{10 12} VG لكل فأر عبر الحيوانات.
      1. احسب حجم الحقن من عيار الجينوم الفيروسي الخاص بالدفعة. بالنسبة للتحضير التمثيلي مع عيار qPCR 1.39 × 10¹³ vg/mL، احقن حوالي 144 ميكرولتر لإعطاء جرعة 2 ×^{10 12} vg لكل فأرة.
   4. نقل الفيروس عن طريق حقن الجيوب الأنفية الوريدي العكسي باستخدام حقنة أنسولين معقمة بسعة 29 جيلون.
   5. حقن التعليق الفيروسي ببطء على مدى حوالي 10–20 ثانية.
   6. تأكيد نجاح الولادة من خلال التحقق من عدم وجود تسرب أو نزيف مفرط أو إصابة العين.
   7. تحقق من صحة ويبلغ عن أي مسار إدارة بديل بشكل منفصل.
   8. راقب الفأر حتى تستعيد وضعية الجسم الطبيعية والحركة التلقائية.
   9. تأكد من استقرار التنفس وغياب النزيف أو الضيق.
   10. أعد الحيوان إلى قفصه المنزلي فقط بعد التعافي الكامل.
   11. اترك 21–28 يوما لتعبير المستشعر قبل التصوير.
   12. حافظ على فترة تعبير متسقة داخل كل مجموعة مقارنة.
   13. تحقق من صحة فترات التعبير خارج نطاق 21–28 يوما بشكل منفصل.
       ملاحظة: قد يتوقف البروتوكول مؤقتا خلال فترة التعبير عن AAV. حافظ على المراقبة الروتينية للرعاية الصحية والمتابعة للجراحة في نافذة الجمجمة فقط بعد انتهاء فترة التعبير المخططة والبقاء بصحة الحيوان.
3. التحقق من صحة تقييد البطانة
   1. فحص الحيوانات قبل جمع البيانات الرسمي.
   2. يقبل الحيوانات عندما تكون إشارة قناة المستشعر الخضراء قابلة للكشف وتتبع الشبكة الوعائية.
   3. تأكد من أن الإشارة مثرية على طول جدران الأوعية المجاورة لللومن TMR–dextran–موجب.
   4. تأكيد غياب التألق المنتشر السائد في الأنهار المحيطية.
   5. تطبيق معايير قبول متطابقة على جميع مجموعات التجريب.
   6. الفئران المثقبة بمتلازمة PBS تليها 4٪ بارافورمالديهايد عند الحاجة إلى التحقق اللاحق.
   7. اجمع الدماغ وحضر مقاطع تاجية أو سهمية بحجم 30–40 ميكرومتر.
   8. تصبغ مقاطع بعلامات بطانية مثل ليكتين الطماطم، CD31، أو كاديرين بطانة الأوعية الدموية (VE-كاديرين).
      1. سجل مصدر الأجسام المضادة، ورقم الكتالوج، ورقم الدفعة، ونوع المضيف، والتخفيف، وظروف الحضانة، وطريقة الكشف لكل تجربة تحقق.
   9. تقييم تعبير نيكوتيناميد فوسفوريبوزيل ترانسفيراز (NAMPT) وبولي (ADP-ريبوز) بوليميراز 1 (PARP1) عند الحاجة.
   10. استخدم مخففات الأجسام المضادة الأولية المصممة خصيصا لتحضير الأنسجة.
   11. احصل على صور فلورية أو كونفوكال باستخدام إعدادات التقاط متطابقة عبر المجموعات.
   12. قم بقياس التموضعي المشترك كنسبة من إشارة الإشارة الإيجابية للمستشعر المتداخلة مع أو المجاورة مباشرة لمناطق إيجابية العلامة الوعائية.
   13. استبعد الحيوانات عندما تكون معظم الإشارات القابلة للكشف خارج البنى الوعائية.
   14. استبعد الحيوانات عندما لا يكون هناك إثراء جدار الوعاء.
