يوفر هذا البروتوكول سير عمل موحد وقابل للتكرار لتقييم القدرة التكاثرية والتمايز العظمي والسني للخلايا الجذعية السنية البشرية المستزرعة على سقالات من المواد النانوية، وذلك باستخدام فحوصات قياسية (نشاط ALP، والفلورة المناعية لـ RANKL [التمايز العظمي]، والفلورة المناعية لـ DMP-1 [التمايز السني]) واستراتيجيات تسوية لضمان إمكانية المقارنة بين الدراسات المختلفة.
مقالة منهجية
بروتوكول معياري In Vitro لتقييم تمايز وتكاثر الخلايا الجذعية لب لب الأسنان البشري على السقالات النانوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد التقييم الموثوق للتمايز العظمي والسنّي، بالإضافة إلى تكاثر الخلايا الجذعية، أمراً أساسياً لتقييم الأداء البيولوجي لاستراتيجيات التجدد القائمة على السقالات. ومع ذلك، فإن التباين في البروتوكولات التجريبية، واختيار المقايسات، وتفسير البيانات غالباً ما يحد من إمكانية إعادة الإنتاج والمقارنة بين الدراسات. يقدم البروتوكول الموصوف في هذا المقال سير عمل موحداً وقابلاً للتكرار للتقييم المختبري للتمايز العظمي والسنّي، فضلاً عن القدرة التكاثرية، للخلايا الجذعية المستزرعة على سقالات من المواد الحيوية. يتم تقييم الالتزام العظمي عن طريق النشاط الإنزيمي للفوسفاتاز القلوي (ALP) والتألق المناعي لـ Receptor Activator of Nuclear Factor κB Ligand (RANKL)، بينما يتم تقييم الالتزام السنّي عن طريق التألق المناعي لـ DMP-1 (dentin matrix protein-1)؛ ويتم قياس كلا النهايتين البروتينيتين باستخدام منهجية H-score الموحدة. يتم تفصيل المعايير التجريبية الحرجة، بما في ذلك كثافة استزراع الخلايا، والجداول الزمنية للحث، وظروف المقايسة، واستراتيجيات التسوية (بما في ذلك نشاط ALP المُسوى بالبروتين، وحيوية 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) المُسواة بالخلايا، وH-score للتألق المناعي)، ونهج تحليل البيانات، إلى جانب إرشادات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتقليل التباين التقني. وقد تم تطبيق هذه المنهجية كإطار عمل موحد عبر دراسات تجريبية متعددة قائمة على السقالات، مما أثبت قوتها وقابليتها لإعادة الإنتاج. يهدف هذا المقال، من خلال توفير إطار عمل شامل وموثق، إلى تسهيل التقييم الموحد للتفاعلات بين الخلايا الجذعية والسقالات وتحسين القابلية للمقارنة عبر الدراسات التجددية قبل السريرية.
المقدمة
تمثل العلاجات اللبية التجديدية تحولاً جذرياً في طب الأسنان، حيث تركز على استعادة حيوية لب الأسنان من خلال استخدام الخلايا الجذعية، وعوامل النمو، والسقالات1,2. إن الحفاظ على حيوية اللب أمر ضروري للوظيفة الحسية والاستجابة المناعية، وهو حيوي بشكل خاص في التعامل مع الأسنان غير مكتملة النمو ذات اللب النخري للسماح باستمرار تطور الجذور2.
تُعد الخلايا الجذعية لِلُّب السن البشري (DPSCs) والخلايا الجذعية للحليمة القمية (SCAPs) مرشحات أساسية لهذه الإجراءات نظرًا لقدرتها العالية على التكاثر، والتجديد الذاتي، وخصائصها المثبطة للمناعة، وقدرتها على التمايز إلى خلايا شبيهة بأرومات السن تحت ظروف بيئية دقيقة مناسبة، مما يجعلها مرشحات مجدية للغاية للتطبيقات المستقبلية في الطب التجديدي والتدخلات العلاجية القائمة على الخلايا3,4,5.
بينما تم استكشاف المواد المصاغة تقليدياً مثل الأسمنت القائم على سيليكات الكالسيوم، تشير الأدلة الناشئة إلى أن التعديل بالجسيمات النانوية يمكن أن يؤثر بشكل كبير على التفاعلات بين المواد الحيوية والخلايا6. وقد توفر المواد الحيوية ذات البنية النانوية بيئة مجهرية أكثر محاكاة للطبيعة الحيوية، مما قد يعزز التصاق الخلايا الجذعية والتمايز النوعي للسلالات الخلوية7. ومع ذلك، لا يزال السلوك البيولوجي للمواد المبتكرة، مثل NeoMTA2 في شكل جسيمات نانوية، غير مفهوم بشكل كافٍ مقارنة بالمواد الراسخة، مثل نانو-هيدروكسي أباتيت8. ويتناول هذا البروتوكول الحاجة إلى إطار منهجي موحد لتقييم هذه التفاعلات بدقة وقابلية للتكرار.
يُعد هذا الإطار الموحد مناسبًا بشكل خاص للدراسات التي تقيم المواد الحيوية المبتكرة أو السقالات المصنوعة من المواد النانوية تحت ظروف بيولوجية متطابقة، حيث تكون القابلية للمقارنة بين الدراسات أمرًا بالغ الأهمية. وهو يوفر مزايا مقارنة بنهج المقايسة الواحدة من خلال دمج فحص الحيوية (MTT)، والالتزام المبكر بتكوين العظم (نشاط ALP)، والتمايز على مستوى البروتين (درجة H للفلورة المناعية) ضمن سير عمل واحد. وقد يستفيد الباحثون الذين يستخدمون صبغ أليزارين الأحمر التقليدي أو المقايسات ذات النقطة الزمنية الواحدة من اعتماد هذا الإطار متعدد المعلمات لتقليل انحياز الملاحظ وتحسين الدقة الكمية. ومع ذلك، لا يُقصد بهذا البروتوكول استخدامه في مزارع العضويات ثلاثية الأبعاد، أو أنظمة المزارع المشتركة، أو نماذج الخلايا الجذعية المشتقة من الحيوانات دون إجراء التكييف المناسب. ويجب على الباحثين الذين يحتاجون إلى توصيف التعبير الجيني (على سبيل المثال، RT-qPCR لجينات RUNX2 أو OCN أو DSPP) استكمال سير العمل هذا بمقايسات جزيئية، حيث يركز البروتوكول الحالي حصريًا على النهايات البروتينية والإنزيمية.
من أجل الرصد الشامل لقدرة التمايز ثنائية الوظيفة للخلايا الجذعية السنية، يستخدم هذا البروتوكول علامتين تكميليتين للفلورة المناعية تعكسان نقاط نهاية بيولوجية متميزة. يُستخدم RANKL (ربيطة منشط مستقبل العامل النووي كابا-بي) كعلامة للالتزام بالسلالة المكونة للعظم: حيث يعكس تعبيره في الخلايا الشبيهة ببانية العظم إشارات التمعدن المدفوعة بأيونات الكالسيوم وتنشيط الخلايا المكونة للعظام، وهو ما يتفق مع استخدامه في عدة دراسات لتقييم الخلايا الجذعية القمية (SCAPs)4,8,9. وبالتوازي، يُستخدم DMP-1 (بروتين مصفوفة العاج-1) كعلامة محددة للتمايز السني/العاجي: حيث يعكس ارتفاع تعبيره في الخلايا الشبيهة ببانية العاج تحفيز تكوين مصفوفة العاج وإصلاح الأنسجة الصلبة الخاصة بلب السن، وهو أمر وثيق الصلة بشكل خاص عندما تكون الجمهرة الخلوية المستهدفة هي الخلايا الجذعية لـلب السن (DPSCs)10. ومن خلال قياس كل من RANKL وDMP-1 ضمن نفس الإطار التجريبي باستخدام منهجية H-score، يتيح هذا البروتوكول للباحثين التمييز بين الالتزام المكون للعظم والالتزام السني؛ وهما نتيجتان متداخلتان ولكن متميزتان من الناحية الميكانيكية لتفاعلات الخلايا الجذعية مع السقالات، وذلك دون الحاجة إلى تصميمات تجريبية منفصلة.
البروتوكول
تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات بكلية طب الأسنان بجامعة عين شمس، تحت رقم الموافقة FDASU-Rec IM112105. وقد نُفذت جميع الإجراءات التي تضمنت أنسجة بشرية وفقاً لإعلان هلسنكي. كما تم الحصول على موافقات كتابية مستنيرة من جميع المشاركين قبل خلع الأسنان وجمع الخلايا الجذعية.
1. تحضير وتوصيف المواد النانوية
- تخليق المواد النانوية وفقاً لمتطلبات محددة10,11. بالنسبة لـ Nano-NeoMTA2، يتم طحن المسحوق باستخدام مطحنة كرات كوكبية (انظر جدول المواد) لمدة 10 h بسرعة 350 rpm مع فترات تشغيل/إيقاف مدتها 3 min. استخدم نسبة وزن الكرات إلى المسحوق 10:1 مع كرات طحن من الزركونيا (بقطر 5 mm) في وعاء طحن من الزركونيا. تحقق من حجم الجسيمات النهائي بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) (الهدف: <200 nm) قبل المتابعة.
تنبيه: قد يسبب مسحوق NeoMTA2 تهيجاً تنفسياً في حال استنشاقه. قم بإجراء جميع خطوات الطحن الجاف داخل خزانة أبخرة معتمدة مع ارتداء جهاز تنفس N95، ونظارات واقية، وقفازات نتريل. - تحضير نانو-هيدروكسي أباتيت باستخدام طريقة الترسيب الكيميائي الرطب8,11,12: 10Ca(NO₃)₂ + 6(NH₄)₃PO₄ + 8NH₄OH → Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ + 20NH₄NO₃ + 6H₂O. حضّر 1 L من محلول نترات الكالسيوم بتركيز 0.5 M و0.6 L من محلول فوسفات الأمونيوم بتركيز 0.3 M، كلاهما في ماء منزوع الأيونات. أضف محلول نترات الكالسيوم إلى محلول فوسفات الأمونيوم بمعدل 2–3 mL/min تقريباً تحت تحريك مستمر بسرعة 400 rpm وسخن إلى 70 °C، مع الحفاظ على pH بين 10–12 عن طريق الإضافة التدريجية لهيدروكسيد الأمونيوم8.
