مقالة منهجية

التهجين الميداني لتركيب mRNA الفلوري متعدد القنوات في الموقع للأنسجة الجمجمية الوجهية النامية في عينات فئران FFPE

DOI:

10.3791/71475

⸱

مايو 8, 2026

 ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School, 3Shriners Hospital for Children, 4Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يواجه التهجين التقليدي في الموقع صعوبة في تصور mRNA في أنسجة الجمجمة والوجه بسبب الهيكل المعقد، والخلفية العالية، وخصوصية المجسات المحدودة، والحساسية. يصف هذا البروتوكول طريقة تهجين RNA فلوري متعدد القنوات في الموقع للكشف الحساس والدقيق عن عدة أهداف mRNA في أنسجة الجمجمة الجنينية للفأر FFPE، متجاوزا القيود السابقة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد تطور الجمجمة والوجه على النشاط المنسق لمجموعات خلايا متنوعة ومتخصصة تتفاعل ضمن هياكل نسيج معقدة لتشكيل والحفاظ على بنية ووظيفة الأنسجة الطبيعية. فهم كيفية تواصل هذه الخلايا مع بعضها البعض ومع بيئتها المحلية أمر أساسي لتعريف الآليات الجزيئية التي تنظم تكوينها وثباتها. يمكن أن يؤدي اضطراب هذه العمليات إلى حالات خلقية في الجمجمة والوجه، بما في ذلك تدهور الأسنان، وشق الحنك، والشفاه المشقوقة، إما بمفعد أو كجزء من اضطرابات التلازم. بينما توفر التقنيات الكمية مثل RT-PCR حساسية عالية ونطاق ديناميكي، إلا أنها تتطلب استخراج RNA من نسيج متجانس، مما يؤدي إلى فقدان السياق المكاني والخلوي، وهو قيد حاسم بشكل خاص للأنسجة الجمجمة الوجهية غير المتجانسة، حيث لا يمكن حل أصل النسخ. تتغلب التهجين الفلوري متعدد الحمض النووي الريبي في الموقع على هذا القيد من خلال تمكين الكشف الحساس والمحدد لعدة نسخ mRNA مع الحفاظ على بنية الأنسجة. تسمح هذه النهج المتقدم بتحديد موقع دقيق لتعبير الجينات على المستوى الخلوي، مما يوفر رؤى قيمة حول التنظيم المكاني للعمليات التطورية وآليات الأمراض في بيولوجيا الجمجمة والوجه.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (RT-PCR) هو المعيار الذهبي لتحليل التعبير الجيني بسبب حساسيته العالية ونطاقه الديناميكي الواسع؛ ومع ذلك، يتطلب استخراج RNA من أنسجة متجانسة، مما يؤدي إلى فقدان السياق المكانيوالخلوي 1. هذا القيد يمثل مشكلة خاصة للأنسجة غير المتجانسة مثل الأنسجة الجمجمية والوجهية أثناء التطور الجنني، حيث لا يمكن حل المصدر الخلوي للنسخ المكتشفة. تقنية التهجين الريبي إن إيه في الموقع (ISH)، وهي تقنية ابتكرها جوزيف غال وماري لو بارديو عام 1968، تتغلب على هذا القيد من خلال تمكين تحديد موقع تعبير ال mRNA ضمن بنية الأنسجة السليمة2. ومع ذلك، فإن ISH التقليدي للحمض النووي الريبي يتطلب تقنيا ويعتمد بشكل كبير على تثبيت الأنسجة الأمثل وتحضير العينة للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي3. تتفاقم هذه التحديات في الأنسجة ذات الكلسية العالية، والتي تتطلب إجراءات إزالة الكلسات غالبا ما تتضمن مواد كيميائية قاسية أو معالجة مطولة، مما يؤدي إلى تحلل الحمض النووي الريبي. وبالتالي، فإن ISH الريبي في أنسجة الجمجمة والوجه، التي تتكون من خلطات معقدة من أنواع الخلايا، يتطلب تحسينا دقيقا وخبرة تقنية، ويستغرق وقتا طويلا، ويحمل خطرا كبيرا للتصبغ دون الكفاءة. تحدي تصور تعبير الرنا الرني أكثر وضوحا في أنسجة الأسنان، التي تمتلك بنية وتركيبا معقدا للغاية. تتكون الأسنان من مكونات معدنية مثل المينا، العاجة، الأسمنت، والعظم المحيط بها، إلى جانب أنسجة أكثر طرية مثل اللب ورباط اللثة. هذه الأنسجة مليئة بأنواع متنوعة من الخلايا التي تلعب أدوارا حاسمة في تطور الأسنان4. تتطلب هذه الميزات توحيدا دقيقا لضمان اكتشاف الإشارة بشكل موثوق. وبالتالي، فإن البروتوكول الموصوف مناسب بشكل خاص لدراسة تعبير الجينات خلال مراحل النمو وما بعد الولادة من تكوين الأسنان.