   15. استبعد الحيوانات عندما يمنع الفلورة المحيطية غير الهدفية اختيار منطقة الاهتمام بشكل موثوق.
   16. استبعد الحيوانات عندما يكون فلورة قناة المستشعر مشبعة أو غير مستقرة أثناء اكتساب القاعدة الطبيعية.

4. تصوير فوتونين وتحليل كمي

1. تحضير يوم التصوير ووضع العلامات المرجعية داخل الأوعية الدموية
   1. تخدير الفئران بمحلول أفرتين جاهز حديثا (1.25٪، 12.5 ملغ/مل) عن طريق الحقن داخل الصفاق بجرعة 200–250 ملغ/كغ، أو استخدم نظام التخدير المعتمد من بروتوكول الحيوانات المؤسسي.
   2. تأكد من استقرار الطائرة الجراحية بفقدان انسحاب الدواسات واستقرار التنفس.
   3. ضع مرهم العيون مباشرة بعد التحفيز.
   4. إذا تم استخدام تخدير استنشاقي، احفز التخدير باستخدام 3٪–4٪ إيزوفلوران.
   5. حافظ على التخدير مع 1٪–2٪ إيزوفلوران في الأكسجين بمعدل 0.5–1.0 لتر/دقيقة وضبط التخدير حسب التنفس وردود الفعل.
   6. جهز TMR–dextran بقدرة 70 كيلو دالتون في PBS المعقم عند 10–25 ملغ/مل.
   7. حماية محلول TMR–dextran من الضوء وترشيح الحل إذا كانت الممارسة المؤسسية مطلوبة.
   8. حقن TMR–dextran وريديا بجرعة 20 ملغ/كغ.
   9. اضبط حجم الحقن حسب تركيز المخزون. بالنسبة لفأر وزنه 25 جرام، أعط حوالي 0.5 ملغ صبغة إجمالية.
   10. جهز جهاز التتبع طازجا أو خزن القطع المحمية من الضوء وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
   11. يسمح لTMR–dextran بالدوران لمدة 5–10 دقائق قبل التقاط الصورة.
2. تكوين المجهر
   1. استخدم مجهر ثنائي الطول الموجي ذو فوتونين، مهيأ لإثارة قناة الاستشعار المعتمدة على eGFP بسرعة 920 نانومتر.
   2. استخدم مسار إثارة 1040 نانومتر لقناة المرجعية الوعائية TMR–dextran.
   3. تم إجراء التصوير التمثيلي على مجهر نيكون A1 MP/A1R MP+ متعدد الفوتونات يتحكم فيه بواسطة برنامج تحليل AR/AR من NIS-Elements (الإصدار 5.42.06).
   4. سجل مصادر الليزر، معلمات النبض، تكوين تركيب الحزمة، نوع الكاشف، وإصدار البرنامج لكل نظام تصوير.
   5. قم بتكوين قنوات الكشف لفصل إشارة قناة المستشعر عن إشارة TMR–dextran.
   6. استخدم كواشف أنابيب مضاعفة ضوئية غير ممسحة (PMT) أو كواشف فوسفيد أزرنيخ الغاليوم (GaAsP).
   7. اجمع انبعاث قناة المستشعرات الخضراء بين حوالي 500 و550 نانومتر.
   8. اجمع انبعاث TMR–dextran بين حوالي 570 و650 نانومتر.
      1. في مجموعة البيانات التمثيلية، اجمع انبعاث قناة الحساس الخضراء باستخدام مرشح انبعاث 525/50 نانومتر، وجمع انبعاث TMR–dextran باستخدام مرشح انبعاث 575/25 نانومتر أو 610/75 نانومتر.
   9. تقليل التسرب الطيفي بين القنوات.
   10. حافظ على ثبات إعدادات الكسب والإزاحة في الكاشف داخل كل مجموعة مقارنة.
