قياس سمية الخلايا غير السرطانية التي تعزز بواسطة مستقبلات المستضدات الكيميرية والأجسام المضادة العلاجية باستخدام تصوير الخلايا الحية وقياس خلوية التدفق

Yuxin G. Chen; James O. Townsend; Wilfredo F. Garcia-Beltran

doi:10.3791/71377

مقالة منهجية

قياس سمية الخلايا غير السرطانية التي تعزز بواسطة مستقبلات المستضدات الكيميرية والأجسام المضادة العلاجية باستخدام تصوير الخلايا الحية وقياس خلوية التدفق

DOI:

10.3791/71377

⸱

يوليو 3, 2026

Yuxin G. Chen^*¹^,² , James O. Townsend^*¹^,² , Wilfredo F. Garcia-Beltran¹^,²^,³

¹Ragon Institute of Mass General, MIT, and Harvard, ²Harvard Medical School, ³Department of Pathology, Massachusetts General Hospital

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول سير عمل موحد في المختبر لقياس متسق للسمية الخلوية الطبيعية التي تعتمد على مستقبلات المستضدات الكيميرية والمعتمدة على الأجسام المضادة لخلايا القاتل الطبيعية البشرية باستخدام تصوير الخلايا الحية وقياس تدفق الخلية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) هي خلايا لمفاوية فطرية تلعب دورا حيويا في المناعة الوقائية ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا المختلفة والسرطانات. وظيفتها الأساسية هي قتل الخلايا المستهدفة المصابة، أو المتحولة خبيثا، أو المغطاة بالأجسام المضادة عبر السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC). يمكن أيضا هندسة خلايا NK وراثيا للتعبير عن مستقبلات مستضدات كيميرية (CARs) تتيح التعرف المستهدف على مستضدات محددة. يعد القياس الكمي لسمية الخلايا الكورية الطبيعية ضروريا لتقييم الوظائف الأساسية ولتقييم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة قبل السريرية واستراتيجيات هندسة CAR. ومع ذلك، تظل اختبارات الوظيفة في المختبر متغيرة للغاية عبر المختبرات بسبب الاختلافات في تحضير الخلية، والخلايا المستهدفة، ونسب المؤثرين إلى الهدف، وأوقات الحضانة المتشاركة، وطرق القراءة، مما يحد من قابلية التكرار والمقارنات بين الدراسات. تقدم هذه المقالة بروتوكولا موحيدا للتقييم الكمي لسمية خلايا NK باستخدام قياس تدفق الخلايا والتصوير الحي في الوقت الحقيقي. تم تقييم خلايا NK البشرية الأولية وخلايا NK-92 التي تعبر عن CAR لقدرتها على قتل خلايا السرطان والخلايا المستهدفة المغطاة بالأجسام المضادة في شكل صفيحة ب 96 بئر لقياس السمية الخلوية الطبيعية، والقتل الذي يعبر عنه CAR، وADCC. تم قياس بقاء الخلايا المستهدفة إما بشكل مستمر باستخدام تصوير الخلايا الحية أو في نقطة زمنية محددة بواسطة قياس تدفق الخلايا الخلية، مما مكن أيضا من التوصيف الظاهري لخلايا NK والخلايا المستهدفة. توفر هذه البروتوكولات إطارا قويا باستخدام طرق زراعة الأنسجة الروتينية، والتصوير، وقياس تدفق الخلايا لتمكين القياس القابل للتكرار لوظائف مؤثر الخلايا الطبيعية لدراسات المناعة الفطرية والعلاجات المناعية القائمة على خلايا NK.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا القاتل الطبيعية (NK) هي خلايا لمفاوية فطرية تلعب دورا مركزيا في المراقبة المناعية ضد الخلايا المصابة بالفيروس والخبيثة، وتظهر سمية خلوية سريعة وقوية¹. على عكس خلايا B وT، لا تعبر خلايا NK عن مستقبلات خاصة بالمستضدات وتعتمد بدلا من ذلك على مجموعة من المستقبلات المنشطة والمثبطة للكشف عن فقدان تعبير الفئة الأولى من معقد التوافق النسيجي الرئيسي أو الإجهاد الخلوي. وهذا يمكنهم من التوسط في السمية الخلوية المباشرة عن طريق إطلاق حبيبات سامة تحتوي على البرفورين والجرانزيمات أو، في بعض الحالات، عن طريق تنشيط مستقبلات الموت 1,2,3,4. بالإضافة إلى السمية الخلوية الطبيعية، تعبر خلايا NK عن FcγRIII (CD16)، وهو مستقبل يتعرف على جزء Fc من الغلوبولين المناعي G (IgG) ويتوسط في سمية الخلايا المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC) ضد الخلايا المستهدفة المغطاة ب IgG ^5,6.

بفضل آلياتها السامة الخلوية الذاتية وملف السلامة المواتية، برزت خلايا NK كمرشحين واعدين للعلاج المناعي الخلوي. مع إمكانية الاستخدام التمطيعي، يمكن لخلايا NK أن تعمل كعلاج "جاهز" مع تقليل خطر الإصابة بمرض الطعم ضد المضيف، مما يتيح تطبيقا سريريا أوسع وتقليل التكاليف⁷. وقد وسعت التطورات الحديثة الإمكانات العلاجية لخلايا NK من خلال استراتيجيات الهندسة الوراثية، بما في ذلك إدخال مستقبلات المستضدات الكيميرية (CARs) التي تعيد توجيه خلايا NK للتعرف على مستضدات أورام محددة. أظهرت خلايا CAR-NK فعالية مضادة للأورام في نماذج الزينوغرافات في الجسم الحي، والتجارب السريرية، مع سمية أقل مقارنة بخلايا CAR-T ^8,9,10. لذلك، هناك اهتمام متزايد بتطوير منصات الخلايا الطبيعية الهندسية واستراتيجيات علاجية قائمة على الأجسام المضادة. في هذا السياق، يعد القياس الدقيق والكمي لقدرة قتل خلايا NK ضروريا لفهم بيولوجيا خلايا NK، وتقييم فعالية علاجات CAR أو غيرها من العلاجات الهندسية لخلايا NK، وتقييم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي تعتمد على ADCC.

تم استخدام مجموعة متنوعة من الاختبارات المختبرية على نطاق واسع في المختبرات لتقييم سمية الخلايا الكورية الطبيعية. تشمل الطرق الشائعة اختبارات إطلاق الكروميوم-51 المشعة، وفحوصات إطلاق إنزيم اللاكتات ديهيدروجيناز، واختبارات إطلاق الكالسيين-أسيتوكسي ميثيل^11,12. بينما استخدمت هذه الطرق التقليدية على نطاق واسع لقياس سمية الخلايا، إلا أنها تعتمد على قراءات غير مباشرة لموت الخلية، وتوفر قياسات نهاية بدلا من بيانات حركية، وتوفر حساسية ونطاق ديناميكي محدودين. كما أنها لا تقدم معلومات عن النمط الظاهري أو حالة تنشيط الخلايا المؤثرة. مؤخرا، تم اعتماد منصات تصوير الخلايا الحية وقياس التدفق الخلوي بشكل متزايد لأنها تتيح القياس المباشر لبقاء الخلايا المستهدفة، ومراقبة القتل على مر الزمن، والتحليل الظاهري المتزامن للمؤثرات والخلايا المستهدفة^13,14. ومع ذلك، حتى بين هذه الأساليب الجديدة، هناك تفاوت كبير بين المختبرات والدراسات المنشورة، بما في ذلك اختلافات في تحضير الخلايا المستهدفة، ونسب المؤثر إلى الهدف (E:T)، وأوقات الحضانة المشتركة، مما يحد من قابلية التكرار والمقارنات بين الدراسات، خصوصا في التقييمات قبل السريرية للعلاجات المناعية القائمة على خلايا NK.

تقدم هذه المقالة سير عمل موحد للتقييم الكمي لسمية خلايا NK باستخدام منصتين مستقلتين مكملتين: التصوير الحي في الوقت الحقيقي (IncuCyte SX5) واختبارات النهاية القائمة على قياس خلية التدفق. يتيح التصوير بالخلايا الحية المراقبة المستمرة لبقاء الخلايا المستهدفة أثناء الزراعة المشتركة مع الخلايا المؤثرة، مما يسمح بتقييم حركي لسمية الخلايا عبر نسب E:T متعددة وظروف تجريبية مع أقل قدر من التلاعب بالاختبار¹⁵. على النقيض من ذلك، يوفر قياس تدفق الخلايا قياسا نهائيا حساسا للغاية لموت الخلايا المستهدفة، إلى جانب توصيف ظاهري متزامن لخلايا NK والخلايا المستهدفة باستخدام لوحة تلوين متعددة الأشرار.

بالإضافة إلى ذلك، يتضمن هذا البروتوكول معايير تجريبية موحدة، بما في ذلك نسب E:T، وظروف الحضانة، وتنسيق اللوحة، وسير العمل التحليلي، لتحسين قابلية التكرار وتسهيل مقارنة قياسات السمية الخلوية عبر المختبرات والدراسات. يتيح سير العمل التقييم الكمي لوظائف مؤثر NK المتعددة، بما في ذلك السمية الخلوية الطبيعية، والقتل الذي يبوطه CAR، وADCC، وهو متوافق مع الخلايا الطبيعية البشرية الأولية وخطوط خلايا NK. يوفر هذا البروتوكول إطارا عمليا لدراسات بيولوجيا خلايا NK والتقييم قبل السريري لتطوير العلاج المناعي القائم على خلايا NK.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على استخدام عينات المتبرعين البشرية للبحث من قبل مجلس المراجعة المؤسسية وتم إجراؤه وفقا للإرشادات المؤسسية (الموافقة #2022P000699).