توجد تقنيات تعتمد على التهجين الفلوري المتعدد في الموقع (FISH) للكشف المكاني عن الحمض النووي الريبي، بما فيذلك FISH 5,6,7,8,9 المضخم بالمجسات، وتفاعل التهجين المتسلسل FISH6، وRNA FISH 10 بجزيء واحد، وتضخيم الإشارات عبر تفاعل التبادل FISH5، ومنصات FISH متعددة الإرسال مثل MERFISH11 و seqFISH12.13. من بين هذه المواد، يستخدم RNA الفلوري متعدد القنوات ISH 7,8,9 على نطاق واسع بسبب حساسيته العالية في اكتشاف جزيء RNA واحد ناتج عن تصميم المجس Z المزدوج، حيث يجب على مجاسين متجاورين التهجين مع التسلسل المستهدف لبدء تضخيم الإشارة. هذا التصميم المزدوج للتعرف يحسن بشكل كبير الخصوصية ويقلل من الإشارة غير المستهدفة. تدعم الطريقة الكشف المتعدد عن 2–4 أهداف (قابلة للتوسيع حتى 12 هدفا أو أكثر باستخدام تقنيات مماثلة)، وتحافظ على شكل الأنسجة، وتتوافق مع الأنسجة المدمجة بالبارافين المثبتة في الفورمالين (FFPE)7,8,9، والأنسجة المجمدة الطازجة، والأنسجة المتكلسة المختارة، مما يجعلها مناسبة للعينات المعقدة مثل تلك التي تواجهها في تطور الجمجمة والوجه والأسنان. الطريقة موحدة، قابلة للتكرار، مدعومة بمكتبات مسبار راسخة، ومعتمدة على نطاق واسع، مما يضمن نتائج متاحة وموثوقة عبر مختبرات مختلفة.

يستخدم ISH RNA الفلوري متعدد الأبعاد عدة مجسات تستهدف مناطق مميزة من نفس النص مع تعزيز تضخيم الإشارة، مما يتيح الكشف الحساس والمحدد حتى لل mRNA منخفضة الوفرة أو المتدهورة جزئيا14,15. بينما تم تطبيق RNA فلوريسنت متعدد الأبعاد بنجاح على عينات عظم منزوعة الكالسيفين16، وقد تم الإبلاغ سابقا عن استخدامه في الأنسجة المعقدة والوجهالجمجمة 7,8,9; ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ بعد عن بروتوكول تفصيلي خطوة بخطوة يصف تطبيقه في هذا السياق.

تتكون هياكل الجمجمة الوجهية من هياكل نسيج معقدة مع أنواع خلايا متنوعة، بما في ذلك الخلايا العظمية، والخلايا العظمية، والأميلوبلاست، والأروميات السنية، والأرومات الليفية، والخلايا الجذعية، والخلايا المناعية، والأوعية الدموية، والخلايا الحسية، التي تعد تفاعلاتها المنسقة مكانيا ضرورية لتكوين الأنسجة، والوظيفة، والتجدد، والحماية المناعية4. لذا فإن دراسة التعبيرات الجينية الموضعية في هذه الأنسجة أمر بالغ الأهمية، ويمثل ISH الفلوري متعدد الرينا نهجا رائدا في مثل هذه التحليلات.

في هذه الدراسة، وصفنا كيف يمكن تطبيق RNA فلورية متعددة الأبعاد باستخدام مجسات RNAscope والتكنولوجيا لدراسة الأنسجة المعقدة للوجه الجمجمي (الشكل 1). علاوة على ذلك، أنشأنا سير عمل مقطع FFPE محسن يحافظ على سلامة الحمض النووي الريبي ويتيح تحليل تعبير جيني عالي الجودة ومحلول مكانيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل المعاهد الوطنية للصحة، واللجنة الوطنية لرعاية واستخدام الحيوانات في المعهد الوطني لصحة الطفل وتنمية الإنسان (IACUC)، بموجب بروتوكول دراسة الحيوان #24-031.

1. التزاوج المحدد بالوقت وجمع أنسجة الأجنة

  1. حدد مواعيد زمنية محددة.
    1. قم بإقران ذكر أنثى من Musculus العضلي الخصب، السليم، في وقت متأخر من بعد الظهر. في صباح اليوم التالي، تحققي من وجود سدادة مهبلية. حدد اليوم الذي يلاحظ فيه السدادة كيوم جنيني (E) 0.5.
  2. قتل الأنثى الحامل.
    1. في المرحلة التطورية المرغوبة، يتم القتل الرحيم للفأر الحامل عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون يليه خلع عنقي الرحم، وفقا لإرشادات رعاية الحيوانات المؤسسية.
    2. ضع الفأر على ظهره على سطح ماص معقم. قم بتعقيم منطقة البطن بنسبة 70٪ إيثانول على طول موقع الشق المقصود.
  3. كشف وعزل قرون الرحم.
    1. قم بعمل شق بطني في منتصف الخط باستخدام مقص جراحي معقم، ثم افتح الجدار البريتوني بمقص جراحي لكشف قرون الرحم.
    2. استخدم ملقط حاد لإزالة سلسلة الرحم برفق إلى الخارج. أطلق نسيج الرحم على طول عضلة الرحم وقطع قناة البيض وربط القرن الرحمي الوسيط لعزل الأجنة.
  4. نقل الأجنة الكاملة.
    1. انقل فورا سلسلة الرحم التي تحتوي على الأجنة إلى طبق Petri بحجم 10 سم يحتوي على PBS 1× PBS بارد ومعقم كالثلج (pH 7.4).
  5. قم بتشريح الأجنة الفردية.
    1. افصل بعناية كل جنين عن الأغشية الرحمية والسلى والمشيمية المحيطة.
    2. انقل الأجنة النظيفة إلى طبق طازج بحجم 10 سم يحتوي على PBS بارد ومعقم كالثلج.
  6. قم بتشريح رؤوس الأجنة للفئران.
    1. باستخدام شفرة جراحية معقمة، قم بتشريح الرؤوس وشطفها مرة واحدة في PBS البارد جدا قبل المعالجة الإضافية.
      ملاحظة: جمع وتشريح الفئران حديثي الولادة في المرحلة التطورية المرغوبة وفقا لبروتوكول الحيوان.