   11. تحقق من فصل القنوات باستخدام ضوابط القناة الواحدة عند توفرها.
   12. استخدم كاميرا نيكون CFI75 Apochromat 25XC W 1300 أو ما يعادلها (25×، فتحة عدسة رقمية 1.10، مسافة عمل 2.0 مم).
   13. تأكيد تسجيل القنوات باستخدام معالم وعائية ثابتة مثل التفرعات وحواف التلومين.
   14. كرر التحقق من التسجيل المشترك بعد أي تعديل للمسار البصري.
   15. قس طاقة الليزر عند مستوى العينة قبل التصوير.
   16. حافظ على ثابت طاقة ليزر 920 نانومتر داخل كل مجموعة مقارنة.
   17. حافظ على ثابت طاقة ليزر 1040 نانومتر داخل كل مجموعة مقارنة.
   18. استخدم حوالي 10–20 ميلاواط عند 920 نانومتر و8–18 ميلاواط عند 1040 نانومتر كميادين عمل تمثيلية.
   19. اضبط قوة الليزر حسب عمق التصوير وجودة نافذة الجمجمة.
   20. استبعد الحقول التي تظهر فقدان الإشارة أكثر من 20٪ خلال فترة الأساس البالغة 120 ثانية.
   21. استبعد الحقول التي تظهر تغيرات ضوئية سامة مرئية.
3. إعدادات الاستحواذ
   1. اختر مجالات رؤية بنافذة بصرية واضحة، وأوعية دقيقة مركزة بدقة، وحركة قليلة.
   2. اقبل نوافذ تحتوي على غطاء شفاف، وعية قشرية مرئية، وجافية سليمة، ودم متبقي قليل، ولا يوجد لاصق تحت الغطاء، ولا عدوى، وتثبيت لوحة الرأس مستقرة.
   3. استبعد الحيوانات التي تعتمي بشكل ملحوظ، أو نزيف مستمر، أو حطام التهابي، أو عدوى، أو إزاحة نوافذ، أو فقدان وزن شديد (>15٪)، أو سوء العناية أو النشاط الطبيعي.
   4. احصل على صور تايم لابس عند 512 × 512 بكسل.
   5. احصل على صور ثابتة ممثلة بدقة 1024 × 1024 بكسل عندما يتطلب الأمر تفاصيل مكانية أعلى.
   6. حافظ على حجم البكسل، والتكبير، وسرعة المسح، ومجال الرؤية ثابتين داخل كل مجموعة مقارنة.
   7. الحصول على مكدسات z باستخدام حجم خطوة 1–3 ميكرومتر.
   8. صور الأوعية الدقيقة القشرية على أعماق تقارب 200–250 ميكرومتر تحت سطح البوال.
   9. قم بتمديد عمق التصوير إلى حوالي 400 ميكرومتر عندما تسمح جودة النوافذ.
   10. حافظ على عمق الصورة ثابتا للمقارنات الزوجية.
   11. احصل على خط أساس 120 ثانية بفواصل زمنية 1 ثانية قبل التدخلات الحادة.
   12. استمر في الاكتساب لفترة ما بعد التدخل المحددة مسبقا.
   13. سجل استجابات NMN الوريدية لمدة حوالي 10–30 دقيقة بعد الحقن.
   14. الحصول على مجموعات بيانات مياه الشرب ونظام التشويش الفموي عند نقاط تجريبية محددة مسبقا.
   15. حافظ على إعدادات الاقتناء المتطابقة عبر جميع مجموعات المقارنة.
4. تدخل NMN (مثال تطبيقي)
   1. إذابة NMN في مياه شرب معقمة.
   2. قم بضبط تركيز NMN ليصل إلى حوالي 100 ملغ/كجم/يوم.
   3. احم زجاجة الشرب من الضوضاء.
   4. استبدل مياه الشرب التي تحتوي على NMN كل 24–48 ساعة.
   5. راقب استهلاك الماء باستخدام قياسات وزن الزجاجة.
