عزل ميكروبيوتا الطماطم المرتبطة ببذور الطماطم من خلال الإنبات المسيطر عليها والزراعة المقارنة

ملخص

يجمع هذا البروتوكول بين تعقيم سطح البذور الموحد والإنبات المتحكم فيه لتمكين العزل القابل للتكرار لميكروبيوتا الطماطم المرتبطة ببذور الطماطم خلال الانتقال من البذرة إلى الشتلات. يعزز هذا النهج استعادة الكائنات الدقيقة القابلة للزراعة والتي لا تمثل تمثيلا كافيا في البذور الجافة ويدعم الدراسات الزراعية المقارنة خلال تطور الشتلات المبكر.

الملخص

يعد تعقيم الأسطح خطوة حاسمة لكنها غالبا ما تكون غير محسنة في الدراسات التي تهدف إلى عزل الكائنات الدقيقة المرتبطة بالبذور، حيث يمكن للعلاجات القاسية جدا أن تقلل أو تشوه مجموعات الميكروبات الداخلية. يقدم هذا البروتوكول نهجا قابلا للتكرار لعزل ميكروبيوتا الطماطم المرتبطة ببذور الطماطم القابلة للزراعة باستخدام ظروف تعقيم سطحية بناء على منهجيات تم التحقق منها سابقا، مع إنبات بذور مضبوط. بدلا من تعريف علاجات التعقيم المثالية عالميا، يطبق النهج ظروفا موحدة يمكن تعديلها وفقا لخصائص البذور مع تقليل التحيز والحفاظ على تجمعات الميكروبات الداخلية.

لتعزيز استعادة الكائنات الدقيقة القابلة للزراعة المرتبطة بالانتقال من البذرة إلى الشتلة، يتضمن البروتوكول خطوة إنبات محكمة قبل العزل الميكروبي. على عكس الأساليب التقليدية التي تعتمد على نقع البذور الجافة وغير المنبتة، فإن الإنبات المسيطر عليه يعزز تنشيط الميكروبات أثناء الانتقال من البذور إلى الشتلة في ظروف معقمة. كشفت التحليلات المقارنة القائمة على وحدة تكوين المستعمرات (CFU) للنسخ البيولوجية المكافئة، كل منها يتكون من مواد مجمعة من 3–5 بذور جافة أو 3–5 شتلات نبتة، عن تحول ملحوظ في المجتمع القابل للزراعة بعد الإنبات. الأجناس التي كانت ممثلة بشكل ضعيف في البذور الجافة أصبحت غنية بعد الإنبات، في حين انخفضت التمثيل النسبي للأنواع الأخرى التي كانت أكثر وفرة في البذور الجافة، مما دعم الدراسات حول التفاعلات المبكرة بين النبات والميكروبات أثناء تأسيس الشتلات.

عبر النسخ البيولوجية، تم إثراء أجناس مثل Stutzerimonas وStenotrophomonas وPriestia بشكل مستمر بين العزلات التي تم استردادها من الشتلات المنبتة، بينما بقي Paenibacillus وفيرا عبر الظروف لكنه أظهر تحولات ملحوظة في تركيب الأنواع على مستوى النوع. من خلال دمج ظروف التعقيم الموحدة مع الإنبات المسيطر عليها والتحليل المقارن للمواد الجافة والإنباتية، يوفر هذا البروتوكول إطارا قويا وقابلا للتكرار للعزل الزراعي للميكروبيوم المرتبط بالبذور ذو أهمية وظيفية محتملة خلال تطور الشتلات المبكر، ويدعم دراسات التفاعلات المبكرة بين النبات والميكروبات أثناء تأسيس الشتلات.

المقدمة

تضم البذور مجتمعات ميكروبية متنوعة تتكون من بكتيريا وفطريات مرتبطة بالأنسجة الداخلية والأسطح الخارجية ^1,2,3. تعرف هذه الكائنات الدقيقة بشكل متزايد كمكونات أساسية في علم الأحياء النباتي لأنها تستطيع التأثير على أداء النبات منذ مراحل النمو الأولى، بما في ذلك الإنبات، واستقرار الشتلات، والاستجابة للإجهاد الحيوي واللاحي ^1,2,3. من الناحية البيئية، تعمل البذور ليس فقط كمصادر لتكاثر النباتات، بل أيضا كخزانات للقيح الميكروبي، مما يجعلها نقطة دخول حاسمة لفهم كيفية بدء وصيانة الميكروبيومات المرتبطة بالنباتات عبر دورة حياة النبات ^1,2,3.

قد تشكل الكائنات الدقيقة المرتبطة بالبذور أول لقاح ميكروبي يواجهه النبات الناشئ، وبالتالي يمكنها المساهمة في تجميع الميكروبيوم خلال الانتقال من البذرة إلى الشتلة ^1,3,4. قد يؤثر هذا اللقاح المبكر على المجتمعات الميكروبية التي تستعمر الجذور وأقسام النبات الأخرى لاحقا، مع عواقب على تأسيس النبات والتفاعلات اللاحقة بين النبات^{والميكروبات 1،4}. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن ينتقل جزء من ميكروبيوتا البذور عموديا عبر هياكل تكاثرية مثل الأزهار والبويضات وحبوب اللقاح، مما يسمح باستمرار تجمعات الميكروبات عبر أجيال النباتات ^4,5. تشير هذه الاستمرارية بين الأجيال إلى أن بعض الكائنات الدقيقة المنقولة بالبذور قد تساهم باستمرار في لياقة وتكيف النبات.

وظيفيا، قد تؤثر الكائنات الدقيقة المرتبطة بالبذور على أداء المضيف من خلال عدة آليات، بما في ذلك إنتاج الهرمونات النباتية، والمركبات المضادة للميكروبات، وغيرها من المستقلبات النشطة بيولوجيا التي تعدل نمو النبات أو تثبط المنافسين والممرضين ^5,6,7. يبدو أن التجمعات الميكروبية المنقولة بالبذور تتعايش أيضا من خلال استخدام الموارد المختلف والتقسيم البيئي، مما يشير إلى أن البذرة تمثل موطنا انتقائيا بدلا من وعاء سلبي من التنوع الميكروبي⁷. تدعم هذه النتائج مجتمعة فكرة أن البذور تستضيف تجمعات ميكروبية قد تؤثر على تطور النبات المبكر وتمثل مرشحين للتوصيف الوظيفي^اللاحق 2,3,5,7.

