تحليل مؤشرات الإصابة العصبية المخصصة للعمر والتدخل غير الدوائي في متلازمة الضيق التنفسي الحاد

ملخص

يوضح هذا البروتوكول سير عمل متكامل للمعلوماتية الحيوية وتعلم الآلة لتحديد مؤشرات البروبتوز الطبقي حسب العمر في متلازمة الضيق التنفسي الحاد (ARDS)، إلى جانب منهجية في الجسم الحي تستخدم نموذج فئران مستحث بواسطة LPS للتحقق تجريبيا من الفعالية الأولية لطاقة الطيف والماء والإشعاع تحت الأحمر البعيد.

الملخص

متلازمة الضيق التنفسي الحاد (ARDS) هي اضطراب رئوي التهابي يهدد الحياة مع معدلات عالية من المراضة والوفاة، حيث برز التهاب البروج كآلية ممرضة محورية. وبالنظر إلى أن الفروق المناعية والجزيئية المرتبطة بالعمر قد تؤثر على البروبتوسيس والاستجابة العلاجية، هدفت هذه الدراسة إلى تحديد المؤشرات الحيوية المرتبطة بالبروبتوسيس الخاصة بالعمر وتقييم الإمكانات العلاجية لمياه طاقة الطيف (SEW) مع الإشعاع بالأشعة تحت الحمراء البعيدة (FIR). يشمل سير العمل الشامل للبروتوكول معالجة مجموعات البيانات النصية، وتقسيم العمر، وتعلم الآلة، وتحليل التسلل المناعي لتحديد جينات المركز الخاصة بالعمر. تتبع هذه المرحلة الحسابية التحقق التجريبي في الجسم الحي، باستخدام نموذج فئران ARDS المستحث بواسطة LPS، باستخدام التقييم النسيجي، وELISA، والوتلات الغربية لتقييم تدخل SEW+FIR بشكل صارم والتحقق من تعبير جينات المحور. تم تحديد ستة عشر جينا مرتبطا بالبيروبتوسيس، من بينها AXL وGSDME كانا مرتبطين بشكل رئيسي بشدة ARDS لدى المرضى الأكبر سنا، بينما كان SPP1 أكثر صلة لدى الأفراد الأصغر سنا. لوحظت بصمات مناعية مميزة، مع إثراء وزيادة في البلاعم M2 وقمع المناعة لدى المرضى الأكبر سنا، مقارنة بتنشيط الالتهابات لدى الأصغر سنا. أشارت التحليلات الوظيفية إلى تورط هذه الجينات في مسارات التمثيل الغذائي والالتهابي والمناعي. في الجسم الحي، خفف علاج SEW+FIR من إصابات الرئة، وقمع إنتاج السيتوكينات الالتهابية (IL-1β، IL-18، IL-6، TNF-α)، وضبط تعبير AXL وGSDME وSPP1. تؤكد هذه النتائج مجتمعة على الفروق المعتمدة على العمر في الآليات المرتبطة بالبيروبوتسيس في ARDS وتحدد AXL وGSDME وSPP1 كمرشحين أوليين للمؤشرات الحيوية تستدعي المزيد من التحقق السريري. في النموذج التجريبي الحالي للفئران، أظهر SEW+FIR تأثيرات وقائية من خلال تخفيف الالتهاب الجهازي وتعديل الإشارات المرتبطة بالبيروبتوسيس، مما وفر دعما أساسيا في الجسم لإمكاناته كاستراتيجية مساعدة غير دوائية.

