تقيم هذه الدراسة تعبير miR-21-5p، وارتباطه بجزيء التصاق الخلايا 1، وعلاقاته بالهجرة، والتكاثر، وتعبير مؤشرات الالتهاب، والبقاء على قيد الحياة في أنسجة وسلالات خلايا سرطان الرئة غير صغير الخلايا.
مقالة بحثية
محور miR-21-5p وجزيء التصاق الخلية 1 في تطور وسير مرض سرطان الرئة غير صغير الخلايا
28 مشاهدة
⸱
سبتمبر 11, 2026
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تشير الأدلة إلى أن miR-21-5p يعد منظماً جزيئياً هاماً في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). جزيء التصاق الخلايا 1 (CADM1) هو كابت محتمل للأورام، ولكن العلاقة التنظيمية بين miR-21-5p و CADM1 لا تزال غير واضحة في تطور سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). وقد استُخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (qRT-PCR) للكشف عن تعبير miR-21-5p و CADM1 في أنسجة وخلايا سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)؛ وارتباط miR-21-5p بالهدف و CADM1 تم التحقق من ذلك بواسطة مقايسة الجين المراسل لـ luciferase المزدوج؛ وكُشف عن قدرة الخلايا على الهجرة بواسطة مقايسة Transwell؛ كما جُمعت البيانات السريرية المرضية وتحليل البقاء على قيد الحياة لاستكشاف الأهمية السريرية لـ miR-21-5p؛ وحُلل الإثراء الوظيفي للجينات المستهدفة لـ miR-21-5p عن طريق المعلوماتية الحيوية. كان تعبير miR-21-5p في أنسجة سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) أعلى بكثير منه في الأنسجة الطبيعية المجاورة، وكان المرضى الذين يعانون من تعبير مرتفع لـ miR-21-5p لديهم فترة بقاء إجمالية أقصر. يعد التعبير المرتفع لـ miR-21-5p عامل خطر مستقل للبقاء على قيد الحياة لمرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا؛ وقد أدى الإفراط في تعبير miR-21-5p إلى تعزيز هجرة الخلايا في خلايا سرطان الرئة غير صغير الخلايا وزيادة تعبير العوامل الالتهابية؛ وأكدت مقايسة الجين المراسل لـ luciferase المزدوج أن miR-21-5p استهدف بشكل مباشر CADM1الإفراط في تعبير CADM1 ثبّط هجرة الخلايا في خلايا سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) وخفّض من تعبير العوامل الالتهابية؛ وأظهر تحليل المعلوماتية الحيوية أن الجينات المستهدفة لـ miR-21-5p كانت غنية في مسارات تأشير متعددة مرتبطة بحدوث الورم وتطوره. يعز miR-21-5p تطور سرطان الرئة غير صغير الخلايا عن طريق استهداف وتثبيط CADM1 وقد يكون بمثابة مؤشر حيوي إنذاري وهدف علاجي.
المقدمة
يصنف سرطان الرئة عالمياً كأحد الأسباب الرئيسية للوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم، مع ارتفاع معدلات الإصابة به بشكل مستمر1,2. ومن بين سكان شرق آسيا، تصل معدلات الإصابة والوفيات بسبب سرطان الرئة إلى 22.1 و 15.5 لكل 10,0 رجل، مقابل 158.1 و 87.3 لكل 10,0 امرأة، على التوالي. ويمثل سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) حوالي 80% من جميع أورام الرئة الخبيثة ويشمل ثلاثة أنواع نسيجية فرعية رئيسية3. وبالمقارنة مع سرطان الرئة صغير الخلايا (SCLC) شديد العدوانية، فإن سرطان الرئة غير صغير الخلايا يتطور وينتشر بشكل أبطأ؛ ومع ذلك، تؤدي الأعراض السريرية المبكرة غير الواضحة إلى تشخيص أكثر من 75% من المرضى في مراحل متوسطة أو متقدمة، مما يساهم في استمرار انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة الإجمالي لمدة 5 سنوات4. وتحدث عملية تكوين أورام الرئة بفعل التنشيط الجيني المسرطن وإسكات الجينات الكابتة للأورام5، مما يسلط الضوء على الحاجة الملحة لتحليل الأسس الجزيئية لسرطان الرئة غير صغير الخلايا من أجل تطوير علاجات مبتكرة6.
توسط جزيئات MicroRNAs (المعروفة بـ miRNAs، ويتراوح طولها بين 18 و25 نيوكليوتيدة) عملية كبح الجينات بعد عملية النسخ عن طريق الارتباط بالمنطقة 3′ غير المترجمة (3′-UTR) لـ mRNAs المستهدفة، مما يؤدي إلى تحفيز تثبيط الترجمة أو تحلل mRNA7. يبدأ التخليق الحيوي لـ miRNAs بنسخ RNA polymerase II لتوليد نسخ miRNA أولية، والتي يتم شطرها بعد ذلك بواسطة إنزيمات RNase III لتكوين miRNAs طليعية على شكل دبوس شعر (pre-miRNAs)8. وبينما تعمل معظم جزيئات miRNAs على كبح التعبير الجيني عبر التكامل الجزئي أو الكلي للتسلسل مع 3′-UTRs لـ mRNA، يمكن لبعض جزيئات miRNAs تعزيز ترجمة mRNA في سياقات محددة من دورة الخلية9. وحتى الآن، تم تحديد المئات من miRNAs البشرية التي تتحكم في العمليات البيولوجية الأساسية بما في ذلك تكاثر الخلايا، والتمايز، والموت الخلوي المبرمج10. سابقاً، كان الكشف عن miRNAs ذات التعبير غير الطبيعي يمثل تحدياً تقنياً؛ إلا أن ظهور التسلسل عالي الإنتاجية قد مكّن من التوصيف السريع وغير المنحاز لـ miRNAs المختلة في الأنسجة المرضية1. نركز هنا على miR-21-5p، وهو أحد أوائل miRNAs الموصوفة التي يتم نسخها بواسطة RNA polymerase II، والتي تخضع وظائفها التنظيمية المسرطنة لاستقصاء مكثف12.
يتم تشفير miR-21-5p ضمن إنترون من جين TMEM49، ويظهر تعبيراً مفرطاً بشكل مستمر في العديد من الأورام الخبيثة البشرية، بما في ذلك سرطانات المريء، والقولون والمستقيم، والرئة13. وتؤكد البيانات قبل السريرية المتاحة حول سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) نشاطه المسرطن: حيث يؤدي ارتفاع miR-21-5p إلى تسريع تكاثر الورم، والانتقال الظهاري المتوسط (EMT)، والانبثاث البعيد من خلال إسكات أهداف مضادة للتسرطن مثل PTEN وPDCD414. ومع ذلك، ركزت الأعمال السابقة إلى حد كبير على إشارات الموت الخلوي المبرمج والتكاثر التي يحفزها miR-21، وقليل من التقارير بحثت بشكل منهجي في المحور التنظيمي miR-21-5p/CADM1 في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)15. ويُعد جزيء التصاق الخلايا 1 (CADM1) كابحاً معروفاً للأورام في مختلف السرطانات الظهارية16؛ إذ يحافظ على الالتصاق بين الخلايا لمنع انفصال الخلايا الورمية والانتشار الانبثاثي، ويرتبط انخفاض تعبيره بمرحلة الورم المتقدمة وسوء معدلات البقاء على قيد الحياة في مجموعات المرضى المصابين بسرطان الرئة غير صغير الخلايا. ومن الناحية الميكانيكية، يعمل CADM1 أيضاً على كبح إشارات الالتهاب المسرطنة لـ العامل النووي كابا B (NF-κB)، والتي تغذي الانبثاث عن طريق تحفيز إفراز السيتوكينات المسببة للالتهابات وإعادة تشكيل البيئة الدقيقة للورم17. وعلى الرغم من التوثيق المنفصل للنشاط المسرطن لـ miR-21-5p والتأثيرات الكابحة للأورام لـ CADM1، لا تزال هناك ثلاث فجوات معرفية حرجة فيما يخص محور miR-21-5p/CADM1 في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC): أولاً، يفتقر الارتباط المباشر وتثبيط CADM1 بواسطة miR-21-5p إلى التحقق التجريبي في خلايا سرطان الرئة؛ ثانياً، لا يزال من غير المحدد ما إذا كان هذا المحور يدفع الأنماط الظاهرية الخبيثة عبر مسارات التهابية تالية؛ ثالثاً، لم يتم تقييم القدرة التنبؤية الإنذارية لبصمات التعبير المشترك miR-21-5p/CADM1 في عينات سريرية من سرطان الرئة غير صغير الخلايا.