تنبيه: هيدروكسيد الأمونيوم مادة أكالة وتطلق أبخرة أمونيا سامة. يتم التعامل معها فقط داخل خزانة أبخرة كيميائية. ارتدِ قفازات مقاومة للأحماض، ونظارات واقية من الرذاذ، ومعطف مختبر. في حال ملامسة الجلد، اشطف المنطقة فوراً بالماء لمدة ≥15 min. - معالجة راسب الأباتيت الناتج حرارياً ومائياً في جهاز أوتوكلاف عند 140 °C وضغط 0.3 MPa لمدة 2–3 h10. يتم التجفيف بالتجميد للراسب المنقى عند -50 °C تحت فراغ ≤0.05 mbar لمدة 48 h8.
- تحضير جسيمات الزجاج النشط بيولوجياً 45S5 النانوية باستخدام طريقة سول-جل (sol-gel) كما يلي:
- تحضير المحلول السلفي عن طريق خلط 40 mL من رباعي إيثيل أورثوسيليكات (TEOS) مع 10 mL من حمض النيتريك (HNO₃) بتركيز 2 M كحفاز حمضي في كؤوس بولي بروبيلين تحت تحريك مستمر بسرعة 300 rpm في درجة حرارة الغرفة.
- بعد 30 min، أضف نترات الكالسيوم رباعية الهيدرات (Ca(NO₃)₂·4H₂O) ونترات الصوديوم (NaNO₃) لتحقيق التركيب المولي المستهدف: 45 mol% SiO₂، و24.5 mol% CaO، و24.5 mol% Na₂O، و6 mol% P₂O₅. أضف فوسفات ثلاثي الإيثيل (TEP) كسلَف للفوسفور.
- التحريك في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 h. تعتيق الهلام (gel) عند 60 °C لمدة 24 h في وعاء محكم الإغلاق. التجفيف عند 120 °C لمدة 24 h. التكليس في فرن مuffle عند 650 °C لمدة 3 h (معدل التسخين: 2 °C/min). الطحن وتأكيد التركيب الطوري بواسطة TEM وحيود الأشعة السينية (XRD)4,9.
تنبيه: TEOS والإيثانول مواد قابلة للاشتعال. HNO₃ مادة أكالة. يجب إجراء جميع الخطوات داخل خزانة أبخرة بعيداً عن مصادر الاشتعال.
- توصيف جميع الجسيمات النانوية المحضرة باستخدام TEM عالي الدقة وXRD لتأكيد حجم الجسيمات والتبلور8. تسجيل متوسط حجم الجسيمات، ومؤشر تعدد التشتت (PDI)، وجهد زيتا باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS) لتأكيد الاستقرار الغرواني. تُقبل الدفعات التي يكون فيها متوسط حجم الجسيمات <200 nm وجهد زيتا <−15 mV أو >+15 mV.
2. حصاد الخلايا الجذعية وزراعتها
- حصاد الخلايا الجذعية لللب السني (DPSCs) أو الخلايا السلفية للرباط السني (SCAPs) من الأضراس الثالثة السفلية المنطمرة المستخلصة حديثاً بعد الحصول على موافقة كتابية مستنيرة10. تتم معالجة الأسنان المستخلصة في غضون 2 h من الاستخلاص ونقلها في محلول ملحي موازن بالفوسفات (PBS) معقم عند 4 °C.
ملاحظة: تشمل معايير أهلية المتبرعين البالغين الأصحاء جهازياً الذين تتراوح أعمارهم بين 18-35 سنة، وغير المدخنين، ممن ليس لديهم تاريخ في استخدام المضادات الحيوية خلال الأشهر الثلاثة السابقة، ولا يعانون من أمراض دواعم السن، ولا توجد أدلة شعاعية على وجود اعتلالات حول ذروية. - عزل الخلايا باستخدام طريقة الهضم الإنزيمي9. يتم تقطيع الأنسجة السنية إلى قطع بحجم 1–2 mm وهضمها بمحلول كولاجيناز من النوع الأول (collagenase type I) بتركيز 3 mg/mL في وسط DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) خالٍ من المصل لمدة 1 h عند 37 °C مع التحريك المستمر بسرعة 60 rpm على منصة هزازة8. يتم تحييد التفاعل باستخدام وسط استزراع كامل والترشيح عبر مصفاة خلايا بمقاس 70 µm.
تنبيه: قد يحتوي الكولاجيناز من النوع الأول على سموم داخلية. استخدم فقط الكولاجيناز المختبر لعدم وجود سموم داخلية والمخصص لزراعة الأنسجة. يجب ارتداء القفازات وتجنب الاستنشاق. - زراعة معلق الخلايا المنفردة في دوارق بمساحة 75 cm2 بكثافة أولية تبلغ 1 × 104 cells/cm2 باستخدام وسط استزراع كامل يتكون من DMEM، و10% مصل بقري جنيني (FBS)، و1% بنسلين/ستربتومايسين (جدول المواد)8.
- تحضين الدوارق عند 37 °C في جو يحتوي على 5% CO₂8. مراقبة النمو والتلوث يومياً باستخدام مجهر تباين طوري مقلوب10. استبدال وسط الاستزراع كل 48–72 h. يتم التخلص من أي دورق تظهر عليه علامات التلوث (عكارة، تغير في اللون، شكل خلوي غير منتظم).
- حصاد الخلايا بعد الممر الثالث، عند وصولها إلى درجة تلاقي تبلغ 70–80% تقريباً8. لإجراء عملية التمرير، يتم سحب الوسط، والشطف باستخدام PBS، وفصل الخلايا باستخدام 0.25% trypsin-EDTA عند 37 °C لمدة 3–5 min. يتم التحييد باستخدام وسط استزراع كامل، والطرد المركزي بسرعة 300 x g لمدة 5 min، وإعادة الزراعة بكثافة 1 × 104 cells/cm2. استخدم فقط الخلايا الواقعة بين الممر 3 والممر 6 للحفاظ على الاستقرار المظهري.
3. توصيف الخلايا الجذعية
- تقييم النمط الظاهري المناعي للخلايا المعزولة باستخدام قياس التدفق الخلوي8,10قم بتوصيف الخلايا عند الممر الثالث. تضَمَّن ضابطاً سالباً غير مصبوغ وضوابط تعويض مصبوغة صبغة أحادية لكل فلوروكوم مستخدم.
- اضبط عدد الخلايا إلى 106/مل في المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS). يتم الطرد المركزي عند 800 x جـ لمدة 10 دقائق، ثم اغسل الراسب مرتين باستخدام PBS8,10.
- قم بصبغ الخلايا باستخدام أجسام مضادة بشرية لعلامات الميزنكيم (CD44، CD43) وعلامات المكونات المكونة للدم (CD45) وفقاً للتخفيفات الموصى بها من الشركة المصنعة (عادةً 1:100 في محلول PBS يحتوي على 1% من ألبومين المصل البقري (BSA) (جدول المواد)8,10حضّن عند 4 °C لمدة 45 دقيقة في الظلام. تُغسل مرتين باستخدام محلول PBS ثم تُعلق مجدداً في 300 µL محلول PBS للاستحواذ.
- تحليل الخلايا باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي (جدول الموادلتقييم النمط الظاهري المناعي (تعبير CD44 وCD73، مع استخدام CD45 كعلامة استبعاد للخلايا المكونة للدم). يتم تطبيق بوابات فرز تسلسلية: (أ) بوابات التشتت (FSC-A مقابل SSC-A)؛ (ب) استبعاد الخلايا المزدوجة (FSC-H مقابل FSC-A)؛ (ج) بوابات خاصة بكل فلوروكروم تُضبط مقابل عينات ضابطة غير مصبوغة. يتم تسجيل النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لكل علامة مع توضيح استراتيجية الفرز المستخدمة.
4. تحديد التركيز الآمن للمادة (التركيز الفعال النصي، EC₅₀)
- تحديد قيمة EC₅₀ باستخدام برنامج التحليل الإحصائي (GraphPad Prism 9). يتم مواءمة بيانات الاستجابة للجرعة مع منحنى سيغموي للانحدار غير الخطي (نموذج لوجستي رباعي المعالم: Y = Bottom + (Top − Bottom) / (1 + 10^((LogEC₅₀ − X) × HillSlope))). يتم تسجيل قيمة EC₅₀ بوحدة µg/mL مع فاصل ثقة 95%8.
- تحضير تخفيفات تسلسلية للمواد النانوية (50، 25، 12.5، 6.25، 3.12، و 1.56 µg/mL) في 1 mL من محلول PBS. يتم رج المعلق المخزون باستخدام جهاز Vortex لمدة 30 s، ثم تعريضه للموجات فوق الصوتية (جهاز سونيكاتور مسباري، 40 W، تشغيل لمدة 30 s/ إيقاف لمدة 10 s لـ 3 دورات عند 4 °C) لضمان الحصول على معلق متجانس. يتم التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية في كابينة السلامة البيولوجية تحت ضوء UV لمدة 30 min.
- زراعة الخلايا الجذعية بكثافة 1 × 104 خلية/بئر في أطباق 96-well لمدة 72 h مع التركيزات المختلفة، وعد الخلايا الحية باستخدام صبغة Trypan blue لحساب قيمة EC₅₀ باستخدام النموذج اللوجستي رباعي المعالم الموصوف في الخطوة 4.1.
- إجراء التجارب في ثلاث مكررات (n = 3 آبار مستقلة لكل تركيز) مع ثلاث مكررات بيولوجية على الأقل. يتم تسجيل قيم EC₅₀ كمتوسط ± SD وحساب معامل الاختلاف (CV%) عبر المكررات (القيمة المقبولة لـ CV هي <15%).