المقدمة

إصابة الرئة الحادة (ALI)/متلازمة الضيق التنفسي الحاد (ARDS) هي مرض تنفسي شديد يتميز بظهور حاد لنقص تأكسج شديد ووذمة رئوية غير القلبية، تنتج أساسا عن تلف السنخات المنتشر¹. يمكن أن يثار بسبب مجموعة من الإصابات الرئوية وخارج الرئة. تشمل الأسباب الرئوية الالتهاب الرئوي المعدي، استنشاق محتويات المعدة، والصدمات الصدرية الشديدة، بينما تنشأ المحفزات خارج الرئة من استجابات التهابية جهازية ثانوية لجراحات غير رئوية، مثل تعفن الدم، التهاب البنكرياس، الصدمات غير الصدرية، الحروق الشديدة، نقل الدم الضخم، وإصابات إعادة التروية بعد زراعة الرئة^أو استئصال الخثرات ^1,2. على الرغم من التقدم في الرعاية الداعمة، لا تزال متلازمة ARDS تشكل تحديا سريريا كبيرا في طب العناية المركزة، مع ارتفاع معدلات المراضة والوفيات حول العالم³. لذلك، فإن فهم مسببات مرض ALI/ARDS أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات فعالة.

التهاب البكثارة، وهو شكل التهابي من موت الخلايا المبرمج تم توصيفه بشكل واسع في سياق كبت الأورام^{والعلاجات} الأورامية 4، أصبح الآن لاعبا محوريا في فيزيولوجيا مرض ARDS⁵. على عكس الاستماتة المبرمجة، يتم التوسط في بيروبتوزيس من خلال تنشيط الالتهابات والانقسام اللاحق لغازديرمين D (GSDMD)، مما يؤدي إلى تكون مسام الغشاء، وتحلل الخلايا، وإطلاق سيتوكينات التهابية مثل الإنترلوكين-1β (IL-1β) والإنترلوكين-18 (IL-18^). في ARS، يساهم التنشيط المفرط للبيروبوتوز في البلعم السنيخية، والخلايا الطهارية، وخلايا البطانة في استجابة التهابية مبالغ فيها، واضطراب الحاجز الحويقي الشعري، وذمة رئوية، وتطور نقص الأكسجين⁷. تشير الأدلة المتزايدة إلى أن استهداف المنظمين الرئيسيين في مسار البروبتوسيس قد يمثل استراتيجية جديدة لتخفيف الالتهاب وتحسين النتائج السريرية في ARDS ^8,9. ومع ذلك، لا تزال هناك فجوة معرفية حرجة تتعلق بتأثير التقدم في العمر — وهو عامل رئيسي في قابلية وتوقعات ARDS — على المشهد الناري الناري. غالبا ما تتعامل الدراسات الحالية مع ARDS كحالة أحادية، متجاهلة إمكانية وجود دوافع جزيئية محددة للعمر قد تحدد استجابات علاجية شخصية.

في السنوات الأخيرة، اكتسب تطبيق تدخلات الفيزياء الحيوية الجديدة والمواد الوظيفية المتقدمة — مثل مسببات SEW والأشعة تحت الحمراء البعيدة (FIR) — زخما كاستراتيجيات غير دوائية لتعديل الاستجابات المناعية وكبح الالتهاب^10,11. وقد أبلغ أن هذه العلاجات تعزز تكاثر كريات الدم البيضاء ونشاطها البلعمي، وتقلل من وذمة الأنسجة، وتخفف من اضطرابات الدورة الدموية الدقيقة الناتجة عن السموم الداخلية — بما في ذلك التصاق الكريات البيضاء وتراكم كريات الدم الحمراء وتنشيط الصفائح الدموية وإصابة البطانة 12,13,14. في فئران ARDS التي تسببها الدهون البوليسكاريدية (LPS)، أدى العلاج المشترك مع SEW وFIR إلى تقليل مستويات IL-1β وIL-18 — المؤثر المميز في تسلسل التفكيك — في كل من المصل وسوائل الغسيل الحويصلي القصيبي (BALF). تشير هذه الأدلة بقوة إلى أن التأثيرات الوقائية ل SEW+FIR قد تتوسطها من خلال كبح موت الخلايا المدفوع بالالتهابات. علاوة على ذلك، وجد أن SEW، عند تطبيقه بشكل مستقل أو كوسط مذيب، يقلل من مستويات تعبير الإنترلوكين-8 (IL-8) وعامل نخر الورم-α (TNF-α)، بينما يرفع مستويات تعبير الإنترلوكين-4 (IL-4) والإنترلوكين-10 (IL-10) في مصل الدم ويخفف من تلف الرئة النسيجي^{المرضي 15، 16، 17، 18}.