لدراسة الكائنات الدقيقة المرتبطة بالبذور بطريقة مفيدة وظيفيا وقابلة للحل التجريبي، من الضروري استعادة تجمعات ميكروبية قابلة للحياة من مواد البذور. في هذا السياق، يوفر العزل الميكروبي وصولا إلى كائنات دقيقة حية يمكن توصيفها تجريبيا وتقييمها لاحقا في اختبارات لاحقة ذات صلة بتفاعلات النبات والميكروبات. وهذا مهم بشكل خاص في أنظمة البذور، حيث قد تساهم الكائنات الدقيقة المرتبطة بالبذور في التكاثر المبكر للنباتات وتمثل مرشحين للفحص الوظيفي والاستخدام المستقبلي.

استعادة الكائنات الدقيقة المرتبطة بالبذور حساسة للغاية لإجراءات تحضير العينات، خاصة تعقيم السطح، ومعالجة الأنسجة، ومرحلة تطور المادة المأخوذة. هذه الحساسية ذات صلة خاصة في أنظمة البذور لأن الكتلة الحيوية الميكروبية غالبا ما تكون منخفضة، والاختلافات الإجرائية الصغيرة يمكن أن تؤثر بشكل كبير على كل من عدد وحدات تكوين المستعمرات وتركيب المعزول. من بين هذه المتغيرات، يعد تعقيم الأسطح من أصعب والأكثر أهمية في التحسين. التعقيم ضروري لتقليل التلوث الهوائي قبل العزل الميكروبي، لكن التعرض المفرط للمعقمات يمكن أن يقلل من بقاء أو قابلية زراعة الكائنات الدقيقة الداخلية، بينما قد يسمح عدم كفاية التعقيم للأنواع المرتبطة بالسطح بالهيمنة على الثقافات اللاحقة ^8,9,10. وبناء عليه، فإن هدف التعقيم ليس تعظيم التعرض الكيميائي، بل تطبيق ألطف علاج يمنع التلوث السطحي بفعالية مع الحفاظ على الكائنات الدقيقة الداخلية القابلة للاسترداد ^5,11.

نظرا لأن كفاءة التعقيم تعتمد على نوع النبات، وبنية الأنسجة، وخصائص غلاف البذور، والمجتمع الميكروبي المرتبط، يجب اختيار البروتوكولات من منهجيات تم التحقق منها مسبقا ثم تكييفها بحذر مع النظام قيد الدراسة ^8,12,13. في المواد منخفضة الكتلة الحيوية مثل بذور الطماطم، يكون هذا التوازن مهما بشكل خاص: فقد يقلل الإفراط في التعقيم بشكل حاد من استعادة الميكروبات، بينما يؤدي نقص التعقيم إلى زيادة احتمال سيطرة الملوثات السطحية سريعة النمو على العازلات المحصولة. لهذا السبب، يجب التحقق من كفاءة التعقيم بشكل روتيني بدلا من افتراضها. يوفر طلاء ماء الشطف النهائي تحكما عمليا في التلوث الخارجي المتبقي، لكن يجب دائما تفسير هذا المكافحة مع التعافي الميكروبي من متجانسات البذور أو الشتلات. قد يكون البروتوكول الذي يوفر ضوابط شطف معقمة ولكن لا تحتوي على ميكروبيوم داخلي قابل للاسترداد إلا إذا كان الهدف هو العزل القارن للميكروبات بدلا من إزالة التلوث القصوى 6,8,10,14.

لذلك، تتطلب المقارنات ذات المعنى توحيدا إجرائيا قويا. في العينات منخفضة الكتلة الحيوية، يمكن أن تؤثر التناقضات في الغسل، والنقل، والتجانس، والتخفيف، والطبق، أو الحضانة على كل من الاسترداد الكلي للميكروبات والتمثيل الظاهر للأنواع الفردية. وهذا مهم بشكل خاص عند مقارنة المواد الجافة والإنبات، حيث يمكن بسهولة الخلط بين التغير المنهجي وتغير بيولوجي.

أحد القيود الرئيسية في العديد من بروتوكولات ميكروبيولوجيا البذور هو أنها تعتمد حصريا على البذور الجافة غير المنبات كمادة بداية. على الرغم من أن هذا يوفر أساسا مفيدا للنسبة الميكروبية الموجودة قبل تنشيط البذور، إلا أنه قد يقلل من تقدير الكائنات الدقيقة التي تكون خاملة، غير نشطة أيضيا، متجهدة، أو موجودة في البداية بكثافة نسبية منخفضة ^2,15.

في الحالة الجافة، تمثل البذور بيئة فسيولوجية هادئة حيث قد تبقى الأنسجة المضيفة والكائنات الدقيقة المرتبطة بها غير نشطة نسبيا. وبالتالي، قد لا تمثل التجمعات الميكروبية المستخرجة مباشرة من البذور الجافة بشكل كامل تلك التي تصبح أكثر قابلية للاسترداد بمجرد بدء الإنبات.

خلال الإنبات، تخضع البذور لامتصاص الماء، وإعادة تنشيط الأيض، وتحريك المغذيات، وإعادة تنظيم الأنسجة، وكلها تغير البيئة المحلية المتاحة للكائنات الدقيقة المرتبطة^11,16. يمكن لهذه التغيرات أن تعزز نمو الميكروبات، وتغير التمثيل النسبي للمجموعات الميكروبية، وتسهل اكتشاف أو استعادة الأنواع التي كانت نادرة سابقا أو لم يتم استعادتها بشكل جيد في البذور الجافة. بالإضافة إلى ذلك، يخلق ظهور الجذور حجرة نباتية جديدة قد تدعم تكاثر وإعادة توزيع الميكروبات، مما يجعل الانتقال من البذرة إلى الشتلة مرحلة مفيدة بشكل خاص للتحليل الميكروبيولوجي ^1,17.