5. تقييم التمايز العظمي والسنّي
ملاحظة: يقيم هذا القسم مساري تمايز متكاملين باستخدام مقايسات تألق مناعي متوازية من نفس تحضير الخلايا. يعمل RANKL (الخطوة 5.5) كعلامة تكوين العظم؛ بينما يعمل DMP-1 (الخطوة 5.6) كعلامة تكوين الأسنان. ويتم قياس كليهما كمياً باستخدام منهجية H-score نفسها (الخطوة 5.8). قم بإجراء كلا المقايسين على شرائح غطاء منفصلة تم تحضيرها في وقت واحد.
- قم بزراعة الخلايا الجذعية في أطباق ذات ستة آبار بكثافة 4.5 × 105 خلية/بئر. تُترك الخلايا لتلتصق لمدة 24 ساعة في وسط استزراع كامل قبل البدء في عملية التمايز.
- وزع العينات على أربع مجموعات: المجموعة الضابطة السالبة (وسط DMEM وحده)، والمجموعة الضابطة الموجبة (وسط تمايز عظمي/سني)، والمجموعات التجريبية (المواد النانوية بتركيز EC)₅₀- التركيزات الآمنة المستمدة).
- قم بتحضير وسط التمايز العظمي عن طريق تزويد وسط DMEM بـ 10% من مصل جنين البقر (FBS)، و1% من البنسلين/ستريبتومايسين، و10 مللي مولار من βجليسيروفوسفات، 50 µg/mL حمض الأسكوربيك (L-ascorbate-2-phosphate)، و100 نانومولار من الديكساميثازون. استبدل الوسط كل 48 ساعة. حضّن لمدة 72 ساعة عند 37 °C و5% CO2₂.
- قياس نشاط إنزيم الفوسفاتيز القلوي (ALP)
- قم باستزراع الخلايا في أطباق زراعة ذات 24 بئراً بكثافة 1 × 104 خلية/بئر وتحضن في 37 °C في جو مرطب يحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2)₂ لمدة 72 ساعة.
- قم بشفط الوسط الزرعي، واغسل الآبار باستخدام محلول PBS، ثم قم بتحليل الخلايا عن طريق إضافة 200 µL من محلول التحلل لكل بئر (0.1% Triton X-100 في PBS) والتحضين عند 4 °C لمدة 10 دقائق مع الرج اللطيف.
- اجمع الراشح وقم بطرده مركزياً عند 500 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 °Cاستخدم السائل الطافي لجميع قياسات ALP اللاحقة. انقل 50 µL لكل عينة اختبار و 100 µL من معايير p-nitrophenol في لوحة معايرة دقيقة ذات 96 بئراً. أضف محلول AMP substrate buffer (جدول الموادلبدء التفاعل الحفزي.
- بعد فترة حضانة ثانوية لمدة 30 دقيقة عند 37 °C، وأوقف التفاعل بإضافة 50 µL من 0.5 M NaOH لكل بئر. قم بقياس الامتصاصية فوراً عند 405 نانومتر باستخدام قارئ ميكرويت للأطباق لقياس الامتصاصية (جدول المواد).
- أنشئ منحنى قياسياً للامتصاصية مقابل تركيز p-nitrophenol، واحسب نشاط ALP بوحدة U/L.
- حدد إجمالي محتوى البروتين في محلول التحلل الخلوي نفسه باستخدام مقايسة بروتين برادفورد (Bradford) أو مقايسة BCA للبروتين. قم بتنميط نشاط الفوسفاتاز القلوي (ALP) بالنسبة لإجمالي محتوى البروتين، وسجل النتائج النهائية بوحدة U/mg بروتين.
- مؤشر تكوين العظم (RANKL)
- قم بتقييم تعبير بروتين RANKL باستخدام التألق المناعي. أولاً، قم بإعداد ضوابط النمط المتماثل والضوابط التي تحتوي على الجسم المضاد الثانوي فقط: (أ) استبدل الجسم المضاد الأولي بـ IgG أرنب متماثل النمط وبنفس التركيز، و(ب) احذف الجسم المضاد الأولي تماماً في آبار منفصلة.
- ثبّت الخلايا باستخدام محلول فورمالدهيد بتركيز 4% مُحضّر حديثاً في محلول PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسلها ثلاث مرات باستخدام محلول PBS (لمدة 5 دقائق في كل مرة).
- يتم النفاذ باستخدام Triton X-100 بتركيز 0.1% في محلول PBS لمدة 10 دقائق، ثم الحجب باستخدام مصل ماعز طبيعي بتركيز 5% في محلول PBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتقليل الارتباط غير النوعي. وبدون غسل، يضاف مباشرة الجسم المضاد الأولي Rabbit Anti-RANKL بتخفيف 1:200 في محلول الحجب (جدول المواد) وتحضن طوال الليل عند 4 °C.
- اغسل ثلاث مرات باستخدام المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS)، ثم حضّن باستخدام جسم مضاد ثانوي من نوع Goat Anti-Rabbit IgG مقترن بفلوروفور بتخفيف 1:500 في محلول الحجب (جدول الموادلمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام8بعد تحضين الأجسام المضادة الثانوية، يتم الغسل ثلاث مرات باستخدام المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) (لمدة 5 دقائق في كل مرة)، ثم الانتقال مباشرة إلى الخطوة 5.7 من أجل التثبيت.
تنبيه: يُعد الفورمالديتيد (محلول بتركيز 4%) مادة تثبيت سامة ومسرطناً محتملاً. يجب تحضيره واستخدامه فقط داخل خزانة استخلاص كيميائية معتمدة. كما يجب ارتداء قفازات من النيتريل، ونظارات واقية من الرذاذ، ومعطف المختبر. يتم التخلص من النفايات وفقاً للإرشادات المؤسسية.
ملاحظة: يتم بدلاً من ذلك تأكيد هوية الخلايا عن طريق مجهر تباين الأطوار والمعايير المورفولوجية قبل تسجيل نتائج التألق المناعي (راجع الخطوة 5.10).
- مؤشر سنّي (DMP-1)
ملاحظة: قم بتقييم تعبير بروتين DMP-1 (بروتين مصفوفة العاج-1) باستخدام التألق المناعي بالتوازي مع الخطوة 5.5 لتقييم الالتزام السني.- باستخدام مجموعة منفصلة من شرائح الغطاء من تحضير الخلايا نفسه، كرر جميع خطوات التثبيت والنفاذية والحجب كما هو موضح في الخطوة 5.5، بما في ذلك ضوابط النمط النوعي والضوابط التي تقتصر على الأجسام المضادة الثانوية فقط.
- دون غسل بعد عملية الحجب، أضف مباشرةً جسمًا مضادًا أوليًا ضد DMP-1 (راجع جدول المواد) بتخفيف 1:200 في محلول الحجب (blocking buffer)، ثم يُحضن طوال الليل عند 4 °Cاغسل ثلاث مرات باستخدام المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS)، ثم قم بالتحضين مع الجسم المضاد الثانوي المناسب والمقترن بفلوروفور (استخدم فلوروكروم متميز طيفياً عن ذلك المستخدم لـ RANKL؛ انظر جدول المواد) بتخفيف 1:500 في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام.
- التقط صوراً فلورية بقوة تكبير 10x لتقييم تعبير بروتين DMP-1 كمؤشر على التمايز الشبيه بخلايا أرومة السن.10بعد تحضين الأجسام المضادة الثانوية، اغسل العينات ثلاث مرات باستخدام المحلول الملحي المنظم بالفوسفات PBS (لمدة 5 دقائق في كل مرة)، ثم انتقل مباشرة إلى الخطوة 5.7 لإجراء عملية التثبيت.
- ثبّت الشرائح باستخدام وسط تثبيت مانع للتلاشي (انظر جدول المواد) واتركها لتستقر طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. قم بتثبيت الشرائح المصبوغة بـ RANKL وDMP-1 بشكل منفصل ووضع علامات تعريفية واضحة عليها (على سبيل المثال، "مجموعة RANKL 1" و "مجموعة DMP-1 الأولى") قبل التصوير.
- افحص الشرائح فوراً باستخدام مجهر الفلورسنس أو خزنها في 4 °C يُحفظ بعيداً عن الضوء. يتم قياس التعبير البروتيني عن طريق تقييم كثافة التصبيغ باستخدام نظام تسجيل معياري مكون من أربعة مستويات: 0 (لا يوجد تصبيغ)، +1 (ضعيف)، +2 (متوسط)، و+3 (قوي).
- التقط الصور باستخدام إعدادات مجهر متطابقة (وقت التعريض، وقوة الليزر، والكسب) عبر جميع المجموعات التجريبية. طبق إعدادات متطابقة بشكل مستقل لكل وسم (RANKL وDMP-1) لضمان الاتساق داخل الوسم الواحد عبر المجموعات.
- قم بتقييم خمسة حقول عالية القوة على الأقل (عدسة شيئية x20) مختارة عشوائياً لكل بئر. يجب أن يقوم مراقبان مستقلان ومجهولان بإجراء التقييم، مع تسجيل معامل كابا لكوهين (قيمة كابا المقبولة ≥ 0.7).
- احسب درجة H (H-score) باستخدام الصيغة التالية: H-score = Σ(i × Pi)، حيث i = كثافة الصبغ (1 أو 2 أو 3) و Pi = نسبة الخلايا (0-100%) عند كل مستوى شدة.
ملاحظة: تتراوح درجة H-score من 0 إلى 30010. - قم بتطبيع بيانات درجة H-score بالنسبة إلى إجمالي عدد الخلايا في كل حقل، والذي يتم تحديده عن طريق العد اليدوي لجميع الخلايا المرئية في كل حقل باستخدام مجهر تباين الطور قبل التصوير المناعي الفلوري، وذلك لمراعاة الاختلافات في كثافة الخلايا بين الآبار.