استنادا إلى هذه الملاحظات، افترضنا أن الفعالية العلاجية لمزيج SEW وFIR (SEW+FIR) في ARDS تعتمد على قدرته على تعديل المسارات البيروبتوزية الخاصة بالعمر، وبالتالي استعادة التوازن المناعي الرئوي بطريقة مستهدفة. حاليا، يعتمد الركيزة الأساسية لإدارة ARDS على التهوية الميكانيكية والعوامل الدوائية المحدودة مثل الكورتيكوستيرويدات، التي غالبا ما تحمل مخاطر إصابة الرئة الناتجة عن جهاز التنفس الصناعي أو تثبيط المناعة الجهازي¹⁹. مقارنة بهذه العلاجات التقليدية، يقدم SEW+FIR بديلا غير جراحي وغير دوائي قد يخفف بأمان من سلاسل الالتهاب في المراحل المبكرة دون تسمم عضوي ثانوي. عمليا، هذا البروتوكول هو الأنسب كتدخل مساعد مبكر لمتلازمة الحساسية المزمنة الخفيفة إلى المتوسطة. القيود الأساسية لها هي أن فعاليته في مرض ARDS الليفي الشديد في المراحل المتأخرة من المراحل المتأخرة لا تزال غير مثبتة، ولا يمكنها تعويض تدابير دعم الحياة الأساسية في بيئة الرعاية الحرجة. لاختبار فرضيتنا، ابتكرنا خط أنابيب متكامل يربط بين التوصيف النصي الطبقي حسب العمر والتعلم الآلي مع التحقق من صحة النسخة الحية. هذا النهج لا يحدد فقط AXL وGSDME وSPP1 كأهداف علاجية جديدة ومحددة للعمر، بل يوفر أيضا أول دليل ميكانيكي على الإمكانات السريرية ل SEW+FIR كتدخل دقيق غير دوائي لمرض ARDS.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات وفقا للإرشادات المعتمدة من لجنة رفاهية وأخلاقيات الحيوان التجريبي في مستشفى دونغتشيمن، جامعة بكين للطب الصيني (الموافقة رقم 19-54)، قبل بدء الدراسة.

مصدر البيانات ومعالجة البيانات
تم استرجاع مجموعتي بيانات تعبير الجينات (GSE89953 و GSE116560) من قاعدة بيانات التعبير الجيني الشاملة (GEO)²⁰. تم استخدام مجموعة البيانات GSE89953، التي تتضمن بيانات النسخ البلعمية الكاملة من مرضى ARDS عبر فئات عمرية مختلفة، للتعبير التفريقي وتحليل الشبكات. تم استخدام مجموعة البيانات GSE116560، التي تتضمن معلومات سريرية مثل حالة التهوية الميكانيكية، في التعلم الآلي والنمذجة التنبؤية. بالإضافة إلى ذلك، تم استخراج 608 جينات مرتبطة بالتهاب البروج من قاعدة بيانات شاملة للتعليقات الجينية البشرية، باستخدام درجة ارتباط أكبر من 1 كمعيار للفحص. تم تطبيع بيانات التعبير الجيني باستخدام حزمة ليما في R. رقم التجربة السريرية: غير قابل للتطبيق.