بناءً على هذه الأسئلة التي لم يتم الإجابة عليها، نقترح فرضية ميكانيكية مركزية: أن زيادة تعبير miR-21-5p في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) ترتبط مباشرة بمنطقة 3′-UTR لـ CADM1 لتثبيط تعبير CADM1، مما يؤدي إلى تحرير إشارات الالتهاب النقيلية التي يثبطها CADM1، وبالتالي تسريع هجرة خلايا NSCLC وتؤدي إلى إنذار سريري سيئ. تهدف هذه الدراسة إلى تحقيق ثلاثة أهداف بحثية محددة مسبقاً: (1) التحقق من الاستهداف الجزيئي المباشر لـ CADM1 بواسطة miR-21-5p وتقييم الهجرة في خطوط خلايا NSCLC من نوع A549 وH129؛ (2) توضيح ما إذا كان تسلسل miR-21-5p/CADM1 ينظم القدرة النقيلية من خلال نقل الإشارات الالتهابية؛ (3) تقييم القيمة الإنذارية السريرية لبصمة تعبير miR-21-5p/CADM1 لتحديد مؤشرات حيوية تشخيصية جديدة ومرشحات علاجية لسرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) النقيلي.
البروتوكول
تمت مراجعة هذه الدراسة الاستعادية والموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى Quzhou للطب الصيني التقليدي (رقم الموافقة 20240208). وقد تم الحصول على موافقة مستنيرة مكتوبة من كل مريض مسجل أو من ولي أمره القانوني قبل جمع العينات.
جمع العينات
تم استئصال أنسجة أورام سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) الأولية جراحياً من المرضى المشاركين، بينما جُمعت أنسجة الرئة الطبيعية المجاورة المطابقة لهم بأثر رجعي من المركز الوطني للهندسة البحثية للخزعات السريرية (مدينة Quzhou، مقاطعة Zhejiang، الصين). شملت هذه الدراسة الحشدية ما مجموعه 157 عينة من مرضى NSCLC تم تسجيلهم بالتتابع بين يناير 2019 وديسمبر 2024. تم تبرير حجم العينة المكون من 157 عينة مزدوجة إحصائياً بناءً على أبحاث سابقة منشورة حول التنبؤ الإنذاري بـ miRNA في حالات NSCLC: بافتراض حجم تأثير متوسط قدره 0.5، وقيمة α = 0.05، وقوة إحصائية بنسبة 80%، تم حساب الحد الأدنى المطلوب لحجم العينة ليكون 12 حالة. ونظراً لاحتمالية فقدان العينات، أو حدوث نخر نسيجي شديد، أو فقدان المرضى أثناء المتابعة، قمنا بتسجيل 157 مريضاً مؤهلاً بالتتابع من يناير 2019 إلى ديسمبر 2024 لضمان القوة الإحصائية الكافية. تم استئصال جميع أنسجة الأورام وأنسجة الرئة الطبيعية المجاورة المطابقة من المريض نفسه أثناء الاستئصال الجراحي، مما شكل عينات مزدوجة للتحليلات المقارنة اللاحقة.
تمثلت معايير الاشتمال في: (1) المرضى الذين تم تأكيد إصابتهم بسرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) الأولي عن طريق الخزعة بعد الجراحة؛ (2) توفر البيانات السريرية الأساسية الكاملة، والتصنيف النسيجي المرضي، وبيانات البقاء على قيد الحياة للمتابعة طويلة الأمد؛ (3) عدم الخضوع للعلاج الإشعاعي أو العلاج الكيميائي أو العلاج الموجه قبل أخذ عينات الأنسجة؛ (4) توفر عينات متطابقة وكاملة من أنسجة الورم والأنسجة المجاورة للسرطان.
كانت معايير الاستبعاد كما يلي: (1) الأورام الخبيثة الثانوية المدمجة في أعضاء أخرى؛ (2) المرضى الذين فُقدت متابعتهم خلال 3 أشهر بعد الجراحة؛ (3) العينات التي تعاني من نخر شديد أو حجم نسيجي غير كافٍ للكشف الجزيئي اللاحق.
وُضعت جميع عينات الأنسجة الطازجة في نيتروجين سائل خلال 15 min من الاستئصال الجراحي، ثم نُقلت إلى مجمد فائق انخفاض درجة الحرارة، وحُفظت عند −80 °C لاستخلاص RNA والبروتين. أُجريت المتابعة السريرية بانتظام، وقيس البقاء الإجمالي بالأشهر من وقت التشخيص المرضي حتى الوفاة أو آخر موعد للمتابعة.
تقسيم مستويات تعبير miR-21-5p إلى طبقات
تم ترتيب قيم التعبير النسبي لـ miR-21-5p لجميع المرضى البالغ عددهم 157 مريضًا ترتيبًا تصاعديًا، وقُسمت المجموعة إلى طبقات بناءً على نقطة الفصل عند الوسيط. ونظرًا لوجود قيم متعددة متساوية حول الوسيط، تم تعيين المرضى الذين لديهم تعبير أقل من الوسيط إلى مجموعة التعبير المنخفض (n = 61)؛ بينما صُنِّف المرضى الذين لديهم تعبير مساوٍ للوسيط أو أكبر منه، بما في ذلك جميع الملاحظات المتساوية عند الوسيط، ضمن مجموعة التعبير المرتفع (n = 96). وقد حُدِّدت قاعدة تخصيص القيم المتساوية هذه مسبقًا قبل عملية التقسيم لمعالجة قراءات الوسيط المكررة، وتم التحقق من نتيجة التقسيم بمطابقتها مع بيانات التكميم الخام لتقنية qRT-PCR.
زراعة الخلايا
تم الحصول على الخطوط الخلوية A549 وH1299 لسرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) البشري من مورد تجاري (انظر جدول المواد). تم الحفاظ على خلايا A549 في وسط RPMI-1640، بينما تمت زراعة خلايا H129 في وسط DMEM. تم إثراء كلا الوسطين لزراعة الخلايا بنسبة 10% من مصل جنين البقر (FBS) المثبط حرارياً، والبنسلين (10 U/mL)، والستربتومايسين (10 µg/mL). زُرعت الخلايا في ظروف قياسية عند 37 °C في حاضنة رطبة مزودة بـ 5% CO₂.
أُجري تحليل التكرارات الترادفية القصيرة (STR) للتحقق من هوية الخطوط الخلوية A549 وH1299 قبل جميع التجارب الوظيفية. كما أُجري اختبار الكشف عن تلوث الميكوبلازما شهرياً باستخدام طقم تجاري للكشف عن الميكوبلازما يعتمد على تقنية PCR، واستُخدمت الخلايا السلبية للميكوبلازما فقط في المقايسات اللاحقة.
تم حصاد الخلايا في طور النمو اللوغاريتمي ذات المورفولوجيا السليمة من أجل التعداء العابر. واستُخدم كاشف تعداء قائم على الدهون (انظر جدول المواد) وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. أُجريت المقايسات الخلوية اللاحقة بعد 50 h من التعداء.
ترانسفكشن الخلايا
لإجراء عملية الترانسفكشن، تم استزراع الخلايا في طور النمو اللوغاريتمي ذات المورفولوجيا السليمة في أطباق الزرع قبل 24 ساعة للوصول إلى درجة تلاقي تتراوح بين 60%–70%. أُجريت عملية الترانسفكشن باستخدام كاشف ترانسفكشن قائم على الدهون (راجع جدول المواد) وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. استُخدمت أربع مجموعات تجريبية: ضابط سلبي للمحاكي (mimic-NC)، ومحاكي miR-21-5p، وضابط سلبي للمثبط (inhibitor-NC)، ومثبط miR-21-5p. تتوفر تسلسلات النيوكليوتيدات في الملف التكميلي 1.
تم استخلاص RNA الكلي بعد 50 h من عملية عفن الخلية (transfection)، وأُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (qRT-PCR) لقياس التعبير النسبي لـ miR-21-5p والتحقق من كفاءة عفن الخلية. كما أُجريت فحوصات الهجرة الخلوية بعد 50 h من عفن الخلية. وبالنسبة لعفن الخلية المؤقت، عولجت الخلايا بـ miR-21-5p mimic أو mimic negative control (mimic-NC) بتركيز نهائي قدره 50 nM، بينما أُدخل miR-21-5p inhibitor و inhibitor negative control (inhibitor-NC) بتركيز 10 nM. ولتجنب التأثيرات المربكة التي قد تعزى إلى الاختلافات في كمية الأحماض النووية المُدخلة، تم الحفاظ على الكمية الإجمالية للأحماض النووية التي تم نقلها متماثلة عبر مجموعات العلاج الأربع جميعها.
تم تقييم تكاثر الخلايا باستخدام مقايسة Cell Counting Kit-8 (CCK-8). وزعت الخلايا المنقولة جينيًا بشكل مستقر في أطباق ذات 96 بئرًا بمعدل 3 × 103 خلية/بئر، مع إنشاء ست مكررات تقنية لكل مجموعة. وبعد 24 و48 و72 ساعة من الاستزراع، أُضيف 10 µL من كاشف CCK-8 إلى كل بئر، تلا ذلك تحضين عند 37 °C لمدة 2 h. وتم قياس تكاثر الخلايا عن طريق قياس الامتصاصية عند 450 nm باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة.