1. اختبار القتل في تصوير الخلايا الحية في الوقت الحقيقي

لوحات المعاطف
1. أضف 50 ميكرولتر/بئر بولي-دي-ليسين (0.1 ملغ/مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات [PBS]) إلى شبكة بحجم 6 × 10 في صفيحة مسطحة القاع بسعة 96 بئر. اهز الطبق بلطف لضمان تغطية قاع كل بئر بالكامل.
2. حضن اللوحة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (RT؛ 18°C–26°C) مع إغلاق الغطاء.
3. غسل الآبار 3× ب 200 ميكرولتر/بئر PBS وتخلص من السوبرناتانت.
  ملاحظة: يمكن ختم الألواح المطلية بطبقة بارا فيلم وتخزينها عند 4°C لمدة تصل إلى أسبوع مع إضافة 200 ميكرولتر من PBS لكل بئر. تأكد من بقاء الألواح معقمة، وتخلص من PBS، ودعها تتوازن مع RT قبل الاستخدام.
جهز الخلايا المستهدفة
1. تحضير 10 مل من محلول 2× SYTOX Orange (200 نانومتر) عن طريق تخفيف محلول SYTOX Orange (250 ميكرومولار في DMSO) إلى وسط زراعة NK-92 (أضف 8 ميكرولتر إلى 10 مل إجمالي الحجم) في أنبوب طرد مركزي مخروطي قاع بحجم 15 مل.
  ملاحظة: وسائط الزراعة لخلايا NK-92 تتكون من وسط RPMI-1640 المتقدم، 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 ملليمولار L-ألانيل-إل-جلوتامين، 100 ميكروغرام/ملليتر بريموسين، و500 وحدة الجنس البشري IL-2.
  تحذير: SYTOX Orange هو صبغة فلورية وقد يشكل مخاطر على الجلد أو التعرض للعين. التعامل مع المعدات الوقائية الشخصية المناسبة ووفقا لإرشادات السلامة المؤسسية.
2. عد الخلايا المستهدفة باستخدام طريقة عد الخلايا القائمة على استبعاد الصبغة (مثل تريبان بلو) أو طريقة معادلة معتمدة (مثل عداد الخلايا الآلي).
  ملاحظة: في هذا الاختبار، كانت الخلايا المستهدفة هي خلايا راموس، وهي سلسلة خلايا لمفوما لخلايا B المعبرة عن مستضد الخلايا B (BCMA⁺)، والتي قمنا بهندستها للتعبير عن بروتين الفلورسنت القارب تحت الأحمر (NIR) emiRFP670.
3. انقل الكمية المطلوبة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي قاع بحجم 15 مل.
4. الطرد المركزي (5 دقائق، 300 × جم، RT، التسارع = الحد الأقصى؛ التباطؤ [الفرامل] = الحد الأقصى).
5. تخلص من السوبرناتانت.
6. أعد تعليق الخلايا المستهدفة إلى تركيز نهائي 2.5 × 10⁵ خلايا/مل (2.5 × 10⁴ خلايا/100 ميكرولتر) في وسط 2× SYTOX Orange.
  ملاحظة: يمكن الحفاظ على الخلايا المستهدفة المعلقة عند 37°C مع 5٪ CO₂ في الأنبوب لمدة تصل إلى 30 دقيقة أثناء تحضير تخفيفات الخلايا المؤثرة.
  ملاحظة: لصفيحة واحدة كاملة، 60 بئرا × 2.5 × 10⁴ خلايا/بئر = 1.5 × 10⁶ خلايا مستهدفة إجمالا. جهز 2.0 × 10⁶ خلايا لتعويض الخسارة. قم بضبط أعداد الخلايا بناء على حجم التحليل وكثافة البذور المرغوبة.
تحضير خلايا المؤثرات
1. تقييم تركيز وفعالية خلايا NK-92 باستخدام طريقة عد الخلايا القائمة على الاستبعاد من الصبغة (مثل تقنية تريبان بلو) أو طريقة معادلة تم التحقق منها. تابع فقط إذا كانت الجدوى ≥80٪، لأن انخفاض الجدوى قد يؤثر على أداء الاختبار.
  ملاحظة: تم استخدام خلايا NK-92 المعدلة للتعبير المستقر عن بروتين الفلورسنت ZsGreen، سواء بمفردها (ضابطة) أو باستخدام تراكيب CAR المستهدفة ل BCMA، كخلايا مؤثرة.
2. يعد وينقل العدد المطلوب من الخلايا إلى أنابيب طرد مركزية مخروطية قاع بحجم 15 مل فردية.
  ملاحظة: احسب العدد الإجمالي لخلايا المؤثرات المطلوبة بجمع عدد الخلايا المطلوبة عبر جميع نسب E:T لنسخة واحدة، وضربها بعدد النسخ المكررة، وإضافة 50٪ فائض لتعويض فقدان الخلية. أرقام دائرية حسب الحاجة لتسهيل التحضير. على سبيل المثال، لنسب E:T التي تتراوح بين 2:1 إلى 0.25:1، استخدم 1.5 × 10⁵ خلايا NK لكل نسخة. بالنسبة للثلاثيات، حضر 4.5 × 10⁵ خلايا لكل حالة بناء على تخطيط اللوحة الموضح في الشكل التكميلي 1A.
3. خلايا الطرد المركزي (5 دقائق، 300 × جم، RT، التسارع = الحد الأقصى؛ التباطؤ [الفرامل] = الحد الأقصى).
4. تخلص من السوبرناتانت.
5. أعد تعليق الخلايا إلى تركيز نهائي يبلغ 5.0 × 10⁵ خلايا/مل (5.0 × 10⁴ خلايا/100 ميكرولتر).
تحضير تخفيفات الخلايا الفعالة
1. جهز تخفيفات خلايا المؤثر، بما في ذلك التحكم بالهدف فقط، في صفيحة دائرية القاع بسعة 96 بئر (انظر الشكل التكميلي 1A لترتيب الصفائح التمثيلية مع أربع شروط في ثلاث نسخ). يتم إعداد كل شرط على ثلاث نسخ.
2. أضف 240 ميكرولتر/بئر من خلايا المؤثرة (5.0 × 10⁵ خلايا/مل) إلى الآبار التي تتوافق بنسبة E:T تبلغ 2:1.
3. أضف 120 ميكرولتر/بئر من الوسائط إلى جميع الآبار المتبقية.
4. قم بتخفيف تسلسلي ثنائي من آبار E:T = 2:1 عبر آبار E:T = 0.25:1. اخلط جيدا عن طريق التوصيل ≥5 مرات وغير الأطراف بين عمليات النقل.
  ملاحظة: إذا لم يتم جدولة عمليات التصوير على نظام التصوير، قم بجدولتها قبل إعداد الزراعة المشتركة. يمكن الحفاظ على تخفيف الخلايا الفعالة المحضرة عند 37°C مع 5٪ CO₂ في صفيحة دائرية قاعية ب 96 بئر لمدة تصل إلى 30 دقيقة أثناء إعداد نظام تصوير الخلايا الحية.
إنشاء ثقافة مشتركة
1. احصل على صفيحة مسطحة الطبقة المسطحة ذات 96 بئر مغلفة بالبولي-دي-ليسين.
2. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من تعليق خلايا الهدف إلى جميع الآبار. أعد تعليق الخلايا المستهدفة تماما فور الصرف عن طريق التوصيل بأنابيب ≥5 مرات باستخدام ماصة مناسبة (مثل 200 ميكرولتر) وتجنب تكون الفقاعات أثناء النقل.
3. أضف 100 ميكرولتر/بئر من تعليق الخلايا المؤثرة إلى الآبار المقابلة. أعد تعليق خلايا المؤثرين جيدا قبل الصرف عن طريق التوصيل ≥5 مرات باستخدام ماصة مناسبة (مثل 200 ميكرولتر) وتجنب تكون الفقاعات أثناء النقل.
4. أضف 200 ميكرولتر لكل بئر PBS إلى الآبار غير المستخدمة المحيطة.
5. قم بالطرد المركزي على اللوح (دقيقتين، 100 × جم، RT، التسارع = منخفض [مثلا، 2]؛ التباطؤ [الفرامل] = منخفض [مثلا، 2]).
  ملاحظة: هذا الدوران الناعم ضروري لتثبيت الخلايا بسرعة وبشكل متساو عبر قاع البئر للحصول على تصوير دقيق لجهاز IncuCyte SX5. نستخدم جهاز طرد مركزي Eppendorf 5810R متوافق مع دوار دلو متأرجح مع إعدادات التسارع والتباطؤ على 2 (من 9).
6. ضع اللوحة في نظام التصوير الحي والتقاط الصور كل ساعة لمدة 24 ساعة (ويمكن تمديدها حتى 72 ساعة إذا لزم الأمر). تأكد من إجراء التصوير تحت ظروف الحضانة القياسية (37°C/5٪ CO₂).
  ملاحظة: لضمان أن التصوير عند t = 0 ساعة يعكس بدقة عدد الخلايا المستهدفة الأساسية، ابدأ التقاط الصورة خلال 10–15 دقيقة بعد إعداد الزراعة المشتركة والطرد المركزي. بالنسبة للوحة كاملة بثلاث قنوات تصوير (أي الأخضر، البرتقالي، والأشعة النارية النارية)، فإن وقت المسح حوالي 10 دقائق في الساعة لثلاث صور/بئر بتكبير 20× النقطة.
7. تحقق من جودة الصورة بعد المسح الأول وقم بضبط الإعدادات إذا لزم الأمر.
إعدادات الآلات الموسيقية
1. اضبط فك الخلط الطيفي لتصحيح تسرب فلورة SYTOX Orange إلى القناة الخضراء. قم بضبط قيمة فك الخلط في البرنامج بمقارنة القناتين الأخضر والبرتقالي والتأكد من أن خلايا Orange⁺ الميتة لا يتم اكتشافها خطأ كGreen⁺. بالنسبة للتجربة التمثيلية (الشكل 1)، تم تعيين مساهمة القناة البرتقالية في القناة الخضراء إلى 8.5٪. هذه القيم خاصة بمجموعة البيانات ويجب تحسينها لكل تجربة.
2. قم بتكوين تحليل خلية تلو الأخرى غير ملتزم لضمان تقسيم وإخفاء دقيق لجميع الخلايا ضمن كل مجال رؤية (انظر الشكل التكميلي 1B للإعداد التمثيلي). يوصى بالمعايير التالية لنظام تصوير الخلايا الحية باستخدام مؤثرات التعليق ونماذج خط الخلايا المستهدفة:
  1. اضبط قطر الجسم المتوقع إلى 15 ميكرومتر (قطر الخلية التقريبي).
  2. اضبط حساسية العتبة وحساسية الملمس إلى 5.
  3. اضبط حساسية الحافة إلى 10 لتسهيل فصل عناقيد الخلايا.
  4. اضبط نطاق مرشح مساحة الجسم المقبولة على 50–2000 ميكرومتر^مربع لاستبعاد الحطام والأجسام الكبيرة.
  5. اضبط الحد الأقصى للخارج مركزية إلى 0.95 لاستبعاد الأجسام غير الخلوية.
3. قم بتكوين عتبات التصنيف (انظر الشكل التكميلي 1C للبوابة التمثيلية). استخدم آبار التحكم المستهدفة فقط لتحديد قاعدة السكان الحية لخلايا الهدف ^الحية NIR+/Orange⁻ . ثم استخدم آبار الزراعة المشتركة في نقاط زمنية لاحقة (مثلا، t = 4 ساعات) لتأكيد الفصل الواضح مع تداخل ضئيل بين مجموعات NIR⁺/⁻ وOrange⁺/⁻ . تظهر عتبات التصنيف ومعايير التحليل في الشكل التكميلي 1C.
  1. اضبط عتبة شدة البرتقالي إلى حوالي 15.
  2. اضبط عتبة شدة NIR على حوالي 0.1.
    ملاحظة: قد تختلف قيم المعاملات والعتبات حسب الجهاز أو البرنامج أو نموذج خط الخلية أو شدة إشارة الفلورة.
    ملاحظة: يمكن تكييف هذا البروتوكول لاختبارات سمية الخلايا الطبيعية البشرية الأولية أو اختبارات ADCC إذا كانت الخلايا المستهدفة تعبر بشكل مستقر عن تألق NIR (مثل emiRFP670). يمكن أيضا تكييفها لاختبارات القتل المعتمدة على قياس خلوي التدفق عن طريق حذف طلاء بولي-دي-ليسين واستخدام ألواح ذات قاع مسطح أو قاع مستدير بسعة 96 بئر.