لهذا السبب، توفر المعالجة المتوازية للبذور الجافة والشتلات المنبتة تصميما تجريبيا أكثر إفادة من تحليل البذور الجافة فقط. تؤسس البذور الجافة خط أساس للمجموعات القابلة للزراعة الموجودة قبل التنشيل، بينما تسمح المواد المنبات بتقييم مقارنة للأنواع التي تصبح أكثر قابلية للاسترجاع خلال التطور المبكر. يكون هذا النهج مفيدا بشكل خاص عندما لا يكون الهدف فقط توثيق الكائنات الدقيقة القابلة للاستعادة، بل أيضا تحديد الأنواع المرتبطة بالانتقال من البذور إلى الشتلة وإعطاء الأولوية للعزلات لتوصيفه لاحقا (الشكل 1).

الشكل 1: نظرة عامة مفاهيمية وإجرائية على سير عمل العزل المقارن. (أ) تمثيل مفاهيمي لحالة بذور الطماطم الجافة قبل الإنبات. (ب) التمثيل المفاهيمي لحالة بذور الطماطم المنبتة خلال الانتقال من البذرة إلى الشتلة. (ج) سير العمل التخطيطي للبروتوكول، بما في ذلك تعقيم سطح البذور، تقييم مكافحة الشطف، المعالجة المباشرة للبذور الجافة أو الإنبات المسيطر عليها، توحيد النسخ البيولوجية المجمعة، التخفيف والتلوين المتسلسل، القياس القياسي المعتمد على الوحدة المعتمدة على الفروع المعتمدة على الوحدات، استعادة العزلة، التعرف التصنيفي، والتحليل المقارن للمواد الجافة والإنبات. تشمل نقاط التحكم الحرجة التي تم تسليط الضوء عليها في سير العمل كفاءة التعقيم، والتكرارات البيولوجية المكافئة، وتحليل الطلاء المتسق وتحليل الوحدات التقلصية المعتمدة. تم إعداد اللوحتين A و B كرسوم توضيحية مفاهيمية بمساعدة الذكاء الاصطناعي للتمثيل البصري فقط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

نظرا لأن البروتوكول يهدف إلى مقارنة استرداد الميكروبات من المواد الجافة والإنبتية، فإن الاتساق المنهجي الصارم ضروري. يجب إجراء جميع المقارنات باستخدام نفس مجموعة البذور، وظروف التعقيم المتطابقة، ونفس وسط الزراعة، وإجراءات التخفيف والطلاء والحضانة المكافئة. بدون هذا المستوى من التوحيد القياسي، قد تعكس الفروقات الظاهرة بين العينات الجافة والنبتة تنوعا تقنيا بدلا من إثراء بيولوجي ذو معنى. وهذا مهم بشكل خاص في سير العمل العزلي، حيث يتشكل الجزء المستعاد بواسطة العينة البيولوجية والتأثيرات الانتقائية للإجراء التجريبي^{نفسه 4,15}.

التكاثر البيولوجي ضروري أيضا. قد تختلف الأنواع منخفضة الوفرة بين دفعات البذور، واستعادة الميكروبات من عينات منخفضة الكتلة الحيوية بطبيعتها عشوائية حتى في ظروف محكمة السيطرة بعناية. يوصى باستخدام خمسة نسخ بيولوجية مستقلة على الأقل لكل حالة للمقارنة القوية. في هذا السير العملي، يتكون كل تكرار بيولوجي من مواد مجمعة من 3–5 بذور جافة أو 3–5 شتلات نبتة تعالج كعينة واحدة. بالإضافة إلى ذلك، يجب إجراء جميع عمليات التعقيم بعد التعقيم في ظروف معقمة لتقليل التلوث الثانوي والحفاظ على قابلية تفسير مجموعة العزل الناتجة.

يجب أيضا اختيار مدة الإنبات بعناية. يجب أن تكون طويلة بما يكفي للسماح بظهور الجذور والتطور المبكر للشتلات، ولكن ليست طويلة جدا بحيث يدخل نمو النبات لاحقا تعقيدا بيئيا إضافيا لا علاقة له بالانتقال الفوري من البذور إلى الشتلات. بالنسبة للطماطم، توفر فترة إنبات تصل إلى 5 أيام في ظروف معقمة نافذة عملية تبقى فيها الشتلة مرتبطة ارتباطا وثيقا ببيئة البذرة بينما يمكن بالفعل أن يحدث تنشيط وإعادة توزيع الميكروبات المبكرة. التوقيت المتسق عبر التجارب أمر ضروري لأن الاختلافات في مرحلة النمو قد تؤثر بدورها على أنماط استعادة الميكروبات. هذا السير هو الأنسب لاستعادة الميكروبيوم القابلة للزراعة من أنظمة بذور منخفضة الكتلة الحيوية عندما يكون الهدف تقييم التحولات المرتبطة بالإنبات في ظروف موحدة. وهو أقل ملاءمة للتقدير المباشر لتنوع ميكروبيوم البذور الكلي أو للأنظمة التجريبية التي تتطلب مناهج مستقلة عن الزراعة لالتقاط المجتمع الميكروبي الأوسع.

هدف هذا البروتوكول هو توفير إطار قابل للتكرار لعزل ميكروبيوتا الطماطم المرتبطة ببذور الطماطم القابلة للزراعة من خلال دمج التعقيم السطحي الموحد مع الإنبات المضبوطة للبذور. تمكن الطريقة من التحليل المقارن للبذور الجافة والشتلات المنبات باستخدام نسخ بيولوجية مكافئة، كل منها يتكون من مواد مجمعة من 3–5 بذور جافة أو 3–5 شتلات نبتة، لتقييم التحولات المعتمدة على الإنبات في استعادة وحدة تكوين المستعمرة (CFU) والتركيب التصنيفي. من خلال تقليل تحيز التعقيم وتعزيز تعافي الميكروبات خلال الانتقال من البذرة إلى الشتلة، يسهل هذا النهج عزل الكائنات الدقيقة ذات الصلة الوظيفية المحتملة خلال تطور الشتلات المبكر ويدعم الدراسات اللاحقة للتفاعلات المبكرة بين النبات والميكروبات.