تحديد مستويات المسح المبكر
تم تقسيم المرضى في مجموعة البيانات GSE89953 إلى مجموعتين عمريتين: المرضى في العمر المنخفض (<45 سنة) والعالي (≥45 سنة). تم اختيار هذا الحد بناء على أدلة وبائية تشير إلى أن متوسط عمر بداية متلازمة ARDS هو حوالي 45 سنة^و21 عاما. لضمان متانة هذه العتبة، أجريت تحليلات حساسية باستخدام حدود عمرية بديلة (50 و55 سنة). أظهرت هذه التحليلات أنماطا متسقة في تحديد جينات المركز وتجميع الوحدات، مما أكد إحصائيا الحد الأقصى لمدة 45 سنة للتحليلات اللاحقة. تم تطبيع مجموعة البيانات باستخدام حزمة ليما في R. تم تحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) بين الفئات العمرية باستخدام النمذجة الخطية مع الاعتدال التجريبي على بايز. الجينات ذات القيمة P المعدلة < 0.05 و |log₂ تتغير الطي تم اعتبار ≥ 0.5 من المستويات ذات دلالة إحصائية عالية جدا. تم إنشاء مخططات براكين وخرائط حرارية لتصوير DEGs باستخدام حزمة ggplot2 في R.

تحليل تحديد وتحليل الجينات المرتبطة بالبيروبتوز
تم استرجاع الجينات المرتبطة بالبطانية من قاعدة بيانات تعليقات الجينات باستخدام الكلمة المفتاحية "بيروبتوزيس". تم تعريف تقاطع DEGs والجينات المرتبطة بالبيروبتوسيس على أنه جينات مرتبطة بالبيروبتوسيس المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEPGs). تم إجراء تحليلات إثراء مسار موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) لأنظمة DEPG باستخدام حزمة clusterProfiler في R²². تم توضيح فئات العملية البيولوجية (BP)، والمكون الخلوي (CC)، والوظيفة الجزيئية (MF)، واعتبرت درجات Z ≥ 1 وقيم P المعدلة < 0.05 ذات دلالة.

تحليل شبكة التعبير المشترك للجينات المرجحة (WGCNA)
لتحديد وحدات الجينات المرتبطة بداء البروج، تم إجراء تحليل WGCNA باستخدام حزمة WGCNA R. تم بناء شبكة موقعة باستخدام قدرة عتبة ناعمة (β) مقدارها 26 لضمان طوبولوجيا خالية من المقياس²³. تم تحديد الوحدات عبر خوارزمية القطع الشجري الديناميكي التي لا تقل عن حجم الوحدة 30، وتقسيم عميق قدره 2، وعتبة دمج (ارتفاع القطع) 0.25. تم حساب العلاقة بين الجينات الذاتية للوحدة وسمات البروج. تم إجراء تحليل تباين مجموعات الجينات (GSVA) على وحدات مختارة باستخدام مجموعات جينية مميزة تم تنزيلها من MsigDB ^24,25.

تعلم الآلة
تم تقسيم مجموعة البيانات GSE116560 إلى مجموعات من العمر العالي والمنخفض باستخدام الحد الأقصى، وتم تحليل كلتا المجموعتين باستخدام خوارزميات التعلم الآلي. تم تنفيذ تحليل الانحدار لأقل انكماش مطلق وعامل اختيار (LASSO) باستخدام حزمة glmnet (الإصدار 4.1-2) في R، حيث تم تحديد معامل العقوبة الأمثل (λ) بواسطة التحقق المتقاطع 10 مرات (معايير 1-SE). لخوارزمية الغابة العشوائية (RF)، تم بناء 500 شجرة (ntree = 500)، وتم تعيين عدد الميزات التي تم أخذ عينات منها عند كل تقسيم (mtry) إلى الجذر التربيعي لعدد المتنبئين الكلي لضمان استقرار النموذج. تم تعريف الجينات المتداخلة من كلا الطريقتين كجينات توقيع خاصة بالعمر.

بناء وتقييم النماذج التشخيصية
تم بناء نموذج تنبؤ تشخيصي بناء على الجينات المميزة المحددة. تم استخدام الانحدار اللوجستي لتطوير النموذج، وتم إنشاء صورة نوموغرامية لعرض قوته التنبؤية. تم تقييم أداء النموذج باستخدام منحنى خاصية تشغيل المستقبل (ROC)، وتم حساب المساحة تحت المنحنى (AUC) لتقييم دقته التشخيصية. تم إجراء التحقق الداخلي عبر إعادة أخذ عينات من الإقلاع. تم إجراء تقييم إضافي لاستقرار النموذج والفائدة السريرية باستخدام مخططات المعايرة وتحليل منحنى القرار (DCA).

