اختبار وحدة تكوين المستعمرة متكيف مع نخاع العظم والخلايا أحادية النواة المحيطية المستمد من المريض

ملخص

يحدد هذا البروتوكول إجراء لتحفيز تمايز الخلايا الجذعية والخلايا السلفية البشرية المسببة للدم، المشتقة من نخاع العظم والخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي. يستخدم الاختبار وسط زراعة شبه صلب يدعم الالتزام بخطوط الحمراء والنخاع، ويدمج مقاييس موحدة لتصنيف المستعمرات القابلة للتكرار لتوصيف الأدوية قبل السريري.

الملخص

اختبار وحدة تشكيل المستعمرة (CFU) هو تقنية أساسية لدراسة الأمراض الدموية، بما في ذلك متلازمات خلل التنسج النخاعي (MDS) وسرطان الدم النخاعي الحاد (AML). يستخدم هذا الاختبار وسط شبه صلب مدعوم بتركيبات محددة من السيتوكين لدعم النمو ثلاثي الأبعاد والتمايز الخاص بالسلالة بين الخلايا الأصلية الحمراء والنخاعية. ومع ذلك، فإن عينات الدم المحيطية المشتقة من المرضى وعينات نخاع العظم تشكل تحديات تقنية بسبب انخفاض القابلية للحياة، وزيادة الحساسية للتعامل، وتفاوت نمو المستعمرات. علاوة على ذلك، تظهر الإرشادات الحالية لتحديد وعد المستعمرات تفاوتا كبيرا في تعريف حجم المستعمرات وأنواع السلالة، مما يحد من قابلية التكرار عبر الدراسات. البروتوكول الموضح هنا محسن لنمو وتمايز الخلايا الجذعية والخلايا السلفية المكونة للدم المعزولة من عينات مرضى MDS وAML. يركز البروتوكول على التعامل اللطيف مع الخلايا، والمعالجة المعقمة لعينات المرضى، وتحسين ظروف الزرعة، وفترات النمو المصممة خصيصا للخلايا المشتقة من المرضى. يوفر هذا البروتوكول إطارا عمليا لاختبارات CFU باستخدام عينات مشتقة من المرضى ويؤسس مقياسا معيارا للعد والتحليل المتسق للمستعمرات في أبحاث الأورام الدموية الخبيثة.

المقدمة

التكوين الدموي هو عملية منظمة بدقة حيث تؤدي الخلايا الجذعية المسببة للدموية (HSCs) الموجودة في مخاضع نخاع العظم إلى توليد جميع سلالات خلايا الدم الناضجة. من خلال سلسلة هرمية من أحداث التمايز، تولد الخلايا الهوائية العالية الخلايا سلفا متعددة القدرات تلتزم تدريجيا بسلالات الحمراء والنخاع واللمفاوية قبل أن تخضع للنضج النهائي لتصبح خلايا دم دورية وظيفية. تحكمها هذه العملية الإشارات المنسقة داخل البيئة الدقيقة لنخاع العظم وبواسطة آليات تنظيمية داخلية للنسخ والجينات. يمكن أن تؤثر الاضطرابات في هذه المسارات التنظيمية، خاصة من خلال تراكم الطفرات الوراثية أو الجسدية في HSCs، إلى إعاقة التمايز الطبيعي وتؤدي إلى توسع استنساخي للسلف غير الطبيعي. قد تؤدي هذه التغيرات في النهاية إلى اضطرابات دموية تتميز بتقلب الدم غير الفعال وضعف الكريات، بما في ذلك متلازمات خلل التصبغ النخاعي (MDS) وسرطان الدم النخاعي الحاد (AML)1,2,3,4,5.