البروتوكول

1. تحضير المواد الكيميائية والوسائط والمواد المعقمة

1. حضر محلول إيثانول بنسبة 70٪ (v:v) باستخدام ماء مقطر معقم.
2. تحضير محلول عمل بنسبة 20٪ (v:v) من مبيض تجاري يحتوي على 5٪ هيبوكلوريت الصوديوم المتوفر عن طريق تخفيف 20 مل من المبيض في 80 مل من الماء المقطر المعقم.
3. حضر ماء مقطر معقم لخطوات الغسيل.
4. جهز NaCl معقم بنسبة 0.45٪ للتجانس والتخفيف التسلسلي، واستخدم هذا الحل باستمرار طوال سير العمل.
5. حضر وسط زراعة الأجار لوريا بيرتاني (LB) (لكل لتر: 10 جرام من التريبتون، 5 جرام من مستخلص الخميرة، 10 جرام من NaCl، و15 جرام من الأجار) وصب الصحون مسبقا تحت ظروف معقمة.
6. قم بتعقيم جميع الأدوات التي ستلامس البذور أو الشتلات بعد التعقيم، بما في ذلك الملقط، والمدقات، والناشرات، والمقصات، ورفوف الأنابيب، عن طريق التعقيم أو العلاج المعقم المعتمد.
7. رتب أطباق بتري المعقمة والأنابيب وأنوبات الماصات وأطباق الزراعة داخل غطاء تدفق طبقي قبل البدء في معالجة البذور.
   ملاحظة: نظرا لأن الكتلة الحيوية الميكروبية المرتبطة بالبذور قد تكون منخفضة، من المهم تقليل وقت التعامل غير الضروري وتجهيز جميع المواد قبل بدء التعقيم. التأخيرات بين المعالجات الكيميائية، الغسيل، الطلاء أو إعداد الإنبات قد تؤدي إلى تفاوتا في عملية التعافي. قد تستخدم مخازن عقمة بديلة في أنظمة تجريبية أخرى، لكن يجب الحفاظ على مخزن مؤقت واحد طوال أي تجربة مقارنة معينة. قد تدرج وسائط إضافية مثل Reasoner 2A (R2A) أو الوسائط الانتقائية في سير العمل الثقافي الموسع، لكن LB agar استخدم كوسيلة قياسية للبروتوكول المقارن الموضح هنا.

2. اختيار وتوزيع البذور

1. استخدم بذور من قطعة بذور طماطم واحدة لكل تجربة كلما أمكن.
   ملاحظة: في سير العمل التمثيلي الموضح هنا، تم استخدام بذور الطماطم من دفعة بذور واحدة من السيرة الذاتية. Money Maker خلال كل تجربة.
2. افحص البذور بصريا وتخلص من البذور التالفة، المكسورة، أو المشوهة بشكل واضح.
3. قسم البذور إلى مجموعات تجريبية مطلوبة للدراسة. على الأقل، خصص البذور إلى: عزل البذور الجافة بعد التعقيم، ثم الإنبات ثم عزل الشتلات.
4. إذا كان من المقرر اختبار أكثر من حالة تعقيم واحدة، قم بتوزيع البذور عشوائيا عبر علاجات التعقيم لتجنب التحيز العلاجي الناتج عن حجم أو حالة البذرة.
   ملاحظة: جميع المقارنات في المراحل النهائية تكون أقوى عندما تستند إلى نفس دفعة البذور المعالجة بالتوازي. يمكن تكييف سير العمل مع أنماط وراثية أو أصناف طماطم أخرى، لكن يجب إجراء أي مقارنة داخل التجربة باستخدام دفعة بذور واحدة تعالج بالتوازي.

3. تعقيم بذور الطماطم على السطح

1. انقل 3–5 بذور إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 2 مل داخل غطاء تدفق طبقي.
2. أضف 1 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ (v:v) إلى كل أنبوب لغمر البذور بالكامل.
3. حضن الأنابيب لمدة 5 دقائق مع خلط لطيف بواسطة دوار الأنابيب عند 25 دورة في الدقيقة.
4. أزل الإيثانول تماما باستخدام ماصة معقمة.
5. أضف فورا 1 مل من محلول الهيبوكلوريت الصوديوم العامل بنسبة 20٪ (v:v) إلى كل أنبوب لغمر البذور بالكامل.
6. حضن الأنابيب لمدة 10 دقائق مع تحريك خفيف بواسطة دوار الأنبوب عند 25 دورة في الدقيقة.
7. قم بإزالة محلول هيبوكلوريت الصوديوم بالكامل باستخدام ماصة معقمة.
8. اغسل البذور ثلاث مرات ب 1 مل من الماء المقطر المعقم في كل غسلة.
   1. لكل غسل، أضف ماء معقما، واخلط بلطف لمدة 30 ثانية، ودع البذور تستقر لمدة 30 ثانية إذا لزم الأمر، ثم أزل محلول الغسيل تماما قبل إضافة ماء معقم طازج.
9. احتفظ بماء الشطف النهائي من كل أنبوب للتحكم في كفاءة التعقيم.
10. انقل البذور المعقمة إلى أطباق بتري معقمة أو أنابيب معقمة، حسب ما إذا كانت ستتم معالجتها فورا كبذور جافة أو تستخدم للإنبات المحكم.
    تحذير: تعامل مع هيبوكلوريت الصوديوم باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة وقم بجميع الخطوات وفقا لإجراءات السلامة الكيميائية المؤسسية.
    ملاحظة: تم اختيار تسلسل هيبوكلوريت الإيثانول-الصوديوم المستخدم هنا كشرط عمل موحد لبذور الطماطم بناء على سير عمل التعقيم المعتمد سابقا. استخدم نفس ظروف التعقيم لجميع العينات المشمولة في تجربة مقارنة. إذا تم تقييم أكثر من نظام تعقيم واحد، قم بمعالجة كل علاج بالتوازي وقيم كفاءة التعقيم بشكل مستقل لكل حالة. تقليل الوقت بين الغسل النهائي والمعالجة النهائية لتقليل التفاوت في استعادة الميكروبات.

