بروتوكول تربية فعال وحقن دقيق لتعديل وراثي للذبابة المستقرة، Stomoxys calcitrans

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة موثوقة لحقن الجنين الدقيق لدمج المادة الوراثية الأجنبية في جينوم الذبابة المستقر، ونظام فحص فلوري لمراقبة تطور الأجنة بعد الحقن، وركيزة تربية لليرقات تتكون من أجار صفار البيض المدعم بالكربون المنشط وملقح ب Escherichia coli الذي يدعم تطور البيض إلى البالغين.

Abstract

الذباب المستقر هو آفات تتغذى على الدم للماشية والحيوانات الأليفة والبشر، وتوجد في جميع القارات ما عدا القارة القطبية الجنوبية. اللدغات المؤلمة لكل من الذكور والإناث البالغين تحفز سلوكيات مرتبطة بالتوتر في المواشي، مما يؤدي إلى فقدان الوزن وخسائر اقتصادية كبيرة للمنتجين. الذباب المستقر الذكور والإناث هم من يتغذون على الدم بشكل إلزامي، مما يشكل تحديا لتقنيات الحشرات المعقمة واستراتيجيات إدارة الآفات الأخرى التي تتطلب إطلاق الذكور بشكل جماعي. غالبا ما تفشل استراتيجيات إدارة آفات الذباب المستقرة الحالية في السيطرة بشكل كاف على أعداد الذباب. على الرغم من تطوير العديد من طرق التلاعب الجيني لإدخال المادة الوراثية الخارجية أو تحفيز الضربات الجينية للبعوض وذبابة الفاكهة ومجموعات الحشرات النموذجية الأخرى، إلا أن طرق التحول الجيني للذباب المستقر لا تزال محدودة. يصف هذا البروتوكول نهجا موثوقا ومحسنا لإدخال المادة الوراثية الأجنبية إلى الذباب المستقر باستخدام متغير مفرط النشاط من إنزيم البيجي باك ترانسبوزاز ووسط تربية يرقات صلب جديد يدعم استعادة اليرقات، والفقس، والتغذية، والفحص الفلوري بعد الحقن الدقيق للجنين.

Introduction

الذباب المستقر (Stomoxys calcitrans L., 1758) هو آفات وناقلات أمراض ذات أهمية اقتصادية للماشية ^1,2,3 ولها توزيع عالمي عالمي. غالبا ما تفشل استراتيجيات الإدارة المتكاملة للآفات (IPM) في السيطرة بشكل كاف على تجمعات الذباب المستقرة ^2,3، مما يؤدي إلى خسائر سنوية تقدر بأكثر من 2 مليار دولار أمريكي في الولايات المتحدة وحدها³. بالإضافة إلى ذلك، تم توثيق مقاومة المبيدات الحشرية في مجموعات مستقرة من الذباب في أوروبا ^4,5 وتم الإبلاغ عنها أيضا في الولايات المتحدة⁶. وبالتالي، تمثل طرق المكافحة الجينية مثل تقنية الحشرات المعقمة (SIT) وأنظمة دفع الجينات إضافات مرغوبة إلى برامج المعالجة الوراثية التقليدية.

الجهود السابقة لتطوير طرق التحكم الجيني في الذباب المستقر، بما في ذلك توليد سلالات تحديد الجنس الجيني ل SIT، اعتمدت على التربية الانتقائية والانتقال الناجم عن الإشعاع ^7,8. هذه الأساليب تتطلب جهدا كبيرا وتقتصر على التعديلات غير المعدلة وراثيا. لاحقا، أوبروشتا وآخرون.⁹ أظهرت أن استخدام نظام هيرميس ترانسبوزاز كان قادرا على دمج الجينات المعدلة في S. calcitrans؛ ومع ذلك، أظهر البروتوكول كفاءة تحويل منخفضة، حيث أنتجت حوالي 0.11٪ من الأجنة المحقونة نسلا معدلين وراثيا، وأدى إلى تعبير ضعيف عن علامة البروتين الفلوري الأخضر المحسنة (eGFP) تحت سيطرة محفز خارجي⁹.

لم يتم تطبيق طرق التلاعب الجيني الأخرى، بما في ذلك أنظمة كريسبر-كاس، على نطاق واسع بعد على الذباب المستقر، جزئيا بسبب صعوبة اختراق الشورش المرن لأجنة الذباب المستقرة. الشوريون الخارجي الصلب مشابه لذباب العضلات الأخرى^10،11. لم تنجح محاولات الحقن عبر الكوريون باستخدام إبر الكوارتز أو إزالة الشورية باستخدام شريط لاصق مزدوج الجانب، مما استلزم العلاج بمحلول مؤكسد (3٪ هيبوكلوريت الصوديوم، NaOCl)، الذي يقلل من معدل فقس البيض.

يمكن الحفاظ على الذباب المستقر لفترة طويلة في ظروف المختبر، وعادة ما تربى المراحل غير الناضجة في ركائز سليلوزية مخمرة مثل رقائق الخشب، نخالة القمح، أو القش المملة بمصادر النيتروجين، بما في ذلك مكملات بروتين العجل أو رقائق السمك¹². ومع ذلك، فإن هذه الركائز تحمل عدة عيوب عند استخدامها في تربية الأجنة المحقونة بمجهزة. عتامتها وتألؤها الذاتي العالي تجعل من الصعب تحديد اليرقات الإيجابية ل GFP بعد الفقس والحفر في الركيزة. بالإضافة إلى ذلك، رغم أن وجود البكتيريا مطلوب لبقاء اليرقات¹³، فإن الأوساط المخمرة تدخل مجتمعات بكتيرية وفطرية غير متوقعة قد تضر أو تستهلك الأجنة قبل الفقس. منعت هذه القيود استعادة اليرقات المحولة باستخدام طرق الحقن والتربية التي تم وصفها^سابقا، مما يبرز الحاجة إلى بروتوكول حقن أكثر موثوقية يسمح أيضا بالفحص الفلوري طوال فترة التطور.