أُجريت جميع تجارب عفن الترانزفكشن المؤقت، واختبار CCK-8، وتجارب الهجرة بثلاث مكررات بيولوجية مستقلة على الأقل، واشتمل كل مكرر بيولوجي على 3–6 مكررات تقنية كما هو موضح أعلاه.
تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بنسخ عكسي
تم عزل الحمض النووي الريبوزي (RNA) الكلي من خلايا NSCLC والأنسجة الورمية السريرية المقترنة والأنسجة الطبيعية المجاورة باستخدام كاشف استخلاص RNA يعتمد على الفينول/الغوانيدين (انظر جدول المواد). تم تحديد نقاء وتركيز RNA بواسطة قياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية؛ وخضعت فقط العينات التي تراوحت نسب الكثافة الضوئية (OD) 260/280 وOD 260/230 بين 1.8–2.1 لعملية النسخ العكسي. تتوفر تسلسلات البادئات في الملف التكميلي 1. احتوى نظام النسخ العكسي على 500 ng من RNA الكلي، و2 µL من منظم النسخ العكسي، و1 µL من خليط dNTP، و0.5 µL من إنزيم النسخ العكسي، و1 µL من بادئ stem-loop النوعي لـ miRNA أو بادئ oligo(dT) لـ mRNA، ومياه خالية من RNase ليصل الحجم الكلي إلى 20 µL. تألف نظام تضخيم qRT-PCR (بحجم كلي 20 µL) من 10 µL من مزيج SYBR Green qPCR الرئيسي، و0.4 µL من البادئ الأمامي (10 µM)، و0.4 µL من البادئ العكسي (10 µM)، و2 µL من قالب cDNA المخف، و7.2 µL من مياه خالية من RNase.
الحمض الريبي النووي المرسال لـ CADM1 و GAPDH تم إجراء النسخ العكسي باستخدام طقم النسخ العكسي، بينما تم إجراء النسخ العكسي لـ miR-21-5p باستخدام بادئات الحلقة الجذعية (stem-loop primers) وcel-miR-39 خارجي المنشأ كضابط داخلي (spike-in control). أُضيف cel-miR-39 خارجي المنشأ إلى كل عينة RNA فور عزل الـ RNA الكلي وقبل عملية النسخ العكسي. وباعتباره مادة اصطناعية C. elegans يمكن لـ cel-miR-39، وهو microRNA لا يمتلك تسلسلاً متماثلاً في النسخ البشرية، أن يصحح الانحراف الناجم عن تفاوت كفاءة استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA)، والفقد الناتج عن تحلله، والتباين في كفاءة النسخ العكسي عبر عينات الأنسجة السريرية المختلفة، حيث يعمل كضابط معايرة خارجي عام لتقدير كمية الـ miRNA. تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) باستخدام خليط رئيسي يعتمد على صبغة فلورية مرتبطة بالحمض النووي (DNA) على نظام PCR في الوقت الحقيقي (انظر جدول المواد): 95 °C لمدة 3 دقائق، تليها 40 دورة عند 95 °C لمدة 10 ثوانٍ، 60 °C لمدة 30 ثانية، و 72 °C لمدة 20 ثانية، مع إجراء تحليل لمنحنى الانصهار للتأكد من التضخيم النوعي. وتضمن كل sample ثلاث مكررات بيولوجية، مع ثلاث مكررات تقنية لكل منها، وحُسب التعبير النسبي باستخدام طريقة 2-ΔCt⁻ΔΔعتبة الدورة (Ct) الطريقة. تتابعات البادئات الكاملة لـ البروتين التفاعلي C, عامل نخر الورم-α، و إنترلوكين-6 يتم توفير تضخيم الحمض الريبوزي المرسال (mRNA) في الملف التكميلي 1 إلى جانب CADM1, GAPDH، وتسلسلات بادئات miR-21-5p.
إنشاء تعبير مستقر لـ miR-21-5p بوساطة الفيروس البطيء
تم تعبئة النواقل الفيروسية البطيئة التجارية LV-miR-21-5p وعنصر التحكم الفارغ LV-NC في خلايا 293T. أُدخل تسلسل سلف miR-21-5p في هيكل فيروس بطيء يحمل جينات مقاومة البوروميسين وجينات مراسل GFP. جُمعت الطافات الفيروسية البطيئة بعد 48 ساعة و72 ساعة من عملية عفن الخلايا، ثم رُكزت ونُقيت من أجل إصابة الخلايا.
تم استزراع خلايا A549 وH129 قبل 24 ساعة من العدوى للوصول إلى درجة تلاقي بنسبة 50–60%. تم إصابة الخلايا بمضاعفات عدوى MOI = 10 (لخلايا A549) وMOI = 15 (لخلايا H129) مع إضافة 5 µg/mL من polybrene لتحسين كفاءة ترنسفكشن. تم استبدال الوسط الزرعي بعد 24 ساعة من العدوى، واستمر استزراع الخلايا لمدة 48 ساعة أخرى قبل إجراء الفرز باستخدام puromycin.
أُجري اختيار الخلايا المستقرة باستخدام puromycin بتركيز 5 µg/mL لمدة 10 أيام متتالية؛ واستُخدمت خلايا فارغة غير مصابة للتحقق من القضاء التام على الخلايا غير المنقولة خلال 7 أيام. تم عزل مستعمرات مفردة موجبة لـ GFP وتوسيعها لإنشاء خطوط خلوية أحادية النسيلة مستقرة هي LV-21 و LV-NC.
لـ CADM1 مقايسات الإنقاذ، LV- تجاريCADM1 فرط التعبير وsh-CADM1 تم تحضير فيروسات لينتيفيروسية للإسكات الجيني. وأُنشئت أربع مجموعات تجريبية وهي: LV-NC، وLV-miR-21-5p، وLV-CADM1، وLV-miR-21-5p + LV-CADM1 مجموعة الإنقاذ. CADM1 تم إصابة الخلايا بالفيروسات البطيئة (lentiviruses) باستخدام ذات تعدد العدوى (MOI) وظروف الفرز بالبوميسين (puromycin) المستخدمة مع ناقلات miR-21-5p. وقد كُررت جميع تجارب استعادة التكاثر والهجرة بثلاث مكررات بيولوجية مستقلة.
التحقق من التعبير المفرط والمستقر لـ miR-21-5p
تم استخلاص الحمض النووي الريبي الكلي (Total RNA) من مستنسخات الخلايا المستقرة LV-21 وLV-NC التي تم حصادها. وأُجري تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) للكشف عن مستوى التعبير النسبي لـ hsa-miR-21-5p باستخدام cel-miR-39 كمرجع خارجي. تم الاحتفاظ بمستنسخات الخلايا التي أظهرت زيادة في التعبير عن miR-21-5p بمقدار تزيد عن 8 أضعاف مقارنة بمجموعة LV-NC لجميع المقايسات الوظيفية اللاحقة، مما يؤكد النجاح في إنشاء خطوط خلوية تعبر عن miR-21-5p بشكل مفرط ومستقر.
مقايسة مراسل اللوسيفيريز المزدوج
تم بناء بلازميد مراسل لـ CADM1 3'-UTR من النوع البري (WT-CADM1) يحتوي على تسلسل الارتباط المتوقع لـ miR-21-5p، وبلازميد مراسل لـ CADM1 3'-UTR طافر (MUT-CADM1) يحتوي على منطقة بذر ارتباط طافرة. زُرعت خلايا A549 في أطباق ذات 24 بئراً قبل 24 ساعة من عملية عفن الخلية (transfection) لتصل نسبة الالتحام إلى 60%–70%. تم إجراء عفن مشترك لكل بئر باستخدام 500 ng من بلازميد المراسل WT/MUT، و 50 nM من miR-21-5p mimic أو mimic-NC، وبلازميد مرجعي داخلي لـ Renilla luciferase بنسبة كتلة ثابتة. وبعد فترة حضانة لمدة 48 ساعة بعد عفن الخلية، تم تحلل الخلايا بالكامل، وكُشفت إشارات تألق لوسيفيريز اليراعة (firefly) و Renilla بالتتابع باستخدام طقم كشف اللوسيفيريز المزدوج. وحُسب نشاط اللوسيفيريز النسبي كنسبة قيمة تألق اليراعة إلى قيمة تألق Renilla. اشتملت كل مجموعة تجريبية على ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة، مع ثلاث مكررات تقنية لكل مكرر بيولوجي، واستُخدم اختبار t للعينات المستقلة لمجموعتين للمقارنة الإحصائية لنشاط اللوسيفيريز النسبي بين مجموعتي mimic-NC و miR-21-5p mimic.
