تقنيات تحديد فعالة ل 61 صنفا من شاي الزيت (Camellia oleifera abel) باستخدام استراتيجية MCID وعلامات الحمض النووي

ملخص

استخدمت هذه الدراسة مخطط تحديد الأصناف يدويا (MCID) مشتقا من أنماط ربط الحمض النووي متعدد الأشكال العشوائي المضخم (RAPD) لتحديد 61 صنفا من الكاميليا أوليفيرا أبل بكفاءة وتكرار لاستخدام موارد الوراثة وتحديد أصناف الشاي الزيتية.

الملخص

من الضروري تحديد مواد وأصناف الوراثة من الكاميليا أوليفيرا أبيل [شاي الزيت (أوتي)] لتقييم موارد الوراثة وتقييم آليات حماية أصناف أوت. استخدمت هذه الدراسة تقنية RAPD محسنة من خلال زيادة طول برايمر RAPD وفحص درجة حرارة التلدين PCR، والتي حددت 61 صنفا من Ot من مناطق مختلفة. علاوة على ذلك، تم تطوير MCID لتصميم علامات فعالة لتحديد الأصناف. من بين 80 برايمر عشوائي من 11-NT في RAPD، تم اختيار 10 بادئات تنتج نطاقات متعددة الأشكال (PBs) لتحليل PCR للأصناف ال 61. علاوة على ذلك، تم استخدام استراتيجية MCID لتمييز 61 صنفا يدويا بناء على الصبغات الدقيقة التي لوحظت في بصمات الحمض النووي من 10 بادئات، والتي أنتجت مخطط تحديد الأصناف المبكرة (Ot-CID). أشار هذا المؤشر الطبي القديم لكل صنف بشكل منفصل، مستخدما PBs لتحديد الصنف، مع وضع البادئات المناسبة بدقة على ال OT-CID. توفر استراتيجية MCID نهجا بسيطا وعمليا لتحديد النباتات باستخدام علامات الحمض النووي. علاوة على ذلك، يوفر هذا النهج طريقة عملية وفعالة لتحديد الأصيل. وقد ميز اختبار Ot-CID الناتج الذي ضم 61 صنفا من Ot متحورات Ot باستخدام علامات RAPD، مما سهل تمايز الأصناف لحماية الأصناف وتحديد الشتلات مبكرا في صناعة المشتل.

المقدمة

الكاميليا أوليفيرا أبيل [شاي الزيت (Ot)] هو من أهم أنواع أشجار الزيت الخشبية الصالحة للأكل في العالم¹. تعتبر الصين مركز الأصل والتنوع للعتة، مع وجود موارد وراثية وفيرة². التقليد القديم للعتة، والتكاثر النباتي، وبرامج التربية العالمية المتنوعة أدت إلى ظهور العديد من الأصناف³. أدى الزراعة العالمية الواسعة لزراعة الأوت إلى ظهور أصناف تحمل أسماء متشابهة (أصناف مميزة تحمل نفس الاسم) ومرادفات (أصناف تحمل أكثر من اسم ^واحد). لذلك، من الضروري تطوير تقنيات لإدارة مجموعة واسعة من الوراثة الوراثية الزائدة والتمييز الدقيق بين الأصناف^{المختلفة 3,5}.

على الرغم من تطبيق مؤشرات جزيئية قائمة على الحمض النووي في توصيف الأصناف والأبحاث الجينية وتحديد الأصناف الجزيئية، والتي يمكن أن توضح التنوع الجيني وتميز أفراد النباتات، لم تنجح أي دراسة في تحديد عدد كبير من أصناف Ot أو توفير أساس موثوق لتمايز الأصناف 6,7,8,9 . نقص الطرق الموثوقة هو القيد الأساسي لتطبيق علامات الحمض النووي في تحديد المحاصيل النباتية. قد يكون ذلك لأن التقنيات التحليلية المستخدمة لبصمات الحمض النووي لا تستطيع تقديم معلومات ذات صلة تحدد بشكل واضح البادئات والعلامات متعددة الأشكال لتمييز الأصناف التي تتطلب تحديدا. التقنيات التحليلية لأنماط ربط الحمض النووي (المعروفة بتحليلات العنقود) غير مناسبة للتمييز الفعال بين الأصناف أو الأنواع.