هنا يقدم بروتوكول حقن دقيق قابل للتكرار يدمج تحسينات في اختيار الترانسبوزاز، ومنهجية الحقن، ووسائط الفحص والتربية. تسهل هذه التعديلات تطوير ذباب مستقر معدل وراثيا لتطبيقات تشمل سلالات تحديد الجنس الجيني لنظام SIT، ومحركات الجينات، وعمليات القضاء الجيني التي توسطها CRISPR-Cas. تشمل التحسينات الرئيسية استخدام إنزيم بيجي باك الترانسبوزاز¹⁴ النشط تحت سيطرة محفز بروتين الصدمة الحرارية المستقرة (HSP)83، وتجفيف الأجنة لتقليل فقدان الأوبلازم بعد الحقن، والتخلص من الشريط اللاصق وزيت الهالوكربون أثناء حقن الجنين.

تم تحسين استعادة الأجنة المحقونة أكثر من خلال استبدال وسط التربية الجماعية بألواح مسطحة ومصبغة من المغذيات المتلقحة بعشب من الإشريكية القولونية. توفر هذه التركيبة من الأجار ميزتين رئيسيتين. أولا، يوفر مصدرا غذائيا أحاديا التكوين لتغذية البكتيريا المتوقعة لتطور اليرقات. ثانيا، يوفر خلفية عالية التباين ومنخفضة التألق الذاتي تسهل ملاحظة الشكل والتطور والتعبير عن GFP في يرقات الجيل الأول (G0). تنمو ذبابات المنزل والذباب المستقر وتتحول إلى عذراء طبيعية على صفائح الأجار القائمة على صفار البيض المحصنة بالإشريكية القولونية ^13،15. التركيبة الموضحة هنا تتضمن مسحوق الكربون المنشط كإضافة غير تفاعلية وآمنة للطعام لتقليل التألق الخلفي بشكل أكبر.

Protocol

تم تنفيذ جميع التجارب والعمليات بموافقة لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية في جامعة تكساس إيه آند إم (البروتوكول IBC2019-081). الكواشف والمواد الكيميائية والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد.