مقايسة الهجرة باستخدام Transwell
في مقايسة الهجرة باستخدام Transwell، عُلقت الخلايا التي تم ترانسفكشنها بشكل مستقر في وسط خالٍ من المصل، ثم زُرعت في الإدراجات العلوية بكثافة 4 × 104 خلية لكل بئر. مُلئت الغرف السفلية بوسط استزراع كامل مدعم بنسبة 10% FBS لإنشاء تدرج كيميائي جذبوي. وبعد التحضين لمدة 48 h عند 37 °C في جو رطب يحتوي على 5% CO₂، أُزيلت الخلايا المتبقية على السطح العلوي للغشاء بعناية. أما الخلايا التي هاجرت إلى الجانب السفلي من الغشاء، فقد تم تثبيتها في الميثانول وصبغها بالبنفسجي البلوري (crystal violet). تم قياس الهجرة كمياً عن طريق عد الخلايا في خمسة حقول مجهرية مختارة عشوائياً لكل إدراج. أُجريت كل تجربة باستخدام ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة، مع تضمين ثلاث مكررات تقنية لكل مكرر بيولوجي.
التحليلات الإحصائية
أُجريت جميع التجارب in vitro باستخدام ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة كحد أدنى، مع مكررات تقنية مقابلة لكل منها. تم تقييم توزيع البيانات أولاً باستخدام اختبار شابيرو-ويلك (Shapiro-Wilk) للاعتدالية لتوجيه التحليل الإحصائي. بالنسبة للمقارنات المزدوجة بين الأنسجة الورمية والأنسجة الطبيعية المجاورة، تم تطبيق اختبار t المزدوج أو اختبار ويلكوكسون للرتب الموقعة المزدوج، وذلك بناءً على توزيع البيانات. أما المقارنات بين مجموعتين مستقلتين فقد حُللت باستخدام اختبار t المستقل أو اختبار مان-ويتني U. وتم تقييم الفروق بين مجموعات متعددة، بما في ذلك تجارب الإنقاذ، بواسطة تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعاً بتصحيح بونفيروني البعدي، بينما استُخدم تحليل التباين للقياسات المتكررة لتحليل مجموعات البيانات الطولية مثل مقاييس التكاثر CCK-8 ومقاييس التئام الجروح. وفُحصت الارتباطات بين المتغيرات السريرية الفئوية باستخدام اختبار χ2، كما قُيمت العلاقة بين تعبير miR-21-5p و CADM1 بواسطة تحليل ارتباط بيرسون. وحُلل بقاء المرضى على قيد الحياة باستخدام منحنيات كابلان-ماير مع إجراء المقارنات بواسطة اختبار log-rank. كما تم تحديد عوامل الإنذار المستقلة من خلال تحليلات انحدار كوكس للمخاطر النسبية أحادية المتغير ومتعددة المتغيرات. وعُرِّفت الدلالة الإحصائية بأنها P < 0.05. وقام انحدار كوكس متعدد المتغيرات بتعديل العمر، والجنس، والنوع النسيجي، ومستوى miR-21-5p، وحالة العقد الليمفاوية (المرجع: العمر ≤ 60، إناث، سرطان حرشفي، miR-21-5p منخفض، سلبية العقد)؛ وتم التحقق من افتراض المخاطر النسبية باستخدام بقايا شونفيلد، وأُدرجت المتغيرات التي كانت قيمة P فيها أحادية المتغير < 0.10 عبر طريقة الاختيار الإدخالي (enter selection).
النتائج
الارتباط بين تعبير miR-21-5p والخصائص المرضية السريرية لمرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)
تم تقسيم إجمالي 157 عينة من أورام NSCLC إلى مجموعتين: مجموعة ذات تعبير منخفض لـ miR-21-5p (العدد = 61) ومجموعة ذات تعبير مرتفع (العدد = 96) بناءً على متوسط مستويات miR-21-5p. وكشفت تحليلات مربع كاي (chi-square) عن عدم وجود ارتباطات ذات دلالة إحصائية بين تعبير miR-21-5p وعمر المريض (χ2 = 1.36, P = 0.2435)، أو الجنس (χ2 = 1.06, P = 0.3032)، أو النوع النسيجي (χ2 = 1.09, P = 0.2965)، أو حجم الورم (χ2 = 5.623, P = 0.0601)، بينما ارتبط التعبير المرتفع لـ miR-21-5p بشكل ملحوظ بدرجة الورم المتقدمة (χ2 = 16.25, P = 0.006)، وإيجابية النقائل في العقد اللمفاوية (χ2 = 12.17, P = 0.0049)، ومرحلة T الأعلى (χ2 = 4.30, P = 0.17)، مما يشير إلى أن miR-21-5p يمارس تأثيرات مسرطنة تسهل تطور سرطان NSCLC (الجدول 1).
تحليل انحدار كوكس للمخاطر النسبية متعدد المتغيرات لعوامل التنبؤ المستقلة لسرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)
كشف تحليل انحدار كوكس متعدد المتغيرات، الذي شمل العمر والجنس والنوع النسيجي وتعبير miR-21-5p وانتقال الخلايا السرطانية إلى العقد اللمفاوية، أن التعبير المرتفع لـ miR-21-5p (نسبة المخاطر [HR] = 3.06؛ فاصل ثقة 95% [CI]: 1.412–6.659؛ P = 0.05) وانتقال الخلايا السرطانية الإيجابي إلى العقد اللمفاوية (HR = 2.295؛ 95% CI: 3.039–163.58؛ P = 0.02) كانا عاملين مستقلين من عوامل خطر التنبؤ غير المواتية لانخفاض معدل البقاء الإجمالي لمرضى NSCLC، بينما لم يظهر لعمر المريض أو جنسه أو النوع النسيجي الفرعي أي تأثيرات تنبؤية مستقلة ذات دلالة إحصائية (جميع قيم P > 0.05) (الجدول 2).
خصائص التعبير السريري لـ miR-21-5p وعلاقته بـ CADM1 والعوامل الالتهابية
أظهر كشف qRT-PCR لأنسجة ورم سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) المقترنة بالأنسجة الطبيعية المجاورة ارتفاعاً ملحوظاً في المستويات النسبية لـ miR-21-5p في الأنسجة السرطانية مقارنة بالمجموعات الضابطة الطبيعية (الشكل 1A، P < 0.01). وأظهرت منحنيات بقاء كابلان-ماير أن المرضى الذين لديهم تعبير مرتفع لـ miR-21-5p كان لديهم معدل بقاء إجمالي أسوأ بكثير من أولئك الذين لديهم تعبير منخفض لـ miR-21-5p (الشكل 1B، P = 0.027). كما كانت وفرة mRNA للوسائط الالتهابية البروتين التفاعلي-C (CRP)، وعامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، وإنترلوكين-6 (IL-6) جميعها مرتفعة بشكل ملحوظ في عينات NSCLC (الشكل 1C، P < 0.01، P < 0.01). وكشف تحليل ارتباط بيرسون عن وجود ارتباط سلبي معنوي قوي بين miR-21-5p وتعبير mRNA لـ CADM1 في العينات السريرية (r = -0.73، 95% CI: -0.8325 إلى -0.7076، P < 0.01، الشكل 1D).
التحقق الوظيفي الخلوي لـ miR-21-5p في خلايا NSCLC
أكد تحليل qRT-PCR كفاءة عملية ترنسفكشن miR-21-5p mimic بنجاح في خلايا A549 وH129 (الشكل 2A). وأظهرت مقايسات Transwell أن الإفراط في تعبير miR-21-5p أدى إلى زيادة كبيرة في قدرة الهجرة النسبية وأعداد هجرة الخلايا في كلا الخطين الخلويين (الشكل 2B،C). كما كشف الكشف عن السيتوكينات الالتهابية بواسطة qRT-PCR عن ارتفاع ملحوظ في مستويات mRNA لكل من CRP وTNF-α وIL-6 بعد ترنسفكشن miR-21-5p mimic، بينما عكس العلاج بـ miR-21-5p inhibitor هذا الارتفاع (الشكل 2D). وأكدت تجارب الإنقاذ (Rescue experiments) أن miR-21-5p mimic ثبط بشكل حاد نسخ CADM1، بينما أدى الترنسفكشن المشترك لـ LV-CADM1 إلى استعادة تعبير mRNA لـ CADM1 بشكل كامل في خلايا A549 وH129 (الشكل 2E،F). وبشكل جماعي، أظهرت هذه البيانات الخلوية أن miR-21-5p يعز هجرة خلايا NSCLC والاستجابة الالتهابية عن طريق كبح CADM1.