2. تثبيت ومعالجة الأنسجة

  1. أصلح المنديل.
    1. اغمر النسيج المفصول فورا في الفورمالين المحايد 10٪ وثبته طوال الليل في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
      ملاحظة: الحفاظ الصحيح على الحمض النووي الريبي أمر بالغ الأهمية لنجاح تحليلات التهجين في الموقع. أظهرت العديد من الدراسات أن النهج القياسي — تثبيت عينات الأنسجة في فورمالين مخزن 10٪ محايد لفترات تتراوح بين 6 إلى 48 ساعة، حسب الحجم والعمر المحدد للنسيج — ينتج نتائج موثوقة للحفاظ على الحمض النووي الريبي 16,17,18,19. في المراحل الجنينية المبكرة (E12.5 وما بعدها)، يكون اختراق المثبت سريعا، ويجب تقليل وقت التثبيت بشكل مناسب لمنع التثبيت الزائد. من اليوم الجنيني 17.5 (E17.5) فصاعدا، وكذلك في العينات بعد الولادة، يصبح اختراق المثبت أقل كفاءة بسبب وجود الجلد على الرأس، الذي يعمل كحاجز فيزيائي. لذا، يجب إزالة الجلد من الرأس بالكامل للسماح باختراق محلول التثبيت بكفاءة. يمكن إزالة الكالسية في 0.5 M EDTA (درجة حموضة 8.0) تحتوي على 0.5٪ فورمالديهايد خال من الميثانول عند 4 °م7. يمكن مراقبة مدة إزالة الكالسية بواسطة فحص ميكرو CT سريع ويمكن تعديلها حسب درجة التمعدن ونوع الأنسجة المحددة؛ بالنسبة للأجنة E18.5، عادة ما يكون 24–48 ساعة كافيا.
  2. اشطف وقم بمعالجة الأنسجة.
    1. أزل المثبت وشطف العينات في PBS. انقل النسيج إلى 70٪ إيثانول وتخزين عند 4 درجات مئوية حتى المعالجة الإضافية (1–4 أسابيع). قم بإجراء تجفيف الأنسجة، وتنظيف الأنسجة، وتسريب البارافين باستخدام معالج أنسجة آلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: بروتوكول معالجة الأنسجة النموذجي هو كالتالي: 70٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة، يليه 95٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة (مرتين)، و100٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة (3 مرات) للجفاف؛ يتم تنظيف الزيلين لمدة ساعة (3 مرات)، ثم التسرب بشمع البارافين عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة (3 مرات) قبل الغرس في كتل نسيج البارافين.
  3. قم بإدخال المنديل.
    1. قم بإدخال الرؤوس في البارافين وتوجيه العينات إما في المستوى الإكليلي أو السهمي، حسب متطلبات التجريب.
    2. انقل الكتل المدمجة إلى صفيحة باردة من كتل البرافين للسماح للشمع بالتصلب لمدة تقارب 30 دقيقة، مع تعديل التوقيت حسب الحاجة حسب حجم الكتلة.
  4. خزن كتل FFPE.
    1. دع البارافين يتجمد تماما. أخرج الكتل من القوالب، وضعها في حاويات محكمة الإغلاق أو أكياس بلاستيكية معنونة، وخزنها على حرارة 4 درجات مئوية حتى تكون جاهزة للتقطيع.
      ملاحظة: يمكن تخزين كتل FFPE التي تحتوي على RNA محفوظ جيدا لعدة سنوات قبل التقسيم دون التأثير على سلامة الأنسجة.

3. معالجة أنسجة FFPE لتركيب RNA فلوري متعدد القنوات ISH

  1. جهز مساحة عمل خالية من RNase.
    1. قم بتعقيم جميع أسطح العمل والأدوات بإيثانول بنسبة 70٪. عالج الأسطح والأدوات والقفازات بمحلول معقم من RNase لتقليل تحلل الحمض النووي الريبي.
    2. قم بتركيب الميكروتوم وتركيب شفرة جديدة. اضبط زاوية المسافة على 10°. عالج الملقط والفرش بمحلول تنظيف RNase قبل الاستخدام.
      ملاحظة: استخدم دائما شفرة جديدة للتقسيمات للحصول على شرائح نسيج دقيقة. تؤثر زاوية الشفرة بشكل كبير على جودة المقطع، وسلامة الأنسجة، وتجانس السماكة، والحفاظ على السمات الشكلية (مورفولوجيا).
  2. جهز حمام الماء.
    1. املأ حمام الماء العائم بمياه فائقة النقاء من الدرجة المختبرية.
    2. اضبط درجة الحرارة بين 40–43 درجة مئوية حسب الحاجة، حسب المرحلة الجنينية وخصائص الأنسجة.
  3. قم بتقليم وتركيب كتلة FFPE.
    1. قم بقص البارافين الزائد من حول الأنسجة المدمجة. برد كتلة FFPE على الثلج وركبها على مرحلة الباردة الميكروتوم.
  4. قم بتقليم حسب منطقة الاهتمام.
    1. قم بمحاذاة وجه كتلة البارافين مع شفرة الميكروتوم وقصها عند 12 ميكرومتر حتى تظهر المنطقة المعنية (مثل الضرس أو السن القاطع) في المقاطع الإكليلية.
    2. أعد وضع الكتلة والشفرة حسب الحاجة للأقسام التاجية أو السهمية المتماثلة والموجهة بشكل صحيح في الرأس الكامل.
  5. قسم النسيج.
    1. بمجرد الوصول إلى المنطقة المعنية، اقطع مقاطع بحجم 5–7 ميكرومتر. قم بتعويم الأجزاء على حمام الماء للسماح بالاسترخاء اللطيف والتسطيح قبل نقلها إلى منزليق.
  6. قم بتركيب وتجفيف الأقسام.
    1. ثبت الأقسام على شرائح زجاجية موجبة الشحنة. افحص الشرائق تحت المجهر الضوئي للتأكد من الاتجاه الصحيح وسلامة الأنسجة.
    2. جفف الزلاجات على سخان منزلق عند 40 درجة مئوية طوال الليل قبل إجراء اختبار RNA الفلوري متعدد الأنواع ISH.