4. التحقق من كفاءة التعقيم

1. تحضير تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 مرات لماء الشطف النهائي في محلول NaCl معقم بنسبة 0.45٪ عن طريق نقل 100 ميكرولتر من ماء الشطف إلى 900 ميكرولتر من المخفف وتكرار نفس الخطوة بشكل متسلسل حتى ^10-4. ضع 100 ميكرولتر من كل تخفيف على أجار LB باستخدام نفس طريقة الطلاء المطبقة على التجانس الجاف والشتلات المنبتة.
2. حضن الصفائح عند 28 درجة مئوية لمدة 24–48 ساعة.
3. افحص الصفائح بحثا عن نمو المستعمرة بعد الحضانة.
4. سجل وجود أو غياب المستعمرات لكل تخفيف. إذا كانت هناك مستعمرات، قم بتسجيل مستوى التخفيف، وعدد المستعمرات التقريبي، وشكل المستعمرات المرئي.
   ملاحظة: استخدم نفس حجم الطلاء وصيغة الطلاء طوال التجربة للسماح بالمقارنة المباشرة بين ضوابط الشطف والعينات البيولوجية. إذا لم يتم اكتشاف أي مستعمرات في ألواح التحكم بالشطف غير المخففة أو الأقل تخفيفا، سجل العينة على أنها لا تحتوي على نمو قابل للكشف تحت ظروف الزراعة المستخدمة.

5. معالجة البذور الجافة (غير المنبتة)

1. نقل مجموعات مجمعة من 3–5 بذور جافة معقمة، تتوافق مع نسخة بيولوجية واحدة، إلى أنابيب طرد مركزي دقيق معقمة بسعة 2 مل تحتوي على 1 مل من البذور المعقمة بنسبة 0.45٪ NaCl.
2. قم بتجانس البذور باستخدام مدقة معقمة قابلة للتخلص منها حتى تتضرر أنسجة البذور بشكل واضح ولا تبقى هياكل بذور سليمة.
3. الدوامة المتجانسة لمدة 30 ثانية لإعادة تعليق الخلايا الميكروبية بشكل متساو.
4. تحضير تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 مرات من المتجانس في NaCl معقم بنسبة 0.45٪ عن طريق نقل 100 ميكرولتر من التجانس إلى 900 ميكرولتر من المخفف لأول مرة وتكرار نفس النسبة بشكل متسلسل حتى ^10-6.
5. وضع لوحة بحجم 100 ميكرولتر من التخفيفات المختارة على أجار LB باستخدام الطلاء المنتشر.
6. حضن الصفائح عند 28 درجة مئوية لمدة 24–72 ساعة.
7. اختر الصفائح التي تتوافق مع نطاق التخفيف الذي ينتج مستعمرات معزولة وقابلة للعد لتقدير CFU في الأسفل واستعادة العزل.
8. سجل إجمالي عدد المستعمرات، ونماذج المستعمرات المرئية، وأي اختلافات في نمط النمو بين النسخ المكررة.
   ملاحظة: إجراء معالجة البذور الجافة بالتوازي مع عينات الشتلات المنبتة باستخدام نفس وسط الزراعة، ونظام التخفيف، وحجم الطبق، وظروف الحضانة. تم استخدام LB agar كوسيلة قياسية لسير العمل المقارن الموضح هنا. قد يتم دمج وسائط إضافية في سير عمل العزل الممتد عندما تكون هناك حاجة لاستعادة أوسع لأنواع بطيئة النمو.

6. الإنبات المحورية للبذور المعقمة

1. ضع البذور المعقمة على دعم إنبات معقم، مثل صفائح موراشيغي وسكوغ (MS) الأجار.
2. وزع البذور بشكل متساو لتجنب ملامسة الشتلات الناشئة.
3. ألواح ختم باستخدام فيلم ختم مختبر أو مادة معادلة تقلل التلوث الخارجي مع السماح بالإنبات الطبيعية.
4. حضن الصفائح أفقيا عند 25 درجة مئوية في الظلام.
5. السماح للبذور بالإنبات تحت ظروف معقمة حتى يصبح التكوين المبكر للجذور واضحا؛ في التجربة التمثيلية، كان هذا يعادل 5 أيام من الحضانة.
6. افحص الألواح بانتظام بحثا عن علامات التلوث، أو الإنبات غير الطبيعية، أو التكثف الزائد.
   ملاحظة: يجب الحفاظ على ثبات شروط الإنبات بين النسخ المتكررة. قد يؤدي التفاوت في مدة الإنبات أو مرحلة الشتلة إلى تغيير التعافي الميكروبي بغض النظر عن التأثير الذي يتم دراسته. يمكن استخدام دعامات إنبات معقمة أخرى، بما في ذلك ألواح الفيتوجار أو ورق الترشيح الرطب المعقم، في سير العمل المخصص، بشرط أن يبقى الدعم ثابتا في كل تجربة. قد تستخدم اتجاهات بديلة للألواح في الحضانة، حسب وعاء الإنبات، لكن يجب الحفاظ على التوجيه ثابتا داخل التجربة. (نقطة توقف) يمكن الاحتفاظ بالشتلات المنبات لفترة وجيزة عند 4 درجات مئوية قبل المعالجة إذا لزم الأمر، لكن يفضل المعالجة الفورية كلما أمكن.

7. عزل الكائنات الدقيقة من الشتلات المنبتة

1. اجمع الشتلات المنبتة باستخدام ملقط معقم داخل غطاء تدفق طبقي.
2. نقل المواد المجمعة من 3–5 شتلات نبتة، تتوافق مع نسخة بيولوجية واحدة، إلى أنابيب طرد مركزي دقيق معقمة بسعة 2 مل.
3. أضف 1 مل من NaCl المعقم بنسبة 0.45٪ لكل أنبوب.
4. قم بتجانس المادة المجمعة للشتلات بشكل كامل باستخدام مدقة معقمة قابلة للاستخدام مرة واحدة، مع ضمان تضمين كل من الجذر الناشئ والأنسجة المتبقية المرتبطة بها، حتى تتضرر الأنسجة بشكل واضح.
5. الدوامة متجانسة لمدة 30 ثانية لإطلاق وتعليق الخلايا الميكروبية بشكل متساو.
6. تحضير تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف للمتجانس في NaCl معقم بنسبة 0.45٪ عن طريق نقل 100 ميكرولتر من التجانس إلى 900 ميكرولتر من المخفف لأول تخفيف وتكرار نفس النسبة بالتتابع حتى ^10-4.
7. وضع لوحة بحجم 100 ميكرولتر من التخفيفات المختارة على LB Agar باستخدام القطاع، وطلاء إسقاط.
8. حضن الصفائح عند 28 درجة مئوية لمدة 24–72 ساعة. سجل إجمالي عدد المستعمرات، وأنماط المستعمرات المرئية، والفروقات بالنسبة لعينات البذور الجافة.
   ملاحظة: عرف نسخة بيولوجية واحدة كمادة مجمعة من 3–5 شتلات نبتة، وأعالج جميع النسخ بالتوازي باستخدام نفس نظام التخفيف، حجم الطبق، وسط الزراعة، وظروف الحضانة. يشمل كل من نسيج البذرة المتبقي والجذر الناشئ في التجانس للحفاظ على الاتساق عبر عينات الشتلات المنبتة.