figure-protocol-1
الشكل 1. قياس حركية وفعالية سمية الخلايا التي توسطها خلايا المستقبل المستضد الكيميري (CAR) باستخدام تصوير الخلايا الحية في الوقت الحقيقي. (أ) نظرة مخططية لاختبار تصوير الخلايا الحية IncuCyte لمراقبة السمية الخلوية التي تتوسط خلايا NK. الخلايا المستهدفة ^BCMA+ Ramos التي تعبر عن emiRFP670 (قناة الأشعة تحت الحمراء القريبة [NIR]) تزرع معا مع خلايا مؤثر NK-92 التي تعبر عن ZsGreen (القناة الخضراء)، ويتم اكتشاف موت الخلايا باستخدام SYTOX Orange (القناة البرتقالية). (B) صورة فلورية تمثيلية لبئر الزراعة المشتركة بنسبة مؤثر إلى هدف (E:T) 1:1 عند 12 ساعة. تظهر الخلايا المستهدفة الحية (emiRFP670⁺) باللون الأزرق، وخلايا NK-92 المؤثرة (ZsGreen⁺) باللون الأخضر، والخلايا الميتة (SYTOX Orange⁺) باللون الأحمر. تم التقاط الصور باستخدام وحدة التحليل الخلية غير الملتصقة ب 20× تكبير. شريط القياس = 100 ميكرومتر. (ج) قياس نمو وبقاء الخلايا المستهدفة مع مرور الوقت بنسب E:T متفاوتة لخلايا NK-92 الضابطة والمعبرة عن CAR. (د) قياس بقاء الخلايا المستهدفة كدالة لنسبة E:T في عدة نقاط زمنية (4، 8، 16، و24 ساعة). تم تطبيع عداد الخلايا المستهدفة إلى آبار خاصة بالهدف فقط (E:T = 0:1) في كل نقطة زمنية. (ه) التمثيل التخطيطي للمقاييس الكمية المستخدمة لتقييم سمية الخلايا:_{KR 50}، نسبة القاتل إلى الهدف المطلوبة لتحقيق 50٪ قتل عند 12 ساعة؛ KT₅₀، الوقت المطلوب لتحقيق 50٪ قتل بنسبة E:T 1:1؛ ومؤشر IKI₅₀، وهو مؤشر قاتل متكامل يعرف بأنه منطقة خريطة الحرارة تحت متساوي البقاء بنسبة 50٪.(F) خرائط حرارية تظهر نمو الخلايا المستهدفة وبقائه كدالة لنسبة E:T والوقت لكل حالة مؤثر. تشير القيم الكمية لكل شرط_{KR 50} وKT₅₀ وIKI₅₀. تم الحصول على عد خام للخلايا المستهدفة الحية من مجموعة NIR⁺/SYTOX ^Orange المحصورة باستخدام تحليل تصنيف خلية بخلية في برنامج IncuCyte 2021C. تم إجراء جميع الشروط بثلاث نسخ (n = 3). تعرض البيانات كمتوسط ± انحراف معياري. تم استخدام تحليل الانحدار غير الخطي لنمذجة اتجاهات السمية الخلوية في اللوحين D و F. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. قياس سمية الخلايا المعتمدة على الأجسام المضادة بواسطة قياس تدفق الخلايا

