يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

طريقة خزعة جديدة لجمع الخلايا اللمفاوية الخبيثة وغير الخبيثة لسمكة الزرد

120 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/72153

⸱

أغسطس 7, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Division of Pediatric Hematology-Oncology, Department of Pediatrics, Stephenson Cancer Center, 3Department of Microbiology & Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center

في هذه المقالة

ملخص

تسمح طريقة خزعة جديدة بجمع خلايا سرطان الدم اللمفاوية الحادة من سمك الزرد الحي. تظهر النتائج وفرة لخلايا اللمفاوية في قشور الأسماك البرية (WT)، وزيادة كبيرة في الخلايا اللمفاوية في قشور الأسماك المصاحبة لسرطان الدم اللمفاوي الحاد (ALL). تسمح هذه التقنية بدراسة طفيفة التوغل للخلايا اللمفاوية الطبيعية والخبيثة في البشرة.

الملخص

سمك الزرد (Danio rerio) هو نموذج قوي لدراسة التلهم اللمفاوي وسرطانات اللمفاويات، حيث يشترك سمك الزرد والبشر في أنظمة مناعة تكيفية متشابهة، بما في ذلك الخلايا B وT. تم وصف عدة نماذج لسرطان الدم اللمفاوي الحاد لخلايا D. rerio (T-ALL)، بما في ذلك الأسماك التي تعبر عن سرطان الدم اللمفاوي البشري (hMYC) الخاص باللمفاويات. أبلغنا أن أسماك rag2:hMYC أيضا تطور سرطان الدم اللمفاوي الحاد من خلايا B (B-ALL)، مما يجعلها مفيدة لدراسة كلا النوعين ALL. أحد قيود نماذج ALL لسمكة الزرد هو عدم وجود طرق غير قاتلة لأخذ عينات تسلسلية من جميع أنواع السمكة (ALL). ولمعالجة ذلك، ابتكرنا طريقة جديدة ل'خزعة القشور' لجمع جميع الخلايا من سمك الزرد الحي. ومع ذلك، فإن المعرفة حول أي الخلايا اللمفاوية تعيش في قشور سمك الزرد الطبيعية نادرة. لذا، لتحديد هويات الخلايا اللمفاوية الجلدية الطبيعية، أجرينا خزعات على نطاق واسع على خطوط معدلة وراثيا معلمة بالخلايا اللمفاوية والتي تفتقر إلى rag2:hMYC. استخدمنا المجهر التقليدي والكونفوكالي لتحليل القشور، وكشفنا عن وفرة من الخلايا اللمفاوية البشرية. كما قمنا بتحليل قشور الأسماك التي تحتوي على T- وB-ALL، والتي أظهرت زيادة ملحوظة في الخلايا اللمفاوية في صفائح متلاطمة من خلايا ALL في العديد من القشور. بعد ذلك استخدمنا فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) لتنقية الخلايا اللمفاوية غير الخبيثة وALL من القشور لدراسات خارج الجسم الحي . أظهرت تحليلات تدفق الخلايا والتعبير لجميع الخلايا من قشور أو أنسجة أخرى لنفس السمك أن تعبير جينات جميع الخلايا على المقياس يشبه تعبير جميع الخلايا في أماكن أخرى. كما قمنا بقياس عدد الخلايا الطبيعية T وB وT-ALL وB-ALL التي يمكن تنقيتها لكل مقياس. بشكل عام، يوفر الخزعة بالمقياس تقنية غير قاتلة وقليلة التوغل لدراسة الخلايا اللمفاوية الجلدية لسمك الزرد، مما يمكن من إجراء دراسات خارج الجسم الحي ، بما في ذلك تحليل عينات خبيثة.

المقدمة

وظيفة الحاجز وأدوار جلد الثدييات في المناعة محددة 1,2,3. تساهم الخلايا اللمفاوية الثديية في المناعة الجلدية، حيث توجد خلايا T سامة في البشرة، وتوجد خلايا B وT وخلايا القاتل الطبيعية (NK) في الأدمة 1,3,4,5. يمتلك سمك الزرد هذه اللمفاويات، مع غلوبولينات مناعية سطحية، ومستقبلات الخلايا التائية، ومستقبلات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC)، والسيتوكينات ومستقبلاتها، وجزيئات مناعية أخرى، وبالتالي يشترك في معظم الخصائص المناعية الثديية 6,7,8,9. أظهرت الدراسات الحديثة على جلد وحراشف سمك الزرد تجمعات مختلفة من الخلايا اللمفاوية الجلدية، بما في ذلك الخلايا التائية وB الطهارية10,11، وشبكة لمفاوية تسهل حركة الخلايا التائية ومراقبة المستضدات12. تجعل التشابهات بين الخلايا اللمفاوية في أسماك التليوست والثدييات D. rerio نموذجا قويا في الجسم الحي لدراسة التلمفاوية، وظيفة الخلايا اللمفاوية، وأمراض اللمفاوية، بما في ذلك سرطان الدم اللمفاوي الحاد (ALL)8,10,13,14,15,16,17,18,19,20.