8. عد المستعمرات واستعادة العزل

1. بعد الحضانة، اختر صفائح التخفيف التي تنتج مستعمرات قابلة للعد ومنفصلة جيدا. استخدم ألواح تحتوي على 30–300 مستعمرة لتقدير الوحدة المعتمدة من الكلمات.
2. عد المستعمرات على الألواح المختارة وحساب CFU لكل نسخة بيولوجية باستخدام الصيغة التالية:
   وحدة الزراعة المعتمدة لكل تكرار = (عدد المستعمرات × عامل التخفيف)/حجم مطلي (مليلتر)
   1. إذا تم استخدام أكثر من صفيحة واحدة من نفس التخفيف، احسب متوسط عدد المستعمرات لذلك التخفيف قبل تطبيق الصيغة.
3. سجل شكل المستعمرة باستخدام أوصاف موحدة، بما في ذلك الحجم، الشكل، اللون، الحافة، الارتفاع، والشفافية.
4. اختر مستعمرات للعزل في المراحل النهائية لتقليل تحيز العينة. اختر جميع الأنماط المميزة عندما تكون أعداد المستعمرات منخفضة، أو اختر عشوائيا عدة مستعمرات عبر الصفائح عندما تكون أعداد المستعمرات مرتفعة.
5. ضع المستعمرات المختارة على أطباق LB Agar طازجة للحصول على الثقافات النقية.
6. كرر إعادة التشكيل حتى تظهر كل وحدة شكل مستعمرة متجانس على اللوحة.
   ملاحظة: أبلغ بوضوح عما إذا كانت قيم CFU معبرا عنها لكل نسخة بيولوجية، لكل وحدة كتلة حيوية، أو باستخدام نهج تطبيع آخر. إذا تم تطبيق طرق تطبيع إضافية، بما في ذلك التطبيع القائم على الكتلة الحيوية، صف طريقة الحساب صراحة في قسم تحليل البيانات.

9. حفظ العازلات المنقاة

1. قم بتلقيح المستعمرات النقية في وسط زراعة LB السائل وحضن حتى يتم الحصول على نمو مرئي.
2. امزج الزراعة (1:1، v:v) مع جليسرول معقم بنسبة 80٪ وفقا للممارسة الميكروبيولوجية القياسية.
3. تخزين البرود عند -80 درجة مئوية.
4. حافظ على سجل رقمي لكل عزلة، بما في ذلك أصل العينة، وعدد النسخ، والحالة (بذور جافة أو شتلة نبتة)، ومعالجة التعقيم، وتاريخ العزل، ووسط الصفيحة، وشكل المستعمرة، وحالة التعريف في المراحل النهائية.
   ملاحظة: البيانات الوصفية الدقيقة للعزلة ضرورية إذا كان من المقرر ربط أنماط الإخصاب بمرحلة البذرة أو المعالجة أو التكرار البيولوجي.

10. التعرف الجزيئي للعزلات

1. استخلاص الحمض النووي الجيني من المزارع البكتيرية المنقاء باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي البكتيري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. تضخيم جين 16S rRNA البكتيري باستخدام منطقة المتغيرات الفائقة V5-V8 أو جين rRNA 16S شبه كامل الطول.
   1. لتضخيم منطقة V5–V8 (~700 bp)، استخدم البادئات 799F (5′-AACMGGATTAGATACCCKG-3′) و1392R (5′- ACGGGCGGTGTGTGTRC-3′).
   2. لتضخيم جين 16S rRNA شبه كامل الطول (~1500 بيت)، استخدم البادئات 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) و1492R (5′-GGTTACCTTTACGACTT-3′).
   3. تحضير كل تفاعل تفاعل بوليميراز متسلسل (PCR) في حجم نهائي 25 ميكرولتر باستخدام خليط PCR الرئيسي، و0.4 ميكرومولار من كل برايمر، و1 ميكرولتر من الحمض النووي للقالب.
   4. تشغيل جهاز دورة حراري تحت الشروط التالية: إزالة الطبيعة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ 40 دورة إزالة طبيعية عند 95 درجة مئوية لمدة 3 ثوان، وتلدين عند 45 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين؛ تلاها تمديد أخير عند 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. أدرج تحكم بدون قالب في كل عملية PCR.
3. تحقق من منتجات PCR عن طريق الرحلان الكهربائي على جل أغاروز بنسبة 1٪ وتصور الأمبليكونات باستخدام نظام الرحلان الكهربائي والتصوير الهلامي.
4. قم بتنقية منتجات PCR باستخدام مجموعة تنظيف PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتقديم المضخمات المنقاة لتسلسل سانجر.
5. فحص الجودة، والقص، وتجميع التسلسلات الناتجة عند الحاجة.
   1. قارن كل تسلسل مع قاعدة بيانات النيوكليوتيدات التابعة للمركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) باستخدام إعدادات BLASTn (إعدادات Megablast لتسلسلات متشابهة جدا).
   2. استخدم الضربة الأكثر دعما لتعيين التصنيف. تعيين العزلات على مستوى الجنس عندما تظهر أفضل إصابة تغطية محاذاة كافية وهوية تسلسل لا تقل عن 94.5٪.
   3. استخدم التعيين المبدئي على مستوى النوع فقط عندما تظهر أفضل نتيجة هوية تسلسلية لا تقل عن 98.7٪، وتغطية استعلام عالية، ولا توجد تطابقات متضاربة بين الأنواع ذات الصلة القريبة.
   4. إذا فشل التضخيم المتكرر أو كانت جودة التسلسل غير كافية، سجل العزل كغير محدد. نظرا لأن تشابه 16S rRNA وحده قد لا يحل الأنواع البكتيرية المتقاربة، تعامل مع جميع التعيينات على مستوى النوع كأنها مؤقتة وأكدها من خلال تحليلات تطورية أو جينومية عند الحاجة.
6. تقرير عن عزل الهوية عند أعلى دقة تصنيفية مدعومة. استخدم هذه التعريفات للتحقق من صحة التجميع القائم على الشكل ولإعطاء الأولوية للعزلات الممثلة للتحليلات الجينومية والوظيفية في المراحل اللاحقة.
   ملاحظة: تهدف خطوة التعريف الجزيئي هذه إلى دعم تصنيف العزل واختيار السلالات التمثيلية. لا ينبغي استخدامه للاستنتاج بنية المجتمع أو أنماط الوفرة الكمية عبر العلاجات.