   6. احسب تقدير تناول NMN باستخدام استهلاك الماء ووزن الجسم.
   7. استمر في تناول المكملات لمدة 5 أيام قبل التصوير.
   8. حضر NMN بجرعة 1 ملغ/مل للتمقم الفموي.
   9. أعط 200 ميكرولتر لكل فأرة باستخدام إبرة جافاج بطول 20 جرام وطرف مستدير بقطر 38 مم.
   10. قم بإجراء التصوير بعد 30–60 دقيقة من التشويق.
   11. جهز NMN بجرعة 1 ملغ/مل للولادة الوريدية.
   12. حقن 100 ميكرولتر لكل فأر عبر الجيب الوريدي الرجعي أو الوريد الذيلي.
   13. قم بإعطاء الحقن ببطء خلال 10–20 ثانية.
   14. ابدأ التصوير فورا أو خلال 5 دقائق بعد الحقن.
   15. احصل على مجموعات بيانات مياه الشرب بعد 5 أيام من المكملات.
   16. الحصول على مجموعات بيانات التجويم الشفهي في نقطة زمنية ثابتة بعد التجويم.
   17. احصل على خط أساس مباشرة قبل الحقن الوريدي.
   18. سجل استجابات حادة لمدة تقارب 10–30 دقيقة بعد الحقن الوريدي.
5. معالجة الصور واستخراج الإشارة
   1. قم بتصحيح الحركة عندما تكون هناك تشوهات حركية.
   2. استخدم Fiji/ImageJ (الإصدار 1.8.0 أو أحدث) مع StackReg أو TurboReg أو خوارزمية تسجيل الجسم الصلب المكافئة.
   3. استخدم المعالم الوعائية في قناة TMR–dextran لتوجيه التسجيل.
   4. قبول مجموعات البيانات فقط عندما يكون الإزاحة المتبقية أقل من حوالي 1–2 بكسل بعد التصحيح.
   5. تأكد من أن حدود منطقة الاهتمام الوعائية (ROI) تبقى مستقرة طوال فترة الاستحواذ.
   6. استخدم قناة TMR–dextran لتقسيم تلال الأوعية.
   7. حدد عائد المؤشرات البطانية المجاورة مباشرة لللومين.
   8. اختر الأوعية الدقيقة ذات العلامة المستقرة على التلوين، وحركة قليلة، وإشارة مرئية من قناة المستشعر.
   9. تحليل أقطار الأوعية التي تتراوح بين حوالي 5–80 ميكرومتر.
   10. عرف ROIs البطانة كمناطق مرتبطة بجدار الوعاء بعرض حوالي 2–5 ميكرومتر.
   11. حلل 3–5 سفن في كل مجال رؤية عند توفرها.
   12. حلل 1–3 مجالات رؤية لكل فأرة عند توفرها.
   13. حدد العائد على المؤشرات الخلفية في المناطق الأنسجة التي تفتقر إلى إشارة التتبع والمستشعر.
   14. ضع مؤشرات العائد على الرؤية في الخلفية على بعد لا تقل عن 20 ميكرومتر من الأوعية والصور المحللة.
   15. اطرح متوسط شدة الخلفية من كل قناة قبل التطبيع.
   16. طبق نفس استراتيجية طرح الخلفية على جميع العينات.
   17. استخرج قيم متوسط شدة السلاسل الزمنية ل F_sensor(t).
   18. استخرج قيم متوسط شدة السلاسل الزمنية ل F_ref(t).
   19. إجراء القياسات باستخدام تحليل AR/AR من NIS-Elements أو Fiji/ImageJ.
   20. تصدير ملفات الصور الخام كملفات ND2.
   21. تصدير نسخ التحليل كمكدس TIFF 16-بت عندما يكون ذلك ممكنا.
   22. تصدير بيانات السلسلة الزمنية على العائد على الاستثمار كملفات CSV.