تحليل تسرب المناعة
تم تقدير تركيب الخلايا المناعية في المجموعات العمرية العالية والمنخفضة باستخدام خوارزمية CIBERSORT بناء على مصفوفة توقيع LM22. تمت مقارنة النسب النسبية ل 22 نوعا من الخلايا المناعية بين المجموعات. تم تحليل التعبير التفاضلي لجينات المحور عبر مجموعات الخلايا المناعية باستخدام بيانات عينة واحدة وتم تصورها في خرائط الحرارة والمخططات التكرارية.

تحليل إثراء مجموعات الجينات (GSEA)
تم إجراء GSEA بشكل منفصل على جينات المحور من الفئتين العمرية العالية والمنخفضة. تم إجراء تحليل إثراء مجموعات الجينات (GSEA) باستخدام مجموعات جينات موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG). تم تصنيف الجينات بناء على نسبة الإشارة إلى الضوضاء (أو تغير الطية) بين مجموعات التعبير العالي والمنخفض. ثم تم حساب درجات الإثراء والتثريب، التي تم تطبيعها (NES) باستخدام 1000 تبديل لتحديد المسارات التي تم إثراؤها بشكل ملحوظ. تم إثراء المسارات التي كان معدل الاكتشاف الخاطئ فيها أقل من 0.25 وقيمة P الاسمية أقل من 0.05 بشكل ملحوظ. ثم استخدم هذا التحليل لاستنتاج المسارات البيولوجية التي يمكن تنظيمها بواسطة كل جين مركزي.

الحيوانات التجريبية
تم استخدام ثمانية عشر ذكرا من جرذ سبراج داولي SPF (تتراوح أعمارهم بين 6 إلى 7 أسابيع، 180 جرام ± 10 جرام) في هذه الدراسة. المعلومات التفصيلية عن الموردين مدرجة في جدول المواد.

المواد الكيميائية والأدوات
تم استخدام أجهزة تحضير المياه المعالجة بالمجال الكهرومغناطيسي وأجهزة الانبعاث بالأشعة تحت الحمراء البعيدة في تدخلات تجريبية لتوفير طاقة طيف الماء (SEW) والإشعاع تحت الأحمر البعيد (FIR) على التوالي. تم استخدام بوليبوليسكاريد (LPS) لنمذجة ARDS. تم قياس مستويات السيتوكين (IL-1β، IL-18، IL-6، TNF-α) باستخدام مجموعات ELISA محددة. تم تقييم مستويات تعبير البروتين (AXL، SPP1، Caspase-3، GSDME، GAPDH) باستخدام أجسام مضادة أولية محددة وأجسام مضادة ثانوية متقاربة مع HRP. تم إجراء معالجة العينات والتحليل باستخدام معدات مختبرية قياسية، بما في ذلك المجهر الحيوي، والميكروتوم، وجهاز الطرد المركزي عالي السرعة، وفريزر منخفض الحرارة جدا، وقارئ الألواح الدقيقة. يتم توفير تفاصيل كاملة لجميع المواد الكيميائية والأجسام المضادة والأجهزة، إلى جانب الشركات المصنعة لها، في جدول المواد.

