مقالة منهجية

عزل والتحقق من صحة مجموعات الخلايا الجذعية المتوسطة الإيجابية لبودوبلانين باستخدام استراتيجية خرز مغناطيسي غير مباشر

DOI:

10.3791/71365

⸱

يونيو 23, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Joint Surgery and Sports Medicine, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, 2Biomedical Innovation Center, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة فرز تعتمد على الخرزات المغناطيسية باستخدام الأجسام المضادة لقياس تدفق الخلايا الموسومة ب phycoerythrin (PE) وحبيبات دقيقة مضادة ل PE لعزل مجموعات فرعية محددة من الخلايا الجذعية الميزنشيمية ذات إيجابية عالية في علامات الهدف بعد الفرز ونشاط تكاثر/أيض قائم على CCK-8 تحت الظروف المختبرة، دون الحاجة إلى فرز خلايا باهظة الثمن أو خرزات مخصصة مخصصة لكل هدف.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد دراسة التغاير الوظيفي في الخلايا الجذعية الميزنشيمية على العزل الفعال لمجموعات فرعية محددة (مثل الخلايا الإيجابية للبودوبلانين (PDPN)). ومع ذلك، بالنسبة لمعظم أهداف البروتينات الغشائية، فإن الخرزات المغناطيسية التجارية المتاحة مباشرة للفرز محدودة. لمعالجة ذلك، أنشأ مختبرنا واختبر بروتوكول فرز الخرزات المغناطيسية الموحد بناء على مبدأ الاقتران غير المباشر ل "الأجسام المضادة للتدفق الخلوي الموسومة ب phycoerythrin (PE)/خرزات مغناطيسية مضادة ل PE." باستخدام الخلايا الإيجابية ل PDPN كنموذج للسكان المستهدفين، يثري هذا البروتوكول نسبة الخلايا المستهدفة دون الاعتماد على فرز الخلايا المتدفق المكلف.

يمكن للباحثين استخدام أجسام مضادة متوافقة مع قياس تدفق الخلايا الموسومة ب PE تستهدف بروتينات سطح الخلية المتاحة ودمجها مع حبيبات دقيقة مضادة للبزوير المبكرة المتوفرة تجاريا لإنشاء سير عمل فرز للأهداف المحددة بعد تحسين خاص بالهدف. يتجنب هذا النهج أوقات التسليم الطويلة والتكاليف العالية المرتبطة بتخصيص أو طلب خرز مغناطيسي خاص بالهدف لكل هدف جديد، مما يجعله مناسبا بشكل خاص لعلامات السطح النادرة أو غير المدروسة بشكل كاف. في نظام نموذج PDPN الذي تم اختباره هنا، مكن البروتوكول من إثراء الفئة الفرعية المستهدفة بإيجابية عالية لشبكة PDPN بعد الفرز، وحافظ على نشاط الانتشار/الأيض القائم على CCK-8 مقارنة بالخلايا الصلبة الصلبة غير المفترضة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في مجال جراحة العظام، غالبا ما تؤدي الإصابات مثل تلف الغضاريف والآفات في المنطقة الوعائية (المنطقة البيضاء) من الغضروف الهلالي إلى تدمير المفاصل بشكل لا رجعة فيه وفقدان الوظيفة، مما يؤدي في النهاية إلى التهاب المفاصل العظمي. ويرجع ذلك إلى ضعف القدرة التجديدية لهذه الأنسجة، والتي تنبع من نقص الدم المباشر والإمداد اللمفاوي، بالإضافة إلى وجود خلايا شديدة التمايز ذات قدرة محدودة على التكاثر والهجرة 1,2,3,4. لمواجهة هذا التحدي، تم استكشاف استراتيجيات سريرية مختلفة، بما في ذلك استخدام الإكسوسومات 5,6، وزراعة الخلايا الغضروفية الذاتية أو المجينة 7,8، وطرق هندسة الأنسجة 9,10,11,12. في السنوات الأخيرة، برزت الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) كمصدر واعد للخلايا للإصلاح التجديدي، بفضل قدرتها على التمايز متعدد السلالات وخصائصها المناعية، مما يمنح أملا جديدا لتجديد الغضاريف 13,14,15,16.

على الرغم من إمكاناتها العلاجية، تظهر الخلايا الجبينية الجزيرة تباينا كبيرا. حتى داخل مصدر نسيج واحد، مثل نخاع العظم أو الحبل السري، يمكن أن تظهر مجموعات فرعية مميزة من الخلايا الجذرية الصلبة الصلبة تنوعا كبيرا في قدرة التكاثر، وإمكانات التمايز متعدد السلالات (خصوصا التمايز الغضروطي)، ووظيفة التجدد في الجسم الحي 17,18,19. لذلك، فإن التحديد الدقيق وعزل مجموعات MSC الفرعية المعرفة وظيفيا — مثل تلك ذات القدرة الغضروفية المعززة — أمر ضروري لتعزيز فهمنا لخصائصها البيولوجية وتحسين فعالية إصلاح الغضاريف. يمثل هذا خطوة حاسمة في بحثنا.