تأثيرات miR-21-5p على تكاثر خلايا NSCLC
أظهرت منحنيات تكاثر CCK-8 عند 24 h و48 h و72 h أن عفن miR-21-5p mimic أدى إلى زيادة ملحوظة في قيم OD عند 450 nm في كل من خلايا A549 وH129، بينما ثبّط miR-21-5p inhibitor حيوية الخلايا بشكل كبير، مع ملاحظة فروق ذات دلالة إحصائية عند 72 h (الشكل 3A،B؛ P < 0.01). وأثبتت هذه البيانات أن miR-21-5p يمارس تأثيراً محفزاً للتكاثر في خلايا NSCLC.
التحقق من أن CADM1 هو الهدف المباشر لـ miR-21-5p عبر التنبؤ المعلوماتي الحيوي ومقايسة المراسل لوسيفيريز المزدوجة
تم تقاطع ثلاث قواعد بيانات عبر الإنترنت للتنبؤ بأهداف miRNA وهي (miRWalk وStarBase وTargetScan) لفحص الجينات المرشحة التي تقع تحت تأثير miR-21-5p، وتم الحصول على 95 جينًا مستهدفًا متداخلًا (الشكل 4A). وأشار تحليل إثراء الوجود الجيني (GO) إلى أن هذه الجينات المرشحة كانت ثرية بشكل أساسي في العمليات البيولوجية، والمكونات الخلوية، والوظائف الجزيئية المرتبطة بعمليات التمثيل الغذائي الخلوي، والاستجابة للإجهاد، وتنظيم النسخ (الشكل 4B). كما كشف تحليل إثراء مسارات موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) عن إثراء بارز في شلالات التأشير المرتبطة بالأورام، بما في ذلك مسارات كيناز البروتين المنشط بالميتوجين (MAPK) ومسارات Ras (الشكل 4C). وأظهرت مقايسة المراسل لوسيفيريز المزدوجة أن محاكي miR-21-5p ثبط بشكل ملحوظ نشاط اللوسيفيريز النسبي لمراسل 3'-UTR من النوع البري لـ CADM1، بينما لم يُلاحظ أي تأثير تثبيطي في مجموعة 3'-UTR الطافرة لـ CADM1 (الشكل 4D، P < 0.01، ns: غير دال إحصائيًا)، مما يؤكد الارتباط المباشر بين miR-21-5p و CADM1.
تعزيز الأنماط الظاهرية الخبيثة لسرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) عبر تثبيط CADM1 في تجارب الإنقاذ
أكد تحليل qRT-PCR كفاءة ترانسفكشن محاكي ومثبط miR-21-5p في خلايا A549 وH1299 (الشكل 5A). أدى الإفراط في تعبير CADM1 (LV-CADM1) إلى خفض مستويات mRNA للعوامل المحفزة للالتهابات CRP وTNF-α وIL-6، بينما أدى تقليل تعبير CADM1 باستخدام RNA المتداخل الصغير (si-CADM1) إلى رفع تعبيرها بشكل ملحوظ (الشكل 5B). وأظهرت مقايسات الهجرة باستخدام Transwell أن ترانسفكشن LV-CADM1 ثبط بشكل كبير القدرة الهجرية لكلا خطي خلايا NSCLC (الشكل 5C،D). كما أثبت كشف التكاثر بواسطة CCK-8 أن التأثير المحفز للتكاثر بوساطة LV-21 قد تم إلغاؤه تماماً عن طريق الترانسفكشن المشترك لـ LV-CADM1، في حين أن تسارع نمو الخلايا الناجم عن si-CADM1 يمكن إنقاذه بواسطة مثبط miR-21-5p (الشكل 5E،F). وبشكل جماعي، أكدت بيانات الإنقاذ هذه أن CADM1 يعمل كوسيط وظيفي في المصب مسؤول عن التكاثر والهجرة والتنشيط الالتهابي الناتج عن miR-21-5p في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC).
توافر البيانات:
تتوفر البيانات المصدرية التي تدعم نتائج هذه الدراسة في الملف التكميلي 2 وهي متاحة مع المقالة المنشورة.
الشكل 1ملفات التعبير لـ miR-21-5p، والعوامل الالتهابية، وارتباطها بـ CADM1 في عينات سريرية من سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). (A) التعبير النسبي لـ miR-21-5p في أنسجة الرئة الطبيعية وأنسجة أورام سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC). (Bمنحنيات كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة الإجمالية لمرضى سرطان الرئة غير صغير الخلايا المصنفين حسب مستوى تعبير miR-21-5p.كربونالتعبير النسبي لـ mRNA للعوامل الالتهابية البروتين التفاعلي C, TNF-α، و إنترلوكين-6 في الأنسجة الطبيعية وأنسجة سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC).دمخطط تشتت لارتباط بيرسون يوضح الارتباط الخطي السلبي بين miR-21-5p و CADM1 تعبير mRNA. **P < 0.01, ***P < 0.01. للوحة سيأُجريت مقارنات إحصائية بين أنسجة الأورام المقترنة والأنسجة الطبيعية المجاورة لكل من CRP وTNF-α وIL-6، على التوالي؛ **P < 0.01, ***P < تشير القيمة 0.01 إلى وجود فروق ذات دلالة إحصائية مقارنة بأنسجة الرئة الطبيعية المتطابقة. تضمنت جميع اللوحات ≥3 مكررات بيولوجية مستقلة؛ وتمثل بيانات qRT-PCR المتوسط ± الانحراف المعياري؛ المقترنة يرجى تقديم النص المراد ترجمته.-اعتُمد اختبار (test) للمقارنة بين المجموعات؛ واستُخدم اختبار بيرسون (Pearson test) لتحليل ارتباط المخطط المبعثر. الاختصارات: CADM1 CAM-1 = جزيء التصاق الخلية 1؛ CI = فاصل الثقة؛ CRP = البروتين التفاعلي C؛ IL-6 = إنترلوكين-6؛ NSCLC = سرطان الرئة غير صغير الخلايا؛ TNF-α = عامل نخر الورم ألفا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2الأنماط الظاهرية الخلوية و CADM1 التعبير المنظم بواسطة miR-21-5p في خلايا سرطان الرئة غير صغير الخلايا A549 وH1299. (A) الكشف عن تعبير miR-21-5p بواسطة qRT-PCR بعد ترانسفكشن المحاكي. (B) التكميم الإحصائي لهجرة الخلايا النسبية من مقايسات Transwell. (سي) تقدير عدد الخلايا المهاجرة لكل حقل مجهري. (دالتعبير النسبي لـ mRNA الخاص بـ البروتين المتفاعل C, TNF-α، و إنترلوكين-6 (IL-6) تحت تأثير الإفراط في تعبير miR-21-5p أو تثبيطه. (هـنسبي CADM1 تعبير mRNA في مجموعات الإنقاذ لـ A549 (المجموعة الضابطة NC، ومحاكي miR-21-5p، وLV-CADM1، mimic+LV-CADM1). (فنسبي CADM1 تعبير mRNA في مجموعات الإنقاذ لـ H129. **P < 0.01, ***P < 0.01. كُررت جميع المقايسات الخلوية لثلاث مكررات بيولوجية مستقلة مع ثلاث مكررات تقنية لكل منها؛ وتمثل أشرطة الخطأ المتوسط ± الانحراف المعياري؛ كما اعتمدت المقارنات بين المجموعات تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA) مع تصحيح بونفيروني؛ وتتطابق تسميات المجموعات تماماً مع مجموعات عفن الخلية (transfection) الموضحة في قسم الطرق. الاختصارات: CADM1 CAM-1 = جزيء الالتصاق الخلوي 1؛ CRP = البروتين التفاعلي C؛ IL-6 = إنترلوكين-6؛ LV = ناقل فيروسي لينتي؛ NC = ضابط سلبي؛ NSCLC = سرطان الرئة غير صغير الخلايا؛ qRT-PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مع النسخ العكسي؛ TNF-α = عامل نخر الورم ألفا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3منحنيات التكاثر باستخدام مقايسة CCK-8 والتي تعكس حيوية الخلايا بعد الإفراط في تعبير miR-21-5p أو تثبيطه. (A( منحنيات امتصاص OD₄₅₀ المعتمدة على الوقت لخلايا A549 المنقولة بـ mimic-NC، أو miR-21-5p mimic، أو