4. اليوم الأول: إزالة البارافينية وإعادة الترطيب

  1. اخبز الشرائح.
    1. اخبز الشرائح بأقسام FFPE لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 60 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا لم تستخدم الشريحة فورا، احتفظ بها غير مخبوزة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع المجففات لمدة 1–4 أسابيع. قد يؤدي التخزين الممتد إلى تدهور الحمض النووي الريبي.
  2. توازن الشرائح.
    1. دع نسيج FFPE ينزلق ليتوازن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق.
  3. قم بإزالة البارافين وإعادة ترطيب الأجزاء.
    1. اغمر الشرائح في الزيلين أو بديل مع تحريك خفيف لمدة 5–10 دقائق عند RT. كرر هذه الخطوة مرة واحدة لضمان إزالة البارافين بالكامل.
      ملاحظة: يجب أن يتم العمل باستخدام الزيلين باستخدام غطاء بخار كيميائي. إذا تم استخدام بديل إكسيلين منخفض السمية، يمكن استخدامه خارج غطاء البخار الكيميائي.
    2. انقل الشرائح إلى 100٪ إيثانول وحضن لمدة دقيقتين عند RT. كرر العملية مرة واحدة لإزالة البقايا من الزيلين. أعد ترطيب الأقسام بإيثانول 70٪ لمدة دقيقتين.
    3. اشطف الأقسام ثلاث مرات باستخدام PBS. ثم أضف قطرة من PBS تكفي لتغطية الأقسام بالكامل وانتقل فورا إلى الخطوة التالية.

5. RNA فلورية متعددة الأبعاد على أقسام أنسجة FFPE

ملاحظة: اتبعت هذه الدراسة تعليمات الشركة المصنعة لإجراء اختبار RNA فلوري متعدد القنوات على أقسام أنسجة FFPE باستخدام تقنية RNAscope21.