تحضير خلايا NK البشرية الأولية
ملاحظة: تم عزل خلايا NK البشرية الأولية من دم محيطي غني بكريات الدم البيضاء تم الحصول عليه من متبرعين بالغين أصحاء باستخدام طريقة إثراء خلايا NK تلتها الطرد المركزي بتدرج الكثافة، كما هو موضح^{سابقا 3}. تم حفظ خلايا NK المنقاة بالتبريد عند 5 × 10⁶ خلايا/مل في محلول تجميد (90٪ FBS و10٪ ثنائي ميثيل كسلفوكسيد [DMSO]) كأليكوات 0.5 مل في البرودة وتخزينها عند أقل من −150°C حتى الاستخدام³.
1. قم بإذابة قارورة واحدة تحتوي على 5 × 10 أو⁶ خلايا NK بشرية أولية عن طريق تحريك الكريوفيال بلطف في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تقارب دقيقة واحدة، حتى يبقى فقط بلورة ثلجية صغيرة.
  تحذير: التعامل مع جميع العينات المشتقة من الإنسان باستخدام إجراءات السلامة البيولوجية المناسبة ومعدات الحماية الشخصية وفقا للإرشادات المؤسسية.
  تحذير: يسهل DMSO امتصاص المواد الكيميائية على الجلد. ارتد معدات الحماية المناسبة وتجنب الاتصال المباشر.
2. انقل الخلايا المذابة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي قاع بحجم 15 مل يحتوي على 10 مل من وسط زراعة الخلايا النارية الساخن مسبقا (37°م) وامزج بحركة خفيفة.
  ملاحظة: يتكون وسط زراعة الخلايا النارية من RPMI-1640 المتقدم مع 10٪ FBS، 10٪ مصل AB بشري، 2 ملليمولار L-ألانيل-L-جلوتامين، 100 ميكروغرام/مل بريموسين، و50 U/mL IL-2 بشري.
3. خلايا الطرد المركزي (5 دقائق، 300 × جم، RT، التسارع = الحد الأقصى؛ التباطؤ [الفرامل] = الحد الأقصى).
4. تخلص من السوبرناتانت.
5. أعد تعليق الحبيبة في وسط زراعة الخلايا الطبيعية المسخن مسبقا (37°C) بحجم 5 مل.
6. خلايا الطرد المركزي (5 دقائق، 300 × جم، RT، التسارع = الحد الأقصى؛ التباطؤ [الفرامل] = الحد الأقصى).
7. تخلص من السوبرناتانت.
8. أعد تعليق الحبيبة في 1 مل من وسط زراعة خلايا NK المسخن مسبقا.
9. انقل التعليق إلى أحد البئر من صفيحة زراعة الأنسجة بسعة 24 بئرا.
10. أضف 1 مل من PBS المعقم إلى الآبار المحيطة لتقليل التبخر.
11. حضن صفيحة 24 بئر بزاوية 45° (باستخدام رف أو دعم للصفائح للحفاظ على الزاوية) عند 37°C مع 5٪ CO₂ لمدة 16–24 ساعة للسماح باستعادة خلايا NK.
  ملاحظة: تحتاج خلايا NK البشرية الأولية إلى اتصال قريب بين الخلايا والخلايا لتحقيق أقصى بقاء وتعافي، ويمكن تحقيق ذلك عن طريق إمالة صفيحة 24 بئرا والسماح بالتراكم عند حافة الآبار. حافظ على وقت حضانة ثابت عبر التجارب.
  ملاحظة: بعد فترة التعافي، توجه مباشرة إلى إعداد الخلايا المستهدفة وإعداد الزراعة المشتركة.
صبغ الخلايا المستهدفة باستخدام إستر كربوكسي فلوريسين سوكسنيميديل (CFSE).
1. احصل على 5 × 10⁵ خلايا مستهدفة وانطلق إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي قاع بحجم 15 مل.
  ملاحظة: تم استخدام خط خلايا لمفوما مشتقة من المريض CD38⁺ كخلايا هدف¹⁶.
2. اغسل الخلايا مرة واحدة ب 10 مل من PBS.
3. خلايا الطرد المركزي (5 دقائق، 300 × جم، RT، التسارع = الحد الأقصى؛ التباطؤ [الفرامل] = الحد الأقصى).
4. تحضير محلول عمل 0.5 ميكرومولار من CFSE في PBS باستخدام محلول مخزن 5 مللي مول، عن طريق تخفيف 1 ميكرولتر من مخزون CFSE بسعة 5 ملليمول إلى 10 مل من PBS في أنبوب طرد مركزي مخروطي قاع بحجم 15 مل.
  تحذير: CFSE هو صبغة فلورية تفاعلية ترتبط بالأمين وقد تشكل مخاطر على الجلد أو العين للتعرض لها. التعامل مع المواد الواقية الشخصية المناسبة والتخلص من المواد غير المستخدمة وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المحلية.
5. تخلص من السوبرناتانت.
6. أعد تعليق الحبيبة عند حوالي 1 ×^{10 6} خلايا/مل في محلول CFSE.
7. حضن لمدة 15 دقيقة عند 37°C مع لف الأنبوب بورق الألمنيوم أو وضعه داخل وعاء معتم للحماية من الضوء.
8. قم بتهدئة التفاعل بإضافة 5–10 مجلدات من وسط الزراعة.
9. حضن لمدة 5 دقائق عند 37°C.
10. خلايا الطرد المركزي (5 دقائق، 300 × جم، RT، التسارع = الحد الأقصى؛ التباطؤ [الفرامل] = الحد الأقصى).
11. تخلص من السوبرناتانت.
12. أعد تعليق الخلايا عند 2.5 × 10⁵ خلايا/ملتر بحيث يحتوي 100 ميكرولتر على 2.5 × 10⁴ خلايا.
  ملاحظة: توجه مباشرة إلى الطلاء للحفاظ على كثافة إشارة CFSE ثابتة وفعالية خلايا الهدف.
خلايا الهدف الصفائح
1. احصل على صفيحة دائرية ذات قاع 96 بئر.
2. أضف 100 ميكرولتر/بئر من الخلايا المستهدفة (2.5 × 10⁵ خلايا/مل) إلى الآبار المخصصة باستخدام ماصة متعددة القنوات (انظر الشكل التكميلي 2). كل حالة تدرج بثلاث نسخ.
  ملاحظة: تأكد من أن نظام تعليق الخلية متجانس قبل الطبق.
تحضير وإضافة الأجسام المضادة
1. تحضير 200 ميكرولتر من محلول 4× الأجسام المضادة (100 ميكروغرام/مل) في وسط زراعة خلايا NK لكل جسم مضاد اختبار وضابط النظير المطابق.
  ملاحظة: هذه الخطوة معيارية ويمكن تكييفها مع أي جسم مضاد يتوسط ADCC ضد خط الخلية المستهدف المختار. قد تختلف تركيزات وتركيبات مخزون الأجسام المضادة؛ عدل التخفيف وفقا لذلك. قد تؤثر المواد الحافظة مثل الأزيد على بقاء الخلايا المستهدفة ووظائف الخلايا الطبيعية. بينما يمكن اختبار مجموعة من تركيزات الأجسام المضادة، يستخدم هنا تركيز نهائي يبلغ 25 ميكروغرام/مل.
2. نقل محاليل الأجسام المضادة إلى صفيحة بئر عميق.
3. أضف 50 ميكرولتر لكل بئر من محلول الأجسام المضادة للخلايا المستهدفة وامزج جيدا عن طريق استخدام الماصات ≥5 مرات.
4. أضف 50 ميكرولتر/بئر من وسط زراعة خلايا NK إلى آبار تحكم بدون أجسام مضادة وامزج جيدا عن طريق استخدام الماصات ≥5 مرات.
5. حضن لمدة 25–30 دقيقة عند 37°C مع 5٪ CO₂.
تحضير وإضافة خلايا NK
1. عد واحصل على 2 × 10⁵ خلايا NK باستخدام طريقة عد الخلايا القائمة على إزالة الصبغة (مثل Trypan Blue) أو طريقة معادلة معتمدة. العدد كاف لثلاث حالات تحتوي على خلايا NK مطلية بثلاث نسخ، مع زيادة لتفسير فقدان الماصات (انظر الشكل التكميلي 2). تابع إذا كانت الجدوى ≥75٪، لأن انخفاض الجدوى قد يؤثر على أداء الاختبار.
2. أعد تعليق الخلايا إلى 2.5 × 10⁵ خلايا/مل في 800 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا الطبيعية البشرية الأولية (التركيز النهائي = 1.25 ×^{10 4} خلايا/50 ميكرولتر).
3. أضف 50 ميكرولتر/بئر من خلايا NK إلى الآبار المقابلة وامزج جيدا عن طريق التوصيل ≥5 مرات.
  ملاحظة: تأكد من أن نظام تعليق الخلية متجانس قبل الطبق.
4. أضف 50 ميكرولتر لكل بئر من وسط الزراعة للتحكم في الآبار وامزج جيدا عن طريق التوصيل ≥5 مرات.
إنشاء الثقافة المشتركة النهائية
1. افحص بعناية صفيحة ال 96 بئر ذات القاع المستدير للتأكد من أن جميع الآبار تحتوي على 200 ميكرولتر مع مستويات موحدة في الغضروف الهلالي وبدون فقاعات.
2. قم بالطرد المركزي على اللوح (دقيقتين، 100 × جم، التسارع = منخفض [مثلا، 2]؛ التباطؤ [الفرامل] = منخفض [مثلا، 2]).
  ملاحظة: هذا الدوران الناعم مهم لاستقرار الخلايا بسرعة وزيادة الاتصال بين الخلايا والخلايا. نستخدم جهاز طرد مركزي Eppendorf 5810R متوافق مع دوار دلو متأرجح مع إعدادات التسارع والتباطؤ على 2 (من 9).
3. حضن لمدة 16–18 ساعة (ليلا) عند 37°C مع 5٪ CO₂.
  ملاحظة: مدة الحضانة هذه محسنة لقراءة السمية الخلوية بدلا من إزالة الحبيبات، والتي يتم تقييمها بشكل أفضل بقياس تعبير CD107a في نقاط زمنية مبكرة (2–6 ساعات). وبالتالي، قد يتم التقليل من تقدير استجابات ذروة إزالة الحبيبات.
  ملاحظة: لا تمد فترة الحضانة لأكثر من 18 ساعة، لأن الزراعة المشتركة المطولة قد تؤدي إلى موت مفرط لخلايا الهدف في آبار التحكم وتقليل النطاق الديناميكي بين الظروف التجريبية.
إجراء قياس خلوي التدفق
1. الطرد المركزي (5 دقائق، 300 × جم، التسارع = الحد الأقصى؛ التباطؤ [الفرامل] = الحد الأقصى).
2. تخلص من السوبرناتانت.
3. اغسل جميع الآبار بسعة 200 ميكرولتر/بئر من مخزن FACS (2٪ FBS، 2 مللي مولار EDTA في PBS).
4. جهز خليط رئيسي للأجسام المضادة السطحية في مخزن FACS بإضافة CD56-BV421 عند تخفيف 1:50، CD16-BV785 عند تخفيف 1:50، وCD107a-PE-Cy7 عند تخفيف 1:25.
  ملاحظة: احسب حجم الخليط الرئيسي الكلي بناء على تصميم اللوحة التجريبية (عدد الآبار × 50 ميكرولتر/بئر + 20٪ فائض). قد تختلف نسخ الأجسام المضادة في شدة التصبغ وسهولة الوصول إلى الحوام. النسخ المستخدمة في البيانات التمثيلية مدرجة في جدول المواد، وقد تتطلب النسخ البديلة معايرة. قد تتضمن أجسام مضادة إضافية لتشكيل النمط الظاهري لمجموعة الخلايا الكورية الثانوية (مثل KIRs، NKG2A/C/D، وCD57) وعلامات التنشيط (مثل CD69 وHLA-DR).
5. أعد تعليق الخلايا في خليط 50 ميكرولتر/بئر من الأجسام المضادة الرئيسية وامزج جيدا عن طريق التلوين ≥5 مرات.
6. حضن لمدة 15 دقيقة عند 4°C مع تغليف اللوحة بورق الألمنيوم أو وضعها داخل حاوية معتمة للحماية من الضوء.
7. أضف 150 ميكرولتر/بئر من مخزن FACS.
8. الطرد المركزي (5 دقائق، 300 × جم، التسارع = الحد الأقصى؛ التباطؤ [الفرامل] = الحد الأقصى).
9. تخلص من السوبرناتانت.
10. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر/بئر من 5 ميكرومولار 4′,6-دياميدينو-2-فينيل إندول (DAPI) في مخزن FACS ثم المضي فورا في اكتساب القياس الخلوي التدفقي. لا حاجة إلى حضانة ما قبل الاستحواذ.
11. جمع البيانات عن طريق قياس التدفق الخلوي وتسجيل قنوات التألق ل CFSE، BV421، BV785، PE-Cy7، DAPI، وأي فلوروفورات إضافية.
  ملاحظة: إعدادات الاستحواذ (مثل جهود الكاشف، التعويض، والبوابة الكهربائية) قد تتطلب تحسينا. استخدم ضوابط غير مصبوغة وذات صبغة واحدة للتعويض وتركيب البوابات، مع خرز تعويض أو خلايا تمثيلية حسب الحاجة. يجب النظر في ضوابط الفلورة ناقص واحد للعلامات ذات التعبير المستمر أو الخافت (مثل CD107a). الحفاظ على إعدادات واستراتيجيات بوابات متسقة، بما في ذلك الإغلاق الحي أو الميت وتحديد مجموعات المستهدف والمؤثرين، عبر التجارب.
  ملاحظة: يمكن تكييف كل من الخطوة 1 والخطوة 2 لتناسب الخلايا المستهدفة الملتصقة. تستهدف الخلايا الذرية (مع وسط الزراعة الخاص بها) في صفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئر قبل يوم واحد من الزراعة المشتركة بكثافة تحقق حوالي 70٪ من التقاء في يوم الاختبار. بعد التأكيد على الالتصاق، تخلص من وسط الخلايا المستهدفة واستبدله ب 100 ميكرولتر من وسط الخلايا الطبيعية الطازجة، ثم أضف الخلايا المؤثرة لبدء الزراعة المشتركة. نظرا للاختلافات في حجم الخلية والشكل، يجب تحسين معايير تحليل خلية بخلية لكل خط خلوي ملتصق.
  ملاحظة: في الاختبارات القائمة على قياس خلية التدفق مع الخلايا الملتصقة، بعد الزراعة المشتركة، قم بطردها بالطرد المركزي على الصفيحة (300 × جم، 5 دقائق) وتخلص من السوبرناتانت. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من تريبيلي وحضن العينات عند 37°م مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_لمدة تقارب 5–15 دقيقة (حسب خط الخلية) لفصل الخلايا. أضف 100 ميكرولتر/بئر من مخزن FACS، وامزج عن طريق التوصيل بالماصات صعودا وهبوطا بحركة دائرية، وانقل جميع الخلايا إلى صفيحة دائرية ذات قاع 96. افحص الآبار مجهريا للتأكد من الانفصال الكامل قبل المضي قدما في التلوين (الخطوة 2، الخطوة الفرعية 7). تحسين وقت حضانة TrypLE حسب الحاجة لتحقيق تعليق خلية واحدة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقياس سمية خلايا NK في الوقت الحقيقي، تم زراعة خلايا NK-92 المؤثرة المعدلة للتعبير عن CAR المضادة ل BCMA مع خلايا هدف ^BCMA+ Ramos في صفيحة سوداء شفافة ذات قاع مسطح بسعة 96 بئرا وتمت مراقبتها باستخدام تصوير الخلايا الحية (الشكل 1A والشكل 1A التكميلي). تمت إضافة الخلايا المؤثرة بنسب E:T 0:1 (الهدف فقط)، 0.25:1، 0.5:1، 1:1، و2:1، مع كل حالة أجريت في ثلاث نسخ. تم تقييم ثلاثة بنى مختلفة من CAR NK-92: CAR1 بدون مجال تحفيز مشترك، CAR2 مع مجال تحفيز مشترك 4-1BB (CD137)، وCAR3 مع مجال تحفيز مشترك DAP10، بالإضافة إلى خلايا NK-92 ضابطة تعبر عن ناقل ZsGreen فقط. تم توليد جميع الخلايا المؤثرة عبر نقل الفيروسات العدسية، كما تم وصفها^{سابقا 4} باستخدام أشرطة ZsGreen-P2A-CAR المعدلة جينيا. تم تحويل خلايا راموس المستهدفة بالمثل باستخدام ناقل فيروسي عدسي يرمز emiRFP670. تم تتبع نمو وبقاء الخلايا المستهدفة كل ساعة على مدى 24 ساعة باستخدام جهاز تصوير الخلايا الحية، حيث تم قياس الفلورة الخضراء لخلايا ZsGreen⁺ NK-92، وتوهج البرتقالي لخلايا SYTOX Orange⁺ الميتة، وتوهج NIR لخلايا emiRFP670⁺ المستهدفة (الشكل 1A والشكلين 1B و1C الإضافيين).