اختبار وحدة تكوين المستعمرات (CFU) هو تقنية مخبرة في المختبر لتقييم إمكانات التمايز للخلايا الجذعية والخلايا الأصلية المكونة للدم (HSPCs). تم تطوير اختبار CFU في الأصل كاختبار قصير الأمد لقياس القدرة على التكاثر والتمايز للنباتات المكونة للدم ^6,7,8، وأصبح منذ ذلك الحين أداة مستخدمة على نطاق واسع في كل من أمراض الدم السريرية والتجريبية⁹. في البيئات المخبرية قبل السريرية، يستخدم الاختبار كثيرا لتقييم تأثير الاضطرابات الجينية أو العلاجات المرشحة على التمايز المسبب للدم. في سياق أبحاث MDS وAML، توفر اختبارات CFU قراءة وظيفية لفهم كيفية تأثير التغيرات الجزيئية والجينية على قدرة التمايز لنخاع العظم أو خلايا الدم الطرفية المشتقة من المريض.

يتضمن اختبار CFU زراعة HSPCs في وسط شبه صلب قائم على الميثيل سيلولوز، مع عوامل نمو محددة تدعم التوسع والتمايز الخاص بالسلالة. في هذه الظروف، تتكاثر الخلايا السلفية وتنتج مستعمرات منفصلة، يمكن تصنيفها شكليا حسب هوية السلالة. يستخدم وسط شبه صلب قائم على الميثيل سيلولوز متوفر تجاريا ومحسب لتمييز الأحمر والنخاع في هذا البروتوكول. يحتوي الوسط على مزيج من السيتوكينات، بما في ذلك الإنترلوكين-3 (IL-3)، الإنترلوكين-6 (IL-6)، عامل الخلايا الجذعية (SCF)، الإريثروبويتين (EPO)، عامل محفز مستعمرة الخلايا الحبيبية (G-CSF)، وعامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية والبلعم (GM-CSF). معا، تدعم هذه العوامل نمو الخلايا الأصلية الحمراء مثل الوحدة المكونة للمستعمرة - الأحمر الأحمر (CFU-E) والأحمر الأحمر المشكل المتفجر (BFU-E)، والخلايا الحبيبية النخاعية - الخلايا البلعمية (CFU-GM)، والمولدات متعددة القدرات مثل الحبيبات، والدم الأحادي، والخلايا الوحيدة، والخلايا الضخمة (CFU-GEMM)^10,11.

على الرغم من فائدته الواسعة، فإن الوسط شبه الصلب المذكور أعلاه محدود في قدرته على التمايز، لأنه لا يدعم بشكل كاف تمييز الخلايا النووية الضخمة والصفائح الدموية. لهذه التطبيقات، تكون التركيبات الأكثر تخصصا التي تحتوي على عوامل نمو الصفائح الدموية أكثر ملاءمة؛ ومع ذلك، فهي خارج نطاق البروتوكول الموضح. بشكل عام، من خلال اختيار دقيق لتركيبات الوسائط مع التقييم الشكلي والتحليلات اللاحقة مثل قياس تدفق التوميتيريا، يمكن للباحثين تقييم حساسية الأدوية بفعالية من خلال تحليل التزام السلالة وإمكانات التمايز¹².

في هذه الدراسة، يستخدم اختبار CFU لدراسة الإمكانات العلاجية للعلاجات المركبة لعلاج متلازمة MDS عالية الخطورة المتكررة/المقاومة للعلاج. البيريميثامين هو مضاد فولات معتمد سريريا يستخدم لعلاج التوكسوبلازما والملاريا الطفيلية، وقد تم دراسته مؤخرا كعامل مضاد للسرطان 13,14,15. أظهرت الدراسات الحديثة أن علاج البيريميثامين قد يعمل من خلال تثبيط المسارات الرئيسية التي تنظم تخليق البيريميدين الجديد¹⁶. هنا في هذا البروتوكول، تستخدم اختبارات CFU لدراسة الفعالية السريرية للبيريميثامين كعلاج بعامل واحد وكعلاج مركب مع فينيتوكلاكس، وهو علاج متقدم حاليا لعلاج MDS وAML^17,18.