  1. اليوم الأول: المعالجة المبدئية وتهجين المجسات
    1. ارسم حاجزا كاره للماء.
      1. باستخدام قلم حاجز، ارسم حاجزا كاره للماء حول كل جزء من الأنسجة. اترك الشرائح تجف في الهواء لمدة تقارب 10 دقائق عند درجة حرارة الغرفة (RT).
      2. تأكد من بقاء أجزاء الأنسجة مغطاة ب PBS في جميع الأوقات لمنع الجفاف.
        ملاحظة: استخدم مناديل خالية من الوبر (ممسحة العدسة) لتجفيف الشريحة حول النسيج مع الحفاظ على ترطيب المنديل. تأكد من أن حبر قلم الحاجز لا يلامس قسم الأنسجة.
    2. قم بإجراء العلاج المسبق.
      1. طبق المادة المعالجة المسبقة المخصصة لتغطية كل قسم بالكامل. حضن الشرائح لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية في حجرة رطبة موضوعة داخل فرن التهجين.
        ملاحظة: لجميع المواد المتوفرة في زجاجات القذارة، أضف قطرات كافية لتغطية القسم داخل الحاجز بالكامل. تأكد من إحضار جميع المواد إلى RT قبل الاستخدام.
    3. اغسل الأقسام.
      1. اشطف الأقسام عدة مرات باستخدام PBS، ثم احتضن PBS طازج لمدة دقيقتين عند RT.
        ملاحظة: استخدم ماصة نقل بحجم 5 مل لغسل كل شريحة بشكل فردي باستخدام PBS. خلال فترة الغسل التي تستمر دقيقتين، تأكد من أن الأقسام تبقى مغطاة بالكامل ب PBS.
    4. تبيط نشاط البيروكسيداز الداخلي.
      1. ضع 3٪ بيروكسيد الهيدروجين على كل قسم وحضن عند RT لمدة 10 دقائق لمنع نشاط البيروكسيداز الداخلي.
    5. كرر الغسيل.
      1. اغسل الشرائح في PBS لمدة دقيقتين عند RT. كرر ذلك مرتين.
    6. جهز المجسات.
      1. سخن المجسات على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. اترك المجسات تبرد حتى تصبح RT قبل الاستخدام.
    7. جهز خليط المجس.
      1. يتم تزويد مسبار C1 كحل يعمل بنسبة 1×؛ استخدم هذا مباشرة.
      2. على النقيض من ذلك، يتم توفير مجسات C2 وC3 وC4 كتركيزات 50×؛ قم بتخفيف هذه المجسات باستخدام محلول المجس C1. إذا لم يستخدم مسبار C1، قم بتخفيف مجسات C2 أو C3 و/أو C4 باستخدام مخفف المجس الذي توفره الشركة المصنعة.
    8. قم بتهجين المجسات.
      1. ضع 30–40 ميكرولتر من خليط المجس على كل جزء من الأنسجة، لضمان التغطية الكاملة. حضن الشرائح لمدة ساعتين عند 40 درجة مئوية في غرفة رطبة داخل فرن التهجين.
        ملاحظة: عند تعلم تقنية RNAscope، ينصح بتضمين مجسات تحكم سالبة وإيجابية أثناء الاختبارات. يساعد هذا النهج في التحقق من صحة الاختبار وتأكيد جودة الإجراء. هناك قيد محتمل يجب الانتباه إليه وهو أن بعض مجسات التحكم الإيجابية المقدمة من المصنع قد لا تعبر عنها في الأنسجة المعنية. لمعالجة ذلك، يمكن استخدام مجسات خاصة بنوع الخلية. على سبيل المثال، Col1a1 هو أداة تحكم إيجابية موثوقة للأنسجة الضامة. يمكن إجراء التلوين للكولون1a1 (أو جين آخر معروف بتعبير عالي) كخطوة أولى لتقييم حفظ الحمض النووي الريبي وشكل الأنسجة في العينات. بمجرد تحقيق الكفاءة في التقنية، عادة ما يتم تنفيذ الضوابط السلبية عن طريق معالجة الشرائح بدون مجسات ولكن معالجتها بجميع الحلول الأخرى. توفر هذه الطريقة معلومات حاسمة حول الإشارة الخلفية في جميع قنوات الكشف. تتيح مجموعة Multiplex V2 القياسية تلوين وتصوير ما يصل إلى أربعة مجسات مختلفة في نفس الوقت. عندما يتم تحديد مستويات التعبير الجيني من خلال دراسات النسخ السابقة، ينصح بتعيين الجينات ذات التعبير المنخفض إلى قناتي Cy5 و Cy7. يجب وضع الجينات التي تعبر عنها بشكل كبير في قناتي GFP وRFP لتحقيق أفضل اكتشاف. في الحالات التي لا تستهدف فيها أي من المجسات جينات ذات تعبير مرتفع، يجب أن تبقى قناة GFP غير مستخدمة. يسمح هذا لقناة GFP بأن تكون مرجعا لطرح الخلفية من قناة RFP، مما يحسن دقة اكتشاف الإشارة للأهداف ذات التعبير المنخفض.
    9. اشطف باستخدام حاجز الغسيل.
      ملاحظة: تم تخفيف مخزن الغسيل 20× المتوفر تجاريا إلى 1× بماء خال من RNase قبل الاستخدام.
      1. اغسل الشرائح لمدة دقيقتين عند RT باستخدام مخزن الغسيل 1× المرفق مع المجموعة. كرر ذلك مرتين.
    10. حضن في محلول مائي لسترات الصوديوم (SSC) بمقدار 5 أضعاف.
      ملاحظة: تم تخفيف محلول SSC المتوفر تجاريا بسعة 20× SSC (3 M NaCl، 0.3 M سترات الصوديوم، pH 7.0) إلى 5× باستخدام ماء خال من RNase قبل الاستخدام.
      1. بعد الغسيل، حضن الأقسام طوال الليل في مخزن SSC 5× عند RT.
  2. اليوم الثاني: تضخيم الإشارة، وضع العلامات الفلورية، والتركيب
    1. اغسل الشرائح.
      1. اغسل الشرائح في 1× وغسل مخزن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة (RT). كرر ذلك مرتين.
    2. قم بتنفيذ خطوات التضخيم.
      1. ضع مادة التضخيم 1 على كل قسم واحتضنها لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية في حجرة رطبة.
      2. اشطف مرتين في 1× ثم غسل المحلول لمدة دقيقتين عند RT.
      3. طبق مادة التضخيم 2 واحتضن لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
      4. اشطف مرتين في 1× ثم غسل المحلول لمدة دقيقتين عند RT.