- قم بحساب وإبلاغ درجات H-score بشكل منفصل لكل من RANKL (النقطة النهائية لتكون العظم) و DMP-1 (النقطة النهائية لتكون السن) لتمكين المقارنة المباشرة بين مساري التمايز هذين.
6. تقييم التكاثر والحيوية
- قم بإجراء عد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) وصبغ تريبان الأزرق (Trypan blue) للتمييز بين الخلايا الحية وغير الحية. احسب العدد الإجمالي للخلايا الحية لكل مليلتر من المزرعة. قم بعدّ ما لا يقل عن 100 خلية لكل عينة لضمان الموثوقية الإحصائية.
- إجراء مقايسة MTT لقياس النشاط الأيضي للميتوكوندريا8,10.
- أضف محلول MTT بتركيز نهائي قدره 0.5 مجم/مل (جدول الموادإلى الخلايا والتحضين لمدة 4 ساعات عند 37 °Cقم بإزالة المحلول، ثم أضف عامل إذابة (مثل SDS-HCl؛ انظر جدول المواد)، وقياس الكثافة الضوئية عند 570 نانومتر باستخدام جهاز spectrophotometer (الطول الموجي المرجعي: 630-650 نانومتر).
- احسب حيوية الخلايا على النحو التالي: حيوية الخلايا (%) = (امتصاصية الخلايا المعالجة / امتصاصية الخلايا الضابطة غير المعالجة) × 100. القيم >تشير نسبة 100% إلى التحفيز التكاثري بالنسبة للضابط السلبي. يرجى تضمين بئر فارغ لتصحيح الخلفية.
- قم بتنميط النتائج وفقًا لعدد الخلايا باستخدام عدّ موازٍ بصبغة Trypan blue. أجرِ جميع المقايسات في ثلاث مكررات (3 آبار لكل مجموعة، و≥ 3 مكررات بيولوجية).
تنبيه: يُعد محلول التذويب SDS-HCl مادة مسببة للتآكل؛ لذا يجب التعامل معه باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة. تخلص من النفايات التي تحتوي على الفورمازان وفقاً للوائح المؤسسية.
النتائج
جميع النتائج المعروضة هنا مقتبسة من دراسات مصاحبة4,8,9,10 أجرتها نفس المجموعة البحثية بموجب موافقة أخلاقية مؤسسية موحدة (FDASU-Rec IM112105).
توصيف المواد النانوية وعزل الخلايا الجذعية
يعطي سير العمل الموحد في البداية تأكيداً قابلاً للقياس لخصائص السقالة والأنماط الظاهرية للخلايا الجذعية. وبعد عملية التخليق، يتم التحقق من المواد النانوية المحضرة باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) عالي الدقة وحيود الأشعة السينية (XRD) لتأكيد حجم الجسيمات والبلورية (الشكل 1A،B). وبالتزامن مع ذلك، تظهر الخلايا الجذعية لب السن (DPSCs) أو الخلايا الجذعية للقمة السنية (SCAPs) المعزولة عبر الهضم الإنزيمي التصاقاً وتكاثراً قوياً في وسط استزراع كامل. ويؤكد تحليل قياس التدفق الخلوي النمط المناعي للخلايا التي تم جمعها عند الممر 3، مما يشير إلى تعبير عالٍ عن العلامات الميزنكيمية (CD44, CD43) ويؤكد أصلها غير المكون للدم من خلال غياب CD45 (الشكل 1C).
تحديد تركيز المواد الآمن وتكاثر الخلايا
من خلال زراعة الخلايا الجذعية عبر تخفيفات متسلسلة من المواد النانوية (50–1.56 µg/mL) لمدة 72 h، يمنح تحليل الانحدار اللوجستي رباعي المعلمات لأعداد الخلايا الحية قيمة EC₅₀ موثوقة (نموذج استجابة الجرعة السيني غير الخطي، كما هو موضح في الخطوة 4.1). وتشير قيم حيوية MTT التي تتجاوز 100% إلى تحفيز تكاثري مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المعالجة، حيث يتم تطبيع القيم بالنسبة لمجموعة الضبط السلبية (الخلايا غير المعالجة تُعتبر 100%). فعلى سبيل المثال، تعكس القيمة التي تبلغ ~196% لـ Nano-NeoMTA2 تحفيزاً حيوياً لنشاط الميتوكوندريا بدلاً من كونها بقاءً مطلقاً للخلايا بنسبة >100%9.
في عدة دراسات طبقت هذا البروتوكول الموحد، تم تحديد قيم EC₅₀ بلغت 7.9 µg/mL (Nano-NeoMTA2, SCAPs)8 و 9.92 µg/mL (Nano-NeoMTA2, DPSCs)10 باستخدام النموذج اللوجستي رباعي المعلمات (الخطوة 4.1)، مما يؤكد تركيزات العمل الآمنة للاستخدام في فحوصات التمايز الموضحة في هذا البروتوكول. وقد أُدرجت هذه القيم في الجدول 1 كمقاييس تحقق تمثيلية.
تقدير التمايز العظمي والسنّي (تقييم ثنائي العلامات)
يؤدي نهج التألق المناعي الثنائي إلى الحصول على مقياسين نتيجتين متميزين ومتكاملين من نفس التحضير الخلوي. وبالنسبة للتقييم العظمي، ميزت درجات H لـ RANKL بين المجموعات الأربع جميعها بدلالة إحصائية: حيث أظهرت الخلايا المستنبتة مع Nano-NeoMTA2 تعبيراً أعلى بكثير لـ RANKL مقارنة بالمجموعة الضابطة السالبة، وهو ما يتفق مع زيادة تنشيط الخلايا الشبيهة ببانيات العظم (الشكل 2A، الجدول 1)8,9. أما بالنسبة للتقييم السنّي، فقد كشفت درجات H لـ DMP-1 عن تمايز قوي للخلايا الشبيهة ببانيات العاج في DPSCs المستنبتة مع Nano-NeoMTA2، حيث كانت درجات H أعلى بكثير من تلك الموجودة في مجموعات النانوهيدروكسي أباتيت والمجموعة الضابطة السالبة، مما يؤكد التوجه التفضيلي نحو تكوين العاج (الشكل 3A، الجدول 1)10. وقد تم تأكيد هوية الخلايا بواسطة مجهر تباين الطور ومعايير مورفولوجية مميزة (مورفولوجيا مغزلية أو مضلعة) قبل عملية التقدير.
تم تمييز نشاط ALP طيفياً بين جميع المجموعات عند 405 nm، حيث يعمل كعلامة إنزيمية مبكرة للالتزام العظمي والسنّي على حد سواء (الجدول 1). وأكد تحليل MTT الطيفي أن جميع المواد النانوية عند تركيزات آمنة مشتقة من EC₅₀ حافظت على حيوية خلوية عالية مقارنة بالمجموعة الضابطة السالبة، وهو ما يتوافق مع القيم التمثيلية المعروضة (الجدول 1).
النتائج التجريبية غير المثالية وغير الناجحة
تم تلخيص النتائج غير المثالية في الجدول 2. عادةً ما يشير انخفاض حيوية الخلايا في مقايسة MTT إلى أن تركيز المادة النانوية يتجاوز عتبة EC₅₀ أو أن التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية كان غير كافٍ. أما عدم اتساق امتصاص ALP (معامل الاختلاف CV > 20%) فيشير عموماً إلى عدم استواء كثافة استزراع الخلايا أو عدم تجانس محلول التحلل بشكل كامل. وغالباً ما تنتج الإشارة الضعيفة أو الغائبة للتألق المناعي لكل من RANKL أو DMP-1 عن تعطيل الأجسام المضادة، أو عدم كفاية النفاذية، أو التثبيت المفرط؛ ويمكن معالجة ذلك باستخدام الفورمالديهايد 4% الطازج وتوزيعات الأجسام المضادة ذات الاستخدام الواحد. يجب استبعاد التفاعل المتبادل بين قناتي RANKL وDMP-1 من خلال مراجعة صور التحكم التي تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية فقط قبل التقييم.