على الرغم من تطوير بطاقات تعريف جزيئية للحمض النووي (IDs) لأكثر من 200 صنف من Ot باستخدام علامات SNP ^2,3,10,11، إلا أن هناك عدة تحديات: (1) جينوم Ot معقد، حيث أن غالبية الكاميليا المزروعة سداسية الصيغة الصبغية، بينما الجينوم المرجعي المستخدم لبناء الهويات الجزيئية للحمض النووي هو ثلاثي الصبغيات، مما قد يؤدي إلى بعض الأخطاء³. (2) تسلسل الجينوم الكامل مكلف، خاصة للمختبرات ذات المرافق المحدودة، مما يمنع تطبيقه الواسع لتحليل الأصناف واسعة النطاق. علاوة على ذلك، تتطلب منتجات تضخيم PCR التسلسل أو الكشف عن الفلورة، مما يزيد من تعقيد العملية¹². (3) في غياب علامات تمييزية للأصناف الجديدة، من الضروري تطوير بادئات علامات جديدة، والتي ستتطلب أيضا إعادة ترميز رموز بطاقات الهوية للأنواع الحالية. ينتج عن ذلك كمية هائلة من مواقع الكود، مما يقلل من فعالية تفاضل المتنوعات. لذلك، من الضروري استخدام تقنية توفر تحققا سهلا وموثوقا وقابلا للمرجعية وعمليا لأصناف أوتيت لقطاع مشتل أوتون، والأعمال الزراعية، وحماية براءات النباتات، وحفظ وتقييم^{الموارد} الوراثية.

اعتمدت الاستراتيجيات التقليدية لتحديد الأصناف على الخصائص الشكلية والفسيولوجية والزراعية، لكن هذه الخصائص لها حدود لأنها عرضة للتأثيرات البيئية وتتطلب تقييما شاملا للنباتات الناتجة بالكامل^13,14. علاوة على ذلك، تتمتع العلامات الجزيئية بميزة واضحة بعدم تأثرها بالمتغيرات البيئية، مما يجعلها أداة فعالة لتوصيف الأصناف^{بدقة 14,15}. مؤخرا، تم إنشاء مؤشرات قائمة على الحمض النووي لتقييم البصمات، والتنوع الجيني، والصنف، والنقاء^{16، 17، 18، 19، 20، 21، 22.} يعد مؤشر RAPD مفيدا لتحليل الأصناف بسبب بساطته وكفاءته وعدم الحاجة إلى بيانات التسلسل السابقة^23,24. يمكن تعزيز نهج RAPD باختيار بادئات 11 نيوكليوتيد (nt) مع درجة حرارة التلدين PCR المحددة لتطبيقها في بصمات النباتات، مما يجعل RAPD طريقة مفضلة لتحديد أصناف النباتات وتقييم التنوع الجيني^25,26. تم استخدام هذه العلامات على نطاق واسع في دراسات تمايز المحاصيل والارتباط الجيني لأنواع نباتية مختلفة، بما في ذلك المشمش²⁷، والخوخ الزخرفي²⁸، والرمان²⁹، والسلالات الأرضية²⁰، والجوز³⁰ (تشيلسيز وآخرون، 2025). على الرغم من استخدامها الواسع على نطاق واسع، لا تزال العديد من الطرق القائمة على علامات الحمض النووي غير عملية أو مبسطة بما يكفي لتحديد أصناف النباتات بشكل روتيني.

لذلك، استخدمت هذه الدراسة تقنية تحليلية جديدة للتعرف القابل للتكرار على أصناف Ot المختلفة. تم اشتقاق MCID من أنماط الربط RAPD التي ميزت 61 صنفا من Ot لاستخدام موارد الوراثة وتحديد الأصيل.

استراتيجية RAPD-MCID الموضحة هنا (الشكل 1) هي الأنسب لتوصيف البلازم الوراثي على نطاق صغير إلى متوسط في المختبرات التي تحتوي على بنية قياسية للتحليل الكهربائي PCR والهلام ولكن مع إمكانية الوصول المحدود إلى مرافق التسلسل. كما أنه مناسب جدا للفحص الأولي السريع والفعال من حيث التكلفة قبل إجراء تحليلات جينية أكثر تفصيلا. تشمل الحدود التشغيلية الأساسية للطريقة اعتمادها على العلامات السائدة والحاجة إلى توحيد دقيق لشروط PCR لضمان قابلية التكرار عبر المختبرات. بالنسبة لبنوك الوراثة واسعة النطاق أو تسجيل الأصناف القانونية، يوصى باستخدام علامات مهيمنة مشتركة مثل SSRs أو SNPs بشكل تكميلي.