مع تقدم الأبحاث، تم تحديد عدد متزايد من بروتينات الغشاء الجديدة كعلامات على مجموعات فرعية متميزة وظيفيا من البروتينات الملوثية الصبغية. ومع ذلك، لا يزال تحويل هذه الاكتشافات إلى استراتيجيات فعالة لفرز الخلايا تحديا تقنيا. فرز الخلايا التقليدي المنشط بالفلورة (FACS)، رغم قوته، يتطلب أجهزة متخصصة وخبرة تقنية، مما يحد من إمكانية الوصول إليه في العديد من المختبرات. من ناحية أخرى، فإن فرز الخلايا المناعية المغناطيسية — رغم استخدامه على نطاق أوسع — مقيد بتوفر محدود للكواشف التجارية، التي تصمم أساسا لعدد قليل من الأهداف الأغشائية المعروفة. وبالتالي، بالنسبة للعديد من العلامات المكتشفة حديثا ذات الأهمية البيولوجية المحتملة، لا توجد خرز مغناطيسي متاحة تجاريا، مما يصعب إثراء هذه التجمعات الفرعية القيمة من MSC بشكل محدد.

لتجاوز هذا القيد، تهدف الدراسة الحالية إلى وضع وتوحيد بروتوكول مرن وفعال من حيث التكلفة وكفاءة للاختيار الإيجابي للخلايا. يعتمد هذا النهج على الاقتران غير المباشر للأجسام المضادة المتقاربة ب فيكوإيريثرين (PE) المتوفرة تجاريا مع خرز مغناطيسي مناعي مضاد ل PE. أظهرت تقارير سابقة أن الخلايا العظيمية الإيجابية للبودوبلانين (PDPN+) تمتلك قدرة أفضل على الحفاظ على الجذع والتمايز مقارنة بنظيراتها من PDPN20. علاوة على ذلك، تم توثيق مشاركة الخلايا الصلبة الصلبة لنمط PDPN+ في تجديد الغضروف وتطور التهاب المفاصل العظمي (OA) في الأدبيات21,22. باستخدام بودوبلانين (PDPN)—وهو مؤشر مرشح تم تحديده مؤخرا لمجموعات MSC الوظيفية الفرعية—كهدف نموذجي، قمنا بفرز الخلايا الإيجابية ل PDPN من الخلايا الصلبة الصلبة المشتقة من نخاع العظم. نقدم بروتوكولا تفصيليا خطوة بخطوة يغطي تحضير تعليق الخلية الواحدة، ووضع علامات الأجسام المضادة وخرز المغناطيسية، والفصل المغناطيسي. علاوة على ذلك، نقوم بتقييم الإنتاجية، وإيجابية PDPN بعد الفرز، والنشاط الأيضي القائم على CCK-8 للخلايا المفترضة. من خلال توحيد هذا البروتوكول، نهدف إلى توفير طريقة متعددة الاستخدامات وسهلة الوصول للباحثين لعزل مجموعات الخلايا المستهدفة باستخدام الأجسام المضادة المتوافقة ضد مؤشرات سطح الخلية المتاحة، مما يسهل أبحاث الخلايا الجذعية الأساسية والتطبيقات الانتقالية المستقبلية في الطب التجديدي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على MSCs المشتقة من نخاع العظم البشري تجاريا (انظر جدول المواد). أكد المورد هوية MSC من خلال التعبير الإيجابي ل CD73 وCD90 وCD105؛ التعبير السلبي عن CD34 وCD45 وHLA-DR؛ وإمكانية التمايز الثلاثي السلالي. تم توسيع الخلايا في الزراعة واستخدامها في المقاطع 3–5. تم تنفيذ جميع أعمال الخلايا المشتقة من الإنسان في خزانة أمان بيولوجية من الفئة الثانية تحت ظروف معقمة. وبما أن الخلايا تم الحصول عليها تجاريا ولم يتم تجنيد أو أخذ عينات مباشرة من البشر في هذا البروتوكول، لم تكن هناك حاجة لموافقة مباشرة من المجلس الداخلي المستقل.

1. تحضير نظام التعليق أحادي الخلية

ملاحظة: جودة نظام التعليق أحادي الخلية تؤثر مباشرة على كفاءة الفرز. تأكد من أن الخلايا منتشرة بشكل جيد، وقابلة للحياة بشكل كبير، وخالية من التكتلات. يجب توزيع الكتل المرئية بتكرار الماصات اللطيفة حتى لا تعد الكتل مرئية.