inhibitor-NC، أو miR-21-5p inhibitor. (B() منحنيات امتصاص الضوء عند الطول الموجي 450 نانومتر (OD₄₅₀) المعتمدة على الوقت لخلايا H129 تحت مجموعات عفن الأربع. ***P < 0.01. تضمنت مقايسات CCK-8 ست مكررات تقنية لكل مجموعة عبر 3 مكررات بيولوجية؛ وعُرضت البيانات في شكل المتوسط ± الانحراف المعياري (SD)؛ واستُخدم تحليل التباين للقياسات المتكررة (repeated-measures ANOVA) للمقارنات بين النقاط الزمنية. الاختصارات: CCK-8 = مجموعة عد الخلايا-8؛ NC = الضابط السلبي؛ OD = الكثافة الضوئية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4الفحص المعلوماتي الحيوي ومقايسة لوسيفيريز المزدوجة للجين المستهدف لـ miR-21-5p CADM1. (Aمخطط فين يوضح الجينات المستهدفة المشتركة لـ miR-21-5p والتي تم تحديدها بواسطة قواعد بيانات التنبؤ miRWalk وStarBase وTargetScan.B(مخطط فقاعي لتحليل إثراء الوظائف وفقاً لـ GO للجينات المستهدفة المتقاطعة. (ج) مخطط شريطي لأكثر مسارات إشارات KEGG إثراءً. (دنشاط مراسل اللوسيفيريز المزدوج للنمط البري والطافر CADM1 المنطقة غير المترجمة في الطرف '3 بعد الإفراط في التعبير عن miR-21-5p. **P < 0.01؛ ns، غير دال إحصائياً. اللوحة د تعتمد فقط على WT-CADM1 المنطقة غير المترجمة 3' (3'-UTR) و-MUTCADM1 تمت عملية التحول المشترك لـ 3'-UTR مع محاكي miR-21-5p أو محاكي-NC لغرض الكشف باستخدام لوسيفيريز المزدوج؛ وقد عُدِّلت التسميات (Control/overexpression/interference) الموضحة في مسودات المخططات الأولية إلى تقسيمات WT/MUT القياسية في الأشكال النهائية. استخدم تحليل التنبؤ بالأهداف ثلاث قواعد بيانات عبر الإنترنت؛ وعُدِّلت قيم P للإثراء عبر تصحيح Benjamini-Hochberg FDR؛ وتضمنت تجارب لوسيفيريز المزدوج ثلاث مكررات بيولوجية (بواقع ثلاث مكررات تقنية لكل منها)؛ وتمثل أشرطة الخطأ المتوسط ± الانحراف المعياري (mean ± SD)؛ لمجموعتين تـ-اختبار للمقارنة الإحصائية. الاختصارات: CADM1 = جزيء الالتصاق الخلوي 1؛ GO = الوجود الجيني؛ KEGG = موسوعة كيوتو للجينات والجينومات؛ MUT = طافر؛ NC = ضابط سلبي؛ ns = غير دال إحصائياً؛ UTR = المنطقة غير المترجمة؛ WT = النوع البري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5تجارب الإنقاذ الوظيفي للتحقق من miR-21-5p/CADM1 المحور التنظيمي في خلايا A549 وH129. (A(التعبير النسبي لـ miR-21-5p بعد تعداء المحاكي أو المثبط. (Bالتعبير النسبي لـ mRNA الخاص بـ البروتين المتفاعل C, TNF-α، و إنترلوكين-6 (IL-6) في LV-CADM1 و si-CADM1 مجموعات. (كربونالتقدير الكمي الإحصائي لقدرة الهجرة النسبية تحت CADM1 فرط التعبير. (دتحديد كمية عدد الخلايا المهاجرة لكل مجال مجهري في LV-CADM1 مجموعات. (هـقيم الكثافة الضوئية OD₄₅₀ بمقاييس CCK-8 لمجموعات الإنقاذ من خلايا A549 (LV-NC وLV-21 وLV-CADM1، LV-21+LV-CADM1، si-NC، si-CADM1، سي-CADM1+مثبط miR-21). (فقيم الـ OD₄₅₀ الخاصة باختبار CCK-8 لمجموعات الإنقاذ من خلايا H129 التي خضعت لمعاملات ترانسفكشن متماثلة. **P < 0.01, ***P < 0.01. شملت جميع مقايسات الإنقاذ ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة؛ تشير أشرطة الخطأ إلى المتوسط ± الانحراف المعياري، مع استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA) واختبار بونفروني البعدي (Bonferroni post-hoc test) للمقارنات بين المجموعات المتعددة. الاختصارات: CADM1 CAM-1 = جزيء التصاق الخلية 1؛ CRP = البروتين التفاعلي C؛ IL-6 = إنترلوكين-6؛ LV = ناقل فيروسي بطيء؛ NC = ضابط سلبي؛ OD = الكثافة الضوئية؛ qRT-PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مع النسخ العكسي؛ si = حمض ريبوزي نووي متداخل صغير؛ TNF-α = عامل نخر الورم ألفا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| تعبير miR-21-5p | إجمالي | يرجى تزويدي بالنص المراد ترجمته.2 | القيمة الاحتمالية (P value) | |||
| منخفض | مرتفع | |||||
| العمر (سنوات) | ≤60 | 24 | 29 | 53 | 1.357 | 0.244 |
| ˃60 | 37 | 67 | 104 | |||
| إجمالي | 61 | 96 | 157 | |||
| الجنس | ذكر | 42 | 73 | 115 | 1.06 | 0.3032 |
| أنثى | 19 | 23 | 42 | |||
| إجمالي | 61 | 96 | 157 | |||
| النوع النسيجي | سرطان الخلايا الحرشفية | 31 | 41 | 72 | 1.09 | 0.2965 |
| سرطان غدي | 30 | 55 | 85 | |||
| إجمالي | 61 | 96 | 157 | |||
| درجة الورم | ١-٢ | 55 | 58 | 113 | 16.25 | 0.00006 |
| ٣ | 6 | 38 | 44 | |||
| الإجمالي | 61 | 96 | 157 | |||
| النقيلة في العقد اللمفاوية | سالب | 41 | 37 | 78 | 12.17 | 0.00049 |
| إيجابي | 20 | 59 | 79 | |||
| الإجمالي | 61 | 96 | 157 | |||
| حجم الورم (سم) | ≤3 | 20 | 23 | 43 | 5.623 | 0.0601 |
| 3-7 | 40 | 62 | 102 | |||
| ˃7 | 1 | 11 | 12 | |||
| إجمالي | 61 | 96 | 157 | |||
| مرحلة T | T1 | 15 | 17 | 32 | 4.295 | 0.117 |
| T2 | 36 | 52 | 88 | |||
| T3 | 10 | 27 | 37 | |||
| إجمالي | 61 | 96 | 157 | |||
الجدول 1: الارتباط بين تعبير miR-21-5p والخصائص المرضية السريرية لدى المرضى المصابين بسرطان الرئة غير صغير الخلايا. القيم تمثل أعداد المرضى. تم تقييم الارتباطات باستخدام اختبار χ2. الاختصار: NSCLC = سرطان الرئة غير صغير الخلايا. تم إجراء كل اختبار χ2 للمتغيرات المرضية السريرية الفئوية، واعتمدت جميع التحليلات على عينات 157 مريضاً بالكامل.
| ن | P قيمة | الخطر النسبي | فاصل ثقة 95% | |||
| أدنى | علوي | |||||
| العمر (بالسنوات) | ≤60 | 53 | 0.503 | 1.282 | 0.62 | 2.652 |
| ˃60 | 104 | |||||
| الجنس | ذكر | 115 | 0.339 | 1.418 | 0.693 | 2.901 |
| أنثى | 42 | |||||
| النمط النسيجي | سرطان الخلايا الحرشفية | 72 | 0.515 | 1.261 | 0.627 | 2.537 |
| سرطان غدي | 85 | |||||
| تعبير miR-21-5p | مرتفع | 96 | 0.005 | 3.066 | 1.412 | 6.659 |
| منخفض | 61 | |||||
| النقائل في العقد اللمفاوية | سلبي | 78 | 0.002 | 22.295 | 3.039 | 163.588 |
| إيجابي | 79 | |||||
الجدول 2: تحليل كوكس للمخاطر النسبية متعدد المتغيرات للبقاء على قيد الحياة بشكل عام لدى المرضى المصابين بسرطان الرئة غير صغير الخلايا. القيم هي نسب المخاطر مع فواصل ثقة 95%. الاختصارات: CI = فاصل الثقة؛ NSCLC = سرطان الرئة غير صغير الخلايا. تم إجراء انحدار كوكس متعدد المتغيرات على بيانات المجموعة السريرية الكاملة، وتم حساب HR و 95% CI للفحص الإنذاري المستقل.