تم التقاط صور مجهرية في فترات زمنية محددة لرؤية الخلايا المؤثرة، والخلايا المستهدفة الحية، والخلايا الميتة أثناء الزراعة المشتركة (الشكل 1B). أظهر قياس نمو وبقاء الخلايا المستهدفة أن خلايا CAR2 وCAR3 NK-92 أظهرت حركية قتل أسرع من خلايا CAR1 NK-92، خاصة عند النقاط الزمنية المبكرة بنسبة E:T 1:1. زاد قتل الخلايا المستهدفة مع ارتفاع نسب E:T، بما في ذلك في خلايا NK-92 الضابطة، والتي أظهرت سمية طبيعية للخلايا (الشكل 1C). تسلط هذه القياسات الضوء على قدرة تصوير الخلايا الحية على التقاط التغيرات الديناميكية في النشاط السامي الخلوي. كما تم تحليل بقاء الخلايا المستهدفة كدالة لنسبة E:T في نقاط زمنية محددة لمقارنة قوة CAR NK-92. أظهرت خلايا CAR2 وCAR3 NK-92 قوة أكبر عند نسب E:T منخفضة في نقاط زمنية لاحقة (مثل E:T = 0.25:1 عند 24 ساعة) وعند نسب E:T المتوسطة في نقاط زمنية مبكرة (مثل E:T = 1:1 عند 4 ساعات) (الشكل 1D). لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في القتل بين خلايا التأثير CAR2 وCAR3 NK-92 عبر التحليلات.

توفر خريطة حرارية تدمج نسبة E:T، ووقت الحضانة المشتركة، وبقاء الخلايا المستهدفة تصورا شاملا للسمية الخلوية الطبيعية والتي تعبر عن CAR عبر جميع مجموعات التأثيرات وتمكن من التقييم الكمي. تم تحديد ثلاثة معايير لقياس القوة والحركية: KR₅₀، نسبة القاتل إلى الهدف التي تحقق 50٪ قتل (عند 12 ساعة); KT₅₀، وهو وقت الحضانة المشتركة المطلوب لتحقيق 50٪ قتل (بنسبة E:T 1:1)؛ ومؤشر IKI₅₀، مؤشر القاتل المتكامل الذي يمثل منطقة خريطة الحرارة تحت 50٪ بقاء، ويعرف بإيزوكلين البقاء 50٪ (الشكل 1E). تتيح هذه المقاييس مقارنة قوة خلايا CAR NK-92 (KR₅₀)، وحركية القتل (KT₅₀)، والأداء المتكامل للسمية الخلوية (IKI₅₀) (الشكل 1F). يوضح هذا التحليل كيف يمكن للاختبار مقارنة المنصات الهندسية لخلايا NK كميا عبر عدة معلمات ضمن تجربة واحدة.