11. تحليل البيانات

1. قم بالتجربة مع وجود خمسة نسخ بيولوجية على الأقل لكل حالة.
   ملاحظة: في هذا السير العمل، يتكون كل تكرار بيولوجي من مواد مجمعة من 3–5 بذور جافة أو 3–5 شتلات نبتة تعالج كعينة واحدة.
2. لكل حالة، قم بقياس: (1) إجمالي استعادة الميكروبيوم القابل للزراعة (CFU)، (2) عدد نماذج المستعمرات المرئية، (3) عدد العزلات المنقاة، و(4) التركيب التصنيفي للميكروبيوم القابل للزراعة المستعاد على مستوى الجنس، وعند الضرورة، على مستوى النوع.
3. مقارنة عينات البذور الجافة والشتلات المنبات لتقييم التغيرات المعتمدة على الإنبات في التعافي الكلي والتركيب التصنيفي.
4. احسب التمثيل النسبي لكل تصنيف كنسبة مئوية إجمالي وحدات CFU المستردة تحت كل شرط. احسب تغيرات الطي باستخدام قيم CFU المطلقة.
5. تحليل البيانات الكمية باستخدام برنامج تحليل إحصائي مناسب (مثل GraphPad Prism [v11.0.2]). أبلغ عن البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD).
   1. للمقارنات الزوجية بين عينات البذور الجافة وعينات الشتلات المنبتة، استخدم اختبار t الطالب ذو الذيلين عندما تفي البيانات بافتراضات الطبيعية.
   2. عندما لا تتحقق هذه الافتراضات، استخدم اختبار مان–ويتني U. انظر إلى الفروق ذات الدلالة الإحصائية عند p < 0.05.
6. أبلغ بوضوح عما إذا كانت كل قيمة معروضة تتوافق مع وحدات CFU المطلقة، أو النسب النسبية المشتقة من CFU، أو تغييرات الطي المحسوبة من قيم CFU المطلقة.
   ملاحظة: استخدم نفس معايير الحساب طوال الدراسة للسماح بالمقارنة المباشرة بين عينات البذور الجافة والعينات التي نبتت من الشتلات. عند عرض التركيب التصنيفي، أوضح صراحة ما إذا كانت القيم معروضة على مستوى الجنس أو على مستوى النوع.

12. نقاط التحكم في الجودة الحرجة وحل المشكلات

1. الشطف النهائي المعقم لا يثبت بمفرده أن نظام التعقيم المختار هو الأمثل للهدف التجريبي. الحد من التلوث الخارجي مع الحفاظ على استعادة الكائنات الدقيقة القابلة للزراعة من الجزء الداخلي أو المرتبط بالبذور بشكل وثيق. تفسير نتائج مكافحة الشطف مع استعادة الميكروبات من البذور الجافة والمتجانسة للشتلات المنبتة.
2. قد يشير انخفاض الاسترداد من العينات الجافة والإنبات إلى الإفراط في التعقيم، أو التجانس الشديد القاسي، أو ظروف الزراعة غير المناسبة، أو تأخر معالجة العينات. في هذه الحالات، تحقق من تطبيق أوقات التعقيم بشكل متسق، والتأكد من أن تعطيل الأنسجة كان كافيا وليس مفرطا، وضمان أن التخفيف، والطبق، والحضانة تم إجراء فورا وتحت نفس الظروف عبر العينات.
3. قد يشير التلوث العالي في أنظمة مكافحة الشطف، أو النمو السريع لعدد قليل من أنواع المستعمرات، إلى تعقيم غير كاف أو تلوث أدخل أثناء التعامل بعد التعقيم. في هذه الحالات، راجع توقيت التعقيم، وخطوات الغسيل، والتعامل مع العزل المعقم، وتنظيم المواد داخل غطاء التدفق الطبقي قبل تكرار التجربة.
4. تفسير الفروقات بين العينات الجافة والإنبات بيولوجيا فقط عندما يتم توحيد مرحلة الإنبات، وبنية التكرار البيولوجي، ووسط الزراعة، ونظام التخفيف، وحجم الطبق، وظروف الحضانة عبر التجربة.
5. عند العمل مع مواد بذور منخفضة الكتلة الحيوية، قد يعكس غياب أنواع معينة في حالة معينة أيضا نقص في أخذ عينات بدلا من غياب حقيقي. لهذا السبب، قم بإجراء معالجة تكرارية متسقة وتحديد مستوى العزل لتفسير التحولات المرتبطة بالانبات بشكل قوي.

13. حفظ العينات لطرق أخرى

1. بعد التحقق من كفاءة التعقيم وقبل الطلاء المعدني، انقل 200 ميكرولتر إضافي من كل ذرة جافة أو متجانسة لشتلة نبتة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 1.5 مل.
2. ضع علامة على كل أنبوب بنوع العينة، وعدد النسخ البيولوجي، وحالة العلاج، وتاريخ الجمع.
3. جمد الأليكوات فورا وخزنها عند -80 درجة مئوية حتى تستخدم في التحليلات اللاحقة.
4. استخدم المادة المتجانسة المخزنة لطرق تكميلية مثل التحليلات القائمة على الحمض النووي، أو الاختبارات المجهرية، أو تجارب التأكيد التي تتطلب نفس التكرار البيولوجي الابتدائي.
   ملاحظة: تخزين الأليكوات قبل التخفيف والتلوين التسلسلي للحفاظ على التركيب المتجانس الأصلي. تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان من خلال إعداد تحليلات منفصلة عند التخطيط لعدة تحليلات لاحقة.