الشكل 1التوصيف القياسي للمواد النانوية والتحقق من النمط الظاهري للخلايا الجذعية. (Aأطياف حيود الأشعة السينية (XRD) التي تؤكد الطور البلوري والسلامة الهيكلية للجسيمات النانوية.B) صور ممثلة بالمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) توضح حجم الجسيمات النانوي، والمورفولوجيا، والتشتت المتجانس للمواد الحيوية المصنعة؛ مع مقارنة بين NeoMTA2 والهيدروكسيباتيت. تظهر مناظر منخفضة التكبير لـ (أ) NeoMTA2 و (ب) الهيدروكسيباتيت، بينما تظهر مناظر عالية التكبير بالتفصيل في (ج) NeoMTA2 و (د) الهيدروكسيباتيت. تظهر أشرطة المقياس في الزاوية السفلية اليسرى. (سيبروتوكول تحديد البوابات في قياس التدفق الخلوي لتوصيف الخلايا الجذعية. تُظهر مخططات النقاط متعددة المعلمات التمثيلية الخلايا المصبوغة لـ CD44 وCD73 (المشار إليها بـ CD43 PE في المخططات الأصلية) وCD45. تم تحديد بوابات المجموعات الفرعية CD44+ وCD73+ بما يتوافق مع تعبير CD45. اللوحتان A وC مقتبستان من Zaki et al.8 (CC BY-NC-SA) واللوحة B مقتبسة من Habib et al.10 (CC BY-NC). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2التقييم الكمي وشبه الكمي للتمايز العظمي عبر التألق المناعي لـ RANKL. (A) صور مجهرية ممثلة بفلورة مناعية عالية الدقة ترصد تعبير مؤشرات البروتين العظمية الحرجة RANKL ضمن البيئة المجهرية للسقالة ثنائية الأبعاد (أ) تُشكل خلايا المجموعة الضابطة السالبة مستعمرات صغيرة ذات تعبير RANKL غشائي باهت، بينما تظهر (ب) خلايا المجموعة الضابطة الموجبة زيادة في عدد المستعمرات الشبيهة بخلية بانية للعظم مع تعبير كثيف ومتجانس. وتظهر الخلايا الجذعية المعالجة بـ (ج) NHAP، و(د) NHAP/chitosan، و(هـ) جسيمات الزجاج النشط بيولوجياً النانوية تمايزاً متقدماً، يتميز بمستعمرات كبيرة مدمجة شبيهة بخلايا بانية للعظم مع تمركز مكثف ومتجانس لـ RANKL في كل من الغشاء والنواة؛ مقتبس من: Elshahat et al.4. (B) مخططات بيانية تمثل تكميم درجة H (H-score) للتعبير عن RANKL عبر الدراسات المختلفة. تطبيق منهجية درجة H لمعايرة بيانات التألق المناعي. من خلال الدمج الرياضي لشدة الصبغ المرئية (المصنفة من 0 إلى 3) مع النسبة المئوية للخلايا المصبوغة إيجابياً، تحول درجة H المجهر النوعي إلى مقياس شبه كمي قوي، مما يقلل بشكل كبير من انحياز المراقب الذاتي. (أ) مقارنة بين Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) وجسيمات الزجاج النشط بيولوجياً النانوية (NBG؛ 500 µg/mL) مقابل ضابط إيجابي من الوسط المحفز لتكوين العظم (OM-PC) وضابط سلبي من وسط DMEM (DMEM-NC). وقد أظهر NBG أعلى ملف تعبيري (p &p < 0.001). مقتبس من Abdelaziz et al. 9 (CC BY-NC-ND 4.0). (ب) تقييم نانو هيدروكسي أباتيت (NHAP; 10µg/mL)، مركب NHAP/الشيتوزان (10 µg/mL)، وNBG (500 µg/mL) مقارنة بالمجموعات الضابطة، حيث أظهرت مجموعة NHAP/Chitosan أعلى درجات H-scores. مقتبس من Elshahat et al.4 (CC BY 4.0). (ج) تقييم Nano- NeoMTA2 (7.9 µg/mL) مقابل NHAP (10 µg/mL) والمجموعات الضابطة، مما أظهر ارتفاعاً ملحوظاً في تعبير RANKL في Nano-NeoMT، مقتبس من: Zaki et al.8. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: صور تمثيلية للفلورة المناعية وتحليل درجة H. (A) تقييم بالمجهر الفلوري المناعي للتعبير عن بروتين مصفوفة العاج (DMP-1) عبر المجموعات التجريبية؛ يشير الفلور الأخضر إلى صبغ إيجابي للأجسام المضادة متعددة النسيلة لـ DMP-1. (أ) المجموعة الضابطة السالبة: تُظهر الخلايا الجذعية لِلُب الأسنان البشرية (hDPSCs) في الوسط غير المتمايز (UM) تجمعات خلوية صغيرة مع تعبير DMP-1 باهت وموحد (+). (ب) المجموعة الضابطة الموجبة: تُظهر hDPSCs في الوسط المكون للأدنتوبلاستات (OM) توسعاً في المستعمرات التي تتميز بإشارات DMP-1 كثيفة ومتجانسة (++). (ج) النانو هيدروكسي أباتيت (10 μg/mL) و (د) Nano-NeoMTA2 (9.92 μg/mL): تشكل hDPSCs المتمايزة مستعمرات كبيرة مدمجة من خلايا شبيهة بالأدنتوبلاستات تُظهر تعبيراً قوياً ومتجانساً لـ DMP-1 يتمركز في الأغشية والنوى. التكبير: ×10. تشير الدوائر الصفراء إلى مستعمرات شبيهة بالأدنتوبلاستات؛ وتشير الأسهم الصفراء إلى التعبير المكثف لـ DMP-1. (B) مخطط بياني يمثل قياس درجة H للتعبير عن بروتين مصفوفة العاج عبر مجموعات الدراسة. لوحظ فرق ذو دلالة إحصائية عالية بين مجموعات التقييم، حيث سُجلت أعلى درجة H في مجموعة Nano-NeoMTA2 (169.33 ± 4.04)، تليها مجموعة النانو هيدروكسي أباتيت (140.33 ± 2.52) ثم المجموعة الضابطة السالبة (15.33 ± 1.53). اللوحتان A و B مقتبستان من Habib et al.10 (CC BY-NC). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| المقايسة / المعلمة | المادة النانوية / نوع الخلية | القيمة التمثيلية (المتوسط ± الانحراف المعياري) | المعايرة | المصدر |
| حيوية الخلية (مقايسة MTT) | ||||
| حيوية MTT | Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) / SCAPs | ~196% (OD = 1.56 ± 0.24) | تمت المعايرة بالنسبة للمجموعة الضابطة غير المعالجة (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz et al.⁹ |
| حيوية MTT | Chitosan-nHA (10 µg/mL) / SCAPs | ~99.97% | تمت المعايرة بالنسبة للمجموعة الضابطة غير المعالجة (DMEM-NC = 100%) | Elshahat et al.⁴ |
| حيوية MTT — المجموعة الضابطة الموجبة | OM-PC / SCAPs | 113.46% (OD = 0.93 ± 0.03) | تمت المعايرة بالنسبة للمجموعة الضابطة غير المعالجة (DMEM-NC = 100%) | Abdelaziz et al.⁹ |
| حيوية MTT — المجموعة الضابطة السالبة | DMEM-NC / SCAPs | 100% (OD = 0.82 ± 0.02) — الخط المرجعي | تم تحديد DMEM-NC بنسبة 100% كمرجع لجميع المجموعات | Abdelaziz et al.⁹ |
| نشاط الفوسفاتاز القلوي (ALP) | ||||
| نشاط ALP | جسيمات الزجاج النشط بيولوجياً النانوية (500 µg/mL) / SCAPs | 69.86 ± 0.98 U/L | تمت المعايرة بالنسبة لمحتوى البروتين الكلي (U/mg البروتين، مقايسة Bradford/BCA) | Abdelaziz et al.⁹ |
| نشاط ALP — المجموعة الضابطة الموجبة | OM-PC / SCAPs | 77.68 ± 1.28 U/L | تمت المعايرة بالنسبة لمحتوى البروتين الكلي (U/mg البروتين، مقايسة Bradford/BCA) | Abdelaziz et al.⁹ |
| نشاط ALP — المجموعة الضابطة السالبة | DMEM-NC / SCAPs | 55.81 ± 1.6 U/L | تمت المعايرة بالنسبة لمحتوى البروتين الكلي (U/mg البروتين، مقايسة Bradford/BCA) | Abdelaziz et al.⁹ |
| تركيز المادة الآمن (EC₅₀) | ||||
| EC₅₀ (SCAPs) | Nano-NeoMTA2 / SCAPs | 7.9 µg/mL | نموذج لوجستي رباعي المعلمات (استجابة جرعة سينيّة غير خطية، GraphPad Prism 9) | Zaki et al.⁸ |
| EC₅₀ (DPSCs) | Nano-NeoMTA2 / DPSCs | 9.92 µg/mL | نموذج لوجستي رباعي المعلمات (استجابة جرعة سينيّة غير خطية، GraphPad Prism 9) | Habib et al.10 |
| H-Score — تعبير بروتين RANKL (مؤشر تكوّن العظم) | ||||
| H-Score (RANKL) مؤشر تكوّن العظم | Nano-NeoMTA2 (7.9 µg/mL) / SCAPs | 164 ± 4 (مقياس 0-300) | إجمالي عدد الخلايا المرئية لكل حقل (مجهر تباين الطور) | Zaki et al.⁸ |
| H-Score (RANKL) مؤشر تكوّن العظم | nHA (10 µg/mL) / SCAPs | 68 ± 3 (مقياس 0-300) | إجمالي عدد الخلايا المرئية لكل حقل (مجهر تباين الطور) | Zaki et al.⁸ |
| H-Score (RANKL) المجموعة الضابطة الموجبة | OM-PC / SCAPs | 84 ± 1 (مقياس 0-300) | إجمالي عدد الخلايا المرئية لكل حقل (مجهر تباين الطور) | Zaki et al.⁸ |
| H-Score (RANKL) المجموعة الضابطة السالبة | DMEM-NC / SCAPs | 18 ± 1 (مقياس 0-300) | إجمالي عدد الخلايا المرئية لكل حقل (مجهر تباين الطور) | Zaki et al.⁸ |
| H-Score — تعبير بروتين DMP-1 (مؤشر تكوّن السن) | ||||
| H-Score (DMP-1) مؤشر تكوّن السن | Nano-NeoMTA2 (9.92 µg/mL) / DPSCs | 169.33 ± 4.04 (مقياس 0-300) | إجمالي عدد الخلايا المرئية لكل حقل (مجهر تباين الطور) | Habib et al.10 |
| H-Score (DMP-1) مؤشر تكوّن السن | nHA (10 µg/mL) / DPSCs | 140.33 ± 2.52 (مقياس 0-300) | إجمالي عدد الخلايا المرئية لكل حقل (مجهر تباين الطور) | Habib et al.10 |
| H-Score (DMP-1) المجموعة الضابطة السالبة | DMEM-NC / DPSCs | 15.33 ± 1.53 (مقياس 0-300) | إجمالي عدد الخلايا المرئية لكل حقل (مجهر تباين الطور) | Habib et al.10 |
| H-score (DMP-1) مؤشر تكوّن السن [المجموعة الضابطة الموجبة - OM-PC] | OM-PC / DPSCs | ~103 H-score (مقياس 0-300) | إجمالي عدد الخلايا لكل حقل (مجهر تباين الطور) | Habib et al. Eur Endod J, 202610 |
| H-score = Σ(i × Pi): i = كثافة التلوين (1 أو 2 أو 3)؛ Pi = النسبة المئوية للخلايا عند كل مستوى كثافة (0-100%)؛ المدى 0-300. تم التعبير عن حيوية MTT بالنسبة إلى DMEM-NC الذي تم تحديده كمرجع بنسبة 100%. تم التعبير عن نشاط ALP كـ U/L من نزع الفسفرة الإنزيمية لـ p-nitrophenyl phosphate؛ وتمت معايرته بشكل إضافي بالنسبة لمحتوى البروتين الكلي (U/mg البروتين). OM-PC = وسط تحفيز تكوّن العظم/السن (مجموعة ضابطة موجبة). DMEM-NC = وسط Dulbecco المعدل (مجموعة ضابطة سالبة). | ||||
الجدول 1: نتائج نموذجية من سير عمل التقييم القياسي في المختبر.نتائج كمية نموذجية من دراسات منشورة سابقاً توضح تكاثر الخلايا، ونشاط الفوسفاتاز القلوي، وتحليلات التألق المناعي التي أُجريت باستخدام البروتوكول القياسي.