البروتوكول

1. المواد النباتية

1. اجمع الأوراق الصغيرة من البراعم الصحية والنامية بنشاط لكل صنف شاي زيتي من المستودع الوطني لجرثومة الكاميليا، مقاطعة شوتشنغ، مقاطعة أنهوي.
2. راجع الجدول 1 لأسماء وأصول هذه الأصناف.

2. استخراج الحمض النووي الجيني

1. استخلاص الحمض النووي الجيني الكامل باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي النباتي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. تم إزالة الحمض النووي باستخدام 1× TE. بعد الاستنتاج، تأكد من أن محلول الحمض النووي المستخرج يبدو صافيا وعديم اللون. قس تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف ميكرو حجم.
3. اضبط تركيز الحمض النووي إلى 30 نانوغرام·^{ميكرولتر-1} مع 1× مخزن TE وتخزين محلول الحمض النووي المعدل عند -20 درجة مئوية.

3. اختيار البرايمر في RAPD

1. طور 80 بادئيا عشوائيا لتحليل RAPD وحللها باستخدام بعض الأنماط الجينية. اختر بادئات RAPD بدرجة 11-NT تنتج أنماط تجمع واضحة وواضحة عبر جميع الأنماط الجينية المختبرة.
2. استخدم المبادرات المختارة للتصنيف الجيني لزيادة مصداقية الشظايا المضخمة. اختر 10 بادئات محلولة جيدا مع أشرطة قابلة للتكرار لمزيد من التحليل، كما هو موضح في الجدول 2.

4. اختبار PCR متعدد الأشكال المضخم العشوائي (RAPD)

1. تحضير تفاعلات التضخيم عن طريق تعديل بسيط للطريقة²³ الموصوفة سابقا. جهز محاليل التفاعل وفقا للتركيب المدرج في الجدول S1.
2. إجراء PCR باستخدام جهاز تدوير حراري مع الشروط التالية: ما قبل التعقيم عند 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ 42 دورة إزالة الطبيعة عند 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، والتلدين لمدة دقيقة واحدة عند درجة الحرارة المثلى المدرجة في الجدول 2، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ وتمديد أخير عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

5. الكشف والتحليل لمنتجات PCR

1. فصل شظايا الحمض النووي المضخمة بواسطة الرحلان الكهربائي الهلام عند 100 فولت في 1.3٪ أغاروز (w/v) تم تحضيره في 1× TAE buffer يحتوي على 0.001 M EDTA و0.04 M تريس-أسيتات عند pH 8.0. صبغ الجل ببروميد الإيثيديوم بقوة 0.5 ميكروغرام·^{ميكرولتر-1}.
   تحذير: بروميد الإيثيديوم هو طفرة قوية. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل مع محاليل بروميد الإيثيديوم أو الجل المصبوغ.
2. شغل الجل بجهد ثابت 100 فولت لمدة 45–60 دقيقة، أو حتى تنتقل مقدمة صبغة بروموفينول الزرقاء تقريبا إلى ثلثي طول الجلام. بعد التلوين وإزالة الصبغ، راقب الهلام تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية.
   ملاحظة: تأكد من أن نطاقات DNA مميزة مرئية بوضوح تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية. تأكد من أن سلم الحمض النووي يظهر نطاقات حادة ومنفصلة جيدا تتراوح بين 100 نقطة رأس إلى 2000 بن في الطلقة.
3. سجل النطاقات متعددة الأشكال (PBs) للأصناف بناء على وجودها أو غيابها تحت أشعة فوق البنفسجية.
4. قم بإجراء كل تضخيم PCR على ثلاث نسخ لضمان قابلية التكرار. قم بتقييم النطاقات فقط التي تكون موجودة أو غائبة بشكل ثابت عبر النسخ المستقلة الثلاثة للتحليل اللاحق. تأكد من أن معدل التوافق في تسجيل النطاق بين النسخ يتجاوز 95٪.