   23. احسب قيم الفلورة الطرحة بالخلفية قبل التطبيع.
   24. احسب ΔF/F₀ باستخدام ΔF/F₀ = (F(t) − F₀)/F₀.
   25. عرف F₀ كإشارة متوسطة خلال فترة الأساس 120 ثانية.
   26. احسب تطبيع المرجع الوعائي ك F_sensor(t)/F_ref(t).
   27. أبلغ عن تغير الذروة، ووقت الذروة، والمساحة تحت المنحنى، وحركة الاسترداد عندما تسمح مدة الاستحواذ.
   28. لا تفسر إشارة قناة المستشعر 920 نانومتر كتركيز معاير ل NAD⁺ .
   29. إجراء معايرة نسبية إضافية أو التحقق الكيميائي الحيوي عند الحاجة إلى قياسات كمية ل NAD⁺ .
6. الإحصاءات والتقارير
   1. عرف الفأر كوحدة تجريبية بيولوجية.
   2. قياسات متوسط مستوى الوعاء داخل كل فأر قبل التحليل على مستوى المجموعة أو تطبيق نموذج إحصائي متداخل.
   3. استخدم اختبارات t ثنائية الطرفين للمقارنات الموزعة بشكل طبيعي داخل الفأرة.
   4. استخدم اختبارات الترتيب الموقعة لأزواج ويلكوكسون عندما لا تتحقق افتراضات الطبيعية.
   5. استخدم نماذج ANOVA أو نماذج التأثيرات المختلطة ذات القياسات المتكررة للتحليلات التي تشمل أكثر من حالتين مرتبطتين.
   6. تطبيق تصحيحات المقارنة المتعددة المناسبة.
   7. قم بإجراء تحليلات إحصائية باستخدام برنامج GraphPad Prism أو برنامج مكافئ.
   8. عرف الدلالة الإحصائية ك p < 0.05.
   9. أبلغ عن الاختبار الإحصائي الدقيق في كل أسطورة شكلية.
   10. قم بترميز ملفات الصور قبل اختيار العائد على الاستثمار وقياسه كلما أمكن ذلك.
   11. حافظ على تعمية المحللين حتى تكتمل قياسات العائد على الاستثمار وقرارات مراقبة الجودة.
   12. استخدم N = 3 فئران كوحدة بيولوجية تجريبية في مجموعة البيانات الممثلة.
       ملاحظة: لا توقف التقاط الصور مؤقتا أثناء التصوير النشط بتقنية التايم لابس. قد يتم إيقاف معالجة الصور والتحليل الكمي مؤقتا بعد تصدير البيانات الخام. تخزين ملفات ND2، وملفات تحليل TIFF، وملفات العائد على الاستثمار، والبيانات الوصفية، وجداول قياس CSV في أرشيف احتياطي. سجل قوة الليزر، إعدادات الكاشف، عمق التصوير، هوية الحيوان، تعيين العلاج، وقرارات الاستبعاد لكل جلسة تصوير.

النتائج

التحضير الناجح ينتج نافذة قحفية شفافة ومستقرة ميكانيكيا مناسبة للتصوير الطولي. يلخص الشكل 1A سير العمل الإجرائي من التخدير والتعرض للجمجمة مرورا بفتح الجمجمة، ووضع غطاء الرأس، وتثبيت لوحة الرأس، والتعافي بعد العملية. يعرض الشكل 1B صورا متسلسلة تمثيلية للخطوات الجراحية الرئيسية. النوافذ المناسبة للتصوير تظهر مسارا بصريا واضحا، وعاءات قشرية مرئية، وجافية سليمة، ودم متبقي قليل، ولا يوجد لاصق تحت الغطاء، وغطاء مغطى بجانب حافة الجمجم...