| المشكلة الملحوظة | السبب المحتمل | المحلول الموصى به |
| انخفاض حيوية الخلايا في مقايسة MTT (الكثافة الضوئية/الامتصاصية الضوئية OD) < مجموعة ضابطة غير معالجة) | تركيز المواد النانوية يتجاوز التركيز الفعال النصفي (EC₅₀)، أو عدم كفاية التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية، أو عدم كفاية تشتت الجسيمات النانوية. | إعادة إجراء تعيين التركيز الفعال النصفي (EC₅₀) (القسم 4). تمديد فترة التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية إلى 30 دقيقة. التحقق من تجانس معلق الجسيمات النانوية عن طريق المعالجة بالموجات فوق الصوتية باستخدام المسبار (40 واط، 30 ثانية تشغيل/إيقاف، 3 دورات عند 4 °C) مباشرةً قبل الاستخدام. |
| معامل الاختلاف (CV) لحيوية خلايا MTT >15% عبر المكررات | خطأ في السحب بالماصة، أو عدم تجانس توزيع الخلايا، أو تباين وقت/درجة حرارة تحضين MTT. | استخدم ماصة متعددة القنوات ومعايرة لجميع عمليات الإضافة. تحقق من كثافة الاستزراع باستخدام مقياس كرات الدم قبل الزراعة. حافظ على فترة تحضين دقيقة لمدة 4 ساعات عند 37 °C في حاضنة CO₂ مرطبة. مع تضمين بئر فارغ لتصحيح الخلفية. |
| قراءات امتصاص ALP غير متسقة (معامل الاختلاف (CV >20% عبر الآبار) | كثافة استزراع الخلايا غير المتساوية، أو تحلل الخلايا غير الكامل، أو عدم الاتساق في عملية الماصة أثناء إضافة الركيزة. | التزم بدقة بوضع 1 × 10⁴ خلية/بئر في أطباق ذات 24 بئراً. قم برج محلول التحلل (lysis buffer) جيداً باستخدام جهاز الرج الميكانيكي (Vortex) قبل الاستخدام. حافظ على ثبات فترة حضانة التحلل (10 دقائق، 4 °C، مع الرج الخفيف). تحقق من امتصاص الخلفية باستخدام بئر فارغ (blank) لا يحتوي على خلايا. |
| ضعف أو غياب التألق المناعي لـ RANKL الإشارة (الخطوة 5.4أ) | تعطيل الأجسام المضادة نتيجة التخزين غير السليم، أو التثبيت المفرط الذي يقلل من إمكانية الوصول إلى الحاتمة، أو عدم كفاية النفاذية. | قم بتحضير محلول فورمالديهيد طازج بتركيز 4% قبل الاستخدام مباشرة. أضف مادة Triton X-100 بتركيز 0.1% للنفاذية (لمدة 10 دقائق، في درجة حرارة الغرفة) قبل مرحلة الحجب. قم بمعايرة تخفيف الأجسام المضادة الأولية (ابدأ بنسبة 1:200). قم بتضمين مقطع نسيجي كعينة ضابطة موجبة. قسّم مخزون الأجسام المضادة إلى حصص صغيرة لتجنب تكرار دورات التجميد والإذابة. |
| تألق مناعي ضعيف أو غائب لبروتين DMP-1 إشارة (الخطوة 5.4ب) | تعطيل الأجسام المضادة نتيجة دورات التجميد والإذابة، أو التخفيف غير المثالي للجسم المضاد الأولي، أو عدم توافق الأنواع المضيفة للأجسام المضادة الثانوية. | قم بتقسيم الأجسام المضادة لـ DMP-1 إلى حصص صغيرة (Aliquot) لتجنب دورات التجميد والإذابة. قم بمعايرة التخفيف بدءاً من نسبة 1:200. تأكد من توافق الأنواع المضيفة بين الجسم المضاد الأولي (DMP-1) والجسم المضاد الثانوي. قم بتضمين مقطع نسيجي من العاج كضابط موجب لـ DMP-1. |
| التفاعل المتبادل بين RANKL وDMP-1 قنوات الفلورة | تداخل طيفي في أطياف الانبعاث في حال استخدام الفلوروكروم نفسه لكلا الأجسام المضادة الثانوية، أو عدم كفاية الفصل بين القنوات في المجهر الفلوري. | استخدم فلوروكروما للأجسام المضادة الثانوية متميزة طيفياً لكل من RANKL وDMP-1 (على سبيل المثال، Alexa Fluor 488 لأحد الواسمات، وAlexa Fluor 594 للواسم الآخر). راجع صور الضوابط التي تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية فقط لكل قناة بشكل مستقل قبل التقييم. قم بالتقاط صور RANKL وDMP-1 بشكل منفصل باستخدام وضع الالتقاط المتسلسل. |
| خلفية غير نوعية عالية في التلوين المناعي الفلوري | حجب البروتين غير الكافي، أو تركيز الأجسام المضادة الثانوية المرتفع للغاية، أو عدم كفاية خطوات الغسل بين فترات الحضن. | قم بتمديد فترة تحضين الحجب إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة. ارفع تركيز تخفيف الجسم المضاد الثانوي إلى 1:1000. تحقق من النوعية باستخدام ضابط الجسم المضاد الثانوي فقط (بدون جسم مضاد أولي). تأكد من إتمام جميع عمليات الغسل بمحلول PBS (3 مرات لمدة 5 دقائق لكل مرة). |
| التباين بين الملاحظين في حساب درجة H (H-score) (معامل كابا لكوهين) <0.7، الخطوة 5.6) | تطبيق غير متسق لمقياس شدة الصبغ المكون من أربعة مستويات (0، +1، +2، +3+) بين الفاحصين، أو عدم كفاية المعايرة قبل جلسات التقييم. | قم بإجراء جلسة معايرة مشتركة باستخدام صور تدريبية ممثلة قبل البدء في التقييم الرسمي. استخدم إعدادات عرض صور متطابقة (السطوع، والتباين) لجميع الفاحصين. قم بتقييم خمسة حقول مجهرية ذات قوة تكبير عالية كحد أدنى لكل بئر، واحسب معامل كابا (kappa) بعد كل 10 حقول لمراقبة الانحراف. |
| منحنى EC₅₀ لا يتقارب أو أن الملاءمة ضعيفة (الخطوة 4.1) | نقاط بيانات غير كافية، أو نطاق تركيز ضيق، أو عدم تحقيق معلق متجانس قبل الاستزراع. | وسع نطاق التخفيف التسلسلي ليشمل 6 تركيزات على الأقل تتراوح بين 50-1.56 µg/mLتأكد من إجراء عملية السونكة بالمسبار (probe sonication) مباشرة قبل كل خطوة تخفيف. كرر العملية باستخدام 3 مكررات بيولوجية مستقلة على الأقل. تحقق من معامل الاختلاف (CV). <بنسبة 15% عبر المكررات. |
الجدول 2: المعلمات الحرجة ودليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها. المشكلات الفنية الشائعة التي تمت مواجهتها أثناء البروتوكول، وأسبابها المحتملة، والحلول الموصى بها لتحسين قابلية تكرار التجربة وجودة البيانات. الاختصارات: CV = معامل الاختلاف؛ RT = درجة حرارة الغرفة.
المناقشة
تتضمن الخطوات الحرجة في هذا البروتوكول التحديد الدقيق لقيمة EC₅₀، وضمان تجانس معلق المواد النانوية، ومعايرة مخرجات المقايسة البيولوجية. ويوفر حساب EC₅₀ عبر الانحدار غير الخطي (نموذج لوجيستي رباعي المعلمات) تقديرًا أكثر دقة للاستجابة للجرعة مقارنة بالاستكمال الخطي، ويُفضل استخدامه عند توفر نقاط بيانات كافية13,14. كما يعد ضمان تجانس معلق الجسيمات النانوية عن طريق استخدام جهاز الموجات فوق الصوتية (probe sonication) مباشرة قبل تعريض الخلايا لها أمرًا بالغ الأهمية؛ إذ تؤدي المعلقات ضعيفة التشتت إلى منحنيات استجابة للجرعة غير موثوقة وتؤدي إلى تقديرات خاطئة لقيمة EC₅₀. وبالنسبة للمواد المبتكرة مثل NeoMTA2، فإن الطحن إلى المقياس النانوي هو خطوة أولى أساسية، لأن حجم الجسيمات الكبيرة يغير بشكل كبير من تفاعلية السطح والنشاط البيولوجي اللاحق13,14. وفي حال لوحظ انخفاض في حيوية الخلايا عند تركيزات يُتوقع أن تكون آمنة، يجب على الباحثين التحقق من بروتوكول التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية (UV) وإعادة فحص إجراءات الطحن والتشتت قبل تكرار مقايسة EC₅₀10.