      5. طبق مادة التضخيم 3 وحضن لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
        ملاحظة: جميع خطوات التضخيم الثلاث مطلوبة بغض النظر عن القنوات (المجسات) التي يتم تطويرها.
      6. اشطف مرتين في 1× ثم غسل المحلول لمدة دقيقتين عند RT.
    3. تطوير بيروكسيداز فجل الحصان (HRP) والفلوروفور.
      1. احسب حجم الفلوروفور المطلوب (عادة بين 100–200 ميكرولتر لكل شريحة فقط) وتخفيف مخزونات الفلوروفور من أوبال.
        ملاحظة: نطاق التخفيف الموصى به للفلوروفور هو 1:300–1:1500. في هذه التجارب، تم تخفيف أوبال بولاريس 780 (كاشف الفلوروفور) بنسبة 1:500 في مخفف الأجسام المضادة، وتم تخفيف جميع الأصباغ الأخرى بنسبة 1:1000 في مخزن TSA. قلل من تعرض الشرائح للضوء كلما أمكن.
      2. ضع كاشف HRP-C1 واحتضن لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
      3. اشطف مرتين في 1× ثم غسل المحلول لمدة دقيقتين عند RT.
      4. ضع 30–40 ميكرولتر من صبغة الأوبال (مثل أوبال 570 أو أوبال 690) على كل قسم. حضن لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
      5. اشطف مرتين في 1× ثم غسل المحلول لمدة دقيقتين عند RT.
      6. ضع مانع تسارع القلب واحتضن لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
      7. اشطف مرتين في 1× ثم غسل المحلول لمدة دقيقتين عند RT.
      8. ضع واثق HRP-C2 أو HRP-C3 واحتضن عند 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      9. اشطف مرتين في 1× ثم غسل المحلول لمدة دقيقتين عند RT.
      10. ضع 30–40 ميكرولتر من صبغة الأوبال الثانية وحضن لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
      11. اشطف مرتين في 1× ثم غسل المحلول لمدة دقيقتين عند RT.
      12. ضع مانع تسارع القلب واحتضن لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
      13. اشطف مرتين في 1× ثم غسل المحلول لمدة دقيقتين عند RT.
      14. ضع كاشف HRP-C3 أو HRP-C4 واحتضن لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 40 درجة مئوية.
      15. اشطف مرتين في 1× ثم غسل المحلول لمدة دقيقتين عند RT.
    4. قم بتضخيم إشارة التيراميد - ديجوكسيجينين (TSA-DIG) ووضع علامات الفلوروفور (إذا كان ذلك ينطبق).
      1. ضع 30–40 ميكرولتر من مادة TSA-DIG المخففة لكل قسم واحتضن لمدة 30 دقيقة عند RT.
      2. اشطف مرتين في 1× ثم غسل المحلول لمدة دقيقتين عند RT.
      3. ضع مادة حاصرة وحضن لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
      4. اشطف مرتين في 1× ثم غسل المحلول لمدة دقيقتين عند RT.
      5. ضع 30–40 ميكرولتر من كاشف الفلوروفور المخفف وحضنه لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
      6. اشطف مرتين في 1× ثم غسل المحلول لمدة دقيقتين عند RT.
    5. قم بعمل التلوين المضاد والتركيب.
      1. ضع 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) وحضن لمدة 5 دقائق عند RT في الظلام.
      2. شطف DAPI وركب الأقسام بسرعة باستخدام تركيب مضاد للتلاشي، وطبق غطاء الغطاء بلطف، وتجنب احتجاز فقاعات الهواء. اختر مقاس غطاء الغطاء الذي يتناسب بشكل مناسب مع تغطية الأنسجة.
      3. جفف الشرائح لمدة ساعتين عند RT في الظلام، ثم حافظ على الشرائح عند 4 درجات مئوية للتخزين طويل الأمد.
        ملاحظة: يمكن الحفاظ على الفلورة لمدة تصل إلى عام إذا تم تخزينها عند 4 درجات مئوية في الظلام مع تركيب مضاد للتلاشي بشكل مناسب.
    6. قم بالتصوير.
      1. قم بإجراء التصوير باستخدام مجهر فلوري متعدد القنوات مع إضاءة LED ومرشحات للفصل الطيفي (الشكل 2A). استخدم أطوال موجات الإثارة والانبعاث كما يلي: DAPI (353/465 نانومتر)، FITC (495/519 نانومتر)، Cy3 (548/561 نانومتر)، Cy5 (650/673 نانومتر)، وCy7 (747/773 نانومتر). تقلل المرشحات المحددة من التداخلات الطيفية وتميز الإشارات الزرقاء والخضراء والبرتقالية والحمراء والإشارات القريبة من الأشعة تحت الحمراء.
      2. احصل على جميع الصور باستخدام إعدادات التعريض والإضاءة المتطابقة عبر العينات، مما يضمن الاتساق وتمكين تحليل مقارن موثوق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام البروتوكول الموصوف (الشكل 1)، نعرض اكتشاف نسخ mRNA الفلورية متعددة الأبعاد في فأر كامل الرأس تم تصويره على منصة مجهر Zeiss (الشكل 2B). يمكن اختيار عروض صورة محددة باستخدام علامة التبويب الجانبية (الصندوق الأصفر)، بينما يمكن عرض عدة قنوات في نفس الوقت باستخدام علامة التبويب (الصندوق الأحمر). يمكن ضبط السطوع والجاما والتباين للصورة الحية مباشرة باستخدام أدوات التحكم تحت علامة التبويب (المربع الأخضر) لتحسين رؤية الميزات ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان التهجين في الموقع أداة أساسية لدراسة التعبير الجيني لأكثر من أربعة عقود وخضع لتحسينات مستمرة. ومع ذلك، غالبا ما تكون الأساليب التقليدية في ISH محدودة بسبب انخفاض الحساسية، وإشارة خلفية عالية، وإجراءات طويلة وتتطلب جهدا كبيرا. وقد حدت هذه القيود من تطبيقها الأوسع، خاصة في الأنسجة المعقدة للوجه الجمجمة حيث يكون الدقة المكانية الدقيقة واكتشاف النسخ منخفضة الوفرة أمرا ضروريا. يتغلب ISH الفلوري متعدد الأبعاد على العديد من هذه التحديات من خلال تصميمه الفريد للمسبار واستراتيجية تضخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر موظفي مرفق الحيوانات في NICHD على مساعدتهم في تربية الحيوانات وتربيةهم. نشكر الدكتور فينسنت شرام من مركز المجهر والتصوير (NIH/NICHD) على مساعدته في تصوير الفلورة. المخطوطة الحالية مدعومة بتمويل من RO1DE033520 NIH/NIDCR إلى M.B.