أظهرت أعمالنا السابقة أن سلالة T وB ALL (T-ALL, B-ALL) تنشأ في سمك الزرد المعدلة وراثيا في rag2:hMYC، مما يجعل هذا الخط مفيدا لدراسة كلا النوعينALL 13,15,21,22. أحد القيود الرئيسية لنماذج D. rerio ALL، خاصة في دراسات التعبير الطولي أو دراسات اختبار المخدرات، هو نقص الطرق لجمع عينات ALL التسلسلية من الحيوانات الفردية. الطرق السابقة، مثل جمع الدم الرجعي الحجاج، كانت صعبة تقنيا بسبب صغر حجم D. rerio، مما يجعل أخذ عينات الدم المتسلسلة أمرا صعبا23. لذا، يقوم معظم الباحثين بقتل أسماك الزرد للتخلص من جميع الخلايا. كان هذا ممارسة شائعة في المختبر ومعظم الباحثين في الميدان، لكنه يمنع القدرة على إجراء تجارب طولية على الحيوانات الحية. لتجاوز ذلك، وصفنا مؤخرا الخلايا اللمفاوية الطهارية T و B في قشور سمك الزرد التي جمعت باستخدام استراتيجية خزعة غير قاتلةللقشور 10. أظهرت دراسة حديثة أخرى وجود خزان خلية T على/بالقرب من سطح سمك الزرد، بين الحراشفالمجاورة 12. يحتوي D. rerio على مئات القشور، التي تتجدد بسرعة بعد أيام قليلة من إزالة24. تشير هذه النتائج والميزات معا إلى أن قشور سمك الزرد هي مصدر للخلايا اللمفاوية التي لا تتطلب القتل الرحيم، مما يمكن من إجراء دراسات طولية على الأسماك الحية.

هنا، نصف طريقة خزعة على المقياس لجمع الخلايا اللمفاوية الجلدية لسمكة الزرد من الأسماك التي تحتوي على علامات فلوروفور خاصة بالخلايا اللمفاوية، مع أو بدون ALL. لدراسة خلايا T-Line، استخدمنا أسماك lck:GFP معروفة جيدا وسلالة مشابهة من lck:mCherys؛ كل من الخلايا T وT-ALL 10,13,15,20. لدراسة خلايا السلالة B، استخدمنا أسماك معدلة وراثيا cd79a:GFP وcd79b:GFP مع خلايا B وB-ALL الموسومة فلورية 10,13,17. كل من هذه الخطوط يسمح بالتصور بالمجهر الفلوري وتنقية الخلايا بالفرز الخلوي بتدفق13. قمنا بفحص القشور بعد الخزعة، وتوليد صور عالية الدقة لخلايا اللمفاوي في القشور، وتحديد تعبير جينات الخلايا اللمفاوية في البشرة عبر qRT-PCR، ومقارنته مع تلك الخاصة بالخلايا اللمفاوية من أنسجة لمفاوية أخرى لنفس السمكة، وقياس الخلايا اللمفاوية لكل مقياس عن طريق قياس التدفق الخلوي/فرز الخلايا المنشطة بالفلورة. باختصار، يصف البروتوكول طريقة بسيطة وعملية للحصول على الخلايا اللمفاوية من أسماك الزرد الحية، بما في ذلك أخذ عينات من الحيوانات الفردية طوليا عبر عدة نقاط زمنية في تسلسل تجريبي. تهدف هذه الطريقة إلى دراسة بيولوجيا الخلايا اللمفاوية لسمك الزرد، وتطور سرطان الدم، واستجابات الأدوية، أو تصاميم تجريبية طولية أخرى تتطلب أخذ عينات متكررة من كل سمكة زرد منفردة. طورنا البروتوكول باستخدام سمك الزرد البالغ المعدلة وراثيا مع مجموعات من الخلايا اللمفاوية الموسومة بالفلورية وتحقق من صورته في التطبيقات اللاحقة، بما في ذلك المجهر التألقي، وقياس تدفق الخلايا الخلوي/الفرز النشط بالفلورة، وتحليلات تعبير الحمض النووي الريبي، ودراسات خارج الجسم التي تتطلب خلايا لمفاوية قابلة للحياة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مركز العلوم الصحية بجامعة أوكلاهوما (البروتوكولات 24-028-EAH و 25-068-EACHIR). يقدم هذا البروتوكول نهجا لعزل وتحليل الخلايا اللمفاوية الطبيعية و/أو الخبيثة من قشور سمك الزرد الحي، مع تفاصيل حول الغرض والتنفيذ والمبادئ التي تقوم عليها هذه الإجراءات.