1. تربية الذباب لإنتاج البيض

1. تحضير أقفاص البالغين
   1. اضبط منظم حرارة غرفة الحاضنة على 28°C وامزج 3 كجم من كلوريد الصوديوم مع ~5 لتر من ماء الصنبور في صينية بسعة 10 لتر، مع إذابة ~50٪ من الملح.
   2. ضع هذه المقلاة المكشوفة في أسفل غرفة الحاضنة للحفاظ على رطوبة حوالي 80٪ رطوبة نسبية. حافظ على دورة ليل نهار 16:8 في الغرفة أو الغرفة.
   3. قم بتبطين أسفل أقفاص الحشرات (أقفاص مقاوم للصدأ/الألمنيوم بحجم 30 × 30 سم مع شبكة شبكية) بطبقتين من مناديل الورق وضع كوب توابل يمكن التخلص منه بسعة 45 مل مليئا بالسكر المحب فوق طبقة منشفة الورق (الشكل 1A).
      ملاحظة: تساعد المناشف الورقية في امتصاص بقعة الذبابة، ويوفر السكر مصدرا للغذاء قبل تغذية الدم.
   4. املأ كأس غريفين بسعة 250 مل بحوالي 100 مل من ماء الصنبور بدرجة حرارة الغرفة، واضع مربع من قماش القطن الأسود بحجم 20 سم × 20 سم (مقطوع من غطاء وسادة أسود أو أغطية سرير بسيطة) في الماء حتى يرطب القماش. عدل القماش الأسود بحيث تمتد حوافه بمقدار 1-2 سم خارج حافة الكأس (الشكل 1B).
      ملاحظة: يوفر هذا القماش الرطب ماء سائلا وسطح لوضع البيض للذباب البالغ. يمكن أن يحدث الموت بسرعة إذا لم يكن لدى البالغين مصدر رطوبة.
   5. انقل 500-1500 عذراء ذبابة مستقرة إلى طبق صغير أو كأس وضعها في قفص الحشرات. ضع القفص البالغ في غرفة التربية الرطبة (الخطوة 1.1.1) وراقب يوميا بحثا عن الخروج من الجسم. بمجرد خروج البالغين، ابدأ بتغذية يومية بدم البقر الستراتي (القسم 1.2).
2. تغذية الذباب البالغ
   1. حضر دم البقر الستراتي بإضافة تركيز نهائي من 10.9 ملليمولار من ثلاثي الصوديوم ديهيدرات إلى دم البقر الذي تم جمعه حديثا.
   2. لفترة وجيزة، علق ~12.8 جرام من ملح السترات في كمية قليلة من الماء منزوع الأيونات وأضف إلى 4 لترات من الدم الذي تم جمعه من المسلخ المحلي.
      ملاحظة: يجب أن تحتوي عبوات الدم على أغطية بمسامير (مثل زجاجات مربعة، واسعة الفم، بسعة 4 لتر) وتنظيفها جيدا بصابون دافئ وماء قبل الاستخدام. في المسلخ، تجنب جمع أول ~1 لتر من دم البقر من حيوان مذبوح لتقليل التلوث بالشعر والعرق والأوساخ وغيرها من المواد المخثرة.
   3. جمد دم البقر المملح في 200 مل من الأليكوات وذيب الدم حسب الحاجة، مع الحفاظ على العليكوات المذابة في الثلاجة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.
   4. قدم ~40 مل من الدم بدرجة حرارة الغرفة لكل 600 ذبابة لكل قفص بالغ.
   5. يمكن تقديم الدم في حاوية توابل أو كأس، ويجب إدخال إسفنجة شاش قطني غير معقمة مطوية في الوعاء لامتصاص الدم. حرك الفتيل حتى يتشبع القطن بالكامل وأدخله في القفص.
      ملاحظة: يجب تغيير الدم يوميا بدءا من 24 ساعة من الإخراج.
3. جمع البيض
   1. بمجرد ملاحظة البيض على قماش القطن الأسود، أزل القماش من الكأس واغسل البيض في وعاء بلاستيكي ضحل منفصل بسعة ~700 مل باستخدام زجاجة غسيل (الشكل 2A). عادة ما يحدث وضع البيض عندما يكون عمر الذباب بين 7-10 أيام.
      ملاحظة: افحص أكواب الدم بحثا عن البيض وجمع أي بيض ضالة قد توضع هناك.
   2. اجمع البيض على ورق التنقية عن طريق التفريغ الكهربائي. يتم ذلك عن طريق وضع ورقة مرشح سوداء في قمع بوخنر، وتطبيق فراغ، ثم صب البيض من الخطوة 1.3.1 فوق الإعداد.
   3. بعد ذلك، نقل البيض إلى أسطوانة متدرجة أو أنبوب طرد مركزي دقيق متدرج بحجم 1.7 مل باستخدام زجاجة غسيل وتسجيل حجم البيض المجمع (الشكل 2B).
      ملاحظة: تجنب الغمر المطول للبيض في الماء، حيث يبدأ معدل الوفاة في الارتفاع بعد ~10 دقائق من الغمر.
4. تحضير وسط اليرقات الجماعية
   1. اجمع المواد لوسائط اليرقات السائبة (الشكل 3A)، كما هو موضح في الجدول 1.
   2. في كأس بسعة 1000 مل، أضف مكمل بروتين العجل وكل ماء الصنبور. اتركه ليعيد ترطيبه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
   3. أضف نخالة القمح والفيرميكوليت إلى وعاء خلط منفصل وأكبر.
   4. بعد إعادة الترطيب طوال الليل، حرك مكمل العجل المعاد ترطيبه جيدا لتفكيك الكتل، ثم صب الخليط في وعاء مع نخالة القمح والفيرميكولايت. اخلط جيدا حتى يصبح متجانسا ويغطى كل نخالة القمح بخليط مكمل العجل.
   5. انقل الوسط السائب إلى حاوية تخزين طعام من البولي بروبيلين في طبقة بعمق ~8 سم تغطي قاع الحاوية بالكامل (الشكل 3B).
   6. أضف ~1,000 جنين (حوالي 0.2 مل من البويضات لكل 2.2 لتر من الوسط السائل) عن طريق جمع الأجنة عبر .الترشيح بالتفريغ على ورق ترشيح دائري قطره 90 مم ثم وضع ورق الترشيح مع البيض مقلوبا في وسط صندوق الوسائط (الشكل 3B، C).
   7. غط ورق الترشيح بحجم ~1 سم من الوسط للاحتفاظ بالرطوبة (الشكل 3C) وغط الحاوية بمستطيل كبير من قماش القطن الأسود، مع 5 سم من قماش القطن المتدلي يمتد إلى ما بعد حافة الحاوية.
   8. اقطع ثقبا كبيرا (~12 سم قطرا) في غطاء حاوية الطعام للسماح بتبادل الغازات وتثبيت الغطاء على صندوق الوسائط مع حبس القماش القطني الأسود بين الحاوية والغطاء (الشكل 3D).
      ملاحظة: يعمل هذا كحشية، تمنع الفجوة بين الغطاء والحاويات من حبس يرقات المرحلة الأولى في قطرات التكثف.
   9. ضع صندوق الوسائط النهائي في غرفة تربية البالغين حتى تصبح عذراء وراقب تطور اليرقة (الشكل 4) (يحدث التعذر خلال ~10 أيام حسب درجة حرارة الوسط وكثافة اليرقة).
      ملاحظة: يجب أن يكون غطاء القماش دقيقا بما يكفي لمنع مرور يرقات المرحلة الأولى، لكنه منفذ بما يكفي لمنع تكون التكثف على الجدران الداخلية لصناديق الوسط، والتي قد تحبس وتغرق اليرقات.
5. انفصال العذارى
   1. أزل غطاء القماش من صناديق العذراء واجمع العذارى بملعقة أو مغرفة.
      ملاحظة: تظهر عذارى الذباب المستقرة كأسطوانات حمراء بنية غير متحركة، طولها 4-7 ملم، على عكس اليرقات الصفراء البيضاء المتحركة. عادة ما تتجمع العذارى على الأطراف الخارجية لجدران الحاوية أو في مواقع رطبة ومرتفعة داخل صندوق الوسائط الخاص بها بينما يبدأ الذباب في التحول من يرقات إلى عذراء ثم إلى بالغين.
   2. طبقة من 500-1,500 عذراء بعمق ~1 سم على طبق وضعها في قفص نظيف جديد كما هو موضح في القسم 1.1 لتكاثر الجيل التالي.