تجميع الحيوانات ونمذجة الحيوانات
تم توزيع ثمانية عشر فأر من سبراج-داولي عشوائيا إلى مجموعات التحكم، والنموذج، وSEW+FIR، مع وجود ستة فئران لكل مجموعة. تم وزن وتوثيق كل مجموعة يوميا. تلقت مجموعة SEW+FIR علاج FIR (طول موجي 4 ميكرومتر–14 ميكرومتر، مسافة إشعاع 20 سم من السطح الظهري) لمدة 20 دقيقة يوميا في بيئة محكمة الحرارة (22 °م ± 2 °م)، بينما تلقت في الوقت نفسه SEW بجرعة 1 مل/100 جم/يوم بواسطة القناة^{الفموية 7}. تم إعطاء الماء المقطر عن طريق الفم لمجموعتي التحكم والنموذج بجرعة مكافئة تبلغ 1 مل/100 جم/يوم. تم إعطاء الماء المقطر والماء المقطر مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام بعد التسخين في حمام دافئ بدرجة حرارة 60 درجة مئوية. في اليوم السابع، بعد 6 ساعات من التغذية، تم حقن مجموعتي النموذج وSEW+FIR بمحلول LPS بجرعة 2 ملغ/كغ حسب الوزن عبر الوريد الذيلي، بينما عولجت مجموعة الضابطة بمحلول ملحي فسيولوجي بنسبة 0.9٪ بجرعة 2 ملغ/كغ بالوزن. اعتبرت تقنية النمذجة طريقة ناضجة ومستقرة لتحفيز استجابة التهابية جهازية بحقنة واحدة من LPS عبر الوريد الذيلي. كانت أنسجة الرئة الناتجة عن أمراض الرئة في المجموعات النمذجة متوافقة مع خصائص ARDS²⁵. نقطة التحقق: يشير نجاح تحفيز ARDS إلى الخمول الظاهر، وتسارع التنفس، وانخفاض ~10٪ في وزن الجسم خلال 16 ساعة بعد الحقن²⁶.

جمع المؤشرات المتعلقة بالفئران
بعد ستة عشر ساعة، تم حقن جميع المجموعات الثلاث داخل الصفاق بجرعة 30 ملغ/كجم من وزن الجسم لتحفيز التخدير. حرج: يجب تأكيد عمق التخدير بدقة من خلال فقدان رد فعل انسحاب الدواسة قبل أي تدخل إجرائي. علاوة على ذلك، تم الحفاظ على بروتوكولات صارمة للسلامة البيولوجية؛ تم التخلص من جميع المواد الملوثة ب LPS، والسوائل البيولوجية، وجثث الحيوانات في حاويات نفايات بيولوجية مخصصة للحرق المناسب. تم جمع خمسة ملليلتر من الدم من الشريان الأبهر البطني في أنابيب معقمة، وتم عزل المصل بالطرد المركزي بقوة 1000 x g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. ثم تم تخزين المصل عند −80 درجة مئوية لمزيد من التحليل. بعد استئصال الصدر وربط الهيلوم الرئوي الأيمن، تم الحصول على سائل غسل القصبات الهوائية (BALF) عن طريق غسل الرئة اليسرى ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات مبرد مسبقا (PBS) عبر قنية داخل القصبة الهوائية. ثم تم تمركز جهاز BALF بقوة 1000 x g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية، وتم تخزين المادة الفائقة عند −80 درجة مئوية. تمت إزالة الفص العلوي من الرئة اليمنى وتنظيفه بمحلول ملحي فسيولوجي بارد لإزالة الدم. تمت إضافة تسعة مجلدات من المحلول الملحي الفسيولوجي بالنسبة لوزن النسيج، وتم تفريم العينة في حمام ثلج باستخدام مقص العيون. تم تحضير تجانس أنسجة رئة بنسبة 10٪ باستخدام جهاز التجانس، تلاها الطرد المركزي عند 700 x جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم جمع المادة الفائقة وتخزينها عند −80 درجة مئوية لمزيد من التحليل الكيميائي الحيوي. بالإضافة إلى ذلك، تم تثبيت جزء من نسيج الرئة اليمنى لكل فأر ببارافورمالديهايد بنسبة 4٪ للفحص النسيجي.

مؤشرات المراقبة وطرق الكشف
تمت معالجة الفص السفلي للرئة اليمنى باستخدام التضمين القياسي، وتقطيع الأنسجة، وإزالة الشمع، وتلوين HE، وفصل الألوان، والتجفيف، وإغلاق الفيلم بعد التثبيت في بارافورمالديهايد بنسبة 4٪. أظهرت أنسجة الرئة لكل مجموعة تغيرات مرضية لوحظت تحت المجهر الضوئي.