تم استخدام القياس الخلوي التدفق مع عد الخلايا لقياس ADCC من خلال الزراعة المشتركة بين الخلايا المستهدفة الموسومة بالفلورية مع خلايا NK البشرية الأولية في وجود أو غياب الأجسام المضادة العلاجية، وقياس كمية الخلايا المستهدفة الحية المتبقية بعد 16–18 ساعة من الحضانة (الشكل 2A). يمكن استخدام أجهزة قياس تدفق الخلايا مثل Cytek Aurora، BD Symphony، أو BD Fortessa مع سامبلر عالي الإنتاجية. في الإعداد التمثيلي (الشكل التكميلي 2)، تم تغليف خلايا الهدف المشتقة من المريض CD38⁺ في صفيحة ذات قاع دائري بسعة 96 بئرا، وأضيف داراتوموماب (أو الجسم المضاد النظيري) إلى الآبار المناسبة. ثم تم زراعة خلايا NK معا بنسبة E:T تبلغ 0.5:1، وهي نسبة محسنة لهذه الخلايا المستهدفة لتقليل القتل الطبيعي مع السماح بالكشف عن ADCC. بعد الحضانة، تم إجراء قياس تدفق الخلايا لتحليل تجمعات الخلايا عن طريق التشتت الأمامي والجانبي، واستبعاد الأحداث غير القابلة للحياة باستخدام DAPI، وفصل الخلايا المستهدفة ^CFSE+ عن خلايا NK CD56⁺CD16⁺ للتحليل المتوازي (الشكل 2B). يتيح هذا التصميم قياس السمية الخلوية وتوصيف الظاهرة بشكل متزامن.

figure-results-1
الشكل 2. يتيح اختبار السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC) القائم على قياس تدفق الخلايا المعتمدة على قياس الكمية المتزامنة لبقاء الخلايا المستهدفة وتنشيط الخلايا الناروليكية. (أ) نظرة عامة تخطيطية لاختبار ADCC. تم طلاء خلايا الهدف اللمفوما CD38⁺ الموسومة ب CFSE عند 2.5 × 10⁴ خلايا في كل بئر وزرعت تحت خمسة شروط: الخلايا المستهدفة وحدها؛ الخلايا المستهدفة التي تحتوي على داراتوموماب (25 ميكروغرام/مل)؛ الخلايا المستهدفة التي تحتوي على خلايا NK (E:T = 0.5:1)؛ الخلايا المستهدفة التي تحتوي على خلايا NK وداراتوموماب؛ والخلايا المستهدفة التي تحتوي على خلايا NK وأجسام مضادة للتحكم بالنظير (25 ميكروغرام/مل). (ب) استراتيجية بوابات تدفق الخلايا التمثيلية. تم تحديد الأحداث أولا بواسطة التشتت الأمامي والتشتت الجانبي، تلاها استبعاد الخلايا غير القابلة للحياة باستخدام DAPI. تم تحديد الخلايا المستهدفة كأحداث ^CFSE+، وخلايا NK كأحداث CD56⁺ وCD16⁺. تم تقييم إزالة حبيبات الخلايا النارية الكردية بواسطة تعبير CD107a. (ج) قياس بقاء الخلايا المستهدفة، معبرا عنه كنسبة مئوية بالنسبة لحالة الهدف فقط في الضابطة (مضبوطة على 100٪). (د) قياس كمية تفكيك الحبيبات في خلايا NK، كما يظهر كنسبة خلايا CD107a⁺ ضمن مجموعة خلايا NK. تمثل القضبان متوسط ± انحراف معياري، والنقاط المكشوفة تمثل آبار مكررة فردية (n = 3). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه باستخدام اختبار المقارنة المتعددة بعد الحدث الذي أجراه توكي. تشير الدلالة الإحصائية كما يلي: *p < 0.05، **p < 0.01، ***p < 0.001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النقطة النهائية الأساسية هي بقاء الخلايا المستهدفة، المحسوبة داخل بوابة ^CFSE+ الحية ويتم تطبيعها إلى حالة الهدف فقط، والتي تضبط على 100٪ على قيد الحياة. هذا التطبيع يتحكم في فقدان الخلايا المستهدفة تلقائيا ويتيح المقارنة المباشرة عبر الحالات. في البيانات التمثيلية (الشكل 2C)، لم يقلل إضافة داراتوموماب وحده من بقاء الخلايا المستهدفة، مما يؤكد أن الجسم المضاد لا يؤثر بشكل مباشر على بقاء الخلايا المستهدفة في غياب الخلايا الفعالة. الزراعة المشتركة مع خلايا NK وحدها قللت من بقاء الخلايا المستهدفة إلى حوالي 70٪، مما يشير إلى السمية الطبيعية الأساسية. أدى إضافة داراتوموماب إلى تقليل البقاء على قيد الحياة إلى حوالي 37٪، بما يتوافق مع زيادة القتل بواسطة الأجسام المضادة، في حين أظهرت حالة التحكم في النمط النظيري بقاء حوالي 62٪، وهو ما يقارن بحالة التهاب الالتهاب الطبيعي. تظهر التجارب الناجحة فصلا واضحا بين الحالات المعالجة بالأجسام المضادة وحالات السيطرة مع قابلية تكرار عالية عبر النسخ المستنسخة.

يوفر النمط الظاهري الثانوي لخلايا NK تأكيدا مكملا للعلاقة بين قتل الخلايا المستهدفة وتنشيط المؤثر. كان تفكيك الحبيبات في الخلايا الكورية الطبيعية، المقاس كنسبة خلايا CD107a⁺ ، الأدنى في الزراعة المشتركة بين خلايا NK والخلية المستهدفة بدون أجسام مضادة، والأعلى في الحالة المعالجة بالداراتوموماب (حوالي 31٪)، حيث أظهر التحكم في النظير تفكيكا متوسطا (حوالي 19٪)، داعما للتنشيط بوساطة الأجسام المضادة (الشكل 2D). تظهر هذه النتائج أن الاختبار يمكنه التمييز بين قتل الخلايا المستهدفة وتنشيط التأثير. على الرغم من أن اتجاهات إزالة الحبيبات والبقاء متوافقة عموما، إلا أنهما لا يتداخلان بالكامل، مما يشير إلى أنهما يمثلان عمليات بيولوجية مرتبطة لكنها متميزة.

تظهر التجارب غير المثالية عادة انخفاضا في الفصل بين الظروف، وتباينا في عدد الخلايا عبر الآبار، وارتفاع موت الخلايا المستهدفة في الآبار الضابطة، أو تلوين ضعيف في CFSE، أو ارتفاع في إزالة الحبيبات الخلفية. قد تنتج هذه النتائج عن ضعف بقاء الخلايا المستهدفة، أو عدم اتساق تعافي الخلايا الكورية الطبيعية، أو خلط غير كاف، أو تباين في التلوين والاكتساب. نظرا لأن الاختبار يحدد بشكل مستقل أقسام الهدف والمؤثر بشكل مستقل، يمكن توسيعه ليشمل نمذجة إضافية للخلايا المستهدفة (مثل كثافة المستضد أو تعبير الليغاند) وتوصيف أوسع لخلايا NK. يمكن لإدراج حالة "NK فقط" أن يحدد بشكل أكبر إزالة الحبيبات الأساسية وقابلية خلايا NK. يعد هذا التصميم متعدد المعلمات ميزة رئيسية، حيث يمكن تفسير السمية الخلوية الوظيفية جنبا إلى جنب مع الأنماط المناعية الميكانيكية.

الشكل الإضافي 1. تخطيط اللوحة التمثيلية وسير العمل التحليلي لاختبار التصوير الحي-الخلوي لتسمم السيل. (أ) مخطط لوحة 96 بئر ممثل لاختبار قتل خلايا CAR NK. يتم ترتيب أربع حالات للخلايا المؤثرة في أرباع، يتم اختبار كل منها عبر نسب E:T 0:1 (الهدف فقط في الضابطة)، 0.25:1، 0.5:1، 1:1، و2:1، مع كل حالة يتم في ثلاث نسخ (بإجمالي 60 بئر اختبار). (ب) التكوين التمثيلي لتحليل الخلية الخلية غير الملتصقة في برنامج IncuCyte 2021C، يوضح معايير الفصل الطيفي والتقسيم والتغطية المستخدمة لتحديد الخلايا المؤثرة والمستهدفة الفردية مع استبعاد الحطام والتجميعات. (ج) استراتيجية تصنيف خلايا بخلية تمثيلية باستخدام الفلورة البرتقالية NIR مقابل SYTOX لتحديد مجموعة الخلايا المستهدفة الحية. تستخدم الآبار المستهدفة فقط وآبار الزراعة المشتركة عند نقطة زمنية نموذجية (t = 4 ساعات) لتأكيد الفصل بين مجموعات الخلايا الحية والميتة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2. تخطيط الصفائح التمثيلية لاختبار ADCC القائم على قياس خلوي التدفق. تصميم لوحة تمثيلية ب 96 بئرا توضح خمسة حالات تجريبية مصفحة في ثلاث نسخ عبر الصفوف B–D والأعمدة 2–6 (إجمالي آبار الفحص = 15): (1) الهدف فقط للضابطة، (2) الخلايا المستهدفة مع داراتوموماب، (3) الخلايا المستهدفة بخلايا NK، (4) الخلايا المستهدفة التي تحتوي على خلايا NK وداراتوموماب، و(5) الخلايا المستهدفة بخلايا NK والأجسام المضادة للتحكم بالنظير. تم طلاء الخلايا المستهدفة عند 2.5 × 10⁴ خلايا لكل بئر، وأضيفت خلايا NK بمعدل 1.25 × 10⁴ خلايا لكل بئر لتحقيق نسبة E:T تبلغ 0.5:1. تم استخدام الأجسام المضادة بتركيز نهائي يبلغ 25 ميكروغرام/مل. تم ملء الآبار المحيطة بأنابيب PBS لتقليل التبخر. تم استخدام حالة الهدف فقط لتطبيع بقاء الخلايا المستهدفة، وأخذ التحكم في النظير تأثيرات تركيب الأجسام المضادة بشكل مستقل عن خصوصية المستضد. قد يكون من الضروري تحسين نسبة E:T حسب قابلية الخط الخلوي المستهدف. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر هذه البروتوكولات نهجين مكملين لقياس سمية خلايا NK في صيغة صفيحة موحد من 96 بئرا. يستخدم Step 1 التصوير الحي في الوقت الحقيقي لمراقبة فقدان خلايا الهدف بشكل مستمر، وهو مناسب جدا لتقييم حركية القتل الطبيعي والقتل التابع ل CAR عبر نسب E:T متعددة. تستخدم الخطوة 2 قياس التدفق الخلوي لقياس ADCC بعد فترة حضانة مشتركة محددة مع فصل أقسام الهدف والمؤثر في الوقت نفسه للتحليل الظاهري¹⁷. هذه الطرق، التي تعرض كمنصات اختبار تكميلية يمكن استخدامها لنمذجة العمليات البيولوجية المختلفة، قابلة للتبديل بسهولة. يمكن استخدام خلايا NK البشرية الأولية في اختبارات ADCC المعتمدة على تصوير الخلايا الحية، ويمكن أيضا هندستها للقتل الذي يتوسط CAR في اختبارات قياس تدفق الخلايا الخلية. علاوة على ذلك، على الرغم من أن خلايا NK-92 البرية تفتقر إلى تعبير^{CD16 18}، فإن إدخال CD16 (مثل النقل الفيروسي العدسي) يمكن خلايا NK-92 بسهولة من التوسط في ADCC القوي. وبالتالي، يمكن تخصيص كلا الاختبارين لتلبية الاحتياجات العلمية والترجمية الفردية.