النتائج

أداء تعقيم الأسطح والتحكم في التلوث الخارجي
أدى تعقيم السطح باستخدام ظروف موحدة بناء على منهجيات تم التحقق منها سابقا إلى تقليل فعال للتلوث الميكروبي الخارجي مع الحفاظ على استعادة الكائنات الدقيقة القابلة للزراعة من المواد المشتقة من البذور. أظهر طلاء ماء الشطف النهائي عدم وجود نمو مستعمرة قابل للكشف، مما يشير إلى إزالة فعالة للكائنات الدقيقة المرتبطة بالسطح تحت الظروف المستخدمة.

ومن المهم أن غياب النمو الميكروبي في عمليات التحكم بالشطف لم ...

المناقشة

تظهر النتائج المعروضة هنا أن دمج التعقيم السطحي الموحد مع الإنبات المتحكم فيه بالبذور يوفر إطارا قويا للعزل الثقافي للميكروبيوم المرتبطة بالبذور. أحد النتائج الرئيسية لهذا البروتوكول هو القدرة على تحقيق التوازن بين إزالة الملوثات الخارجية بفعالية والحفاظ على تجمعات الميكروبات الداخلية. هذا التوازن ضروري في الدراسات القائمة على الزراعة، حيث يمكن أن يقلل التعقيم الصارم المفرط من استعادة الميكروبات، بينما يمكن أن يؤدي عدم كفاية التعقيم إلى حدوث تحيز من خلال تكاثر الك...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Agar	Sigma-Aldrich	01916-500G	مكون من وسط LB الهلامي؛ 15 غ/ل.
Autoclave	Lab1st	SV120H	يُستخدم لتعقيم الأدوات/المواد أو التحقق من صحة المعالجة العقيمة.
Bacteria DNA extraction kit	Promocell	PK-MB708-206-100	استخراج الحمض النووي
Colony counting/recording setup	OCS	B079Y5W57N	مطلوب لتسجيل CFUs، وأشكال الخلايا، واختلافات اللوحات؛ لم يحدد المخطوط نوع/طراز العداد.
Cryostorage vials	Sigma-Aldrich	Z359033	مقترحة لتخزين مخزونات الجليسرول في -80 درجة مئوية؛ لم يتم تسميتها صراحة ولكنها مطلوبة لخطوة الحفظ.
Digital isolate record system	Not specified in manuscript	Not applicable	يُستخدم لتسجيل البيانات الوصفية للعزلات: الأصل، المكرر، الحالة، معالجة التعقيم، تاريخ العزل، وسط اللوحة، التشكل، حالة التعريف.
Ethanol	VWR	83813440	يُستخدم لتحضير محلول الإيثانول بنسبة 70٪ م/م لتعقيم سطح البذور.
Filter paper	Fisher Scientific	11718772	بديل اختياري لدعم الإنبات.
Forceps/Tweezers	Sigma-Aldrich	930229	يُستخدم لنقل البذور وجمع الشتلات المنتفخة.
Genomic DNA extraction kit	PromoCell	PK-MB708-206-100	يُستخدم لاستخراج الحمض النووي الجينومي من مزارع البكتيريا النقية؛ لم يتم تحديد الطقم/الطريقة بالتحديد.
Glycerol, sterile 80%	VWR	24388364	يُمزج بنسبة 1:1 م/م مع الثقافة السائلة لتحضير المخزون الجليسيولي.
Laminar flow hood Bio48	Faster	LAB-CAP-22	مطلوب للتعامل مع البذور العقيمة، وعمليات نقل التعقيم، وتحضير المواد المعقمة.
LB agar medium	VWR	846495000	الوسط القياسي المستخدم في التثقيف المقارن؛ لكل لتر: 10 غ من التربتون، 5 غ من مستخلص الخميرة، 10 غ من كلوريد الصوديوم، 15 غ من الأغار.
Microcentrifuge tubes	Ratiolab	RATI5615000	يُستخدم لتعقيم البذور ومعالجة العينات.
MS medium	Sigma	M0404-10L	تم ذكره كدعم تعقيم عقيم لإنبات وحيد الخلية.
NZYTaq II 2× Master mix	Nzytech	MB35803	خليط PCR للتضخيم
Parafilm	Parafilm/Merck	HS234526A	يُستخدم لإغلاق ألواح الإنبات مع تقليل التلوث.
Petri dishes	Labbox	PDIP-E9N-500	يُستخدم لإعداد الإنبات، والزراعة، والتعامل مع البذور المعقمة.
Phytoagar	Duchefa Biochemie	9002-18-0	تم ذكره كدعم تعقيم عقيم بديل اختياري.
Pipettes set and tips	Merck	EP3123000918-1EA	يُستخدم لإزالة محاليل التعقيم، والغسل، والتخفيف، والزراعة.
R2A agar medium	HI-MEDIA	M1743-500G	وسط إضافي اختياري لتدفقات زراعة ممتدة.
Sodium chloride, NaCl	Fisher Chemical	10040460	يُستخدم لتحضير كلوريد الصوديوم العقيم بنسبة 0.45٪ للتجانس والتخفيف التسلسلي؛ أيضًا جزء من وسط LB.
Sodium hypochlorite	Carlo Erba	370323	يُستخدم لتحضير محلول هيبوكلوريت الصوديوم بنسبة 20٪ م/م لتعقيم سطح البذور. مسبب للتآكل؛ يتطلب معدات حماية شخصية.
Sterile disposable pestles	Eppendorf	EP0030120973	يُستخدم لتفتيت البذور الجافة والشتلات المنتفخة.
Vortex mixer	Fisher Scientific	15901137	يُستخدم لإعادة تعليق الخلايا الميكروبية من المستحلبات.