الملف التكميلي 1: تسلسلات قليلة النوكليوتيد والبادئات المستخدمة في عملية عفن الخلايا وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مع النسخ العكسي. يسرد الملف محاكي ومثبط miR-21-5p، والضوابط السلبية الخاصة بكل منهما، وبادئات CADM1 و GAPDH و hsa-miR-21-5p و cel-miR-39. جميع التسلسلات معروضة في الاتجاه 5′–3′. الاختصارات: CADM1 = جزيء التصاق الخلايا 1؛ cel = Caenorhabditis elegans؛ GAPDH = جليسرالدهيد-3-فوسفات ديهايدروجيناز؛ hsa = Homo sapiens؛ miR = microRNA؛ PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 2. البيانات المصدرية الداعمة للأشكال. يحتوي هذا الملف على مجموعات البيانات الأساسية والتحليلات الإحصائية المستخدمة لإنشاء الأشكال المعروضة في المخطوطة، بما في ذلك الخصائص السريرية، وتحليلات التعبير، وبيانات البقاء، والنتائج الإحصائية المرتبطة بها. وتدعم هذه البيانات المصدرية النتائج الواردة في النص الرئيسي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
المناقشة
أكدت هذه الدراسة بشكل منهجي ارتفاع تعبير miR-21-5p في الأنسجة السريرية لسرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)، وهو ما ارتبط بتعزيز نسخ العوامل الالتهابية، وزيادة القدرة على هجرة الخلايا وتكاثرها، بينما حددت تجارب لوسيفيراز المزدوج و qRT-PCR وتجارب الإنقاذ جين CADM1 كهدف وظيفي مباشر له. وأشار التنبؤ المعلوماتي الحيوي بشكل أكبر إلى أن الأهداف النهائية لـ miR-21-5p كانت غنية في شلالات MAPK و Ras المسرطنة، مما يوفر دليلاً أولياً على أن محور miR-21-5p/CADM1 قد يكون مشاركاً في مسارات الإشارات المرتبطة بالتطور الخبيث للأورام.
كشف تحليل المجموعة السريرية أن التعبير العالي لـ miR-21-5p يرتبط ارتباطاً وثيقاً بدرجة الورم المتقدمة، وانتقال الورم إلى العقد اللمفاوية، وقصر مدة البقاء على قيد الحياة بشكل عام. وأكد تحليل انحدار كوكس متعدد المتغيرات أن miR-21-5p يمثل عاملاً إنذارياً سيئاً مستقلاً، مما يشير إلى أن miR-21-5p قد يعمل كمؤشر حيوي محتمل لتقييم مخاطر تطور المرض ونتائج البقاء على قيد الحياة لمرضى NSCLC.
In vitro أوضحت المقايسات الوظيفية أن الإفراط في تعبير miR-21-5p قد سهل تكاثر خلايا NSCLC وهجرتها والاستجابة الالتهابية، بينما أدى زيادة تعبير CADM1 إلى عكس جميع هذه الأنماط الظاهرية المسرطنة؛ وقد أوضح الارتباط السلبي في التعبير بين miR-21-5p وCADM1 في عينات المرضى، جنباً إلى جنب مع بيانات الإنقاذ الخلوي، الآلية التنظيمية التي يقود من خلالها miR-21-5p السلوكيات الخبيثة لـ NSCLC عبر التثبيط المباشر لـ CADM1.
اتساقاً مع الدراسات السابقة التي أفادت بالدور المسرطن لـ miR-21-5p في سرطان الرئة، يعمل هذا البحث على استكمال بيانات الارتباط السريري السليمة والتحقق الكامل من عملية الإنقاذ (rescue validation) لتعزيز إثبات وظيفته المحفزة للأورام؛ وبخلاف الأبحاث الحالية التي تركز فقط على نمط ظاهري واحد من الانتقال الورمي، تربط الدراسة الحالية miR-21-5p في آن واحد بتكاثر الخلايا والبيئة المجهرية الالتهابية للورم من خلال هدف CADM1، مما يوسع الشبكة التنظيمية لـ miR-21-5p في سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC).
بناءً على الأدلة الأولية المذكورة أعلاه، فإن الكشف عن تعبير miR-21-5p في الأنسجة يمتلك قيمة مساعدة محتملة في تصنيف مخاطر سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) والتقييم الإنذاري، وقد يوفر محور miR-21-5p/CADM1 أهدافاً جزيئية مرشحة جديدة لتطوير استراتيجيات تدخل لمكافحة تطور سرطان الرئة غير صغير الخلايا، رغم أن فعاليتها العلاجية السريرية لا تزال بحاجة إلى تحقق.
هناك عدة قيود لهذه الدراسة؛ فقد استُخدمت فيها مقايسات خلوية in vitro ومجموعة سريرية استعادية واحدة دون التحقق من النتائج عبر طعوم غريبة in vivo أو من خلال مجموعة خارجية مستقلة. كما لم يتم إجراء مقايسات إضافية للتكاثر (مثل مقايسات EdU وتكوين المستعمرات)، ومقايسات الغزو، والاستماتة، ودورة الخلية. وبالمثل، لم تتوفر اختبارات الدم المحيطي لتقييم إمكانيات التشخيص غير الجراحي، والتحقق من مستوى بروتين CADM1، والقائمة الكاملة للجينات المستهدفة المتداخلة، وتحليل شبكة التفاعل بين البروتينات (PPI) بشكل منهجي. وينبغي أن تتناول الأعمال المستقبلية هذه القيود، وأن تدرس بشكل أعمق المنظمات العلوية لـ miR-21-5p ومسارات إشارات CADM1 السفلية.
بشكل جماعي، يقدم هذا العمل أدلة أولية على أن miR-21-5p يعمل كـ microRNA مسبب للأورام، حيث يسرع من تكاثر سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) وهجرته والتهابه من خلال استهداف CADM1 بشكل مباشر، كما يتنبأ تعبيره العالي ببقاء المرضى على قيد الحياة بشكل غير مواتٍ.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي مصالح مالية أو غير مالية ذات صلة للإفصاح عنها.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| فورمالين منظم متعادل بتركيز 10% | Fisher Scientific (Fisherbrand™) | SF10-4 (نموذجي) | مثبت أنسجة؛ تقطيع الأنسجة إلى &سُمك أقل من 5 مم، تُثبَّت في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 14 و26 ساعة |
| طبق زراعة خلايا بـ 24 بئراً | Corning | 3526 | طبق لاستزراع الخلايا المنقولة جينياً وإجراء مقايسة التئام الجروح (الخدش) |
| الخط الخلوي A549 | ATCC (أو مركز شنغهاي للموارد) | CCL-185 | خط خلوي لسرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) لدى البشر (سرطان غدي) |
| طقم فحص CCK-8 | Dojindo | CK04 | الكشف عن التكاثر الخلوي |
| وسط زراعة الخلايا (غير محدد) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | متنوعة (على سبيل المثال، RPMI-1640: 1875093، وF-12K: 212702) | وسط أساسي لخطوط خلايا سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)؛ وتعتمد التركيبة الدقيقة على خط الخلايا المستخدم |
| cel-miR-39 (عنصر تحكم خارجي مضاف) | GenePharma (شنغهاي، الصين) | مخصص (على سبيل المثال، B010302) | مرجع خارجي لمعايرة تعبير الـ miRNA، يُضاف أثناء عزل الـ RNA |
| أول أكسيد الكربون2 حضّانة (مرطبة) | Thermo Fisher Scientific (Heracell) | Heracell 150i (5016047) | يوفر 37°C، 5% CO22، ورطوبة مشبعة لاستنبات الخلايا |
| البروتين التفاعلي-C/عامل نخر الورم-ألفا (CRP/TNF-α)αأزواج بادئات IL-6 | Sangon Biotech | التخليق المخصص | التسلسلات الكاملة في الملف التكميلي 1 |
| محلول صبغة البنفسج البلوري | Solarbio | G1062 | صباغة الخلايا المهاجرة |
| وسط DMEM | Gibco | 11965092 | لاستنبات خلايا H129/293T |
| طقم مقايسة المراسل لإنزيم اللوسيفيراز المزدوج | Promega | E1910 | الكشف عن المنطقة غير المترجمة '3 لجين CADM1 بنمطيه البري والطافر |
| cel-miR-39 خارجي المنشأ | Qiagen | إضافة معيار داخلي مخصص | أُضيفت خطوة ما بعد عزل الحمض النووي الريبي (RNA) لغرض التنميط (normalization) |
| مصل جنين البقر (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10437028 | مكمل يُضاف إلى وسط المزرعة بتركيز نهائي 10% لدعم نمو الخلايا |
| طرف ماصة دقيق (على سبيل المثال، 10 µL نصيحة) | Axygen (Corning) | T-300 | تُستخدم لكشط طبقة أحادية من الخلايا يدويًا لإنشاء "جرح" فجوة |
| GAPDH (ضابط داخلي) | موردون متعددون (على سبيل المثال، Sangon Biotech وRiboBio؛ وبادئات مخصصة) | مخصص | الجين المرجعي لمعايرة الـ mRNA المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) |
| GO/KEGG (توصيف clusterProfiler) | Bioconductor | إصدار 2026 | |
| GraphPad Prism | برمجيات GraphPad | v9.5.1 | التمثيل البياني & الإحصاءات المختبرية |
| خط خلايا H129 | ATCC (أو مركز شنغهاي للموارد) | CRL-5803 | خط خلوي لسرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC) بشري مشتق من نقيلة في العقد اللمفاوية |