الشكل 1: مواد تربية الذبابة البالغة. (أ) قفص تربية ذبابة بالغ يظهر كوب السكروز (S) وكوب وضع البيض (O). (ب) كوب وضع البيض معد بقماش قطني أسود مشبع بالماء يمتد قليلا خارج حافة الكأس. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: جمع البيض. (أ) جمع البيض من قماش وضع البيض باستخدام زجاجة غسيل. (ب) استعادة البيض عن طريق الترشيح بالفراغ على ورق مرشح عالي التباين. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مواد لوسائط اليرقات بالجملة
المادة الكيميائية	الكتلة (g)
الماء	900
نخالة القمح	230
مكمل الساق	100
فيرميكوليت (A4 خشن)	70
مواد لحلول إزالة التشويمات
الحل	التكوين
حمام مؤكسد	3٪ هيبوكلوريت الصوديوم في المياه منزوعة الأيونات
حمام الغسيل	ترايتون X-100 محلول 0.02٪ في المياه منزيعة الأيونات
شطف	الماء منزوع الأيونات
مواد لألواح الفصل والتربية من الأجار الأسود
المادة الكيميائية	الكتلة (g)
الماء	500
صفار البيض المطحون	18
الفحم النشط	4
كلوريد الصوديوم	1

الجدول 1: كواشف لوسائط اليرقات الكبيرة، محاليل إزالة التصنيع، وصفائح الأجار السوداء. المواد المستخدمة في تحضير وسط يرقات بالجملة لصيانة المستعمرة، بالإضافة إلى تركيب المحاليل المستخدمة لإضعاف وإزالة الكوريون من أجنة الذباب المستقرة، والمواد اللازمة لتحضير 500 مل من وسط التغطية والتربية الأسود للغيار الأسود.

الشكل 3: تحضير وسائط اليرقات السائبة. (أ) المواد المستخدمة لتحضير وسط اليرقات السائبة: مكمل بروتين العجل (CM)، نخالة القمح (WB)، فيرميكوليت (VM)، حاوية تخزين (SC)، الغطاء (L)، وحشية القماش (FG). (ب) خلط شامل لمكونات الوسائط. (ج) وضع ورق التصفية المغطى بالبيض (EP) مقلوبا على سطح الوسط وتغطيته بوسائط إضافية لمنع الجفاف. (د) تركيب حشية قماش القطن بين الحاوية والغطاء. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: تطور اليرقات في الأوساط الكبيرة. تسمح الحاويات الشفافة بمراقبة تطور اليرقات وحالة الوسط. تظهر اليرقات (L) على جدران الحاوية، والغطاء، وداخل الوسط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. التحضير للحقن: إزالة التشجيع والتجفيف

1. ضع قطعة قماش قطنية أسود مبللة في كأس كما هو موضح في الخطوة 1.1.4. وانقلها إلى قفص بالغ لمدة 25 دقيقة لجمع البيض. اشطف البيض على منخل من الفولاذ المقاوم للصدأ بحجم 106 ميكرومتر باستخدام زجاجة غسيل.
   ملاحظة: عادة ما تنتج فترة جمع 25 دقيقة حوالي 400 بيضة.
2. اترك الأجنة تستريح على المنخل دون إزعاج لمدة 30 دقيقة إضافية.
3. أثناء تقدم الأجنة في العمر، حضر 150 مل لكل من محاليل المؤكسدة والغسل والشطف الموصوفة في قسم "مواد محاليل إزالة التكامل" في الجدول 1 (الشكل 5). استخدم حجما كافيا لتغطية الأجنة بحوالي 1 سم من المحلول.
4. اغمر المنخل الذي يحتوي على الأجنة في حوض المؤكسد لمدة دقيقتين وحرك الأجنة بلطف باستخدام ماصة باستور (الشكل 6A).
   ملاحظة: يساعد الاستنشاق المتكرر وتوزيع المحلول لإنشاء دوامة دائرية على تركيز الأجنة في مركز المصفاة ويمنع الأجنة الطازجة من التصاق بجدران المنخل.
5. أزل المنخل من الحمام المؤكسد وأزيل المحلول الزائد. انقل المصفاة إلى محلول الغسيل وحرك عن طريق الشفط والصرف لمدة دقيقتين.
6. انقل المنخل الذي يحتوي الأجنة إلى محلول الشطف وحرك كما هو موضح في الخطوة 2.4. لمدة دقيقتين. أزل المنخل من محلول الشطف وأزيل الماء الزائد.
7. ضع غطاء زجاجي معقم على المنخل، وتحت مجهر التشريح، استخدم فرشاة طلاء نايلون ذات طرف ناعم لنقل الأجنة (الشكل 6B) من المنخل إلى حافة الغطاء الداخلي. ضع الأجنة قريبة من بعضها دون السماح لها بالتلامس، بحيث يكون القطب الخلفي الأعرض مواجها لحافة غطاء الدرج. تجنب ثني أو تشويه أو تمزيق الأجنة أثناء النقل.
8. جهز غرفة تجفيف عن طريق تغطية قاع قارورة بسعة 1 لتر ب 100 مل من مجفف كبريتات الكالسيوم وإغلاق القارورة بسدادة مطاطية.
   ملاحظة: بعد 24 ساعة من التوازن، تصل غرفة الجفاف عادة إلى رطوبة نسبية تبلغ <5٪ عند 23 درجة مئوية.
9. قم بإزالة الماء الزائد من غطاء الغطاء وضع غطاء الغطاء الذي يحتوي على الأجنة المتحللة على المجفف. أعد إغلاق القارورة بسدادة مطاطية وجفف الأجنة لمدة 8 دقائق.
10. قم بإزالة الغطاء من غرفة الجفاف وضعه على مرحلة المجهر تحت هدف 20× للحقن المجهري.