على الرغم من فائدته الواسعة، إلا أن اختبار CFU يواجه عدة قيود تقنية. يعتمد تحديد وتصنيف المستعمرات بشكل كبير على المعايير الشكلية التي يمكن أن تسبب تباينات بين المراقبين وعبر مراكز البحث 6,19,20,21. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تظهر العينات المستمدة من المرضى من أفراد مصابين بمتلازمة MDS أو AML انخفاض في قدرة الخلايا، وزيادة الهشاشة، وتباين، مما قد يعقد تكوين المستعمرات والتحليلات اللاحقة⁹. لذا قد يتطلب إعداد المستعمرات لمزيد من التوصيف، بما في ذلك قياس خلوية التدفق، معالجة دقيقة للحفاظ على سلامة الخلية. غياب الإجراءات الموحدة لتحديد المستعمرات، العد، والتحليل اللاحق يساهم في التباين عبر الدراسات. تسلط هذه الاعتبارات الفنية الضوء على الحاجة إلى إجراءات موحدة محسنة خصيصا لعينات المكونات الدموية المشتقة من المرضى.

يوضح هذا البروتوكول سير عمل محسن لإجراء اختبارات CFU باستخدام خلايا أحادية النواة مشتقة من عينات دم نخاع العظم الأولية أو عينات دم محيطية للمرضى المصابين بالأورام الدموية الخبيثة. يركز النهج على استراتيجيات عملية للتعامل مع الخلايا الحساسة المشتقة من المرضى، وإنشاء ظروف زراعة موثوقة، وتنفيذ معايير متسقة لتحديد المستعمرات وقياسها. من خلال تقديم إرشادات منهجية مفصلة والتركيز على ممارسات التحليل القابلة للتكرار، يهدف هذا البروتوكول إلى تسهيل تقييم أكثر موثوقية للتمايز الدموي والاستجابة العلاجية في الدراسات ما قبل السريرية لمتلازمة MDS وAML.

البروتوكول

تستخدم هذه الدراسة عينات حيوية بشرية غير محددة الهوية تم الحصول عليها من بنك حيوي بموجب بروتوكول معتمد من مجلس مراجعة مؤسساتي، "علم الأحياء الجزيئي للاضطرابات الدموية الحميدة والخبيثة" (بروتوكول IRB #200536)، في كلية ألبرت أينشتاين للطب/مركز مونتيفيوري الطبي. تم إجراء جميع الإجراءات وفقا لإرشادات الأخلاقيات المؤسسية. جميع المواد والمواد مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير نخاع العظم المشتق من المريض أو خلايا الدم المحيطية المحيطية

ملاحظة: وفقا للإرشادات الشائعة لمعالجة عينات المريض، ينصح بارتداء معطف مختبر كامل الطول وقفازات مختبرية مقاومة للتمزق، والعمل تحت غطاء زراعة الخلايا المختبرية للحماية الشخصية من التعرض لمسببات الأمراض المنقولة بالدم. يجب نقع جميع رؤوس الماصات والماصات المصلية التي تلامس خلايا المريض في محلول مبيض بنسبة 10٪ لمدة لا تقل عن 30 دقيقة قبل التخلص منها في النفايات البيولوجية الخطرة.

1. التحضير التجريبي
   1. الوسط الدافئ من IMDM، مصل البقر الجنيني (FBS)، والمضادات الحيوية للبنسلين-ستربتوميسين (Pen-strep) حتى حرارة 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
   2. إذابة الوسط شبه الصلب عند 4 درجات مئوية خلال الليل. في يوم التقديم، سخن الزجاجة إلى درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
   3. قم بتعقيم غطاء زراعة الخلايا بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة، ثم رش أسطح الغطاء، والماصات، ورفوف الأنابيب بنسبة 70٪ إيثانول (EtOH).
   4. جهز كأس نفايات يحتوي على محلول مبيض بنسبة 10٪ كبير بما يكفي لجمع رؤوس الماصات الملوثة والماصات المصلية.
   5. الحصول على نخاع العظم أو خلايا دموية وحيدة النواة المحيطية معزولة عبر طرق الطرد المركزي بتدرج الكثافة. يمكن استخدام الخلايا في نفس يوم الجمع أو من عينات مجمدة في بنك حيوي.
2. إذا تم تجميد العينات، قم بإذابتها بسرعة في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى يذوب معظم الجليد ولا يبقى سوى بلورة جليدية صغيرة. ضع العينات فورا على الثلج بعد إذابة الجليد.
   ملاحظة: عينات المرضى حساسة جدا للذوبان. من المهم إذابة العينات بأسرع وقت ممكن وعلى دفعات لتقليل موت الخلايا.
3. تعليق الخلايا في وسط نمو كامل دافئ بمقدار 5 مل (وسط IMDM مدعوم ب 4٪ FBS و1٪ Pen-Strep).
4. حدد تركيز الخلايا وقابليتها للبقاء باستخدام صبغة تلوين AO/PI وعداد الخلايا الآلي.
5. قم بعمل طرد مركزي على الخلايا بحرارة 350 x g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإطلاق الحبيبات. تخلص من السوبرناتانت.
6. أعد تعليق الخلايا في محلول ملحي معقم بحجم 5 مل من محلول دولبيكو المعقم المخزن بالفوسفات (DPBS). كرر الطرد المركزي على خلايا الحبيبات وتخلص من السوبرناتانت.
7. تعليق الخلايا في وسط نمو كامل إلى تركيز 2 مليون خلية حية/مل. جهز خلايا كافية ل 100 ألف خلية/بئر من صفيحة ذات 6 آبار.