تم تحديد تشوهات مرضية في بنية السنيخ الدموي والحاجز الأنفي، ودرجة تسرب الخلايا الالتهابية، وفرط الدم، وذمة الشعيرات الدموية الرئوية تحت المجهر الضوئي. ساعد قسم علم الأمراض في جامعة بكين للطب الصيني في الملاحظة. تم حساب درجة إصابة الرئة النسيجة لتقييم إصابة الرئة كما يلي: لا توجد إصابة = 0، إصابة في أقل من 25٪ من الحقل = 1، إصابة في 25–50٪ من الملعب = 2، إصابة في 50–75٪ من الحقل = 3، وإصابة في أكثر من 75٪ من الحقل = 4. تم اختيار عشرة مجالات عشوائيا وتقييمها من قبل الباحثين الذين كانوا أعمى عن التجميع.

تم إجراء ELISA على عينات BALF السوبرناتانت، ونسيج الرئة، وعينات الدم المجمعة سابقا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لفترة وجيزة، تم حضن العينات في آبار مطلية مسبقا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بعد الغسل خمس مرات باستخدام محلول الغسيل، تم تطبيق أجسام مضادة للكشف البيوتينيلة (تخفيف 1:100) لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد خطوة غسيل أخرى، أضيف ال HRP-conjungate وحضنه في الظلام لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. لاحقا، تم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ ميكروبليت لحساب تركيزات العينات.

تم إجراء تحليل البقعة الغربية لتقييم مستويات تعبير AXL، SPP1، كاسباز-1، GSDMD، كاسباز-3، GSDME، وGAPDH في أنسجة الرئة وعينات BALF المخزنة عند −80°C. تم جمع البروتينات وتحطيمها وفقا للتعليمات في مجموعة استخراج البروتين. تم تحميل كميات متساوية من مستخلصات البروتين (40 ميكروغرام) لكل مسار وتم حلها بواسطة SDS-PAGE. ثم تم فصل الببتيدات ونقلها إلى أغشية PVDF. تم حجب الأغشية بحليب جاف خالي من الدسم بنسبة 5٪ في TBST لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة ثم حضنها طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام الأجسام المضادة الأولية المحددة (مخفف 1:1000). بعد الغسل ب TBST ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها، تم حضن الأغشية مع الأجسام المضادة الثانوية المتوافقة مع HRP (مخففة بنسبة 1:5000) في محلول حاجب عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. تم استخدام GAPDH كبروتين مرجعي داخلي. تم تصور أشرطة البروتين باستخدام مجموعة تعزيز التلميض الكيميائي (ECL) بزمن تعرض يتراوح بين 1–5 دقائق، وتم تحليل النتائج باستخدام برنامج معالجة الصور. تم حساب مستويات التعبير النسبية للبروتينات المستهدفة كنسبة البروتين المستهدف إلى GAPDH.

التحليل الإحصائي
تم التعبير عن المؤشرات الكمية كمتوسط ± انحراف معياري، وتم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برامج إحصائية. تم استخدام اختبار كروسكال–واليس أو تحليل التبويث الأحادي الاتجاه لمقارنة الفروقات بين عدة مجموعات، اعتمادا على ما إذا كانت البيانات موزعة بشكل طبيعي. تم تقييم جميع الإحصائيات باستخدام اختبار فرضية ثنائية الجانب. في التحليلات التي تتضمن مقارنات متعددة، مثل التعبير الجيني التفاضلي وتحليل التسلل للخلايا المناعية، تم تعديل قيم P باستخدام طريقة معدل الاكتشاف الخاطئ لبنجاميني-هوشبرغ (FDR). تم اعتبار قيمة P المعدلة 0.05 أو أقل ذات دلالة إحصائية. تم استخدام برامج رسم بياني للرسم البياني.