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول سير عمل شامل من البداية إلى النهاية لمراقبة استقلاب NAD⁺ بطانة الدماغ في الجسم الحي. تشمل العوامل الرئيسية للنجاح: (1) وضوح وثبات النوافذ، بما في ذلك تقليل الضرر الحراري والسيطرة على النزيف أثناء الحفر؛ (2) الخصوصية البطانية والتعبير الكافي عن المستشعر من خلال الاختيار المناسب لكابسيد AAV، والمحفز، والجرعة، وفترة التعبير؛ و(3) إعدادات تصوير وتحليل متسقة، خاصة عند إجراء المقارنات الطولية. توفر قناة TMR–dextran داخل الأوعية الدموية مرجعا قويا للوعاء ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	تحذير: مادة كيميائية سامة/ضارة. يُستخدم لتحضير محلول التخدير Avertin لجراحة النافذة القحفية. محلول العمل النموذجي: 1.25% (12.5 ملغ/مل)، يُحقن داخل الصفاق بمعدل 200-250 ملغ/كغ.
2-Methyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	تحذير: مادة كيميائية سامة/ضارة. مذيب يُستخدم لتحضير محلول Avertin المركز. احمِه من الضوء وتخلص من المستحضرات التي تظهر ترسبًا أو تغيّرًا في اللون.
مسحات ماصة	Winner Medical	مسحات قطنية طبية معقمة	يُستخدم لوقف النزيف، وتجفيف الجمجمة، والغسل، والحفاظ على نظافة الحقل الجراحي.
AAV-X1.1-Cdh5-cytoplasmic NAD+ biosensor-SV40 pA	Shanghai GeneChem Co., Ltd.; Addgene sources for plasmids	GeneChem construct GCPV5052075; Addgene #186787; Addgene #196836	مستشعر NAD+ موجه للأوعية الدموية والمعبأ في AAV-X1.1. كاسيت التعبير: محفز Cdh5 - مستشعر NAD+ في السيتوبلازم - SV40 poly(A). جرعة حقن نموذجية: 2 × 10¹² vg/فأر. قم بتخزين الأجزاء في -80 درجة مئوية وتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. سجّل قيمة تركيز qPCR الخاصة بالدفعة، ورقم الدفعة، ومخطط البلازميد، والتحقق من التسلسل، وشهادة التحليل.
عامل مسكن (هيدروكلوريد البوبرينورفين)	MCE	HY-B0071	تخدير حول العمليات وجراحة ما بعد العملية. جرعة نموذجية: 0.05-0.1 ملغ/كغ تحت الجلد كل 8-12 ساعة لمدة 24-48 ساعة.
نظام توصيل التخدير	RWD Life Science	R500 مع المبخر R580	يُستخدم لتوصيل الأيزوفلوران أثناء التصوير. تدفق الأكسجين النموذجي: 0.5-1.0 لتر/دقيقة.
عامل التخدير (الأيزوفلوران)	RWD Life Science	سلسلة R510-22	يُستخدم في تخدير التصوير. الإعدادات النموذجية: 3-4% للحث و1-2% للصيانة.
غطاء زجاجي	مُعد حسب الطلب	لا يوجد رقم كتلوجي	غطاء زجاجي معقم رقم 1.5 الحجم لتغطية نافذة جمجميّة بحجم 3 × 3 ملم بالكامل والجلوس بشكل مسطح على حافة الجمجمة.
ملاط الأسنان/اللاصق	Sun Medical	Super-Bond C&B; VZB/JAP8147	يُستخدم في إغلاق النافذة القحفية وتثبيت لوحة الرأس التيتانيوم. تحضير نموذجي: مغرفة مسحوق واحدة، قطرة محفز واحدة، و4 قطرات من المونومر. صلابة حوالي 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
مثقاب الأسنان	RWD Life Science	microdrill 78001	مثقاب عالي السرعة يُستخدم لترقيع الجمجمة وشق الجمجمة. استخدم حوالي نصف السرعة القصوى مع تبريد متكرر بمحلول ملحي.