الشكل 5: حلول إزالة التأثير. من اليسار إلى اليمين: منخل من الفولاذ المقاوم للصدأ، محلول مؤكسد، محلول غسيل، ومحلول شطف يستخدم لإزالة الجنين. يتم الحفاظ على هيبوكلوريت الصوديوم كمحلول مخزوني بنسبة 6٪ محمي من الضوء، بينما يحافظ على ترايتون X-100 كمحلول بسعة 10× ويخفف إلى تركيز نهائي 0.02٪ قبل الاستخدام. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: إزالة الجنين. (أ) الشفط اللطيف وتوزيع المحلول يولد دوامة تركز الأجنة في مركز المصفاة وتقلل الالتصاق بجدران المنخل. (ب) الجنين المنفصل الذي يخرج من المشمشية الشفافة بعد الشطف. عادة ما يظهر القطب الأمامي (الطرف الأضيق) قبل القطب الخلفي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. الحقن الدقيق

1. اسحب إبر حقن الكوارتز من شعيرات زجاجية خيوط بقطر 100 مم (التعريف 0.7 مم، الدرجة الزائدة 1.0 مم) باستخدام المعلمات المدرجة في الجدول 2. احتفظ بالإبر في مكان خال من الغبار حتى الاستخدام.
   ملاحظة: يمكن أيضا استخدام إبر بوروسيليكات ذات هندسة مشابهة.
2. جهز محلول الحقن (0.1٪ مع الفولت/فولت فينول الأحمر في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)، درجة حموضة 7.4) ثم تعقيم بالفلتر عبر فلتر حقنة بحجم 0.22 ميكرومتر.
3. جهز 20 ميكرولتر من خليط الحقن بدمج 10 ميكروغرام من بلازميد بيجي باك المساعد وبلازميد المتبرع، والذي يحتوي على الحمولة الجينية بين تكرارات الطرفين المقلوبة اليسرى والأيمن، مع 4 ميكرولتر من محلول الحقن. يتم تخفيف تركيزه النهائي إلى 500 نانوغرام/ميكرولتر باستخدام ماء خال من النوكليز.
   ملاحظة: يتكون البلازميد المساعد من تسلسل محفز hsp83 بحجم 3.1 كيلو بايت أعلى من كودون البداية hsp83. وتسلسل ترميز ترانسبوزاز بيجي باك النشط.
4. انقل خليط الحقن إلى فلتر PTFE منخفض الحجم بحجم 0.20 ميكرومتر وضع المرشح في فتحة أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 0.5 مل (الشكل 7A). الطرد المركزي عند ≥11,000 × جرام لمدة 10 دقائق أو حتى يمر كل خليط الحقن عبر الفلتر. خزن خليط الحقن غير المستخدم عند -20 درجة مئوية.
5. قم بملء إبرة حقن كوارتز بحوالي 2 ميكرولتر من خليط الحقن باستخدام رأس ماصة محملة بالهلام الدقيق (الشكل 7B). تجنب إدخال فقاعات الهواء أثناء التحميل.
   ملاحظة: توجيه إبرة الحقن الدقيق موازية للمحور الطويل للجنين والحفاظ على عدم انحراف زاوية أفقي ورأسي لتقليل التمزق والقطع.
6. اضغط بلطف على طرف الإبرة على حافة شريحة زجاجية حتى يمر خليط الحقن عبر طرف الإبرة (الشكل 7C).
   ملاحظة: اكسر رأس الإبرة تدريجيا لتكوين أصغر فتحة حادة تسمح بتدفق الخلط بالحقن.
7. حقن الجنين عبر القطب الخلفي مباشرة بعد الجفاف باستخدام ضغط حقن حوالي 700 هكتوباسكال وضغط عكسي 300 هكتوباسكال.
8. اخترق الجنين بلطف وحقن حوالي عشر حجم الجنين بخليط الحقن (الشكل 7D–F).
   ملاحظة: تقليل اختراق الإبر لتقليل اضطراب غشاء الفيتلين ومنع فقدان الأوبلازمزم أثناء سحب الإبرة.
9. انقل غطاء الغطاء إلى طبق بتري مبطن بورق فلتر أسود معقم ومبلل بحجم 90 مم مباشرة بعد الحقن، وحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة.
   ملاحظة: أكمل جميع الحقن خلال ساعتين من وضع البيض لاستهداف الأجنة قبل المرحلة المخلوية.
10. افحص الأجنة للفقس كل 12–16 ساعة. نقل اليرقات الجديدة وغطاء الزجاج إلى صفيحة أجار متلقونة ومكيفة محضرة كما هو موضح في القسم 4.

المعلمة	الحرارة	والد	فيل	ديل	اسحب
القيمة	825	5	60	150	175

الجدول 2: معايير سحب الإبرة. المعايير المستخدمة لتوليد إبر حقن الكوارتز الدقيقة.