| مصل جنين البقر المعطل حرارياً | Gibco | 10099141 | تركيز تشغيلي 10% |
| سلالة خلايا HEK-293T | ATCC | CRL-3216 | RRID:CVCL_063؛ تم اختبار تحليل STR شهرياً، وكانت نتيجة الكشف عن الميكوبلازما سلبية |
| مزيج تعبئة الفيروس البطيء | Genecopoeia (أو Takara Bio) | HPK-LvT-10 (Genecopoeia) | توفير بلازميدات التغليف (gag/pol, rev, vsv-g) لإنتاج الفيروسات البطيئة (lentivirus) |
| ناقل الفيروس البطيء-21 (LV-21) | GeneChem (شنغهاي، الصين) أو Genecopoeia | مخصص | ناقل فيروسي بطيء يحتوي على miR-21-5p لإنشاء خطوط خلوية ذات تعبير مستقر |
| ناقل الفيروس البطيء السلبي (LV-NC) | GeneChem (شنغهاي، الصين) أو Genecopoeia | مخصص | ناقل فيروسي لينتي (lentiviral vector) ضابط سلبي بدون إدراج miR-21-5p |
| كاشف ترانسفكشن ليبيدي | Thermo Fisher | L30015 | للتعداء العابر |
| كاشف ترانسفكشن Lipofectamine 30 | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | L30015 أو L3008 | كاشف ترانسفكشن قائم على الدهون؛ بعد 50 ساعة من عملية الترانسفكشن لإجراء التجارب اللاحقة |
| ميثانول | Sinopharm | 67-56-1 | تثبيت الخلايا |
| ميثانول (مثبت/مخف للتصبيغ) | Sigma-Aldrich | 34860 | يُستخدم كمثبِّت أو مخفِّف لصبغة البنفسج البلوري (crystal violet) |
| مثبط miR-21-5p/المثبط السلبي miR-21-5p | GenePharma | التصنيع المخصص | التسلسلات الواردة في الملف التكميلي 1 |
| محاكي miR-21-5p/محاكي ضابط سلبي (mimic-NC) | GenePharma | تخليق مخصص | التسلسلات الواردة في الملف التكميلي 1 |
| miRDB | جامعة واشنطن | الإصدار 6.0 | |
| miRWalk | جامعة هايدلبرغ | الإصدار 3.0 | |
| المركز الوطني لهندسة الخزعات | المركز الوطني لهندسة الخزعات (الصين) | نظرًا لعدم وجود نص مصدر متاح للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة. | مزود مؤسسي لعينات أنسجة سرطان الرئة مع بيانات سريرية مسجلة وتشخيص نسيجي مرضي |
| أنسجة سرطان الرئة غير صغير الخلايا (من أجل المزرعة الأولية) | شركة Shanghai Rui Bao He Biotechnology Co. | طلب مخصص | مصدر النسيج؛ تمت زراعته في وسط يحتوي على 10% من مصل جنين البقر (FBS) عند 37°Cتُختار الخلايا ذات المورفولوجيا الجيدة والتي تمر بمرحلة النمو اللوغاريتمي لعملية عفن الخلية (Transfection) |
| جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) | Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) | 750 Fast (406984) | الحصول على نواتج التضخيم لتقنية qRT-PCR |
| بنسلين-ستربتومايسين | Solarbio | P1400 | ١٠ وحدة/مل من البنسلين، 100 μg/mL ستريبتومايسين |
| ماصات (أحادية القناة & متعدد القنوات) | Eppendorf | سلسلة ريسيرش بلس (Research Plus) | لضمان التعامل الدقيق مع السوائل في جميع التجارب |
| بوليبرين | Sigma-Aldrich | H9268 | النهائي 5 μg/mL لإصابة الفيروسات البطيئة |
| بيوروميسين | InvivoGen | نمل-بر-1 | 5 μg/mL لفحص الخلايا المستقرة |
| ثنائي هيدروكلوريد البيوروميسين | Thermo Fisher Scientific (InvivoGen) | ant-pr-1 (InvivoGen)؛ P725 (Sigma-Aldrich) | المضاد الحيوي الانتقائي، المستخدم بتركيز 5 μg/mL لإنشاء خطوط خلوية معدلة وراثياً بشكل مستقر |
| R | مؤسسة R | v4.2.1 | الحزمة: clusterProfiler, ggplot2 |
| طقم النسخ العكسي | Takara | RR047 | تفاعل النسخ العكسي بنظام الحلقة الجذعية لـ miRNA، وبنظام oligo(dT) لـ mRNA |
| أنابيب إبندورف (EP) خالية من RNase | Axygen (Corning) | MCT-150-C | أنابيب سعة 1.5 مل خالية من إنزيم RNase لتخزين الحمض النووي الريبي (RNA) ومعالجته |
| وسط RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | لاستزراع خلايا A549 |
| si-CADM1 | GenePharma | تخليق مخصص | التسلسلات الواردة في الملف التكميلي 1 |
| si-NC | GenePharma | التخليق المخصص | التسلسلات في الملف التكميلي 1 |
| SPSS | IBM | v26.0 | تحليل انحدار كوكس السريري |
| مزيج SYBR Green qPCR الرئيسي | Roche | 4913914001 | تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) |
| TargetScan | معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (MIT) | v8.2 | |
| كاشف استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (Total RNA) | Takara | 9109 | التحلل القائم على الفينول/الغوانيدين |
| غرفة ترانس-ويل (Trans-well) | Corning (Costar) | 342 (بـ 24 بئراً، 8.0 µm) | لإجراء ترانسفكشن (transfection) للخلايا في وسط زراعي في درجة حرارة الغرفة؛ تُضاف البادئات الكيميائية وتُحضن لمدة 48 ساعة. |
| غرف هجرة الخلايا من نوع Transwell | Corning | 3422 | 8 μm حجم المسام |
| كاشف TRIzol | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 15596026 | استخلاص الحمض الريبي النووي الكلي (Total RNA) من عينات الأنسجة؛ وتقييم جودة الحمض الريبي النووي عن طريق نسب الامتصاص الضوئي OD260/280 وOD260/230 |
| تربسين-إيديتات الكالسيوم ثنائية الصوديوم (0.25%) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 25200072 | لفصل الخلايا عن أوعية الزرع قبل استزراعها في أطباق ذات 24 بئراً |
المراجع
- Bautista-Sánchez D, et al. The promising role of miR-21 as a cancer biomarker and its importance in RNA-based therapeutics. Mol Ther Nucleic Acids. 2020;20:409-20.
- Zhou J, et al. Global burden of lung cancer in 2022 and projections to 2050: incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Cancer Epidemiol. 2024;93:102693.
- Nicholson AG, et al. The 2021 WHO classification of lung tumors: impact of advances since 2015. J Thorac Oncol. 2022;17(3):362-87.
- The Lancet Regional Health – Europe. NSCLC: bridging the gap between clinical progress and real-world application. Lancet Reg Health Eur. 2024;38:100878.
- Reyes J, et al. Oncogenic and tumor-suppressive forces converge on a progenitor niche at the benign-to-malignant transition. Cell. 2026;189(10):2875-97.e53.
- Yu L, Yang R, Long Z, Tao Q, Liu B. Targeted therapy of non-small cell lung cancer: mechanisms and clinical trials. Front Oncol. 2024;14:1451230.
- O'Brien J, Hayder H, Zayed Y, Peng C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 2018;9:402.
- Treiber T, Treiber N, Meister G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(1):5-20.
- Ohno S, Kuroda M. Exosome-mediated targeted delivery of miRNAs. Methods Mol Biol. 2016;1448:261-70.
- Ell B, Kang Y. MicroRNAs as regulators of bone homeostasis and bone metastasis. Bonekey Rep. 2014;3:549.
- Dedeoğlu BG. High-throughput approaches for microRNA expression analysis. Methods Mol Biol. 2014;1107:91-103.
- Qu K, et al. Circulating miRNA-21-5p as a diagnostic biomarker for pancreatic cancer: evidence from comprehensive miRNA expression profiling analysis and clinical validation. Sci Rep. 2017;7(1):1692.
- Xu H, et al. Engineered exosomes transporting the lncRNA, SVIL-AS1, inhibit the progression of lung cancer via targeting miR-21-5p. Am J Cancer Res. 2024;14(7):3335-47.
- Chawra HS, et al. MicroRNA-21's role in PTEN suppression and PI3K/AKT activation: implications for cancer biology. Pathol Res Pract. 2024;254:155091.
- Huang Y, Feng G. MiR-423-5p aggravates lung adenocarcinoma via targeting CADM1. Thorac Cancer. 2021;12(2):210-7.
- Hartsough EJ, et al. CADM1 is a TWIST1-regulated suppressor of invasion and survival. Cell Death Dis. 2019;10(4):281.
- Li H, Gao J, Zhang S. Functional and clinical characteristics of cell adhesion molecule CADM1 in cancer. Front Cell Dev Biol. 2021;9:714298.