هناك عدة خطوات مهمة بشكل خاص لقابلية التكرار في كلا الاختبارين. يمكن أن تغير التغيرات الصغيرة في عدد الخلايا المؤثرة والنمط الظاهري أن تغير بشكل كبير بقاء الخلايا المستهدفة. يعد العد الدقيق للخلايا وإعادة التعليق الشاملة أثناء الطلاء ضروريين لتقليل الانحرافات في عدد الخلايا والخلط غير الكامل. وبالمثل، يجب الحفاظ على اتساق تحضير الخلايا بين التجارب، بما في ذلك الجدوى، ووقت التعافي، والتعرض السابق للسيتوكين، لضمان وظيفة مؤثرة موحدة. هندسة الصفائح هي عامل رئيسي آخر لأداء الاختبار. في سير عمل تصوير الخلايا الحية، تدعم الألواح المطلية ذات القاع المسطح التقاط الصور المستقرة وتحليل الحقل المتسق، بينما في سير عمل قياس الخلايا الجري، تعزز الصفائح ذات القاع المستدير تلامس الخلايا والخلية وتسهل استعادة الزراعة غير الملتصقة عند نقطة النهاية. بالإضافة إلى ذلك، يجب تأكيد جودة الوسم الفلوري قبل الاختبار، حيث أن التمييز الضعيف بين الخلايا المستهدفة بالتصوير أو الفصل الضعيف لكلموز CFSE بواسطة قياس تدفق الخلايا سيؤثر على القياس والتفسير.

هاتان المنطقتان تعرضان اعتبارات تقنية مميزة. في اختبار تصوير الخلايا الحية، تشمل الأسباب الشائعة لجودة البيانات غير المتساوية في الطبق، وتجمع أو تكتل الخلايا الكثيفة، وعتبات تحليل الصور غير المثالية، وكلها قابلة للتصحيح بسهولة. قد تؤدي هذه المشاكل إلى تشويه عدد الخلايا وتؤدي إلى تتبع غير متسق مع مرور الوقت. في اختبار القياس الخلوي الجريء، غالبا ما تكون النتائج غير المثالية ناتجة عن ارتفاع موت الخلايا المستهدفة في الخلفية، أو ضعف الفصل بين مجموعات الهدف والمؤثر الفعال، أو تلوين ضعيف للأجسام المضادة، أو عدم اتساق التوصيل بين الآبار المكررة. نظرا لأن هذه الاختبارات مصممة للتحليل المقارن، فإن تضمين ضوابط داخلية مناسبة أمر ضروري للتفسير، بما في ذلك الضوابط المستهدفة فقط للتطبيع وضوابط سلبية مطابقة للحالات الخاصة بالأجسام المضادة أو CAR.

يجب مراعاة عدة قيود مشتركة وخاصة بالاختبارات مع هذه الطرق. يوفر اختبار تصوير الخلايا الحية دقة زمنية لكنه يعتمد على معايير الوسم الفلورية الدقيقة وتحليل الصورة، وكلاهما قد يتأثر بتجميع الخلايا أو التداخل الطيفي أو تغيرات في الشكل^{خلال الزراعة} المشتركة. في بعض الحالات، خاصة عندما تشمل الاختبارات الخلايا المؤثرة الأولية، فإن تحقيق وسم فلوري كاف دون تغيير ديناميكيات القتل أمر صعب أو غير ممكن. يوفر اختبار القياس الخلوي التدفق دقة ظاهرية أعلى عند نقطة نهاية محددة، لكنه لا يميز بشكل مستقل بين القتل المبكر والمتأخر إلا إذا تم جمع عدة نقاط زمنية متطابقة، مما قد يكون مكلفا ويستغرق وقتا طويلا¹⁷. بالإضافة إلى ذلك، قد تعكس قياسات النهاية ليس فقط موت الخلايا المستهدفة، بل أيضا اختلافات في تكاثر الخلايا المستهدفة، أو فقدان المؤثر، أو التعافي أثناء التعامل مع العينة. لذلك، فإن القراءات الميكانيكية مثل CD107a تفسر بشكل أفضل كمؤشرات تكميلية لتنشيط الخلايا المؤثرة بدلا من بدائل مباشرة لإزالة الخلايا^{المستهدفة 19}. وبشكل أوسع، لا تعيد أي من المنصتين إنتاج البنية المكانية بالكامل، أو التفاعلات العضلية، أو تدرجات السيتوكينات، أو قيود الانتقال التي تشكل وظيفة خلايا NK في الجسم الحي.

يجب أيضا أخذ عدة عوامل بيولوجية في الاعتبار عند تفسير اختبارات قتل الخلايا النارية الطبيعية. التفاوت بين المتبرع والمانح جوهري في التجارب على خلايا NK البشرية الأولية، والتي تختلف في الجهد الخلوي السامة وتركيب المجموعة الفرعية بسبب عمر المتبرع، والجنس، وتاريخ الأمراض المعدية، وتعدد أشكال المستقبلات²⁰. استخدام خلايا NK-92 يقلل بشكل كبير من التباين، لكن هذه الخلايا لا تزال تظهر تغييرات مرتبطة بالمصدر والممر¹⁸. يخفف بروتوكولنا من الفروقات التقنية أو التجريبية من خلال معايير موحدة ومقارنات اللوحة نفسها لتقييم هذه العوامل البيولوجية بدقة أكبر. حيثما أمكن، نوصي باستخدام نطاقات مرور محددة ل NK-92 مع عتبات قابلية ثابتة. بالنسبة لخلايا NK الأولية، يجب أن تستخدم الاختبارات خلايا NK من عدة معطحين لكل حالة، مع أخذ التحليلات الإحصائية في الاعتبار التباين بين المتبرعين (مثل نماذج التأثيرات المزدوجة أو المختلطة)، نظرا لأن الفروق النسبية بين الحالات عادة ما تحفظ بين المتبرعين. علاوة على ذلك، يمكن دمج علامات إضافية لخلايا NK (مثل KIRs، NKG2A/C/D، وCD57) في لوحات الأجسام المضادة المستخدمة لقياس تدفق الخلايا لمقارنة ترددات المجموعات الفرعية بين المتبرعين وتقييم تنشيط خلايا NK الخاصة بكل مجموعة فرعية (أي تعبير CD107a وCD69)، مما يسهل تفسير النتائج بشكل أكبر. أخيرا، لجميع اختبارات قتل الخلايا النارية الصغيرة، يجب النظر في سيناريوهات إضافية معينة. يمكن أن يؤدي التعبير عن المستضدات المستهدفة على خلايا NK، سواء عن طريق التعبير الداخلي أو اكتساب المستضدات من الخلايا المستهدفة عبر التروجوسيتيوز، إلى قتل الأخ لخلايا NK ونتائج مربكة. على سبيل المثال، يمكن لداراتوموماب استهداف CD38 المعبر عنه في خلايا NK وتحفيز قاتل الأخ²¹، مما يحد من حجم ADCC ضد الأهداف المقصودة. لحسن الحظ، تسمح اختبارات تصوير الخلايا الحية وقياس تدفق الخلايا بقياس كمية الخلايا الطبيعية لتقييم قتل الأخوة.