تعد الاستعانة بعلامتين تكميليتين للتألق المناعي تعكسان مسارات تمايز متميزة ولكنها متداخلة حجر الزاوية في هذا البروتوكول. يعكس زيادة تنظيم RANKL في الخلايا الشبيهة ببانيات العظم إشارات تكوين العظم المدفوعة بأيونات الكالسيوم وتتناسب طردياً مع عدد الخلايا المكونة للعظم8,9، بينما يعمل تعبير DMP-1 كمؤشر محدد للتمايز الشبيه ببانيات العاج والنشاط المكون للعاج، مما يجعله ذا صلة خاصة عندما تكون الخلايا المستهدفة هي DPSCs10. ومن خلال قياس كلتا العلامتين باستخدام منهجية H-score، يتيح هذا البروتوكول للباحثين التمييز بين الالتزام السلالي المكون للعظم والملتزم بتكوين العاج ضمن نظام تحليل معياري واحد، وهو تقدم مقارنة بنهج العلامة الواحدة الذي لا يمكنه التمييز بين الالتزام بتكوين العظام أو تكوين العاج. يجب تسجيل قيم H-scores لكل من RANKL و DMP-1 في جميع المنشورات التي تستخدم هذا البروتوكول للحفاظ على إمكانية المقارنة بين الدراسات. كما يجب على الباحثين استخدام فلوروكرمات متميزة طيفياً للأجسام المضادة الثانوية لضمان عدم تداخل القنوات، ويجب مراجعة صور التحكم التي تحتوي على الأجسام المضادية الثانوية فقط قبل البدء في عملية التقييم.
قد يلزم إجراء العديد من التعديلات المنهجية عند تكييف هذا البروتوكول مع مواد حيوية أو نماذج خلوية بديلة. بالنسبة للسقالات شديدة العتامة أو الملونة، قد يتسبب التداخل مع امتصاص MTT عند 570 nm في الحاجة إلى اختبار حيوية بديل، مثل CellTiter-Glo (الوميض الحيوي) أو PrestoBlue (اختزال الريسازورين)، والتي تكون أقل عرضة للتداخل البصري الناتج عن مواد السقالات. يجب على الباحثين الذين يستخدمون SCAPs بدلاً من DPSCs ملاحظة أن SCAPs تميل إلى إظهار تعبير أقوى عن RANKL، مما يعكس التزامها العظمي الأكبر، بينما تظهر DPSCs تعبيراً أكثر وضوحاً عن DMP-1، مما يعكس انحيازها السلالي الأقوى نحو التكوين السني/العاجي. يعد رقم الممر (Passage number) متغيراً حرجاً؛ لذا يجب تجنب الخلايا التي تتجاوز الممر 6 لأنها قد تظهر قدرة تمايز منخفضة وتغيراً في تعبير العلامات السطحية.
تشمل قيود هذا الإطار المنهجي نافذة تقييم قصيرة المدى (72 h)، والتي قد لا ترصد أحداث التمعدن في المرحلة المتأخرة التي تتطلب عادةً من 14–21 يوماً. ويمثل غياب التحقق في الجسم الحي (in vivo) فجوة انتقالية كبيرة. كما يؤدي استخدام H-score إلى احتمالية حدوث تباين بين المراقبين؛ لذا يجب إدراج موثوقية ما بين المراقبين (Cohen's kappa) الواردة في القسم 5.10 في جميع النتائج المنشورة.
يوفر هذا الإطار العملي عدة مزايا مقارنة بنهج النقاط النهائية الواحدة الحالية. فغالباً ما تعتمد فحوصات تكوين العظم التقليدية حصراً على صبغ Alizarin Red أو نشاط ALP في نقطة زمنية واحدة. إن دمج فحص الحيوية باستخدام MTT، وقياس نشاط ALP، وتحديد درجات H-score عبر التألق المناعي المزدوج لـ RANKL + DMP-1 ضمن سير عمل واحد، يوفر مخرجات متعددة المعايير تتيح إجراء مقارنة إحصائية مباشرة بين أنواع السقالات تحت ظروف تجريبية متطابقة. وتعمل استراتيجيات المعايرة الموصوفة، حيث يُعبر عن نشاط ALP لكل mg بروتين، ونتائج MTT كنسبة مئوية من المجموعة الضابطة غير المعالجة، ودرجة H-score معيرة وفقاً لإجمالي عدد الخلايا في كل حقل، على إزالة العوامل المربكة الناتجة عن التباين بين الآبار4,8.
قد تطبق الدراسات المستقبلية هذه المنهجية لتقييم تأثيرات المواد الحيوية على علامات الالتهاب، أو الاستجابات المكونة للأوعية الدموية، أو نماذج بديلة للخلايا الجذعية. كما أن تسلسل المقايسة قابل للتكيف مع تنسيقات السقالات ثلاثية الأبعاد (3D scaffold). وفي نهاية المطاف، فإن اعتماد هذا الإطار الموحد عبر المختبرات المستقلة سيسهل إجراء مقارنات تحليلية تلوية ذات مغزى لأداء السقالات في أبحاث طب الأسنان التجديدي قبل السريرية15.
الإفصاحات
يقر المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أطباق زرع ذات 24 بئراً | Corning | 3527 | تُستخدم في فحوصات ALP |
| أطباق ذات 96 بئراً | Corning | 3596 | تُستخدم لقراءات امتصاص ALP واختبارات MTT |
| طقم فحص ALP | Abcam | ab83369 (أو ما يعادلها) | تُستخدم لقياس نشاط الفوسفاتاز القلوي |
| محلول منظم لركيزة ALP (2-أمينو-2-ميثيل-1-بروبانول) | Sigma-Aldrich | لا يوجد نص متوفر للترجمة. يرجى تقديم النص المصدر باللغة الإنجليزية لكي أتمكن من ترجمته إلى اللغة العربية وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المطلوبة. | تُستخدم لبدء التفاعل التحفيزي لإنزيم ALP |
| هيدروكسيد الأمونيوم (NH4OH)4(OH) | نظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى المطلوب تحويله إلى اللغة العربية. سأقوم بترجمته وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة لـ JoVE، مع ضمان الدقة التقنية والمصطلحية المناسبة للباحثين والأكاديميين. | يرجى تزويدي بالنص المصدر المراد ترجمته. | تُستخدم لضبط الأس الهيدروجيني (pH) أثناء تخليق النانو-هيدروكسي أباتيت. مادة أكالة |
| الجسم المضاد الأولي Anti-DMP-1 | بما أنك لم تقم بتوفير نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية، وسأقوم بنقله بدقة وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة لـ JoVE. | لا يوجد نص متاح للترجمة. يرجى تقديم النص المصدر لبدء عملية الترجمة. | مؤشر سنّي المنشأ؛ تخفيف بنسبة 1:200 في محلول الحجب؛ طوال الليل في درجة حرارة 4 °C |
| جسم مضاد مضاد لـ CD44 البشري (CD44-FITC) | Beckman Coulter | لا ينطبق | تُستخدم في قياس التدفق الخلوي؛ وهي مؤشر إيجابي للخلايا الجذعية الميزنكيمية |
| جسم مضاد مضاد لـ CD45 البشري (CD45-PC5) | Beckman Coulter | لا ينطبق | تُستخدم في قياس التدفق الخلوي؛ علامة سلبية للسلالة المكونة للدم |
| جسم مضاد مضاد لـ CD73 البشري (CD73-PE) | Beckman Coulter | لم يتم تقديم نص للترجمة. يرجى تزويدي بالنص المصدر باللغة الإنجليزية لنبدأ عملية الترجمة العلمية إلى اللغة العربية. | تُستخدم في قياس التدفق الخلوي؛ علامة إيجابية للخلايا الجذعية الميزنكيمية |
| الموصدة (مفاعل حراري مائي) | Tuttnauer | نظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تقديم المحتوى العلمي أو التعليمي الذي ترغب في ترجمته من اللغة الإنجليزية إلى اللغة العربية، وسأقوم بصياغته بدقة وفقًا للمعايير الأكاديمية والتقنية المحددة. | تُستخدم للمعالجة الحرارية المائية للنانو-هيدروكسي أباتيت عند 140 °C، 0.3 ميجا باسكال |
| طقم تحليل بروتين BCA | Thermo Fisher Scientific | 23225 (أو ما يعادلها) | تُستخدم لتحديد التركيز الكلي للبروتين بغرض معايرة نشاط إنزيم ALP |
| أول أكسيد الكربون2 حضّانة | Thermo Fisher Scientific | لا ينطبق | اضبط على 37 °C و 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2)2 لكافة خطوات زراعة الخلايا |
| كولاجيناز النوع الأول | Sigma-Aldrich | C0130 | تُستخدم للهضم الإنزيمي للأنسجة السنية أثناء عزل الخلايا الجذعية |
| وسط دولبيكو المعدل لـ إيجل (DMEM) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11965-092 | وسط استزراع أساسي؛ ويُستخدم أيضاً كمجموعة ضابطة سلبية |
| مصل جنين البقر (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10270-106 | مكمل لوسط زراعة كامل؛ استخدم مصل جنين العجل (FBS) المؤهل للخلايا الجذعية الميزنكيماوية (MSC) لوسط التمايز |
| جهاز قياس التدفق الخلوي (Navios) | Beckman Coulter | نافيوس (Navios) | تُستخدم لتحديد النمط الظاهري المناعي للخلايا الجذعية |
| برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي (Navios) | Beckman Coulter | بما أن النص المصدري غير متوفر (N/A)، يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية لكي أتمكن من تطبيق المعايير العلمية والمهنية المطلوبة في ترجمة محتوى JoVE. | تُستخدم في تحديد البوابات وتحليل بيانات لوحات قياس التدفق الخلوي |
| المجهر الفلوري | شركة Labomed / NY للمجاهر | 9126000 | تُستخدم للتصوير المناعي الفلوري وحساب درجة H-score |
| المجفف بالتجميد (الليوفلايزر) | Labconco | يرجى تقديم النص المصدر المراد ترجمته. | تُستخدم لتجفيف رواسب المواد النانوية عند −50 °C |
| جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد لـ IgG الأرنب (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | A-11034 | جسم مضاد ثانوي فلوري؛ تخفيف بنسبة 1:500؛ لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة |
| جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد لـ IgG الأرنب (Alexa Fluor 594) | Invitrogen (أو ما يعادلها) | A-11012 (أو ما يعادله) | جسم مضاد ثانوي متميز طيفياً يُستخدم في التألق المناعي لبروتين DMP-1 عند إجراء صبغ متعدد* |