النتائج

تحديد DEGs في GSE89953 الفئات العمرية المختلفة وتحليل الإثراء الوظيفي المقابل
تم تطبيع بيانات التعبير الخام من مجموعة البيانات GSE89953 باستخدام دالة normalizeBetweenArrays في حزمة ليما (الشكل 1A)، وأكدت مخططات الصناديق قبل وبعد التطبيع تحسن الاتساق عبر العينات. حدد تحليل التعبير التفاضلي بناء على المصفوفة التطبيعة 228 DEGs (تم تعديله p < 0.05 باستخدام تصحيح Benjamini-Hochberg، |log₂FC| ≥ 0.5)، بما في ذلك 16 جينا مرتفعا بشكل ملحو...

المناقشة

تراكم الإصابات الالتهابية واضطراب المناعة هو علامة مميزة لمتلازمة الضيق التنفسي الحاد (ARDS)، مما يؤدي إلى تلف رئوي شديد وارتفاع معدلات الوفاة. نظرا لتعقيد المرض ونقص العلاجات الفعالة، فإن تحديد أهداف علاجية دقيقة أمر بالغ الأهمية لتحسين النتائج. تشير الأدلة الناشئة إلى أن التهاب البروج، وهو شكل من أشكال موت الخلايا المبرمج، يلعب دورا مركزيا في تطور متلازمة ARD. نظرا لأن العمر عامل مهم يؤثر على بداية وشدة متلازمة ARDS، قمنا بتقسيم مجموعة البيانات حسب العمر، مستخدمين 45 سنة كحد فاصل، لتحد...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الأجسام المضادة المضادة لتقنية AXL	أبكام	AB215205
الأجسام المضادة المضادة لكاسباز-3	أبكام	ab184787
الأجسام المضادة المضادة لGAPDH	أبكام	ab8245
الأجسام المضادة المضادة ل GSDME	أبكام	ab215191
الأجسام المضادة المضادة SPP1	أبكام	AB307994
المجهر الحيوي	أوليمبوس، اليابان	BH2
أداة FIR	مجموعة قوانغدونغ JFC	JF-802
ماعز مضاد للأرنب IgG H& L (HRP)	أبكام	AB6721
GraphPad Prism 10.1.2	برنامج جراف باد	-
جهاز الطرد المركزي عالي السرعة	ثيرمو، الولايات المتحدة الأمريكية	سورفال ST16R
مجموعة IL-18 ELISA	شركة جيانغسو ميبياو للتكنولوجيا الحيوية المحدودة	MB-1735B
IL-1 & بيتا؛ مجموعة ELISA	شركة جيانغسو ميبياو للتكنولوجيا الحيوية المحدودة	MB-1588B
مجموعة IL-6 ELISA	شركة جيانغسو ميبياو للتكنولوجيا الحيوية المحدودة	MB-50054A
ImageJ	المعاهد الوطنية للصحة	-
ليبوبوليسكاريد (LPS)	سيغما، الولايات المتحدة الأمريكية	L6511
ذكر فئران سبراج داولي SPF (6-7 أسابيع)	شركة بكين HFK للعلوم البيولوجية، الصين	SCXK (بكين) 2019-008 (ترخيص)
قارئ الميكروبليت (Varioskan Flash)	ثيرمو ساينتفيك	فلاش فاريوسكان
ميكروتوم	لايكا	RM2235
برنامج R (ليما، clusterProfiler، WGCNA، glmnet، randomForest)	مؤسسة R للحوسبة الإحصائية	-
أداة تحضير الخياطة	مجموعة قوانغدونغ JFC	JF-139
SPSS 26.0	آي بي إم	-
توازن الطاولة	شركة شنغهاي كاني بريسيجن إنسترومنتس المحدودة.	HC· TP11 وmiddot; 10
TNF-&; مجموعة ELISA	شركة جيانغسو ميبياو للتكنولوجيا الحيوية المحدودة	MB-50051A
فريزر فائق الحرارة	ثيرمو، الولايات المتحدة الأمريكية	سلسلة فورما 900