2. تحضير الأدوية وإدارتها للعلاج.

ملاحظة: يتم الحصول على البيريميثامين كمسحوق متحمر ويتم إعادة تشكيله داخليا في كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO) بتركيز 100 ملم متر؛ يتم تخزين الأليكوات في درجة حرارة −80 درجة مئوية. يشترى فينيتوكلكس مذاب مسبقا في DMSO بتركيز 10 ملليمول، ويخزن في -20 درجة مئوية. في هذه التجربة، يتم إعطاء فينيتوكلكس وبيريميثامين كجرعة واحدة عبر امتصاص حر بالتوازي مع حالة علاج DMSO للتحكم في المركبة.
تحذير: البيريميثامين، فينيتوكلاكس، وDMSO عوامل بيولوجية خطرة. تعامل فقط تحت غطاء المحرك، وارتدى معدات الحماية الشخصية، واستخدم بحذر إضافي.

1. في يوم الطبق، قم بإذابة الدواء على الجليد والدوامة ولف بسرعة قصوى على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة لمدة 30 ثانية.
2. قم بعمل دوامة وامزج زجاجة من الوسط شبه الصلب بقوة حتى تتجانس جميع المكونات. اتركها دون إزعاج في غطاء المحرك على درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للفقاعات بالصعود إلى السطح.
3. جهز 3 مل من الوسط شبه الصلب في أنابيب مخروطية معقمة بحجم 15 مل. اترك الأنابيب دون إزعاج لمدة 30 دقيقة حتى تظهر الفقاعات على السطح. يمكن إعادة تجميد وتخزين الوسائط شبه الصلبة الإضافية في درجة حرارة -20 درجة مئوية للاستخدام لاحقا.
4. لا يضف أكثر من 10 ميكرولتر من حجم الدواء إلى الوسط شبه الصلب. في هذه التجربة، يتم تعديل تركيزات الفينيتوكلكس والبيريميثامين وفقا لظروف تآزرية محددة تجريبيا. إلى مجموعة التحكم في المركبة، أضف كميات مكافئة من DMSO. جهز أليكوتات مكررة بحجم 3 مل لكل حالة.
   ملاحظة: من المهم الحفاظ على حجم الدواء المضاف ضئيلا حتى لا يؤثر على التركيز النهائي للدواء في الوسط شبه الصلب.
5. وسائط الدوامة في 4-5 دفعات قصيرة لدمج الدواء بالكامل في الوسائط.
   ملاحظة: لا تحافظ على خليط الخلايا على الدوامة لفترات طويلة، لأن ذلك قد يسبب موت الخلايا.
6. أضف 100 ميكرولتر من الخلايا أو حجم مكافئ يبلغ 200,000 خلية إلى 3 مل من الوسائط شبه الصلبة. خليط الدوامة على دفعات قصيرة حتى يتم دمجها أو تجانسها بالكامل.
7. اربط إبرة 16 جيلون ذات طرف غير حاد بحقنة 3 مل وأسقط الإبرة والحقنة في خليط الخلايا. اتركها دون إزعاج لمدة 30 دقيقة للسماح للفقاعات بالصعود إلى السطح.