الشكل 7: حقن دقيق للجنين. (أ) ترشيح خليط الحقن باستخدام فلتر حقنة متداخل في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 0.5 مل. (ب) تحميل خليط الحقن المصفى في إبرة حقن دقيقة باستخدام رأس ماصة محملة بالجل. (ج) الهندسة النهائية لإبرة حقن الكوارتز الدقيقة. (د) محاذاة الإبرة مع القطب الخلفي للجنين. (ه) اختراق سطح الجنين مع تقليل اضطراب غشاء الفيتيليني. (و) حقن حوالي عشر حجم الجنين يليه سحب الإبرة. تشير زيادة الشفافية إلى إزاحة الأوبلازم بواسطة خليط الحقن. شريط المقياس = 400 ميكرومتر (D–F) يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. تحضير الطبق المعالج

1. تركيبة وسط أجار
   1. جهز الوسيط الموضح في قسم "مواد لألواح التصفية والتربية من الأجار الأسود" في الجدول 1 واستخدم المعقم لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية. صب الأجار على حرارة 40 درجة مئوية أو خزنه في درجة حرارة الغرفة قبل إعادة تسخينه وتوزيعه في أطباق بترى بحجم 90 مم.
      ملاحظة: لف بقوة قبل أن تصب لإعادة تعليق الجزيئات الصلبة.
2. تلقيح الصفائح
   1. قم بتخفيف مزرعة 24 ساعة من K12 Escherichia coli. إلى OD600 = 0.200 في مرق لوريا-بيرتاني وتوزيع 200 ميكرولتر على صفيحة أجار مبردة ومتصلبة. قم بتوزيع الثقافة بشكل متساو باستخدام خرز زجاجي معقم أو موزع زجاجي ودع اللوح يمتص الرطوبة الزائدة (الشكل 8A، B).
      ملاحظة: استخدم أطباق الأجار خلال شهر واحد من الصب أو تخلص منها لضمان نمو موثوق للبكتيريا واليرقات.
3. تكييف الألواح
   1. اطو 6 × 6 سم من ورق الترشيح الأسود لتكوين 6-10 نتوءات مموجة وتعقيم عن طريق الخبز أو التعقيم بالتعقيم. ضع ورقة ترشيح مموجة معقمة معقمة على طبق بتيري المطعم ورطبها بعدة قطرات من الماء المعقم (الشكل 8C).
   2. قم بتعقيم السطحية من يرقات النوع البري (WT) في المرحلة الأولى غير معالجة وغير محقونة، وانقل 10 يرقات إلى ورق الترشيح المبلل.
      ملاحظة: تعقيم أجنة WT عن طريق غمرها في 10٪ مبيض (0.6٪ NaOCl) لمدة دقيقة واحدة، ثم شطفها في ماء معقم منزوع الأيونات لمدة دقيقتين.
   3. ضع ورق فلتر بحجم 90 مم بين غطاء وجسم صحن بتري ليعمل كحشية.
   4. اسمح ليرقات WT بتكييف الصفائح لمدة 24 ساعة قبل إضافة الأجنة المحقونة على ألواح زجاجية (الشكل 8C). إزالة يرقات WT بعد فقس الأجنة الأولى المحقونة.

الشكل 8: تحضير صفائح الأجار واستعادتها بعد الحقن. (أ) تلقيح صفائح الأجار بمزرعة OD600 = 0.2 من الإشريكية القولونية باستخدام حبات زجاجية معقمة. (ب) امتصاص الرطوبة السطحية الزائدة قبل نقل الجنين. (ج) وضع حشوة ورق فلتر بحجم 90 مم بين غطاء وجسم طبق بتري. (د) فحص اليرقات بحثا عن علامات فلورية على صفائح الأجار المعدلة. يتم استرجاع الأجنة المحقونة على ورق فلتر مشبع بماء منزوع الأيونات بحجم 90 مم يوضع في غطاء طبق بتري مقلوب ويحتضن لمدة 48 ساعة قبل نقلها إلى ألواح العرض. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Results

باستخدام هذا البروتوكول، تم إزالة الأيونات وحقن 431 جنينا مستقرا من الذباب بلازميد المتبرع بيجي باك-Hsp83 وبلازميد المساعدة Hsp83 بتركيز نهائي يبلغ 500 نانوغرام/ميكرولتر. من بين 431 جنينا تم حقنه، فقست 18 يرقة ZsGreen إيجابية (4.2٪) و8 يرقات ZsGreen سالبة (1.9٪) بعد 48-76 ساعة من الحقن عند فحصها على ألواح أجار كربونية سوداء (الجدول 3). بشكل عام، فقست 26 من أصل 431 جنينا محقونا (6.0٪)، و16 من أصل 26 يرقة فقست حتى مرحلة البلوغ (61.5٪).

الأنواع	نوع الحقن	التركيب	# تم حقنه	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	عذارى ZsGreen(+)	عذارى ZsGreen(-)	ZsGreen(+) البالغون	ZsGreen(-) البالغون	# البالغون ينتجون نسل ZsGreen(+)
ستوموكسيس كالسيترانس	إدخال الترانسبوزاز	hsp83:hy-pBac (مساعد، 500 ng/uL) hsp83: zsGreen (متبرع، 500 نانوغرام/ميكرولتر)	226	5	8	5	6	3	6	1
ستوموكسيس كالسيترانس	إدخال الترانسبوزاز	hsp83:hy-pBac (مساعد، 500 ng/uL) hsp83: zsGreen (متبرع، 500 نانوغرام/ميكرولتر)	205	13	0	7	0	7	0	5

الجدول 3: إحصائيات الحقن. معدلات البقاء والتحول والتعافي بعد حقن الأجنة الميكروية.

من بين 18 يرقة إيجابية ل ZsGreen، نجت 12 منها حتى العذراء (66.7٪) و10 مغلقة كبالغة. ستة بالغين إيجابيين ل ZsGreen (1.4٪ من الأجنة المحقونة، 60٪ من الناجين الخصبين من G0) أنجبا نسلا إيجابيا ل ZsGreen. هذه النسل (الشكل 9A–E) تم تهجينها ذاتيا وحافظوا على الفلورة لمدة ستة أجيال وقت كتابة هذا الكتاب.