| برنامج GraphPad Prism | برمجيات GraphPad | الإصدار 9 | تُستخدم لـ EC50 الحساب والتحليل الإحصائي |
| مقياس كرات الدم (هيموسيتوميتر) | نيوباور | لم يتوفر نص. | تُستخدم لعد الخلايا يدويًا ولحساب العدد الكلي للخلايا من أجل تسوية درجة H (H-score normalization) |
| مجهر تباين الأطوار المقلوب | Olympus | بما أنه لم يتم توفير نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص العلمي أو التعليمي الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية، وسأقوم بتنفيذه وفقاً للمعايير المهنية والأكاديمية المحددة. | تُستخدم للمراقبة اليومية لنمو الخلايا وشكلها الظاهري |
| وسط تثبيت، مضاد للبهتان (ProLong Gold) | Invitrogen | P36930 | تُستخدم لتثبيت الشرائح بعد الصبغ المناعي الفلوري |
| كاشف MTT | Invitrogen | M6494 | تُستخدم لتقييم النشاط الأيضي للخلايا؛ 0.5 مجم/مل، لمدة 4 ساعات عند 37 °C |
| نانو-هيدروكسي أباتيت (NHAP) | نانوجيت، القاهرة، مصر | لا ينطبق | تُصنّع عن طريق الترسيب الرطب أو يتم الحصول عليها تجارياً؛ وتُستخدم بـ 10 µg/mL |
| مسحوق NeoMTA2 | شركة NuSmile Ltd. / Avalon Biomed | بما أنك لم تقم بتزويدي بنص مصدر لترجمته، يرجى إرسال النص الإنجليزي الذي ترغب في تحويله إلى العربية، وسأقوم بترجمته فوراً وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة في تعليماتك. | المواد الأولية لتحضير Nano-NeoMTA2 باستخدام مطحنة الكرات الكوكبية |
| مصل ماعز طبيعي | لا ينطبق | لا ينطبق | تُستخدم للحجب (5% في PBS) قبل تطبيق الأجسام المضادة الأولية |
| وسط تمايز عظمي/سني | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | غير متاح | وسط التحكم الإيجابي؛ يحتوي على DMEM وFBS والأسكوربات وبيتا-جليسيروفوسفات والديكساميثازون |
| بارافورمالدهيد (4%) | Sigma-Aldrich | P6148 | تُستخدم لتثبيت الخلايا قبل التألق المناعي. سامة — يُستخدم داخل خزانة استخلاص الغازات (fume hood) |
| محلول PBS (محلول ملحي منظم بالفوسفات، باهاء 7.4) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10010-023 | تُستخدم لغسل الخلايا، وتخفيف الأجسام المضادة، وتعليق المواد النانوية |
| محلول البنسلين-ستريبتومايسين | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 15140-122 | مكمل مضاد حيوي؛ يُستخدم بنسبة 1% في وسط استنبات كامل |
| مطحنة الكرات الكوكبية | Retsch (أو ما يعادلها) | PM 400 | تُستخدم لتصغير حجم مسحوق NeoMTA2 إلى الحجم النانوي؛ 350 دورة في الدقيقة، لمدة 10 ساعات |
| معايير p-نيتروفينول | Sigma-Aldrich | نظرًا لعدم وجود نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية وفقًا للمعايير المهنية والعلمية المذكورة. | تُستخدم لإنشاء منحنى القياس لنشاط إنزيم الفوسفاتاز القلوي (ALP) |
| جسم مضاد أولي من الأرنب مضاد لـ RANKL | Abcam | ab9957 | مؤشر تكوين العظم؛ تخفيف بنسبة 1:200؛ طوال الليل في درجة حرارة 4 °C |
| جسم مضاد ضابط من النمط الإيزوتيبي IgG للأرانب | نظرًا لعدم وجود نص مصدر، يرجى تقديم النص الإنجليزي المراد ترجمته. | الضابط السلبي للفحص المناعي الفلوري؛ تركيز مطابق للأجسام المضادة الأولية | |
| محلول إذابة SDS-HCl | Sigma-Aldrich | نظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية، وسأقوم بتنفيذه وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة. | يُستخدم لإذابة بلورات فورمازان MTT. مادة أكالة |
| أطباق زراعة الأنسجة ذات الستة آبار | Corning | 3516 | تُستخدم في مقايسات التمايز |
| هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)، بتركيز 0.5 مولار | Sigma-Aldrich (أو ما يعادلها) | لم يتم تقديم نص للمراجعة. يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي المراد ترجمته إلى اللغة العربية. | تُستخدم لإيقاف تفاعل ALP قبل قياس الامتصاصية؛ مادة أكالة |
| جهاز سونيكيتور (المسبار / حمام الموجات فوق الصوتية) | Branson Ultrasonics | بما أنك لم تقدم أي نص للمراجعة أو الترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية، وسأقوم بصياغته وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة في تعليماتك. | تُستخدم لتشتيت الجسيمات النانوية قبل المقاييس البيولوجية |
| دوارق زراعة خلوية T-75 | Corning | 430641 | تُستخدم لإكثار الخلايا الجذعية |
| تيترا إيثيل أورثوسيليكات (TEOS) | نظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المذكورة. | لا ينطبق | طليعة السيليكا لتخليق الزجاج النشط بيولوجياً 45S5 بطريقة سول-جيل. قابل للاشتعال |
| مجهر إلكتروني نافذ | JEOL Ltd. | JEM-2100 | تُستخدم لتوصيف حجم ومورفولوجيا المواد النانوية |
| Triton X-100 (بتركيز 0.1% في محلول PBS) | يرجى تقديم النص المصدر المراد ترجمته. | لا ينطبق | يُستخدم لنفاذية الخلايا قبل التألق المناعي |
| محلول صبغة تريبان الزرقاء (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | تُستخدم لتقييم حيوية الخلايا |
| جهاز حيود الأشعة السينية (X'PERT-PRO) | PANalytical | X'PERT-PRO | تُستخدم للتحليل البلوري للجسيمات النانوية |
المراجع
- Sui B et al. Dental pulp stem cells: from discovery to clinical application. J Endod. 2020;46(9 Suppl):S46-S55. doi:10.1016/j.joen.2020.06.027.
- Zhang W, Yelick PC. Vital pulp therapy: current progress of dental pulp regeneration and revascularization. Int J Dent. 2010;2010:856087. doi:10.1155/2010/856087.
- Zhang W et al. The performance of human dental pulp stem cells on different three-dimensional scaffold materials. Biomaterials. 2006;27(33):5658-68. doi:10.1016/j.biomaterials.2006.07.013.
- Elshahat S, Elgendy AA, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using chitosan-coated nanohydroxyapatite and bioactive glass nanoparticles. Eur J Dent. 2024;18(2):665-71. doi:10.1055/s-0043-1777044.
- Huang M, Dissanayaka WL, Yiu CKY. Exploring the potential of stem cells from the apical papilla (SCAPs) in regenerative medicine: advantages, applications, challenges and opportunities. Stem Cell Res Ther. 2025;16(1):626. doi:10.1186/S13287-025-04705-8.
- Tran N, Webster TJ. Nanotechnology for bone materials. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2009;1(3):336-51. doi:10.1002/wnan.23.
- Ding F, Guo S, Pan G. Emerging biomimetic materials with micro/nanostructure-dependent biological effects. Rev Mater Res. 2025;1(2):100040. doi:10.1016/j.revmat.2025.100040.
- Zaki NT, El-Helbawy M, Mahran AH, Elsewefy T. Effect of Neo-MTA and hydroxyapatite nanoparticles on proliferation and osteogenic differentiation of apical papilla stem cells (SCAPs) (in vitro study). J Pharm Negat Results. 2023;14. doi:10.47750/pnr.2023.14.02.344.
- Abdelaziz H, Mahran AH, Elsewify T. Osteogenic differentiation and proliferation of apical papilla stem cells using nanoparticles of Neo MTA and bioactive glass. Saudi Dent J. 2024;36(1):134-39. doi:10.1016/j.sdentj.2023.10.018.
- Habib N, Elgendy A, Elsewify T, Yehia T. The effect of Nano-NeoMTA2 and nanohydroxyapatite on the human dental pulp stem cells odontogenic differentiation and proliferation. Eur Endod J. 2026;11(4):158-65. doi:10.65717/eej.2026.25165.
- Ferraz MP, Monteiro FJ, Manuel CM. Hydroxyapatite nanoparticles: a review of preparation methodologies. J Appl Biomater Biomech. 2004;2(2):74-80.
- Xu F, Li Y, Wang X, Wang J, Yang A. Preparation and characterization of nano-hydroxyapatite/poly(vinyl alcohol) hydrogel biocomposite. J Mater Sci. 2004;39:5669-72. doi:10.1023/B:JMSC.0000040074.64787.b3.
- Tanomaru-Filho M et al. Biocompatibility and mineralized nodule formation of Neo MTA Plus and an experimental tricalcium silicate cement containing tantalum oxide. Int Endod J. 2017;50(Suppl 2):e31-e39. doi:10.1111/iej.12780.
- Rodríguez-Lozano FJ et al. Biomineralization potential and biological properties of a new tantalum oxide (Ta2O5)-containing calcium silicate cement. Clin Oral Investig. 2022;26(2):1427-41. doi:10.1007/s00784-021-04117-x.
- Okajcekova T et al. A comparative in vitro analysis of the osteogenic potential of human dental pulp stem cells using various differentiation conditions. Int J Mol Sci. 2020;21(7). doi:10.3390/ijms21072280.