6. تحليل البيانات

1. قم بتقييم الأشرطة لتحديد الأصناف بناء على وجودها أو غيابها عن طريق تعيين "+ o" للأشرطة المرئية بوضوح و"−" للأشرطة الغائبة في موقع الحجم الجزيئي المقابل عبر جميع الأصناف. ادرج فقط النطاقات التي تلاحظ باستمرار عبر ثلاث نسخ مستقلة.
2. صنف الأصناف التي تحتوي على أشرطة مميزة في البصمة التي ينتجها تمهيد واحد بشكل مستقل. صنف الأصناف التي لها أنماط ربط متطابقة ضمن نفس المجموعة الفرعية. قم بالتمييز بين جميع أصناف الشاي الزيتي تدريجيا وبشكل كامل بناء على هذه المعايير.

7. تطبيق المخطط وكفاءته في تحديد الأصناف

1. اختر عشوائيا مجموعتين من أصناف الشاي الزيتي من بين المجموعات الداخلية وبين المجموعات للتحقق من تطبيق ووظيفة المخطط الذي يوضح 61 صنفا من أنواع الشاي الزيتي. قم بالاختيار يدويا من خلال الرجوع إلى فروع مختلفة من مخطط Ot-CID، دون استخدام أي برنامج.
   ملاحظة: تم اختيار مجموعتين من أصناف Ot عشوائيا للتحقق من تطبيق ووظيفة المخطط الذي يوضح 61 صنفا من Ot.
2. حدد المجموعتين المختارتين ك "أ" و"ب". قم بفحص المقدمات المناسبة لكل مجموعة من OT-CID.

8. إرشادات التخلص من النفايات الخطرة

1. جهز وتعامل مع جميع محاليل بروميد الإيثيديوم في منطقة محددة. اجمع جميع النفايات الصلبة الملوثة بروميد الإيثيديوم والنفايات السائلة بشكل منفصل للتخلص منها وفقا لإرشادات النفايات الخطرة المؤسسية.
2. التخلص من جميع المواد الملوثة ببروميد الإيثيديوم في حاويات النفايات الخطرة المخصصة. تواصل مع مكتب الصحة والسلامة البيئية المؤسسي للحصول على إجراءات التخلص المعتمدة إذا لم يكن متأكدا.

النتائج

توضح النتائج التمثيلية المعروضة هنا سير العمل الكامل لاستراتيجية RAPD-MCID، من الفحص الأولي للبرايمر مرورا بالتمييز الهرمي بين الأصناف وصولا إلى التحقق النهائي. تم توثيق عملية التمييز التدريجي في الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4، الشكل 5، الشكل 6، والتي توضح مجتمع...

المناقشة

علامات الحمض النووي هي أدوات قوية تستخدم لتحديد أصناف النباتات وأنواع^{النوع. 24}. تم تطوير هذه العلامات واستخدامها في آلاف الدراسات حول التحليل الجيني، وتحديد الأصناف، وغيرها؛ ومع ذلك، فهي ليست سهلة ولا تستخدم على نطاق واسع في التصنيف الجيني^24,31. ويرجع ذلك إلى نقص الطرق الفعالة والسهلة التي تستخدم علامات الحمض النووي لتحديد الأصناف أو الأشجار التطورية أو بصمات الأصابع. على الرغم من أن استخدام علاما...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Centrifuge	Eppendorf، ألمانيا	5427R	يستخدم لاستخراج الحمض النووي الجيني من أوراق الشاي الزيتي
Hi-DNAsecure Plant Kit	Tiangen، الصين	DP350	يستخدم لاستخراج الحمض النووي الجيني من أوراق الشاي الزيتي
جهاز تضخيم جين PCR	Monad، الصين	MP60901	يستخدم لتضخيم PCR
SolarRed Agarose LE	Solarbio، الصين	A8202	يستخدم لفصل الكهرباء لشظايا PCR
TAE	Tsingke، الصين	TSG001	يستخدم لفصل الكهرباء لشظايا PCR
TaKaRa Ex Taq	Takara، اليابان	RR001A	يستخدم لتضخيم PCR
مقياس الطيف الضوئي Thermo Scientific NanoDrop 2000C	ABI، الولايات المتحدة الأمريكية		يستخدم لتحديد تركيز الحمض النووي الريبي