من بين ثماني يرقات سلبية من ZsGreen، نجت ست منها حتى البلوغ (75٪). لم ينجب أي من البالغين غير الفلوريين نسلا فلوريين.

الشكل 9: الفحص الفلوري للذباب المعدلة وراثيا. (أ) مقارنة بين يرقات F1 التي تعبر عن ZsGreen ويرقات WT. (ب) الفلورة المرئية من خلال الجلد العذراء، مما يتيح الفحص المعدل وراثيا في مرحلة العذراء. (C,D) مقارنة بين ثلاث يرقات وعذراء تعبر عن ZsGreen (يسار) مع ثلاث يرقات وعذراء WT (يمين) تحت إضاءة الضوء الأبيض (C) والفلورة (D). (ه) ذبابة F1 بالغة معدلة وراثيا تعبر عن ZsGreen (يسار) مقارنة بذبابة WT بالغة (يمين). أشرطة السلم = 1 مم (A)، 2 مم (B,E)، و3 مم (C,D). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

يظل التحول الجيني لأنواع الحشرات غير النموذجية عنق زجاجة رئيسي في تطوير وتقييم استراتيجيات المكافحة الجينية لآفات ومقاتلات المفصليات.

بالنسبة للذباب المستقر، يقلل البروتوكول الموضح هنا من الوقت والموارد والجهد والتنوع المرتبط بحقن وتربية ذباب G0 بعد الحقن الدقيق للجنين. بالإضافة إلى ذلك، يتيح استخدام ألواح فحص الأجار السوداء المراقبة المباشرة للتطور طوال دورة الحياة، مما يسهل تحديد وتصحيح المشكلات التي تظهر أثناء الحقن والتعافي وتربية اليرقات. باستخدام البنى البلازميدية التي تم تقييمها في هذه الدراسة، أنتج البروتوكول خطوط ذبابة مستقرة معدلة وراثيا مع عدد أقل من الأجنة المحقونة مقارنة بالطرق السابقة⁹. على الرغم من أن هذا خارج نطاق هذه المقالة، يمكن تأكيد وتحديد مواقع إدخال الجينات المنقولة باستخدام طرق راسخة مثل PCR العكسي وPCR المخطط ب splinkerette.

كما يسهل بروتوكول الحقن الفعال الدراسات المستقبلية في علم الجينوم الوظيفي، بما في ذلك توصيف المروجات باستخدام مراسلين فلوريين؛ الكفاءة على الناقلات، من خلال تحليلات الجينات العكسية للجينات المرتبطة بانتقال الممرضات؛ توصيف النوكلياز، بما في ذلك تقييم CRISPR-Cas9 ونوكلياز القابلة للبرمجة الأخرى في الذباب المستقر؛ أبحاث مقاومة المبيدات الحشرية من خلال تعديل أليلات مقاومة مرشحة؛ والتحقيقات في علم الأحياء الأساسي، بما في ذلك الجينات المشاركة في تغذية الدم والتزاوج والتطور. كما يلغي بروتوكولنا الحاجة إلى حقن الأجنة المغمورة في الزيت وغرف الرطوبة المؤكسجة لتعافي الجنين بعد الحقن، كما هو موثق في أدبيات تحول موسكا المنزلية ولوسيليا كوبرينا بيجي باك^16,17.

تعد هناك عدة معايير حاسمة لنجاح عملية التحول الجوي. يعد جفاف الأجنة وتوقيت الحقن مهمان بشكل خاص لأن حمض البلازميد النووي يجب أن يدخل قبل الخلوية لضمان دمجه في الخلايا السلفية للجرثوم. ومع ذلك، لا يزال التوقيت الدقيق لتكوين السينسيتيوم في أجنة الذباب المستقرة غير معروف. بالإضافة إلى ذلك، يتأثر معدل تطور الأجنة بدرجة الحرارة، ولم يتم توصيف الجدول الزمني الكامل لأجنة الذباب المستقرة تحت ظروف بيئية مختلفة. قد توفر الأبحاث المستقبلية حول معدلات التطور وتكوين سلالات الذباب المستقرة في مختبر التجارب رؤى حول تحسين بروتوكولات الحقن المجهري والتحويل، مما يزيد من الكفاءة وقابلية تكرار البروتوكولات. ومع ذلك، حتى ذلك الحين، يظل تحديد نافذة الحقن المثلى قيدا منهجيا قد يؤثر على كفاءة التحول. عندما تكون معدلات البقاء منخفضة، يمكن إجراء استكشاف الأخطاء من خلال مقارنة معدلات الفقس والبالغين بين الأجنة غير المعالجة، والأجنة التي تم تفريغ التأثير، والأجنة التي حقنتها ب PBS المعقمة بالفلتر، والأجنة WT التي تربت على صفائح الأجار. أدت الأدبيات السابقة التي تصف تحول موسكا المنزلي إلى 14 حدث دمج من أصل 1,668 حقنة (0.84٪ من الحقن)¹⁶، وأدى تحول آفة الأغنام Lucilia cuprina إلى إنشاء 3 خطوط معدلة وراثيا من حوالي 900 حقن جنين (0.33٪ من الحقن)¹⁷، مما يشير إلى أن بروتوكول تحويل الذبابة المستقرة الموصوف في هذا البروتوكول (6 أحداث دمج في 431 حقنة، 1.4٪ من الحشرات المحقونة) توفر تحسنا في كفاءة الحقن مقارنة بأنواع الآفات الأخرى في الأدبيات.