3. تغطية تعليق الخلايا المعالجة بالمخدرات.

1. باستخدام إبرة وحقنة مغمورة، اأخذ خليط الخلايا والدواء، مع الحرص على عدم استنشاق أي فقاعات هواء. انتظر 3–5 دقائق، ثم خذ الخليط المتبقي الذي تجمع على جانبي أنبوب مخروطي بسعة 15 مل.
2. في صفيحة معقمة ذات 6 آبار، أضف خليط الخلية باتجاه القطر، مع التناوب بين بئرين من عمود خارجي للصفيحة. انشر الخليط عن طريق إمالة اللوحة بلطف بحركات دائرية لتغطية قاع الآبار بالكامل بشكل متساو. هاتان البئران تشكلان نسخا تقنية.
   ملاحظة: إذا تشكلت فقاعات أو أضيفت عن طريق الخطأ إلى الآبار، استخدم رأس فلتر الماصة لفرقع أو تحريك الفقاعات بلطف إلى حافة اللوحة. أي فقاعات كبيرة متبقية في الصفيحة يمكن أن تؤثر على نمو المستعمرات.
3. أضف خليط اختبار المستعمرة فقط إلى الأعمدة الخارجية للوحة ذات 6 آبار. أضف إلى العمود الأوسط 5 مل من الماء المعقم إلى كل بئر. إضافة الماء إلى الآبار سيضمن وجود رطوبة كافية لمنع الوسط شبه الصلب من الجفاف.
4. حضن الصفيحة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_2. راقب نمو الخلايا ومستويات الماء مرتين في الأسبوع. يجب أن تتكون الخلايا مستعمرات مرئية بالعين بعد حوالي 7 أيام من الطبق، ويجب أن تصل الصفائح إلى التقاء بنسبة 75٪–80٪ بعد ما بين 14–21 يوما من الطبق.

4. تصوير المستعمرة والعد

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول المعايير التي تم التحقق منها للاستخدام في نظام التصوير EVOS M7000. قد تحتاج هذه الإعدادات إلى تحسين أو تكييف لتتوافق مع أنظمة تصوير الألواح الأخرى.