محلول مطهر	Winner Medical	بوفيدون-يودين/إيودوفورو و70% إيثانول	يُستخدم لتحضير فروة الرأس قبل الجراحة. قم بتطبيق المطهرات بالتناوب لمدة ثلاث دورات.
ملقط ناعم	JZ Brand	JD1050/JD1070	يُستخدم لإزالة الغشاء الغضروفي، ومعالجة الأنسجة، ورفع غطاء العظم.
إبرة التزويد	RWD Life Science	20G، 38 ملم، طرف كرويّ	يُستخدم لتناول NMN عن طريق الفم.
لوحة الرأس	مُعد حسب الطلب	لا يوجد رقم كتلوجي	لوحة رأس من التيتانيوم بفتحة مركزية حوالي 10 ملم متوافقة مع حامل التصوير.
وسادة تسخين/جهاز تحكم في درجة الحرارة	RWD Life Science	69020 مع لوحة 69023	يُستخدم للحفاظ على درجة حرارة الجسم حوالي 36.5-37.5 درجة مئوية أثناء الجراحة والتصوير.
برنامج الحصول على الصور	Nikon	NIS-Elements AR/AR Analysis v5.42.06	يُستخدم للتحكم في المجهر وتسجيل الصور. تشمل الإعدادات النموذجية 512 × 512 أو 1024 × 1024 بكسل، وخطوة z من 1-3 ميكرومتر، وفترة التقاط الصور بمعدل 1 ثانية.
برنامج تحليل الصور	NIH	Fiji/ImageJ v1.8.0 أو أحدث	يُستخدم لتصحيح الحركة، واختيار منطقة الاهتمام، وطرح الخلفية، واستخراج الشدة، وتصدير CSV.
إمدادات الحقن الوريدي	BD	329461	محقنة إنسولين معقمة سعة 1 مل مع إبرة 29G للحقن في AAV، وTMR-dextran، وNMN.
NMN (نيكوتيناميد أحادي النوكليوتيد)	Selleck Chemicals	S5259	سلف NAD+ يُستخدم لتجارب شرب الماء، والتناول عن طريق الفم، والحقن الوريدي.
مرهم العين	صيدلية محلية معتمدة	غير قابل للتطبيق	يُستخدم لمنع جفاف القرنية أثناء التخدير.
محلول فوسفات عازل (PBS)	Servicebio	G4202-100ML أو G4202-500ML	محلول PBS معقم 1× يُستخدم لتخفيف الفيروسات، وتحضير المتتبع، وشطف الأنسجة، وتحضير الكواشف.
نظام مراقبة التنفس	RWD Life Science	وحدة مراقبة متكاملة	يُستخدم لمراقبة التنفس ومستوى التخدير أثناء الجراحة والتصوير.
محلول ملحي (0.9% NaCl، معقم)	Servicebio	G4702-500ML	يُستخدم لتبريد الجمجمة، والغسل، وترطيب الأنسجة، وتحضير المحلول.
إطار ستيريوتكسي/حامل الرأس	مُعد حسب الطلب	لا يوجد رقم كتلوجي	يُستخدم لتثبيت الوضعية أثناء جراحة النافذة القحفية والتصوير.
مجهر جراحي	Olympus	SZ61	يُستخدم أثناء جراحة النافذة القحفية لترقيع الجمجمة وشق الجمجمة ووضع الغطاء الزجاجي.
TMR-dextran (70 kDa)	Thermo Fisher Scientific / Invitrogen	D1818	متتبع فلوري داخل الأوعية يُستخدم لتسمية الإشارة المرجعية للأوعية الدموية. التركيز النموذجي: 10-25 ملغ/مل. حقن بمعدل 20 ملغ/كغ والسماح بفترة تداول 5-10 دقائق قبل التصوير.
ليكتين الطماطم (DyLight 488)	Vector Laboratories	DL-1174	يُستخدم للتحقق من الأوعية الدموية/الأوعية البطانية بعد الحدث.
مجهر ثنائي الفوتون	Nikon	A1R