، وبرنامج البحوث الداخلية، والمعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) إلى E.M.، ومعهد الصحة والتنمية البشرية الوطني (NICHD) لمنحة البحث ZIA HD009015. لم يكن للجهة الممولة أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1× PBSثيرمو فيشر10010023استخدام  لأداء الغسلات أثناء سير العمل
20&00; SSCثيرمو فيشرJ60839. K2استخدمها لصنع الرقم 1´؛ مخزن الغسيل
أنابيب مخروطية بحجم 50 مل (أمبيون) خالية من الرينزثيرمو فيشرAM12502الاستخدام لتخزين العينات في محاليل مختلفة
هزاز مداري متقدمVWR6683-470استخدم لتحريك الأنسجة في محلول تثبيت أثناء الحضانة
الكحول، 70٪، فيشربراند، هيستوبريبفيشر ساينتيفكHC-1000-1GLاستخدامه لتنظيف وتعقيم جميع أماكن العمل
مخفف الأجسام المضادة  أكويا للعلوم الحيويةARD1001EAمخفف ل TSA-DIG
معالج الأنسجة التفريغ الآليلايكا بيوسيستمزASP300Sاستخدامه لتنظيف العينات وتجفيفها وإعادة ترطيبها وتسريب الشمع
سمك زجاج الغطاء 1.5، 25 مم × 25 مم كورنينغ2850-25الاستخدام لتركيب الشرائح في سير عمل Visium HD
كاشف المعالجة المسبقة المخصصACD، Bio-Techne300040تحسين نفاذية الأنسجة والوصول إلى الأهداف.
EDTAميليبور سيغما03690الاستخدام لإزالة الكالسيات من الأنسجة المعدنية
الإيثانول 100٪مجموعة إيروبيس6505001050000استخدامه لإزالة الزايلين وإعادة ترطيب العينات أثناء المعالجة
حمام الماء HistoCore  لايكا بيوسيستمزHIS2326كان يستخدم تعويم الأقسام عند 40-43 درجة ودرجة مئوية؛ ج لإزالة التجاعيد من أقسام FFPE  
ورق ترطيب HybEZACD، Bio-Techne310015استخدم داخل فرن HybEZ للحفاظ على الرطوبة ومنع جفاف أجزاء الأنسجة أثناء التهجين
فرن HybEZ والصينية والرفACD، Bio-Techne310011, 310012, 310014استخدامه لتوفير درجة حرارة ورطوبة ووضع مناسب للشريحة أثناء خطوات التهجين والحضانة 
قلم الحاجز الكاره للماء من ImmEdgeمختبر الناقلاتH-4000استخدم لرسم حدود كارهة للماء على الشرائح لحصر المواد الكيميائية في قسم الأنسجة أثناء إجراءات التلوين.
شفرات منخفضة الملف القابلة للاستخدام مرة واحدة DB80LXلايكا بيوسيستمز14035843496استخدم لقسم كتل FFPE  
الفورمالين المحايد المخزن 10٪آذر ساينتفيكNBF-4-Gاستخدامه لإصلاح الأنسجة
حزمة المواد الكيميائية OPAL 520أكويا بيوساينسز، إنك.FP1487001KTتضخيم واكتشاف إشارات RNA المستهدفة باستخدام وضع علامات فلورية.
حزمة المواد الكيميائية OPAL 570أكويا بيوساينسز، إنك.FP1488001KTتضخيم واكتشاف إشارات RNA المستهدفة باستخدام وضع علامات فلورية.
حزمة كاشف OPAL 620أكويا بيوساينسز، إنك.FP1495001KTتضخيم واكتشاف إشارات RNA المستهدفة باستخدام وضع علامات فلورية.
حزمة كاشف OPAL 690أكويا بيوساينسز، إنك.FP1497001KTتضخيم واكتشاف إشارات RNA المستهدفة باستخدام وضع علامات فلورية.
حزمة كاشف أوبال بولاريس 780أكويا بيوساينسز، إنك.FP1501001KTتضخيم واكتشاف إشارات RNA المستهدفة باستخدام وضع علامات فلورية.
ألماسة برولوندثيرمو فيشرP36970وسط تثبيت مضاد للتدرج للحفاظ على إشارات الفلورسنت وحماية إشارة RNAscope أثناء التصوير
RNAscope 4-Plex مجموعة مساعدة واجهة مستخدم محددةACD، Bio-Techne323120المواد الإضافية المستخدمة في اختبار RNAscope Multiplex Fluorescent v2
RNAscope DAPIACD، Bio-Techne320858صبغة نووية فلورية تستخدم في اختبارات RNAscope لرؤية نوى الخلية
مجموعة RNAscope Multiplex لمادة الكواشف الفلورية v2ACD، Bio-Techne323100لإجراء التهجين الفلوري متعدد الوحدات في الموقع
مخزن RNAscope Multiplex TSAACD، Bio-Techne322810مخزن مؤقت يستخدم في منظار RNA لتخفيف أصباغ الأوبال
كواشف مخزن الغسيل RNAscopeACD، Bio-Techne310091استخدم لغسل أقسام النسيج على الشرائح أثناء الفحص
محلول إزالة التلوث RNaseZap RNaseثيرمو فيشرAM9782استخدامه لتنظيف وإزالة RNase
الميكروتوم الدوار شبه الآليلايكا بيوسيستمزRM2245استخدم قسم حجب FFPE كما هو مذكور في الإرشادات.
سلايدبريتعلم المجهر الإلكتروني23401-01لخطوة إزالة البارافينية قبل معالجة RNAscope.
سخان منزلق مع غطاءالعرض الأول  XH2004الاستخدام لحضانة الشرائح عند درجات حرارة مختلفة
شرائح سوبرفروست بلس فيشر ساينتيفك12-550-15 استخدام تركيب أقسام لجهاز Vsium HD
البارابلاست الجراحيلايكا بيوسيستمز39601006الاستخدام لإجراء تسريب الأنسجة وغرس الأنسجة
مزرعة الأنسجة DISH 100 × 20 مم 500/CSفيشر ساينتيفك877222الاستخدام لجمع وتشريح العينات في 1´؛ PBS
زيلينفيشر ساينتيفك6.81001E+12يستخدم كعامل تنظيف لإزالة الكحول وجعل الأنسجة شفافة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Artika, I. M., et al. Real-time polymerase chain reaction: current techniques, applications, and role in COVID-19 diagnosis. Genes. 13 (12), 2387(2022).
  2. Chu, Y. H., et al. In situ hybridization: introduction to techniques, applications and pitfalls in the performance and interpretation of assays. Semin Diagn Pathol. 36 (5), 336-341 (2019).
  3. Atout, S., et al. Evaluation of the suitability of RNAscope as a technique to measure gene expression in clinical diagnostics: a systematic review. Mol Diagn Ther. 26 (1), 19-37 (2022).
  4. Tseng, K. C., Crump, J. G. Craniofacial developmental biology in the single-cell era. Development. 150 (19), dev202077(2023).
  5. Kishi, J. Y., et al. SABER amplifies FISH: enhanced multiplexed imaging of RNA and DNA in cells and tissues. Nat Methods. 16 (6), 533-544 (2019).
  6. Lovely, A. M., et al. Hybridization chain reaction fluorescence in situ hybridization (HCR-FISH) in Ambystoma mexicanum tissue. Methods Mol Biol. 2562, 109-122 (2023).
  7. Raju, R., et al. Profiles of Wnt pathway gene expression during tooth morphogenesis. Front Physiol. 14, 1316635(2024).
  8. Piña, J. O., et al. Multimodal spatiotemporal transcriptomic resolution of embryonic palate osteogenesis. Nat Commun. 14, 5687(2023).
  9. Piña, J. O., et al. Spatial multi-omics reveals the role of the Wnt modulator Dkk2 in palatogenesis. J Dent Res. 103 (13), 1412-1420 (2024).
  10. Raj, A., et al. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  11. Xia, C., et al. Spatial transcriptome profiling by MERFISH reveals subcellular RNA compartmentalization and cell cycle-dependent gene expression. Proc Natl Acad Sci USA. 116, 19490-19499 (2019).
  12. Lubeck, E., et al. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nat Methods. 11, 360-361 (2014).
  13. Shah, S., et al. In situ transcription profiling of single cells reveals spatial organization of cells in the mouse hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  14. Gaspar, I., Ephrussi, A. Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).
  15. Erben, L., Buonanno, A. Detection and quantification of multiple RNA sequences using emerging ultrasensitive fluorescent in situ hybridization techniques. Curr Protoc Neurosci. 87, e63(2019).
  16. Makareeva, E., et al. RNA-based bone histomorphometry: method and its application. J Bone Miner Res. 39 (2), 177-189 (2024).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  18. Monné Rodríguez, J. M., et al. Review of in situ hybridization techniques for drug research and development. Toxicol Pathol. 51 (3), 92-111 (2023).
  19. Colburn, M. E., et al. Effect of formalin-fixation and paraffin-embedded tissue storage times on RNAscope signal amplification. J Vet Diagn Invest. 36 (4), 498-505 (2024).
  20. Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium. Am J Clin Pathol. 137 (3), 429-436 (2012).
  21. RNAscope multiplex fluorescent reagent kit v2 user manual. , ACDbio. Available from: https://manuals.plus/m/0f24eea864dcf70b83735b261589c2e98f9c707b01c1c9c0455f349c8ab2eb0c (2025).
  22. Bankhead, P., et al. QuPath: open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7, 16878(2017).
  23. Hernández, S. C., et al. Single-cell and spatial transcriptomic profiling of cardiac fibroblasts following myocardial infarction. Sci Data. 13, 216(2026).
  24. Dropmann, A., et al. The TGF-β1 target WISP1 is highly expressed in liver cirrhosis and cirrhotic HCC microenvironment. Biochem Biophys Res Commun. 732, 150409(2024).
  25. Stolley, D. L., et al. RNA in situ hybridization with sequential protein immunofluorescence in tandem assay. J Vis Exp. (224), e68615(2025).
  26. Anderson, C. M., et al. Visualizing genetic variants, short targets, and point mutations in the morphological tissue context. J Vis Exp. (138), e58097(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Multiplex Fluorescent HybridizationIn Situ HybridizationCraniofacial DevelopmentFFPE Mouse SamplesmRNA DetectionGene Expression LocalizationTissue ArchitectureCraniofacial TissuesCongenital Craniofacial DisordersSpatial Gene Expression

مقالات ذات صلة