1. أزل غطاء فلتر الضوء الواقي من منصة المجهر. شغل المجهر وافتح البرنامج المرتبط به.
2. أدخل موزع ضوء في العدسة العلوية لجهاز المجهر.
3. أدخل موضع اللوحة على المنصة بحيث يكون البئر A1 في الزاوية العلوية اليسرى.
4. في برنامج التصوير، أدخل إعدادات التركيز التالية:
   1. اختر الوعاء الذي سيتم تصويره. في هذا البروتوكول، يستخدم صفيحة ذات 6 آبار.
   2. اضبط الهدف على 4X.
   3. اختر مصدر الضوء ك Trans أو حول المجهر إلى وضع الحقل المضيء.
   4. شغل ضوء المجهر وضبط شدة الضوء يدويا باستخدام شريط التمرير الخشن. بالنسبة للأداة المستخدمة في هذا البروتوكول، فإن النطاق الأمثل لتصوير مستعمرات التصوير هو حوالي 0.03.
   5. إذا كان هناك ميزة تركيز تلقائي على الآلة، استخدمها لضبط التركيز. إذا لزم الأمر، قم بضبط التركيز أكثر باستخدام إعدادات التركيز اليدوي الدقيقة.
5. أدخل إعدادات التقاط الصور التلقائية التالية:
   1. اختر المنطقة الكاملة للبئر ليتم تصويرها في كل بئر.
   2. اختر التقاط الصورة الآلي ليبدأ من مركز البئر ثم يلتف نحو حواف البئر.
   3. اختر إعدادات التركيز التلقائي بحيث تعيد الآلة التركيز في كل بئر.
   4. اختر الصور الخام في كل بئر ليتم تبليطها أو دمجه معا.
   5. اختر أن تكون الصور مقلوبة أفقيا وعموديا.
   6. اختر إعدادات حفظ البيانات لجمع "صورة مبلطة" و"صورة مدمجة"
   7. شغل فحص اللوحة الآلي. الجهاز المستخدم في هذا البروتوكول سيعمل بسرعة 1.5 دقيقة لكل بئر.
   8. أزل اللوحة، وضع غطاء الفلتر الواقي فوق منصة المجهر، أطفئ المجهر، وأغلق البرنامج.
   9. بعد التصوير، قم بعد إجمالي المستعمرات الفردية بالإضافة إلى الأنواع الفرعية النخاعي والأحمر الأحمر في كل بئر يدويا باستخدام صور البئر المدمجة المبلطة.
6. تعريف المستعمرات وفقا لتوصيف الصرفات التالية:
   1. اعتبر مستعمرة فردية أو مجموعة مستعمرة مميزة عندما تكون بعيدة بما فيه الكفاية عن مجموعة خلية أخرى، أي مسافة تساوي طولها. يتم تجميع السكان الذين تقع ضمن هذا الحد الأقصى في عدد مستعمرات واحد.
   2. تأكد من أن مستعمرات الدم الأحمر ذات صبغة عميقة وتبدو حمراء داكنة. تظهر هذه المستعمرات كمجموعات فردية مكتظة النمو أو مجموعات ذات حواف محددة بوضوح. تصنف مستعمرات الأحمر الأصغر التي تتكون من مجموعات خلايا غير ناضجة بطيئة النمو ضمن CFU-E. تصنف المستعمرات الأكبر ذات التجمعات الناضجة كوحدات BFU-E.
   3. تحقق من أن مستعمرات النخاع تحتوي على خلايا تبدو أكثر شفافية ولونها أفتح. مستعمرات الميلويد أكثر تشتتا ولا تحتوي على حواف محددة بوضوح. تميل مستعمرات النخاع إلى النمو بشكل أكثر كمجموعات فردية بدلا من تجمعات، رغم أنه قد تظهر أحيانا عناقيد متراكم. في كلتا الحالتين، تصنف مستعمرات النخاع كوحدة CFU-GM.
   4. صنف المستعمرات المختلطة التي تحتوي على كلا النوعين الأحمرائي والنخاعي على أنها CFU-GEMM.

5. جمع الخلايا وتجميدها لتحليل التدفق عبر قياس خلوي التدفق

1. قم بالخطوات التالية قبل البدء:
   1. a. جهز ودافئ مخزن فرز الخلايا المنشط بالفلورة (مخزن FACS، مكون من DPBS/4٪ FBS) ووسط تجميد (FBS/10٪ DMSO) في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
2. أضف 5 مل من مخزن FACS الدافئ إلى سطح كل بئر. حضن الألواح لمدة لا تقل عن 30 دقيقة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لإذابة الوسط شبه الصلب.
3. أعد تعليق الخلايا بشكل كامل باستخدام ماصة بحجم 5 مل وانقله إلى أنبوب مخروطي معقم بسعة 50 مل.
4. باستخدام 5 مل من مخزن FACS المسخن، اغسل كل بئر ثلاث مرات وانقل الحجم بالكامل إلى أنبوب مخروطي بحجم 50 مل.
5. أعد تعليق الخلايا جيدا عن طريق الدوامة في 4–5 دفعات قصيرة، ثم الطرد المركزي عند 400 x g لمدة 10 دقائق عند RT إلى خلايا الحبيبات. إذا لم تكن الحبيبات مرئية بعد الطرد المركزي، تبقى الخلايا معلقة في وسط شبه صلب. بدون الشفط، أضف 10–15 مل DPBS إضافية إلى الأنبوب لتخفيف الوسط شبه الصلب وإعادة تعليقه بشكل جيد. إذا لزم الأمر، قم بالحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 10–15 دقيقة لإذابة الوسط بالكامل، ثم إعادة الخلايا إلى الحبيبات.
6. استنشق المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا في مخزن FACS بسعة 10 مل. الطرد المركزي بقوة 400 × جرام لمدة 10 دقائق عند RT إلى خلايا الحبيبات.
7. أعد تعليق الخلايا في وسط تجميد وأضف 3 ملايين خلية لكل مادة تبريدية. تجميد القوارير في حاوية تجميد بمعدل تحكم عند -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لتحقيق معدل تبريد 1 °C/min.
8. انقل الكريوفيالات إلى تخزين النيتروجين السائل في أقرب وقت ممكن.
   ملاحظة: العينات التي تحفظ عند -20 درجة مئوية لفترات طويلة ستكون ذات قابلية للبقاء أقل. من المهم نقل الخلايا إلى النيتروجين السائل للتخزين طويل الأمد.