وفر محفز الذبابة المستقر hsp83 تعبيرا قويا ل ZsGreen طوال فترة التطور ودعم التعبير عن إنزيم البيجي باك الترانسبوزاز المفرط النشاط خلال بداية تكوين الجنين، مما حسن من رؤية العلامة الفلورية وكفاءة التحول مقارنة ببروتوكول تحول ذبابة مستقر تم الإبلاغ عنه^سابقا. تم توليد البلازميد المساعد المستخدم في هذه الدراسة عن طريق استنساخ 3.1 كيلوبايت من الحمض النووي الجينومي مباشرة في أعلى كودون بداية hsp83 إلى ناقل بلازميد صغير أعلى تسلسل ترميز بيجي باك الترانسبوزاز النشط. تم تحديد نسبة البلازميد المساعد إلى الحمولة تجريبيا بنسبة 1:1 حسب الكتلة واستخدمت طوال الدراسة. على الرغم من عدم تقييم نسب البلازميدات الإضافية، قد تثبت النسب البديلة فعاليتها أيضا.

قد تكون التحسينات الموضحة هنا قابلة للتطبيق على بروتوكولات التحول الوراثي لمفصليات أخرى. بالإضافة إلى ذلك، يتم حاليا تطبيق نظام الفحص والتربية المعتمد على الأجار على حقن وفحص أجنة ذبابة الجندي الأسود (Hermetia illucens). قد يكون البروتوكول مفيدا بشكل خاص لجهود التحول الوراثي في ذباب عضلي آخر، بما في ذلك Musca domestica وHaematobia irritans، بسبب تشابه بيئة اليرقات وتطورها في الركائز الليفية المتحللة. قد يوفر استخدام صفائح الأجار المحصنة بالإشريكية القولونية نهجا عمليا للمراقبة بعد الحقن، مع السماح للباحثين بتقييم تطور الأجنة، وشكل اليرقات، وتعبير العلامات، ومعدلات الفقس، والتعافي العام. قد يعزز تكييف المكون البكتيري في الوسط مع بيولوجيا النوع المستهدف فائدة هذا النهج في تطوير وتحسين بروتوكولات التحول الوراثي.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L flask with rubber stopper (desiccation chamber)	VWR	214-1134	غرفة التجفيف
Bacto Agar	Difco	281230	أجار للألواح السوداء
Black pillowcases	Aisawate	3.45496E+11	قماش قطني أسود لجمع البيض وعازل من القماش لخزانات تربية اليرقات
Calcium sulfate desiccant	Drierite	21001	مادة تجفيف لغرفة التجفيف
Calf Manna Performance Supplement	Manna Pro	095668940010	وسائط اليرقات السائبة
Compound microscope	Leica Microsystems	DM750M	مجهر حقن
Dried Egg Yolks	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	مصدر مغذٍ للألواح السوداء
E. coli	New England Biolabs	C2987H	البكتيريا المستخدمة على الألواح السوداء
Femtojet 4i microinjection pressure supply	Eppendorf	5252000021	مصدر ضغط حقن ميكرو
Fine-tipped nylon paintbrush	Transon	7.42298E+11	نقل الأجنة
Fire-polished quartz capillaries with filament, OD 1.0 mm, ID 0.70 mm, 10 cm length	World Precision Instruments	QF100-70-10	الحرار لسحب الإبر
Forceps	Fine Science tools	11251-20	مناورة العينات
Full height seive, 3” dia, No. 140 ASTM-E11 Standard test sieve (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	يحتوي على الأجنة أثناء إزالة الغلاف
Germicidal Ultra Bleach (6% sodium hypochlorite)	Pure Bright	59647-21014	محلول التبييض لإزالة الغلاف
GladWare Family Size Food Storage Containers, XL 104 oz	Glad	012587701294	حاوية وسائط اليرقات السائبة
Grade 8613, 9cm Black qualitative filter papers	Ahlstrom	8613-0550	جمع الأجنة
LB Broth	BD Difco	DF0446-17-3	مرقة LB لزراعة E.coli
M60 zoom stereo dissecting microscope with Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	مجهر ميكروسكوبي لنقل الأجنة ومحاذاتها
Microloader tips 0.5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	يستخدم لتحميل مزيج الحقن في الإبر
Micromanipulator	Leica Microsystems	11520137	جهاز مايكرو للتحكم في الحقن
Millex Syringe Filter, Hydrophilic PTFE, 0.2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	يستخدم لتصفية مزيج الحقن
Nuclease-free water	Corning	46-000-CM	محلول الحقن
Organic coconut activated charcoal powder	Belle Chemical	B073BSNLJ3	صبغة للألواح السوداء
P-2000 Laser-based pipette puller	Sutter Instruments	P-2000/G	جهاز لسحب الإبر من الحرار
PBS, pH 7.4	Gibco	10-010-023	محلول الحقن
Petri plates	VWR	391-0609	أطباق بتري للألواح السوداء
Phenol red, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	صبغة للحقن
Rubber stoppers	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	سدادة غرفة التجفيف
Soft wheat bran (soft red winter wheat) 50 lb	Siemer	55600050500000	وسائط اليرقات السائبة
Square Glass Coverslips, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	غطاء زجاجي مربع للحقنة المجهرية
Stereo microscope fluorescent adapter	Nightsea	SFA-RB	مصباح فلورسنت ومرشحات لفحص اليرقات
Sterile glass beads	VWR	1.04016.0500	نشر البكتيريا على الألواح
Transfer Pipette Disposable 5mL	LabAid	BP1200	غسل الأجنة أثناء إزالة الغلاف
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	إزالة غلاف الأجنة
Wash bottle	Safetyware	Z423335	غسل الأجنة من الأسطح