  1. مختارة من MSCs (مقاطع 3–5) التي وصلت إلى التقاء بنسبة 80–90٪. تخلص من وسيط الثقافة.
  2. اغسل الخلايا بجرعات 2 × 10 مل من PBS المسخن مسبقا. هز الوعاء بلطف وتخلص من PBS.
  3. أضف 2 مل من 0.25٪ من تريبسين-إيدتا وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 3–5 دقائق. راقب الخلايا تحت المجهر حتى تتجمع وتبدأ في الانفصال.
  4. أضف 4 مل من وسط الزراعة الذي يحتوي على 16.5٪ FBS (انظر جدول المواد) لتحييد التربسين. قم بعمل الماصة بلطف على الخلايا لضمان الانفصال الكامل. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي بحجم 15 مل.
    ملاحظة: تحقق تحت المجهر للتأكد من أن جميع الخلايا قد تم جمعها.
  5. الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 3 دقائق ثم تخلص من السوبرناتانت.
  6. أعد تعليق حبيبة الخلية في 1 مل من المخزن (انظر جدول المواد). تابع عد الهاتف.

2. عد الخلايا وضبط التركيز

ملاحظة: إذا كان العدد الكلي للخلايا أقل من 1 × 107، فلا يزال يضيف الأجسام المضادة والكواشف المغناطيسية بناء على الحجم القياسي لخلايا 1 × 10إلى 7 لضمان كفاءة الوسم.

  1. قم بعمل جهاز تعليق الخلية مرة أخرى عند 300 × جرام لمدة 3 دقائق وتخلص من السوبرناتانت.
  2. أعد تعليق الخلايا في المخزن لتحقيق كثافة 1 × 108 خلايا/مل.
    ملاحظة: على سبيل المثال، لمعالجة 1 × 107 خلايا، أعد تعليق الحبيبة في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت.
  3. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب بوليسترين دائري قاع بسعة 5 مل.

3. وضع علامات الأجسام المضادة

  1. أضف 10 ميكرولتر من حاجب FC جاما RII (انظر جدول المواد) لكل 1 × 107 خلايا. اخلط بلطف واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  2. أضف 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة PDPN المضادة للبشرية المتقاربة ب PE (انظر جدول المواد) لكل 1 ×10 7 خلايا، وفقا للتركيز الموصى به من الشركة المصنعة. اخلط بلطف وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15–20 دقيقة، محميا من الضوء.
    ملاحظة: يجب تعديل حجم الأجسام المضادة وفقا لورقة بيانات الجسم المضاد لقياس التدفق الخلوي المستخدم، حيث قد تختلف التركيزات بين المنتجات.

4. وضع العلامات المغناطيسية على الخرزات

ملاحظة: احتفظ بجميع المواد الكيميائية على الثلاجة قبل الاستخدام وأعدها إلى الثلج فورا بعد كل إضافة للحفاظ على النشاط والاتساق.

  1. أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل الانتقاء لكل 1 × 107 خلايا (انظر جدول المواد). اخلط بلطف وحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  2. أضف 5 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية لكل 1 × 107 خلايا (انظر جدول المواد). اخلط بلطف واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: قم بتدوير الدوامة بقوة لمدة 30 ثانية قبل الاستخدام لضمان التشتت المتساوي.

5. الفصل المغناطيسي

  1. ضع أنبوبا من البوليسترين ذو قاع دائري بسعة 5 مل يحتوي على عينة الخلية الموسومة في حامل الفصل المغناطيسي (انظر جدول المواد).
  2. أضف المخزن إلى الأنبوب ليصل الحجم الكلي إلى 2.5–3 مل. حضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بالفصل: عند تثبيت المغناطيس والأنبوب معا كوحدة واحدة، قلبهما لصب المادة الفائقة في أنبوب جمع جديد. يحتوي هذا الجزء المجمع على الخلايا السلبية ل PDPN؛ أبق هذا الأنبوب على الثلج.
    ملاحظة: لا تقم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي أثناء هذه الخطوة، لأن ذلك سيعطل الفصل ويؤدي إلى فشل الإجراء.
  4. كرر الخطوات 5.1–5.3 3x. في كل مرة، أضف المخزن إلى الأنبوب الأصلي في المغناطيس، انتظر 5 دقائق، ثم صب المادة الفائقة في نفس أنبوب جمع الكسور السالبة المستخدم في الخطوة 5.4.
  5. بعد الغسل النهائي، أزل الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا المرتبطة مغناطيسيا من الحامل. يحتوي هذا الأنبوب على نسبة الخلية الإيجابية ل PDPN.
  6. أضف 3 مل من المخزن لإعادة تعليق الخلايا الإيجابية. انقل هذا التعليق إلى أنبوب جديد ومعنون (أنبوب الكسر الموجب).