على الرغم من هذه القيود، يوفر الاستخدام المشترك لتصوير الخلايا الحية وقياس تدفق الخلايا إطار عمل لاختبار وظائف الخلايا الطبيعية القابلة لإعادة الإنتاج عبر مجموعة من التطبيقات الأساسية وما قبل السريرية. يكون سير عمل التصوير مفيدا عندما يكون السلوك الزمني مهما، مثل التمييز بين الاستجابات السريعة والتأخيرة للسمية الخلوية أو مقارنة حركيات القتل عبر تصاميم CAR²². يكون سير العمل القائم على قياس التدفق الخلوي ميزة عندما يجب تفسير القراءات الوظيفية جنبا إلى جنب مع الأنماط الظاهرية للمؤثر والخلايا المستهدفة ضمن نفس العينة. معا، تمكن هذه الأساليب من التقييم الكمي للقتل الطبيعي، والسمية الخلوية التي بوساطة CAR، وADCC باستخدام منصات تجريبية متاحة على نطاق واسع. من خلال إنشاء إطار عمل موحد وقابل للتوسع، يسهل هذا النظام المقارنة الدقيقة والاستجواب الميكانيكي عبر الأساليب القائمة على خلايا NK، مما يسرع من تطوير وترجمة العلاجات المناعية من الجيل القادم وترجمتها.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.F.G.-B. حصل على مكافأة من BioSciences.sas لعرض علمي حول القياس الطيفي في عام 2025. يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية أو غير مالية متنافسة أخرى.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون ريموند كينيونيس ألفارادو (جامعة ييل)، وييتونغ تشين (معهد راغون للعلوم العامة، معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، وهارفارد)، أنجيليك هولزيمر وكاثارينا شيرينغ (معهد تطوير العدوى واللقاح، المركز الطبي الجامعي هامبورغ-إبندورف)، وأبنر لويسانت، وجيسيكا دافي، وجينا مولين، وجايل نيوتن (مستشفى ماساتشوستس العام وكلية الطب بجامعة هارفارد) على النصائح العلمية والتقنية والنقاشات العميقة. كما يشكر المؤلفون مايكل وارينغ، وكات فولز-دوناهيو، وناتالي بونهور من مركز تدفق القياس الخلوي في معهد راجون على الدعم الفني الخبير. W.F.G.-B. يحظى بدعم من معهد راغون في ماساتشوستس جنرال، ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، وهارفارد، وقسم علم الأمراض في مستشفى ماساتشوستس العام، وجائزة المبتكر الجديد من مدير المعاهد الوطنية للصحة (DP2CA311214). تحظى مؤسسة كينغهورن بدعم مؤسسة كينغهورن كمنحة دراسية فوربرايت المستقبلية للدراسات العليا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Advanced RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	12633020	Basal medium for NK-92 and primary human NK-cell culture media (see protocol for complete formulation)
Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)	BioLegend	328618	Degranulation marker for flow cytometry
Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)	BioLegend	302046	Flow cytometry
Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)	BioLegend	318328	Flow cytometry
Benchtop centrifuge with swinging bucket rotor compatible with 15-mL tubes and 96-well plates (Eppendorf Centrifuge 5810R)	Eppendorf	5811000015	Used for cell pelleting and plate centrifugation (100–300 × g)
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Thermo Fisher Scientific	C34554	Cell proliferation dye for target-cell labeling
Cytek Aurora spectral flow cytometer (or equivalent)	Cytek Biosciences	N7-00003	Used for flow cytometry acquisition and analysis
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole)	BioLegend	422801	Nuclear stain for live/dead discrimination
Deep-well 96-well plate	USA Scientific	1896-2110	Used for antibody preparation
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Cryopreservation reagent
Fetal bovine serum (FBS)	Avantor	76419-584	Basal media supplementation; used in FACS buffer (2% FBS)
General Purpose Water Bath, 10 L (37 °C)	PolyScience	WBE10	For cell thawing
GlutaMAX (L-alanyl-L-glutamine supplement)	Thermo Fisher Scientific	35050061	Stable glutamine source
Human AB serum	Sigma-Aldrich	H4522-100ML	Supplement for primary human NK-cell culture media
IncuCyte SX5 live-cell imaging system	Sartorius	4816	Real-time live-cell imaging and Cell-by-Cell analysis
LUNA-FL dual fluorescence cell counter (or equivalent)	Logos Biosystems	L20001	Automated cell counting
Parafilm M (4 in × 250 ft roll)	Genesee	16-101	Plate sealing and storage
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile (pH 7.2–7.4)	Corning	21-020-CV	Used for washes and FACS buffer preparation
Poly-D-lysine (0.1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A3890401	Plate coating reagent
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	Antibiotic
Recombinant human interleukin-2 (IL-2)	R&D Systems	202-IL-500	Cytokine
RosetteSep Human NK-cell enrichment kit	STEMCELL Technologies	15065	Human NK-cell enrichment cocktail
SYTOX Orange dead cell stain	Thermo Fisher Scientific	S34861	Viability dye for live-cell imaging
Trypan Blue 0.4%	Gibco	15250-061	Viability dye for cell counting
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604039	For adherent cell detachment
UltraPure EDTA (0.5 M, pH 8.0)	Thermo Fisher Scientific	15575020	Used for FACS buffer preparation
15-mL conical-bottom centrifuge tubes	Corning	352097	Sterile
24-well tissue culture plate (tissue culture–treated)	Corning	3524	Used for NK-cell recovery
96-well clear round-bottom plate (tissue culture–treated)	Corning	3799	Used for co-culture and flow cytometry assays
96-well flat clear-bottom black polystyrene plate (tissue culture–treated)	Corning	3603	Compatible with live-cell imaging systems

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chen, S., Zhu, H., Jounaidi, Y. Comprehensive snapshots of natural killer cells functions, signaling, molecular mechanisms and clinical utilization. Signal Transduct Target Ther. , (2024).
Liesche, C., Sauer, P., Prager, I., Urlaub, D., Claus, M., et al. Single-fluorescent protein reporters allow parallel quantification of natural killer cell-mediated granzyme and caspase activities in single target cells. Front Immunol. , (2018).
Hartmann, J. A., Cardoso, M. R., Talarico, M. C. R., Kenney, D. J., Leone, M. R., et al. Evasion of NKG2D-mediated cytotoxic immunity by sarbecoviruses. Cell. , (2024).
Garcia-Beltran, W. F., Hölzemer, A., Martrus, G., Chung, A. W., Pacheco, Y., et al. Open conformers of HLA-F are high-affinity ligands of the activating NK-cell receptor KIR3DS1. Nat Immunol. , (2016).
Rezvani, K., Rouce, R. H. The application of natural killer cell immunotherapy for the treatment of cancer. Front Immunol. , (2015).
Coënon, L., Villalba, M. From CD16a biology to antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity improvement. Front Immunol. , (2022).
Ruggeri, L., Mancusi, A., Capanni, M., Martelli, M. F., Velardi, A. Exploitation of alloreactive NK cells in adoptive immunotherapy of cancer. Curr Opin Immunol. , (2005).
Liu, E., Marin, D., Banerjee, P., Macapinlac, H. A., Thompson, P., et al. Use of CAR-transduced natural killer cells in CD19-positive lymphoid tumors. N Engl J Med. , (2020).
Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity. Cell Stem Cell. , (2018).
Marin, D., Li, Y., Basar, R., Rafei, H., Daher, M., et al. Safety, efficacy and determinants of response of allogeneic CD19-specific CAR-NK cells in CD19+ B cell tumors: a phase 1/2 trial. Nat Med. , (2024).
Chava, S., Bugide, S., Gupta, R., Wajapeyee, N. Measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells. J Vis Exp. (156), e60714(2020).
Liu, E., Tong, Y., Dotti, G., Shaim, H., Savoldo, B., et al. Cord blood NK cells engineered to express IL-15 and a CD19-targeted CAR show long-term persistence and potent antitumor activity. Leukemia. , (2018).
Mensali, N., Dillard, P., Hebeisen, M., Lorenz, S., Theodossiou, T., et al. NK cells specifically TCR-dressed to kill cancer cells. EBioMedicine. , (2019).
Nowak, J., Bentele, M., Kutle, I., Zimmermann, K., Lühmann, J. L., et al. CAR-NK cells targeting HER1 (EGFR) show efficient anti-tumor activity against head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC). Cancers (Basel). , (2023).
Granger, J. E., Appledorn, D. M. Kinetic measurement of apoptosis and immune cell killing using live-cell imaging and analysis. Methods Mol Biol. , (2021).
Duffy, J., Rider, A., Loneman, D., Thakkar, D., Mullen, G., et al. ALK+ LBCL and PBL share a similar plasmablastic transcriptional identity but show divergent signaling dependencies and therapeutic vulnerabilities. Blood. , (2025).
Kandarian, F., Sunga, G. M., Arango-Saenz, D., Rossetti, M. A flow cytometry-based cytotoxicity assay for the assessment of human NK cell activity. J Vis Exp. (126), e56191(2017).
Klingemann, H., Boissel, L., Toneguzzo, F. Natural killer cells for immunotherapy - advantages of the NK-92 cell line over blood NK cells. Front Immunol. , (2016).
Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. , (2004).
Valiante, N. M., Uhrberg, M., Shilling, H. G., Lienert-Weidenbach, K., Arnett, K. L., et al. Functionally and structurally distinct NK cell receptor repertoires in the peripheral blood of two human donors. Immunity. , (1997).
Wang, Y., Zhang, Y., Hughes, T., Zhang, J., Caligiuri, M. A., et al. Fratricide of NK cells in daratumumab therapy for multiple myeloma overcome by ex vivo-expanded autologous NK cells. Clin Cancer Res. , (2018).
Cichocki, F., Bjordahl, R., Gaidarova, S., Mahmood, S., Abujarour, R., et al. iPSC-derived NK cells maintain high cytotoxicity and enhance in vivo tumor control in concert with T cells and anti-PD-1 therapy. Sci Transl Med. , (2020).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

233 233 JoVE ADCC CAR NK

قياس سمية الخلايا غير السرطانية التي تعزز بواسطة مستقبلات المستضدات الكيميرية والأجسام المضادة العلاجية باستخدام تصوير الخلايا الحية وقياس خلوية التدفق

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة