يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التنمذة الظاهرية للتنكس العصبي الدوباميني في يرقات أسماك الزرد باستخدام التحليل السلوكي والتصوير عالي المحتوى

335 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71516

⸱

يونيو 16, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Pharmacy Practice, UC Irvine School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2Robert A. Mah Molecular Innovation Center, University of California Irvine

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول طريقة فحص مركبة موحدة وعالية الإنتاجية تستخدم سمك الزرد في الجسم الحي لقياس فقدان الخلايا العصبية الدوباميني والعجز السلوكي الحركي، مما يمكن من فحص المركبات الواقية العصبية بكفاءة.

الملخص

أبحاث اكتشاف الأدوية في التنكس العصبي مقيدة بالتكلفة العالية وانخفاض إنتاجية النماذج الثديية التقليدية. يلاحظ هذا العجز بشكل خاص في أبحاث مرض باركنسون، حيث تظل الدراسات الصارمة والقابلة للتوسع للتنكس العصبي للدوبامين (DA) بطيئة وتستهلك الكثير من الموارد. لسد هذه الفجوة، نقدم خط أنابيب نموذجية موحد عالي الإنتاج باستخدام نموذج سمكة زرد معدلة وراثيا تعبر عن إنزيم النيتروريدوكتاز في خلايا DA لدراسة فقدان خلايا DA خلال خمسة أيام من الإخصاب. تقدم سمكة الزرد مزايا رئيسية لعلوم الأعصاب الانتقالية، بما في ذلك التطور السريع لليرقات، والشفافية البصرية التي تمكن من التصوير الكامل للدماغ في الجسم الحي ، والحفاظ القوي على الجينات والمسارات المرتبطة بمرض باركنسون، والدوائر العصبية السليمة التي لا يمكن الوصول إليها في نماذج زراعة الخلايا. يدمج بروتوكولنا الإزالة الكيميائية الجينية والتصوير عالي المحتوى لتوليد مجموعات بيانات سريعة للفحص. يتم إزالة خلايا DA بشكل انتقائي باستخدام ميترونيدازول (MTZ)، مما ينتج عنه تنكرا عصبيا محددا وقابلا للتعديل. ينتج علاج MTZ انخفاضات تعتمد على الجرعة في الحركة المتوافقة مع الأنماط الظاهرية الشبيهة بالخلايا الحركية البطيئة، مما يوفر ارتباطا سلوكيا قويا بفقدان خلايا DA. نظرا لأن مرض باركنسون هو في جوهره اضطراب حركي، فإننا نربط القياسات التشريحية بالقراءات السلوكية الوظيفية. يتم تسجيل النشاط الحركي مباشرة في لوحة ويتم قياسها باستخدام تتبع آلي، مستخلصا مقاييس تشمل المسافة الكلية المقطوعة، وتكرار جولة السباحة، وبدء الانفجار. توفر أسماك الزرد نظام نماذج فعال وقابل للتوسع يمكن من خلاله اختبار مئات اليرقات في نفس الوقت مع التعامل البسيط الأدنى. قمنا بتحسين بروتوكول فحص دوائي عالي الإنتاجية يعتمد على الألواح مصمما لتقليل التباين التجريبي في أبحاث الطلاب الجامعيين. يضمن هذا التنسيق الموحد القائم على الألواح لفحص المركبات المرشحة للحماية العصبية أو الإنقاذ الوظيفي أن تظل البيانات التي يجمعها الباحثون مختلفون قابلة للمقارنة الإحصائية وفعالة في تحديد المرشحين الواقيين العصبي، مما يحسن من قابلية التكرار. معا، توفر هذه المنهجية إطارا قويا وقابلا للتوسع لأبحاث التنكس العصبي.

المقدمة

تواجه أبحاث اكتشاف الأدوية في التنكس العصبي عنق زجاجة كبير في الكفاءة بسبب التكلفة العالية وانخفاض الإنتاج في نماذج الثدييات التقليدية 1,2، مما يتطلب تخطيطا تجريبيا دقيقا واستخدام قوة عاملة كبيرة. الهدف العام من هذه الطريقة هو تقديم نهج موحد عالي الإنتاجية باستخدام Tg(th:Gal4؛ نموذج سمك الزرد المعدلة وراثيا UAS:NTR-mCherry، حيث يتم التعبير عن نيتروريدوكتاز-mCherry بشكل خاص في الخلايا العصبية الدوبامينية (DA) لدراسة فقدان عصبون DA ونقص الحركة في العصبون. ينبع الدافع وراء استخدام هذه التقنية من الحاجة إلى نماذج صارمة وقابلة للتوسع واقتصاديا في الجسم الحي لأبحاث التنكس العصبي 3,4,5. بينما تسمح زراعة الخلايا المختبرية بفحص سريع للأدوية، إلا أنها تفتقر إلى الدوائر العصبية السليمة وسياق الكائن الحي الكامل الضروري للأهمية الانتقالية6. على النقيض من ذلك، توفر نماذج القوارض سياقا فسيولوجيا ممتازا لكنها مكلفة وتستغرق وقتا طويلا للفحص الأولي عالي الإنتاجية للمركبات الواقية العصبية7،8.

تمتلك أسماك الزرد تطورا يرقيا سريعا، وشفافية بصرية تمكن من التصوير الكامل للدماغ في الجسم الحي، وحفظ جيني قوي للمسارات ذات الصلة بالأمراض، خاصة المتعلقة بالتنكس العصبي 9,10,11. يدمج البروتوكول بشكل خاص الزراعة الموحدة، والاستئصال الكيميائي عبر ميترونيدازول (MTZ)، والتصوير عالي المحتوى مع تتبع السلوك الوظيفي. قياس النشاط الحركي بشكل مباشر يوفر ارتباطا سلوكيا قويا بفقدان الخلايا العصبية في DA، حيث يرتبط فقدان الخلايا العصبية للدوبامين باضطرابات سلوكية12،13،14. التنسيق الموحد القائم على الصفائح يقلل من التباين التجريبي بين المشغلين، كما أن سرعة النقل العالية لنظام يرقات سمك الزرد تتيح أحجام عينات كبيرة، مما يوفر معا قوة إحصائية كافية لاكتشاف التأثيرات الوقائية العصبية. وهذا يجعل البروتوكول مناسبا جدا للتطبيقات التي تتطلب فحصا قابلا للتوسع وإعادة الإنتاج، بما في ذلك الإعدادات التي قد تختلف فيها خبرة المحقق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الطرق التي تتضمن استخدام المواد الفقارية وفقا لإرشادات لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (موافقة IACUC AUP-25-098).

1. تربية أسماك الزرد

  1. الحفاظ على ظروف النظام المائي
    1. حافظ على نظام الماء المعاد تدويره عند 28.5°C (النطاق المقبول: 26°C–30°C)، ودرجة الحموضة بين 7.1–7.8، وتوصيلية 600–700 ميكروثانية/سم. حافظ على كثافة تخزين سمك الزرد البالغ حوالي 5 أسماك/لتر في الأحواض المنزلية.
    2. راقب مستويات الأمونيا والنتريت والنترات يوميا باستخدام مجموعة اختبار جودة مياه الحوض اللوني وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. حافظ على الأمونيا والنتريت عند 0 جزء في المليون، والنترات بين 10–20 جزء في المليون.
    3. إجراء تبادلات مياه عندما تتجاوز الأمونيا أو النتريت 0 جزء في المليون، أو النترات تتجاوز 20 جزء في المليون، أو يكون هناك عكارة مرئية أو حطام، أو عندما تقع قيم الرقم الهيدروجيني/التوصيلية خارج النطاقات المستهدفة الموضحة في الخطوة 1.1.1. يستمر التبادل حتى تعود الأمونيا والنيتريت إلى 0 جزء في المليون، وتعود النترات إلى 10–20 جزء في المليون، وتستعيد قيم الرقم الهيدروجيني والتوصيلية إلى النطاق المستهدف.
    4. حافظ على دورة ضوء 14 ساعة و10 ساعات مظلمة لمزامنة الإيقاع اليومي والتكاثر.
  2. تغذية سمك الزرد في مراحل تطور مختلفة
    1. أطعم الأسماك البالغة حبيبات تغرق ببطء 0.5 مم مرتين يوميا. توحيد التغذية حسب وقت الاستهلاك وتوفير الكمية المستهلكة فقط خلال 3–5 دقائق. استخدم نفس حجم الحبيبات ونوع النظام الغذائي باستمرار عبر مجموعات تجريبية.
    2. أطعم يرقات الأسماك جيما مايكرو 75 ZF، أو نظام غذائي مكافئ لسمك الزرد بحجم جسيمات حوالي 75 ميكرومتر، ثلاث مرات يوميا. أطعم الأسماك الصغيرة (شهر واحد) جيما ميكرو 150 ZF، أو نظام غذائي مكافئ لسمك الزرد بحجم جسيمات حوالي 150 ميكرومتر، ثلاث مرات يوميا.
    3. استبدل الأنظمة الغذائية المكافئة فقط إذا كانت مصممة ليرقات أو صغار سمك الزرد، وتوفر حجم جسيمات مماثل، وتوفر تغذية غنية بالبروتين وكاملة المغذيات مناسبة للمرحلة التطورية.
    4. أضف حمية يرقة وصغار الروبيان المالحي الحي الطازج مرة واحدة يوميا عند الظهر في أيام الأسبوع. فقس أكياس الجمبري المملح في ماء مالح مهوي لمدة 24–36 ساعة حسب تعليمات الشركة المصنعة.
    5. اجمع الناوبلي السائق النشط، اشطفها بماء النظام، وأطعم فقط الكمية التي تستهلك خلال 5–10 دقائق.
    6. تجنب الإفراط في الإطعام، لأن العشاءات الزائدة ترفع مستويات الأمونيا.
      ملاحظة: قم بإزالة الطعام غير المأكول والحطام الظاهر يوميا عن طريق الشفط اللطيف. افحص الأحواض بحثا عن الأسماك الميتة أو غير الصحية ونظف أسطح الحوض أو المصافي عند ملاحظة تراكم الحطام. الحفاظ على كثافة الخزانات، والتغذية، والتنظيف، ومراقبة جودة المياه بشكل مستمر عبر مجموعات التجريب. لمزيد من التفاصيل حول تربية سمك الزرد، ومرحلة التطور، وتربية الجمبري المالح، وصيانة المنشأة طويلة الأمد، يرجى الرجوع إلى ويسترفيلد15 وأفديش وآخرون 16.

2. جمع الأجنة، تحضير المواد الكيميائية، والفحص المعدل وراثيا

  1. إعداد تهجين التكاثر
    1. قم بتجميع خزانات التقاطع مع فاصل في المساء قبل جمع الأجنة.
    2. ضع ذكر واحد وأنثى سمكة زرادية في كل حوض عبور، مع فصل الذكور والإناث بواسطة الفاصل طوال الليل.
    3. أزل الفاصلة في صباح اليوم التالي في بداية دورة الضوء واترك التكاثر لمدة ساعتين ثابتة. اجمع الأجنة مباشرة بعد نافذة التكاثر لتقليل التباين في مراحل النمو.
  2. جمع وحضن الأجنة
    1. اجمع الأجنة عن طريق صب ماء الحوض عبر فلتر شبكي بحجم 400 ميكرومتر. اشطف الأجنة بلطف بماء النظام أو ماء البيض الأزرق (BEW) لإزالة الحطام، ثم نقل الأجنة إلى أطباق بيتري بحجم 100 مم باستخدام ماصة نقل ذات مرة واحدة. قلل من التعامل مع الأجنة وتجنب تعريض الأجنة للهواء لفترات طويلة.
    2. نقل الأجنة إلى أطباق بتري بحجم 100 مم تحتوي على 30 مل من BEW بكثافة تتراوح بين 50–60 جنينا في كل طبق. لا تتجاوز 60 جنينا في كل طبق للحفاظ على نمو مستمر وتوفر الأكسجين.
    3. حضن الأجنة عند 28.5°م تحت دورة ضوء 14 ساعة:10 ساعات مظلمة.
    4. قم بإزالة البويضات غير المخصبة والأجنة غير الصالحة للحياة يوميا.
      ملاحظة: حضر BEW باستخدام 60 ملغ من ملح البحر الفوري للمحيط، 50 ميكرولتر من 1٪ ميثيلين أزرق، و1 لتر من الماء منزوع الأيونات17.
  3. تحضير وتطبيق محلول 1-فينيل-2-ثيوريا (PTU)
    1. حضر محلول مخزون PTU بسعة 100 مللي مول في ثنائي ميثيل كبريتسي (DMSO).
    2. قم بتخزين محلول PTU عند 4°C محمي من الضوء.
    3. عند 24–36 ساعة بعد التسميد (hpf)، أضف 60 ميكرولتر من محلول PTU إلى كل طبق يحتوي على 30 مل BEW لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 200 ميكرومول.
    4. اخلط PTU عن طريق تدوير طبق بتري بلطف بحركة دائرية من 5 إلى 10 مرات. تجنب الحقن مباشرة على الأجنة لتقليل الإجهاد الميكانيكي.
      تحذير: قد يسبب PTU تهيجا في الجهاز التنفسي والجلدي. تعامل مع القفازات وقم بالتحضير في مكان جيد التهوية.
  4. حضر مخدر تريكائين
    1. قم بإذابة 400 ملغ من تريكائين ميثانيسلفونات في 97.9 مل من ماء ميلي-كيو.
    2. أضف 2.1 مل من قاعدة Tris بقوة 1 M (pH 9) إلى المحلول.
    3. اضبط المحلول إلى درجة حموضة 7.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك بمقدار 0.1 مل.
    4. أليكوت المحلول في أنابيب معنونة وخزنها عند 4°C.
    5. تخفيف المحلول الأصلي بنسبة 1:25 للحصول على تركيز عمل 160 ميكروغرام/مل أو تخفيف 1:100 للحصول على 40 ميكروغرام/مل للتطبيقات منخفضة الجرعة18.
      تحذير: تريكائين ميثانيسلفونات هو مخدر كيميائي. تعامل مع استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة.
  5. أداء التهجين
    1. التداخل المتماثل Tg(th:Gal4؛ UAS:NTR-mCherry) البالغون مع أسماك الزرد البرية AB عن طريق وضع بالغ واحد متحول وراثيا متماثل الزيجوت وبالغ بري من نوع AB من الجنس الآخر في حوض تقاطعي مع فاصل طوال الليل. أزل الفاصلة في بداية دورة الضوء واجمع الأجنة بعد نافذة تكاثر ثابتة مدتها ساعتان.
  6. يرقات معدلة وراثيا على الشاشة
    1. بعد 3 أيام من الإخصاب (DPF)، تخدير اليرقات باستخدام ترايسين بتركيز نهائي 160 ميكروغرام/مل.
    2. راقب اليرقات تحت ميكروسكوب فلوري باستخدام مجموعة مرشح mCherry (إثارة ~587 نانومتر، انبعاث ~610 نانومتر). استخدم نفس إعدادات الفحص لجميع اليرقات داخل التجربة، بما في ذلك التكبير الموضوعي، ووقت التعريض، والكسب، وشدة الإضاءة.
    3. اضبط التعرض والكسب باستخدام يرقة معدلة وراثيا إيجابية معروفة بحيث يكون فلورة عصبون DA مرئية بوضوح دون تشبع، ثم حافظ على هذه الإعدادات لجميع اليرقات المتبقية في التجربة.
    4. تأكيد وجود إشارة mCherry الإيجابية موضعية في تجمعات الخلايا العصبية DA في الدماغ الثنائي البطني بين العينين وقليلا في البطن إلى الخط الأوسط (الشكل 1A).
    5. حدد اليرقات الإيجابية كتلك التي تظهر توهج mCherry بوضوح في مجموعات الخلايا العصبية المتوقعة للدكيري في الدماغ البطني. صنف اليرقات كسلبية إذا لم تكن هناك إشارة mCherry مرئية فوق الخلفية تحت إعدادات الفحص الثابتة، باستخدام يرقات سلبية غير معدلة وراثيا أو معروفة كعناصر تحكم خلفية.
      ملاحظة: 3 dpf هو أول مرحلة تنتج خلايا DA في الدماغ الثنائي البطني إشارة فلورية موثوقة للقياس.

figure-protocol-1
الشكل 1: الفحص المعدل وراثيا، تضمين اليرقة، وتصميم الصفائح. (أ) صورة فلورية (قناة mChery، 4× هدف) ليرة سمكة زرد معدلة وراثيا تعبر عن إنزيم النيتروريدوكتاز (NTR) في الخلايا العصبية الدوبامينية (DA)، تظهر تجمعات عصبية DA في الدماغ البطني بين العينين. (ب) رؤوس ماصات P200 المعدلة المقذوفة إلى فتحات بحجم حوالي 1.5 مم، تستخدم لنقل اليرقات أثناء دمج الأغاروز. (ج) تخطيط لوحة 96 بئر تمثيلي لفحص الأدوية عالي الإنتاجية، بما في ذلك التحكم في المركبات، والآبار المعالجة بالميترونيدازول (MTZ)، وظروف المركبات الفحصية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. الاستئصال الكيميائي والتصوير الفلوري

  1. تحضير وسط تثبيت الأغاروز
    1. في يوم الدمج عند 4 DPF، حضر أجوروز منخفض نقطة الانصهار (LMA) بنسبة 1.2٪ في مياه Milli-Q.
    2. سخن محلول الأغاروز في ميكروويف بفواصل قصيرة تتراوح بين 5–10 ثوان، مع الدوران برفق بين الفترات، حتى يذوب الأغاروز بالكامل ويصبح المحلول صافيا. تجنب الغليان الزائد أو التسخين المطول، الذي قد يغير تركيز الأغاروز النهائي من خلال التبخر.
    3. أليكوت الأغاروز في أنابيب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل.
    4. اذيب الأليكوات عند 70°C ووازنها في كتلة حرارية 42°C قبل الاستخدام.
    5. أضف 20 ميكرولتر من محلول مخزون التريكين (4 ملغ/مل) إلى كل أليكوت أغاروز لتحقيق تركيز عمل يقارب 40 ميكروغرام/مل.
    6. اخلط الترايكاين في الأجاروز المنصهر عن طريق التوصيل بلطف للأعلى والأسفل 5–10 مرات باستخدام ماصة P200. تجنب الدوامة أو إدخال الفقاعات، لأن الفقاعات قد تتداخل مع تحديد موقع اليرقات وتصويرها.
  2. تخدير وغرس اليرقات
    1. أضف محلول مخزون التريكائين إلى طبق بتري الذي يحتوي على يرقات بقوة 4 dpf لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 160 ميكروغرام/مل.
    2. حضن اليرقات في التريكائين لمدة تقارب 5 دقائق، أو حتى تظهر فقدان السباحة التلقائية ولا تستجيب لللمس اللطيف بالمجس الكهربائي. تابع التضمين فقط بعد الوصول إلى نقطة التخدير هذه.
    3. قم بقص الطرف البعيد لطرف ماصة P200 باستخدام مقص نظيف أو شفرة معقمة لتكوين فتحة تقريبية 1.5 مم. تحقق من حجم الفتحة باستخدام مسطرة أو مقياس معاير تحت المجهر المجسم قبل الاستخدام. تخلص من الأطراف ذات الحواف الخشنة أو الفتحات الضيقة جدا بحيث لا تستطيع اليرقات المرور دون ملامسة (الشكل 1B).
    4. استنشق يرقة واحدة في سائل ضئيل باستخدام رأس الماصة المعدل.
    5. اغمر طرف الماصة في الأغاروز أليكوت.
    6. وزع 40 ميكرولتر من الأغاروز الذي يحتوي على يرقة واحدة في بئر واحد من صفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا. استخدم نفس حجم الأجاروز لجميع الآبار ضمن التجربة. إذا تم استخدام نوع مختلف من الصفائح، قم بتحسين حجم الأغاروز قبل بدء التجربة والحفاظ على الحجم المختار عبر جميع الآبار.
      ملاحظة: استخدم ألواح مسطحة القاع لضمان تصوير متناسق. تحسين حجم الأجاروز بناء على هندسة الصفائح.
  3. اليرقات الشرقية والغرس
    1. ضع اللوحة تحت ميكروسكوب مجسم (مجهر تشريح).
    2. استخدم ملقط ذو رؤوس دقيقة أو مسبار بقطر 0.25 مم لتوجيه اليرقة بحيث تواجه العضلة البطنية الدماغية الهدفية.
    3. ضع اليرقات من الجانب الظهري للأسفل للمجهر المقلوبة أو الجانب الظهري للأعلى للمجهر العمودية.
    4. يتم التوجيه الكامل خلال دقيقة إلى دقيقتين قبل أن يتصلب الأغاروز.
    5. تضمين يرقة واحدة لكل بئر وفقا لخريطة صفيحة محددة مسبقا ل 96 بئرا. احتفظ الصف A بضوابط المركبات، والصف H للعناصر التي تعتمد فقط على MTZ، وتعيين الصفوف B–G لشروط مركبة مرشحة أو مجموعات استجابة الجرعة. عشوائي توزيع المركبات داخل الصفوف B–G عندما يكون ذلك ممكنا لتقليل انحياز الموضع. استخدم نفس خريطة اللوحة للتصوير الأساسي وبعد العلاج.
    6. بعد تصلب الأجاروز، أضف BEW بدون تريكائين إلى كل بئر ليصل حجم البئر النهائي إلى 200 ميكرولتر بالضبط. استخدم نفس الحجم النهائي لجميع الآبار داخل الصفيحة للحفاظ على انتشار وتعرض معالجي ثابت.
  4. تحضير حلول علاج MTZ
    1. تحضير حلول MTZ العاملة في BEW مع دعم 1٪ DMSO و200 ميكرومولار PTU. أضف مسحوق MTZ إلى المحلول والدوامة حتى لا تبقى جزيئات مرئية. اخلط على جهاز هزاز أو مدور أنبوبي محمي من الضوء لمدة 15–30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن المحلول شفاف وخال من الرواسب الظاهرة قبل الاستخدام.
    2. تحضير تركيزات 3، 4.5، و9 ملليمولار لتحسين الجرعة والاستجابة المناسبة.
    3. جهز نظام تحكم للمركبة يحتوي على 1٪ DMSO في BEW مع وحدة PTU بسعة 200 ميكرومول.
    4. جهز فقط تركيز MTZ المعتمد للفحص الروتيني بعد التحسين.
      تحذير: MTZ حساس للضوء. حضر محاليل جديدة لكل تجربة، واحم من الضوء باستخدام ورق الألمنيوم، ولا تعيد استخدام المحاليل المتبقية.
      ملاحظة: حافظ على تركيزات DMSO النهائية المتطابقة في جميع مجموعات العلاج ومجموعة الضابطة. لا تستبدل تركيبات MTZ البديلة.
  5. احصل على صور فلورية قبل العلاج
    1. عند 4 DPF، بعد التضمين، التقط صور فلورية أساسية باستخدام مجهر فلوري بهدف 20× (الشكل 2).
    2. صور كل بئر باستخدام قناة mCherry (الإثارة ~587 نانومتر، الانبعاث ~610 نانومتر).
    3. استخدم إعدادات تصوير متطابقة لجميع الآبار ضمن التجربة. اضبط وقت التعرض، شدة الإضاءة، وكسب الكاشف باستخدام يرقة تحكم المركبة بحيث تصل أكثر بكسل الخلايا العصبية DA سطوعا إلى حوالي 70٪–80٪ من النطاق الديناميكي للكاشف دون تشبع. سجل وقت التعريض النهائي، شدة الإضاءة، كسب الكاشف، الهدف، وملف الاكتساب، وحافظ على هذه الإعدادات لجميع الصور الأساسية وبعد المعالجة.
    4. التقاط جميع الصور خلال جلسة واحدة عندما يكون ذلك ممكنا لتقليل التفاوت في شدة المصباح أو حساسية الكاشف عبر النقاط الزمنية. بالنسبة للأنظمة التي تحتوي على تحكم تلقائي في المرحلة، استخدم اكتساب الوضع المتعدد للحفاظ على إحداثيات متطابقة عبر جلسات التصوير.
    5. احتفظ بملف الاستحواذ لإعادة استخدامه أثناء التصوير بعد العلاج (الخطوة 3.7) وفي التجارب اللاحقة.
      ملاحظة: يوفر هدف 20× توازنا بين مجال الرؤية والدقة لتصوير تجمع الخلايا العصبية الدماغية للدوالين.
  6. تطبيق علاج MTZ بعد التصوير الأساسي
    1. مباشرة بعد التصوير الأساسي عند 4 ديفرانسيلر قدم، أضف محلول يحتوي على MTZ أو محلول مركبة مباشرة إلى كل بئر ليصل حجم البئر النهائي إلى 200 ميكرولتر.
    2. لتجارب فحص المركبات، أضف المركبات المرشحة مع MTZ في هذه المرحلة بحيث تتعرض اليرقات لمركب MTZ ± خلال نفس فترة المعالجة التي تستمر 24 ساعة.
    3. يحتضن الصفائح عند 28.5°م تحت دورة ضوء مظلمة مدتها 14 ساعة:10 ساعات لمدة 24 ساعة، من 4 DPF إلى 5 DPF.
    4. تجنب إزعاج الألواح أثناء الحضانة.
      ملاحظة: في تجارب استجابة الجرعة، قيم أوقات الحضانة الإضافية (مثل 12 و48 ساعة) لتحسين ظروف العلاج.
      نقطة التوقف: يمكن الحفاظ على الصفائح تحت ظروف الحضانة لمدة العلاج المحددة قبل الانتقال إلى التصوير.
  7. احصل على صور فلورية بعد العلاج
    1. عند 5 DPF، التقط صورا بعد العلاج باستخدام نفس إعدادات المجهر المستخدمة للتصوير الأساسي عند 4 DPF، بما في ذلك وقت التعرض، شدة الإضاءة، كسب الكاشف، الهدف، وملف الالتقاط (الشكل 2).
    2. لا تقم بتعديل وقت التعرض، أو زيادة الكاشف، أو شدة الإضاءة، أو التركيز، أو الهدف، أو إعدادات الاكتساب بين الآبار أو بين جلسات التصوير قبل وبعد العلاج.
    3. إذا كان المجهر مغلقا بين الجلسات، أعد تحميل ملف تعريف الاستحواذ المحفوظ وتحقق من جميع الإعدادات مقابل المعلمات المسجلة قبل التصوير.
    4. تجمع الصور بنفس الترتيب المستخدم أثناء التصوير الأساسي عندما يكون ذلك ممكنا، وتحصل على جميع الصور بعد العلاج خلال نفس جلسة التصوير.
    5. هذا التصميم التصويري قبل العلاج وما بعد العلاج يتحكم في التباين بين الأفراد في تألق الخلايا العصبية في التحليل الدابلورلي الأساسي ويضمن أن التغيرات في الإشارة تعزى إلى العلاج وليس الفروق في الاكتساب.

figure-protocol-2
الشكل 2: انخفاض الفلورة العصبية العصبية DA حسب الجرعة بعد معالجة الميترونيدازول. صور فلورية تمثيلية (قناة mChery، 20× هدفي) لرقات أسماك الزرد المعدلة وراثيا تظهر خلايا DA ثنائية الدماغ بعد علاج استمر 24 ساعة مع تركيزات متفاوتة من MTZ. تنخفض شدة الفلورة بطريقة تعتمد على الجرعة، مما يشير إلى نجاح الاستئصال الكيميائي للخلايا العصبية المعبرة عن NTR. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. فحص الأدوية عالي الإنتاجية باستخدام الألواح

  1. توليد وفحص اليرقات المعدلة وراثيا
    1. توليد مجموعة جديدة من اليرقات المعدلة وراثيا متجانسة الزيجوت.
    2. اجمع الأجنة وربيها في BEW.
    3. عالج الأجنة بوحدة PTU بقوة 200 ميكرومولار بعد 24–36 ساعة من الإخصاب (hpf) كما هو موضح في الخطوة 2.3.
    4. عند 3 dpf، تستخدم قناة mCherry مع إعدادات مجهرية ثابتة لجميع اليرقات داخل التجربة. اضبط وقت التعرض، وزيادة الكاشف، وشدة الإضاءة باستخدام يرقة موجبة معروفة للكشف بوضوح عن فلورة عصبون DA دون تشبع، ثم حافظ على هذه الإعدادات دون تغيير أثناء الفحص.
    5. صنف اليرقات كإيجابية إذا كان الفلورة الشفافة في تجمع الخلايا العصبية المتوقعة للدئا في الدماغ البطني تحت إعدادات فحص ثابتة. تخلص من اليرقات التي لا يوجد بها إشارة فوق الخلفية في هذه المنطقة أو التي تحتوي على فلورة ضعيفة أو منتشرة أو خارج الرحم.
  2. دمج اليرقات والحصول على صور أساسية
    1. عند 4 DPF، تدمج اليرقات في صفيحة بها 96 بئر كما هو موضح في الخطوات 3.2–3.3، باستخدام يرقة واحدة لكل بئر.
    2. احصل على صور فلورية أساسية قبل العلاج كما هو موضح في الخطوة 3.5.
  3. تطبيق MTZ والمركبات المرشحة
    1. بعد الحصول على صور فلورية أساسية عند 4 dpf، أضف محاليل المعالجة مباشرة إلى الآبار وفقا لخريطة اللوحة (الشكل 1C).
    2. بالنسبة لآبار التحكم في المركبات، أضف BEW الذي يحتوي على نفس تركيز DMSO النهائي المستخدم في الآبار المعالجة بالمركبات.
    3. بالنسبة لآبار التحكم التي تحتوي فقط على MTZ، أضف محلول MTZ بدون مركب مرشح.
    4. بالنسبة لآبار فحص المركبات، أضف MTZ والمركب المرشح معا حتى تتعرض اليرقات لكليهما خلال نفس فترة العلاج التي تستمر 24 ساعة.
    5. للفحص الأولي، استخدم تركيز مركب واحد، مثل 10 ميكرومول، ما لم تشير بيانات الذوبانية أو السمية أو الاستجابة السابقة لكل مركب إلى ضرورة استخدام تركيز مختلف.
    6. ضبط كل بئر إلى حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر. حافظ على تركيزات DMSO النهائية المتطابقة عبر جميع الآبار، بما في ذلك التحكم في المركبات، والتحكم ب MTZ فقط، وMTZ بالإضافة إلى الآبار المركبة.
    7. يحتضن الصفائح عند 28.5°م تحت دورة ضوء مظلمة مدتها 14 ساعة:10 ساعات لمدة 24 ساعة، من 4 DPF إلى 5 DPF.
      ملاحظة: هذا البروتوكول لا يشمل إزالة MTZ أو الغسل قبل التعرض للمركبات. يتم تطبيق المركبات المرشحة بالتزامن مع MTZ مباشرة بعد التصوير الأساسي.
  4. احصل على صور بعد العلاج وحسب احتفاظ الفلورة
    1. عند 5 DPF، التقط صورا فلورية بعد العلاج باستخدام نفس إعدادات الاكتساب المستخدمة في التصوير الأساسي عند 4 DPF.
    2. آبار الصور بنفس الترتيب المستخدم أثناء التصوير الأساسي كلما أمكن.
    3. احسب احتفاظ الفلورة لكل يرقة كالتالي:
      figure-protocol-3
    4. تطبيع قيم الاحتفاظ بالفلورة إلى متوسط قيمة التحكم في المركبة من نفس اللوحة.
    5. حدد المركبات الواقية المرشحة على أنها تلك التي تحتوي على قيم احتفاظ بالفلورة أعلى بكثير من مجموعة التحكم التي تعتمد فقط على MTZ.
  5. تحديد مركبات الإصابة
    1. حدد المركبات الضربة على أنها تلك التي تحتوي على نسب احتفاظ بالفلورة أعلى بشكل ملحوظ من الضابط السلبي (MTZ فقط).
    2. إجراء تحليل إحصائي باستخدام اختبار t لويلش لمقارنة مجموعة الضوابط التي تحتوي فقط على MTZ مع مجموعات العلاج ب MTZ بالإضافة إلى مركبات.
    3. التحقق من صحة المركبات الضربية باستخدام النسخ البيولوجية المستقلة واختبارات استجابة الجرعة. أكد أن الضربات هي مركبات تزيد احتفاظ الفلورة بشكل متكرر مقارنة بالتحكم في MTZ فقط، مع p < 0.05 وعدم وجود سمية ظاهرة لليرقات أو شكل غير طبيعي.
    4. نتائج مثبتة مسبقة للاختبارات الثانوية مثل تحليل السلوك الحركي، التحقق من الجرعة-الاستجابة، أو اختبار النسخ البيولوجي المستقل.
      ملاحظة: بالنسبة لشاشات مكتبة المركبات، احسب عامل Z لكل لوحة باستخدام عناصر تحكم موجبة وسالبة. يشير عامل Z > 0.5 إلى اختبار قوي مناسب لتحديد الإصابة.

5. تقييم السلوك الحركي

  1. تعيين اليرقات لمجموعات العلاج
    1. عند 4 DPF، قم بتخصيص اليرقات من كل نمط جيني إلى ثلاث مجموعات علاجية مع ما لا يقل عن 10 يرقات لكل مجموعة: BEW فقط، وDMSO التحكم في المركبات، وعلاج MTZ.
    2. خصص المجموعات كما يلي: (1) BEW فقط (خط الأساس غير المعالج)، (2) 1٪ تحكم DMSO للمركبات، و(3) تركيز MTZ محسن (4.5 ملليمولار في 1٪ DMSO/BEW مع 200 ميكرومولار PTU).
    3. يشمل يرقات AB البرية المعالجة بمركبة أو MTZ تحت ظروف متطابقة. تأكيد التأثيرات المعتمدة على NTR إذا قلل MTZ من الحركة في Tg(th:Gal4؛ يرقات UAS:NTR-mCherry) ولكن ليست في يرقات AB البرية.
  2. إجراء العلاج ويرقات الصفائح
    1. عالج اليرقات لمدة 24 ساعة عند 28.5°C باستخدام الظروف المحددة في الخطوة 5.1.2: BEW فقط، 1٪ DMSO تحكم في المركبة، أو 4.5 mM MTZ في 1٪ DMSO/BEW مع 200 ميكرومول.
    2. انقل خمس يرقات إلى كل بئر من صفيحة ذات 6 آبار تحتوي على 2.5 مل BEW طازج باستخدام ماصة نقل عريضة التجويف. قلل من حجم الحمل وتعامل مع اليرقات بلطف لتجنب التوتر أو الإصابة.
      ملاحظة: استخدام خمس يرقات في كل بئر يوازن إنتاج البيانات ويقلل من الاكتظاظ. تزيد الكثافات الأعلى من تقاطع المسارات وتدخل أخطاء تتبع في تحليل السلوك.
  3. إعداد ظروف الإضاءة
    1. ضع لوحة الستة على لوحة إضاءة LED بيضاء مع إضاءة متساوية تحافظ عليها عند 25°C–28°C. استخدم نفس لوحة الضوء، وإعداد السطوع، وموضع اللوحة لجميع التسجيلات داخل التجربة (الشكل 3A).
    2. أضيء اللوحة من الأسفل والأعلى باستخدام مصادر ضوء منتشرة لتقليل الظلال والوهج والانعكاسات.
  4. تكوين إعداد تسجيل الفيديو
    1. قم بتركيب كاميرا عالية الدقة في وضع ثابت من الأعلى إلى الأسفل فوق اللوحة باستخدام دعم مستقر (مثل حامل ثلاثي أو حامل ذراع) (الشكل 3B).
    2. ضع مسطرة بجانب اللوح ضمن مجال الرؤية للمعايرة المكانية.
    3. تأكد من أن الكاميرا عمودية على سطح اللوحة لتقليل تشويه اختلاف المنظر.
  5. تسجيل النشاط الحركي
    1. إجراء تسجيلات خلال المرحلة الضوئية من دورة الضوء المظلمة التي تبلغ 14 ساعة:10 ساعات لتقليل التقلبات اليومية.
    2. اترك اليرقات تتأقلم لمدة ساعة قبل التسجيل.
    3. سجل النشاط الحركي لمدة 60 دقيقة.
    4. لا تزعج الإعداد أثناء التسجيل.
      ملاحظة: قم بإجراء تسجيلات في نفس وقت اليوم عبر التجارب لتقليل التغير اليومي.
  6. تكوين برنامج تتبع السلوك
    1. استورد الفيديو المسجل إلى برنامج تتبع السلوكيات (EthoVision XT) (الشكل 3C).
    2. قم بضبط الإعدادات التالية: 6 ساحات، 5 مواضيع في كل ساحة، اكتشاف نقطة المركز، المسافة بالمليمترات، والوقت بالثواني.
    3. قم بمعايرة المقياس المكاني باستخدام المسطرة الموجودة في إطار الفيديو.
    4. حدد حدود الساحات لكل بئر، مع التأكد من أن كل ساحة تغطي داخل البئر بالكامل دون أن تمتد إلى ما وراء حواف البئر.
  7. تحسين إعدادات الكشف
    1. إنشاء صورة مرجعية باستخدام واجهة البرنامج (إعدادات الكشف → صورة مرجعية → بدء التعلم).
    2. اضبط عتبة الكشف لضمان تتبع دقيق لجميع اليرقات دون اكتشافات خاطئة.
    3. قم بإجراء اختبار قصير (~دقيقتين).
    4. فحص المسارات المتتبعة بصريا قبل الانتقال إلى التحليل الكامل. تأكد من أن جميع اليرقات تم اكتشافها وأن الفقاعات أو الحطام أو الانعكاسات أو حواف الآبار لا يتم تحديدها خطأ كيرقات.
      ملاحظة: تشمل القطع الأثرية الشائعة تتبع الحواف الناتج عن الملاعب الكبيرة، والاكتشافات الخاطئة من الفقاعات أو الحطام، وفقدان التتبع أثناء فترة الخمول الطويل.
    5. استبعاد الآبار من التحليل إذا كان هناك فشل مستمر في التتبع، أو عبور مفرط للمسار، أو حطام أو فقاعات مرئية، أو يرقات ميتة، أو شكل غير طبيعي، أو يرقات محاصرة عند حافة البئر تمنع القياس الموثوق.
    6. تطبيق نفس معايير الاستبعاد على جميع مجموعات العلاج قبل التحليل الإحصائي.
  8. إجراء تحليل كامل وتصدير البيانات
    1. نفذ عملية الاستحواذ الكاملة.
    2. إنشاء تصورات للمسارات وخرائط الحرارة (تحليل → النتائج → المسارات وخرائط الحرارة).
    3. تصدير جدول البيانات الخام الذي يحتوي على مقاييس لكل موضوع، بما في ذلك إجمالي المسافة المقطوعة (مم)، والسرعة المتوسطة (مم/ثانية)، وعدد جولات الحركة.
    4. استخدم المسافة الكلية المقطوعة خلال 60 دقيقة كنقطة نهاية أساسية للمحرك (الشكل 3D).

figure-protocol-4
الشكل 3: إعداد تسجيل سلوك الحركة وسير عمل التحليل. (أ) إعداد تجريبي يظهر صفيحة ذات 6 آبار تحتوي على يرقات سمك الزرد موضوعة على منصة ضوء مع مسطرة للمعايرة المكانية ومصدر حرارة متحكم فيه بدرجة الحرارة للحفاظ على الظروف التجريبية. (ب) إعداد التقاط الفيديو مع كاميرا علوية تستخدم لتسجيل حركة اليرقة، مع تراكب تتبع تمثيلي. (ج) التتبع السلوكي الذي يتم باستخدام برنامج تتبع سلوك EthoVision XT، الذي يظهر الكشف التلقائي وتتبع حركة اليرقات. (د) ملخص سير العمل يوضح الخطوات من اكتساب الفيديو إلى التحليل الكمي لسلوك الحركة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

6. تحليل البيانات

  1. جهز الصور للتحليل
    1. أزواج الصور المفتوحة قبل المعالجة وما بعدها في فيجي (ImageJ، برنامج تحليل الصور).
    2. إذا تم التقاط الصور كمجموعات Z، قم بتوليد إسقاطات بأقصى شدة (مكدسات → الصورة → مشروع Z → أقصى شدة).
    3. قم بضبط السطوع/التباين باستخدام إعدادات العرض الثابتة المتطابقة لجميع الصور داخل مجموعة البيانات. لا تستخدم التكبير التلقائي للقياسات الكمية، وقم بقياس الفلورة على الصور الأصلية غير المعدلة.
  2. تعريف مناطق الاهتمام (ROI)
    1. استخدم أداة اختيار المضلعات لرسم عائد على الرؤية حول تجمع الخلايا العصبية DA في الدماغ في الصورة قبل العلاج. حدد حدود العائد على الاستثمار باستخدام المعالم التشريحية المرئية في صورة الفلورة، بما في ذلك الحواف الإنسية للعينين والخط الأوسط البطني للعينة الثنائية الدماغية (الشكل 2). تأكد من أن العائد على الاستثمار يشمل كامل تجمع الخلايا العصبية DA دون أن يمتد إلى هياكل فلورية متجاورة. لتحقيق الاتساق بين المشغلين، حفظ قالب عائد استثمار ممثل ووزعه على جميع أعضاء الفريق كمرجع مكاني.
    2. اضغط "t" لإضافة العائد على الاستثمار إلى مدير العائد على الاستثمار.
    3. قم بمحاذاة الصور قبل وبعد العلاج باستخدام علامات تشريحية، بما في ذلك العيون والدماغ البطني، قبل تطبيق عائد العائلة. قم بتطبيق نفس العائد على الاستثمار على الصورة المطابقة بعد العلاج فقط بعد تأكيد المحاذاة.
    4. احتفظ بجميع العائد على الاستثمار لكل لوحة لتمكين إمكانية إعادة الإنتاج وإعادة التحليل.
  3. قم بقياس شدة التألق
    1. قم بضبط إعدادات القياس (تحليل → تعيين القياسات) واختر "المساحة" و"القيمة الرمادية المتوسطة".
    2. قس كل صورة (حلل → قياس).
    3. قس الفلورة الخلفية من منطقة غير عصبية مجاورة داخل نفس الصورة وطرحها من قياس العائد على الاستثمار في الخلية العصبية DA. احسب الكثافة المتكاملة المصححة خلفيا كالتالي: IntDen المصحح = IntDenROI − (areaROI × متوسط خلفية).
    4. احسب نسبة الاحتفاظ بالفلورة لكل يرقة ك IntDen (بعد المعالجة) / IntDen (قبل المعالجة).
    5. تطبيع نسب احتفاظ الفلورة إلى متوسط قيمة التحكم في المركبة من نفس اللوحة. احسب متوسط التحكم في المركبة بشكل منفصل لكل لوحة قبل مقارنة مجموعات العلاج19.
      ملاحظة: لتحليل معدل إنتاجية أعلى، قم بنفس القياس باستخدام CellProfiler (برنامج تحليل الصور) مع اكتشاف ROIتلقائي 20.
  4. إجراء تحليل إحصائي زوجي
    1. للمقارنات بين مجموعة علاج واحدة ومجموعة ضابطة، قم بإجراء اختبار t ويلش ذو الذيلين غير المرتبطين، والذي لا يفترض التباين المتساوي بين المجموعات.
    2. استخدم هذا الاختبار عندما يختلف التباين بين المجموعات.
  5. إجراء تحليل إحصائي متعدد المجموعات
    1. إجراء تحليل النوفاع الجوي أحادي الاتجاه للتجارب التي تشمل مجموعات علاج متعددة.
    2. تطبيق اختبار دانيت بعد الاختبار لمقارنة كل مجموعة علاج مع مجموعة الضابطة باستخدام GraphPad Prism أو برنامج إحصائي مكافئ.
  6. تقرير النتائج الإحصائية
    1. اضبط عتبة الدلالة عند α = 0.05.
    2. أبلغ عن قيم p الدقيقة بدلا من العتبات التصنيفية.
    3. عرض البيانات كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط (SEM) مع نقاط بيانات فردية مراكبة كمخططات تشتت باستخدام برنامج GraphPad Prism أو برنامج رسم بياني مكافئ.
    4. حجم العينة (n)، الاختبار الإحصائي، إحصائية الاختبار، درجات الحرية، والقيمة p الدقيقة في أساطير الشكل. بالنسبة لمجموعات البيانات الكبيرة، قم بتضمين المخرجات الإحصائية الكاملة في جدول تكميلي.
      ملاحظة: لاختبارات الفرز، احسب عامل Z لكل لوحة كZ = 1 − [3(σp + σn)/||μp − μn|]، حيث σp و μp هما الانحراف المعياري والمتوسط لمجموعة التحكم في المركبة، و σn و μn هما الانحراف المعياري والمتوسط لمجموعة التحكم التي تعتمد فقط على MTZ. يعتبر عامل Z > 0.5 مقبولا للفحص.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

علاج MTZ يؤدي إلى فقدان الخلايا العصبية الدوباميني المعتمد على الجرعة وضعف الحركة الحركية

لتحديد المعايير المثلى للاستئصال العصبي العصبي المضغوط بواسطة MTZ، تم تقييم شدة الفلورة المستخدمة كمؤشر لبقاء خلايا DA العصبية ومسافة الحركة عبر تركيزات MTZ 3 و4.5 و9 mM بعد علاج لمدة 24 ساعة. تكونت كل مجموعة علاجية من n = 10 Tg فردي (th:Gal4؛ يرقات UAS:NTR-mCherry) مع مجموعة تحكم مركبة مطابقة (1٪ DMSO في BEW مع 200 ميكرومولار PTU، n = 10). تم اشتقاق الير...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول خط أنابيب قابل للتوسع في الجسم الحي لقياس فقدان الخلايا العصبية DA وفحص المركبات الواقية العصبية باستخدام نظام NTR–MTZ الكيميائي في سمك الزرد المعدل. تم تطوير سير العمل الموحد القائم على الألواح خصيصا لفرق البحث الجامعية، حيث يكون معدل دوران المشغلين مرتفعا وتختلف تجربة المحققين بين الفصول الأكاديمية. تم هيكلة كل خطوة من خطوات سير العمل لإعطاء الأولوية لقابلية التكرار وسهولة التدريب، مما يتيح تنفيذا متسقا عبر عدة مستخدمين مع أقل قدر من التباين. يطور هذا البروتوكول طرق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب مالي في المصالح.

شكر وتقدير

نشكر الدكتور سو قوه (جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو) على توفير سمكة الزرد المعدلة وراثيا، والدكتور دايسوك إيوم، والدكتور مايكل بارسونز، وإيدي هالو (جامعة كاليفورنيا، إيرفين) على توفير الأجنة البرية والإرشادات حول تربية أسماك الزرد وصيانة مرافق الأسماك. كما نشكر موظفي مركز الابتكار الجزيئي روبرت أ. ماه ومبنى الابتكار في فولينغ ليفز (جامعة كاليفورنيا، إيرفين) على توفير البنية التحتية لمنشأة المياه المائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Adult zebrafish diet, 0.5 mm pelletsZeiglerAH271Used for feeding adult zebrafish during routine husbandry
Agarose, low melting point (LMA)Sigma-AldrichA9414-10GUsed for embedding larvae in wells for stable positioning during imaging
Aluminum foilULINES-20197Used to protect light-sensitive reagents such as MTZ during preparation and incubation
CellProfilerBroad InstituteRRID: SCR_007358Used for optional automated fluorescence image analysis
Conical tubes, 15 mLCorning352097Used for reagent preparation and sample handling
Conical tubes, 50 mLCorning352070Used for reagent preparation and solution storage
Crossing tanks (1.0 L)AquaneeringZHCT100Used for controlled zebrafish breeding and embryo collection
Danio rerio (AB wild type)——Non-transgenic control line used to validate specificity of nitroreductase-dependent effects
Danio rerio (Tg(th:Gal4; UAS:NTR-mCherry))——Transgenic zebrafish line expressing nitroreductase-mCherry in dopaminergic neurons for targeted chemogenetic ablation
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous (≥99.9%)Sigma-Aldrich472301-500MLSolvent for PTU, MTZ, and screening compounds
EthoVision XTNoldusRRID: SCR_000441Behavioral tracking software used to quantify larval locomotion
Fiji (ImageJ)NIHRRID: SCR_003070Image analysis software used for fluorescence quantification
Fine-tipped forceps or 0.25 mm probeWorld Precision InstrumentsWPI0118Used to orient larvae during agarose embedding
Fluorescence microscopeZeiss11845460Used to image dopaminergic neurons via mCherry fluorescence
Gemma Micro 150 ZF (juvenile diet, 100–200 μm)Skretting10818945Used to feed juvenile zebrafish
Gemma Micro 75 ZF (larval diet, 50–100 μm)Skretting10818935Used to feed larval zebrafish
GraphPad PrismGraphPadRRID: SCR_002798Statistical analysis software used for data analysis and plotting
Heat block (42°C and 70°C capable)Thermo Fisher88870001Used to melt and maintain agarose at controlled temperatures
High-resolution camera (top-down mount compatible)Basler88-327Used to record larval locomotor activity
Hydrochloric acid (HCl), 0.1 MFisher ScientificSA48-500Used to adjust pH during tricaine preparation
Incubator (28.5°C, 14 h light:10 h dark photoperiod)MilliporeZ763314Maintains controlled environmental conditions for zebrafish development
Instant Ocean sea saltInstant OceanSS15-10Used to prepare blue egg water (BEW)
Light diffuser sheet (or equivalent)Edmund Optics27-103Used to provide uniform lighting and minimize glare during behavioral recording
Light padLightcraftLC2004LEDProvides bottom illumination during locomotor tracking
Metronidazole (MTZ)Sigma-AldrichM3761-100GUsed for chemogenetic ablation of dopaminergic neurons
Methylene blue, 1% aqueous solutionSigma-AldrichM9140Added to BEW to prevent microbial growth in embryos
Microcentrifuge tubes, 1.5 mLEppendorf22363204Used for reagent aliquoting and storage
Micropipette, P200GilsonFP10005SUsed for handling larvae and preparing solutions
Petri dishes, 100 mmCorningCLS430167Used for embryo collection and incubation
Pipette tips, 200 μLRAININ30389188Used with micropipettes for liquid handling and larval transfer
Sodium chloride (NaCl), ≥99.0%Sigma-AldrichS9888-500GUsed for preparing buffer and aqueous solutions
Sodium hydroxide (NaOH), 0.1 MFisher ScientificSS256-500Used to adjust pH during tricaine preparation
StereomicroscopeNikonSMZ-745Used for larval manipulation and orientation during embedding
Temperature-controlled heat mat (25°C–28°C)VivosunV-SHMDTMaintains stable temperature during behavioral recording
Tricaine methanesulfonate (MS-222)Sigma-AldrichE10521-10GUsed as an anesthetic for zebrafish larvae
Tris baseFisher ScientificBP152-1Used in preparation of buffered tricaine solution
Water purification systemMilliporeZIQ7003T0Used to generate deionized water for solution preparation
Zebrafish holding tanksAquaneeringZS560Used for maintaining adult zebrafish populations
1-Phenyl-2-thiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629-10GUsed to inhibit melanogenesis and maintain optical transparency
6-well plate, flat bottomCorning07-200-83Used for locomotor behavioral assays
96-well plate, flat bottomGreiner Bio-One655096Used for high-throughput imaging and screening assays

المراجع

  1. Haynes, E. M., Ulland, T. K., Eliceiri, K. W. A model of discovery: the role of imaging established and emerging non-mammalian models in neuroscience. Front Mol Neurosci. 15, 867010 (2022).
  2. Yang, W., Chen, X., Li, S., Li, X. J. Genetically modified large animal models for investigating neurodegenerative diseases. Cell Biosci. 11 (1), 218 (2021).
  3. Dodiya, R., et al. Zebrafish-based Parkinson’s disease models: unveiling genetic mechanisms and therapeutic pathways. CNS Neurol Disord Drug Targets. 24 (12), 900-920 (2025).
  4. Wasel, O., Freeman, J. L. Chemical and genetic zebrafish models to define mechanisms of and treatments for dopaminergic neurodegeneration. Int J Mol Sci. 21 (17), (2020).
  5. Kozol, R. A., et al. Function over form: modeling groups of inherited neurological conditions in zebrafish. Front Mol Neurosci. 9, 55 (2016).
  6. Jang, H., Kim, S. H., Koh, Y., Yoon, K. J. Engineering brain organoids: toward mature neural circuitry with an intact cytoarchitecture. Int J Stem Cells. 15 (1), 41-59 (2022).
  7. Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. J Pharm Bioallied Sci. 6 (1), 2-9 (2014).
  8. Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
  9. Hasani, H., et al. Whole-brain imaging of freely-moving zebrafish. Front Neurosci. 17, 1127574 (2023).
  10. Mattern, K., von Trotha, J. W., Erfle, P., Köster, R. W., Dietzel, A. NeuroExaminer: an all-glass microfluidic device for whole-brain in vivo imaging in zebrafish. Commun Biol. 3 (1), 311 (2020).
  11. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy. Front Neural Circuits. 7, 65 (2013).
  12. Noda, S., et al. Aging-related motor function and dopaminergic neuronal loss in C57BL/6 mice. Mol Brain. 13 (1), 46 (2020).
  13. Godoy, R., et al. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135 (2), 249-260 (2015).
  14. Schallert, T., Tillerson, J. L. Intervention strategies for degeneration of dopamine neurons in parkinsonism: optimizing behavioral assessment of outcome. Cent Nerv Syst Dis. , 131-151 (2000).
  15. Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).
  16. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
  17. Nipu, N., et al. Methylene blue at recommended concentrations alters metabolism in early zebrafish development. Commun Biol. 8 (1), 120 (2025).
  18. Ohnesorge, N., et al. Assessment of the effect of tricaine (MS-222)-induced anesthesia on brain-wide neuronal activity of zebrafish larvae. Front Neurosci. 18, 1456322 (2024).
  19. Schroeder, A. B., et al. The ImageJ ecosystem: open-source software for image visualization, processing, and analysis. Protein Sci. 30 (1), 234-249 (2021).
  20. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
  21. Kim, G. H. J., et al. A zebrafish screen reveals renin-angiotensin system inhibitors as neuroprotective via mitochondrial restoration in dopamine neurons. eLife. 10, (2021).
  22. Kim, G. H. J., et al. In vivo dopamine neuron imaging-based small molecule screen identifies novel neuroprotective compounds and targets. Front Pharmacol. 13, 837756 (2022).
  23. Aponte, P. M., Gutierrez-Reinoso, M. A., Garcia-Herreros, M. Bridging the gap: animal models in next-generation reproductive technologies for male fertility preservation. Life (Basel). 14 (1), (2023).
  24. Fen, W., et al. A review for cell-based screening methods in drug discovery. Biophys Rep. 7 (6), 504-516 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الاستئصال الكيميائي الجينيالعلاج بالميترونيدازولنموذج مرض باركنسونالنشاط الحركيفحص الأدويةالمركبات الواقية للأعصاب
التنمذة الظاهرية للتنكس العصبي الدوباميني في يرقات أسماك الزرد باستخدام التحليل السلوكي والتصوير عالي المحتوى
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.