النتائج

يوضح الشكل 1 خط أنابيب اختبار المستعمرة من عزل عينات المرضى عبر تحليل أعداد المستعمرات وشكل المستعمرات. يعرض الشكل 2 الإعدادات الرئيسية لتصوير المستعمرات على مجهر الحقل الساطع. تظهر الشكلان 3 والشكل 4 صورا تمثيلية لتكوين المستعمرة من عينة واحدة مشتقة من المريض بعد 13 يوما من وضع الدرع. في الشكل 3، يتم تصوير المستعمر...

المناقشة

البروتوكول الموضح هنا يوضح سير عمل محسن لإجراء اختبارات CFU باستخدام عينات دم نخاع العظم الأولية وعينات دم محيطية من المرضى، مع اهتمام خاص بالحفاظ على بقاء الخلايا وضمان نمو المستعمرات القابل للتكاثر. تعد عدة خطوات في البروتوكول ضرورية لتحقيق تكوين مستعمرات موثوق عند العمل مع عينات مستمدة من المرضى. يعد الذوبان السريع للخلايا أحادية النواة المحفوظة بالتجميد متبوعا بالتبريد الفوري أمرا ضروريا للحفاظ على بقاء الخلية، حيث يمكن أن يؤدي الذوبان المطول إلى زيادة موت الخلايا بشكل كبير في العينا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Blunt-End 16 G needles	STEMCELL Technologies	28110	لتوزيع وترسيب وسط MethoCult
Cellometer Auto 2000	Nexelcom Bioscience	26407	عداد الخلايا
CHT4 Counting Chambers (cell counter slides)	Revvity	CHT4-SD100-002	شرائح عداد الخلايا
Dimethyl sulfoxide	Fisher Bioreagents	BP231-100	يستخدم لإعادة تكوين الأدوية وتجميد الخلايا
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	لزراعة الخلايا
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, Inc.	2701	لتعقيم أسطح زراعة الخلايا
EVOS M7000 imaging system	ThermoFisher Scientific	AMF7000	لتصوير المستعمرات والألواح
Fetal bovine serum	BenchMark	100-106	مكمل وسط لزراعة الخلايا والتجميد
IMDM Modified Culture media	Cytiva	SH30228.01	وسط زراعة غني مناسب لتعامل مع عينة المريض
LuerLok Tip 3 mL Syringes	BD	309657	لتوزيع وترسيب وسط MethoCult
MethoCult H4435 Enriched	STEMCELL Technologies	04435	وسط شبه صلب قائم على الميثيل سلولوز لفحص المستعمرات
Multiwell 6-well plate	FALCON	353046	لزراعة المستعمرات
Nikon Eclipse TS2FL Inverted Trinocular Phase Contrast Fluorescence Microscope	Coastal Microscopes	51623	لتصوير وتمييز شكل المستعمرات
Pen Strep	Gibco	15140-122	مكمل مضاد حيوي لزراعة الخلايا
pyrimethamine	Sigma-Aldrich	46706	دواء مضاد للفولات معتمد من FDA
UltraPure Distilled water	Invitrogen	10977-015	لزراعة المستعمرات
venetoclax	Selleck Chemical LLC	50-136-6419	العلاج الكيميائي المعتمد من FDA
ViaStain AOPI Staining Solution	Revvity	CS2-0106	صبغة حيوية لعد الخلايا الحية