6. جمع وزراعة والتحقق من صحة الخلايا المستهدفة

  1. عد الخلايا من أنبوبي الكسور الموجبة والسالبة. سجل عائد الخلية لكل جزء.
  2. قم بجهاز الطرد المركزي بتعليق الخلايا الإيجابية بنسبة 300 × جرام لمدة 3 دقائق. تخلص من السوبرناتانت.
  3. أعد تعليق الحبيبات الخلوية في وسط مزرعة MEM ألفا يحتوي على 16.5٪ FBS. قم بضبط كثافة الخلايا حسب الحاجة وازرع الخلايا في ألواح أو قوارير مزرعة.
  4. حضن الخلايا عند حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ بنسبة 5٪.

7. تحضير العينة للنقاء والتحقق الوظيفي

  1. عد الخلايا وزرعها على طبق زراعة بحجم 100 مم بكثافة 3 × 10إلى 6 خلايا لكل طبق في وسط زراعة بسعة 12 مل. بعد أربع وعشرين ساعة من البذر، راقب التصاق الخلايا. استبدل وسط الزراعة بوسط جديد لإزالة أي خرز مغناطيسي متبقي وخلايا غير ملتصقة.
  2. احصد الخلايا عن طريق التريبسين. قم بعمل الماصة بلطف للأعلى والأسفل بمقدار 10–15 مرة لإزالة وإزالة الخرزات المغناطيسية والأجسام المضادة المتبقية.
  3. قيم نسبة الخلايا الموجبة ل PDPN-PE باستخدام قياس تدفق الخلايا (انظر الملف التكميلي 1 للبروتوكول المفصل).
  4. اجمع الخلايا خلال مرحلة النمو اللوغاريتمي. زرعها في صفيحة بها 96 بئرا. في نقاط زمنية مختلفة (0 ساعة، 24 ساعة، 48 ساعة، 72 ساعة)، أضف كاشف CCK-8 (انظر جدول المواد) وقس الامتصاص وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. رسم منحنى الانتشار بناء على البيانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المبدأ العام وسير العمل للتجربة موضحان في الشكل 1. جميع البيانات التجريبية اللاحقة تعتمد على خلايا الممر 5. بعد الفصل المغناطيسي، تم زراعة خلايا PDPN+ التي تم الحصول عليها لمدة 24–48 ساعة. بعد استبدال وسط الزراعة لإزالة الخلايا غير الملتصقة والخرزات المغناطيسية المتبقية المحتملة (الشكل 2A)، قمنا بتقييم كفاءة الفرز وعائد الخلية. بدءا من مجموعة أولية من 1 × 10 إلى7 MSCs، كان العدد النهائي للخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، أنشأنا بروتوكولا يعتمد على الخرزات المغناطيسية لعزل خلايا PDPN+ عن الخلايا العضلية الصلبة المشتقة من نخاع العظم. يتيح هذا النهج إثراء فعال للسكان الفرعيين الإيجابيين ل PDPN مع الحفاظ على التكاثر/النشاط الأيضي القائم على CCK-8 تحت الظروف المختبرة.

مقارنة بطرق الفرز المناعي المغناطيسي المباشر التقليدية، تكمن الميزة الأهم في هذه الاستراتيجية في تعدد استخداماتها. تتطلب الطرق التقليدية تطوير أو تخصيص خرزات مغناطيسية محددة لكل علامة جديدة ذات اهتمام<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون لا يفرضون أي تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نعبر عن امتناننا للبروفيسور بيان ليمينغ والبروفيسور تشانغ كونيو من كلية العلوم الطبية الحيوية والهندسة، الحرم الجامعي الدولي، جامعة جنوب الصين للتكنولوجيا، على توفير المنصة التجريبية والإرشاد. تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة الصين للعلوم ما بعد الدكتوراه (2023M734022)، ومؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية (2023A15151111162)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82502983).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
7-AAD Cell Viability Assay KitKeyGENKGD1202-50
Anti-human CD32 Blocker (Fc gamma RII Blocker)STEMCELL Technologies18520
BufferSTEMCELL Technologies20104Buffer
CCK-8MeilunbioMA0218-5
Dextran Magnetic ParticlesSTEMCELL Technologies50100Magnetic Particles
Fetal Bovine SerumGibco16050-122
MagnetSTEMCELL Technologies18000magnetic separation stand
MEM Alpha MediumGibcoC12571500BTMEM Alpha Medium (82.5%) + FBS (16.5%) + Penicillin-Streptomycin (1.0%)
MSCsKeyGENKGG5575-1Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
PE-conjugated Anti-Human PDPN AntibodyABclonalA26770PDPN-PE
PE Selection CocktailSTEMCELL Technologies18151Selection Cocktail
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Trypsin-EDTAGibco25200-072

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PE

مقالات ذات صلة