تحذير: MS-222 هو مخدر كيميائي خطير ويجب التعامل معه باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة مثل قفازات المختبر، واقيات العين، ومعطف المختبر. التخلص من محاليل MS-222 وفقا لإرشادات النفايات الكيميائية المؤسسية. كن حذرا عند التعامل مع الإبر والملاقط لمنع الإصابات الحادة. اعتبر جميع العينات البيولوجية التي قد تكون خطيرة بيولوجيا والتخلص من النفايات وفقا لإجراءات السلامة البيولوجية المؤسسية.

1. تحضير وسائط الفرز

  1. مكمل 1× محلول RPMI 1640 مع 1٪ مصل بقري جنيني (FBS) و1٪ بنسلين/ستريبتومايسين.
    ملاحظة: يحافظ وسائط RPMI 1640 على بقاء الخلايا اللمفاوية خارج الجسم الحي. يمكن استبدال RPMI 1640 ب 0.9× PBS. مزود مصل الأبقار الجنيني (FBS) عوامل نمو لتعزيز القدرة على العيش الخلوي. البنسلين والستريبتوميسين يحدان التلوث البكتيري.
  2. يقوم أليكوت بوسائط أليكوت إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة بحجم 1.5 مل في أحجام 500 ميكرولتر، مع تخصيص كل أنبوب ل 10–20 مقياسا. استمر في فرز أنابيب الوسائط على الثلج.

2. تخدير سمك الزرد، فحص المجهر الفلوري، والتصوير

  1. تم تخدير D. rerio باستخدام ترايسين ميثانيسلفونات (MS-222) المخازف بنسبة 0.02٪ المحضر وفقا لإرشادات رعاية الحيوانات المؤسسية باستخدام ماء من نظام الأسماك.
  2. بعد التخدير، ضع السمكة بلطف في طبق لزراعة الخلايا مع كمية كافية من ماء النظام (بالإضافة إلى 0.02٪ MS-222) للحفاظ على الرطوبة أثناء التعامل لاحقا.
  3. فحص وتصوير الأسماك المخدرة باستخدام مجهر فوق فلوري للكشف عن التألق من الجينات المعدلة. تحدد هذه الخطوة المقاييس الفلورية للخزعة.
    ملاحظة: يمكن رؤية الخطوط التي تفتقر إلى الجينات المنقولة الفلورية عبر المجهر الضوئي القياسي.
  4. استخدم الفلورة لتحديد الخلايا التائية (lck:GFP أو lck:mCherry fish) أو T-ALL (rag2:hMYC + lck:GFP أو lck:mCherry fish). خلايا خط T تكون فلورية ساطعة في هذه الخطوط؛ خلايا B-ALL متوهجة بشكل خافت في خلفيات lck:GFP و lck:mCherry 13، 15، 21.
  5. الفحص B-Lineage – الموسوم ب cd79a:GFP أو cd79b:GFP (مع أو بدون rag2:hMYC) لخلايا B الجلدية و/أو B-ALL، باستخدام GFP لاختيار مقاييس الخزعة.
  6. تدرب على وضع سمك الزرد وضبط إعدادات المجهر قبل الخزعة إذا كان التصوير مطلوبا
    ملاحظة: يتطلب التصوير والخزعة من 5 إلى 7 دقائق من التخدير عبر نسبة MS-222 بنسبة 0.02٪. راقب حركة الأوركال باستمرار. إذا تباطأت الحركة العملية بشكل ملحوظ أو توقفت، انقل السمكة فورا إلى ماء نظام خال من التخدير وأوقف الخزعة. أعد وضع ~50–100 ميكرولتر من ماء السمك المحتوي على الجلد والقشرة والخياشيم كل دقيقة إلى دقيقتين أثناء التصوير والخزعة للحفاظ على رطوبة السطح.

3. جمع وتحضير السلالم

  1. لوضع السمكة للخزعة، ضع السمكة المخدرة على جانبها في طبق لزراعة الخلايا.
  2. لمنع السمكة من الانزلاق أثناء الخزعة، استخدم إسفنجة رطبة مع فتحة خطية أو على شكل حرف V وضعها في طبق زراعة الخلايا لحمل السمكة.
  3. بدلا من ذلك، تأكد من أن مستوى ماء النظام يغطي بالكاد قاع طبق زراعة الخلايا (بما يكفي للحفاظ على رطوبة السطح) للسماح بالتوتر السطحي لتثبيت السمكة.
  4. قم بتطبيق ~50–100 ميكرولتر من MS-222 بنسبة 0.02٪ المحضر في ماء النظام بشكل دوري على الأوبكوما والخياشيم للحفاظ على الرطوبة والحفاظ على التخدير أثناء التصوير والخزعة.
  5. إجراء خزعة باستخدام المجهر الفلوري لاختيار قشور فلورية عالية غنية بالخلايا اللمفاوية أو جميع الخلايا.
  6. اجمع 10–20 قشورا متجاورة من منطقة فلورية واحدة عالية، ويفضل أن تكون ضمن الشريط الأفقي المصبوغ الأول أو الثاني.
    ملاحظة: عادة ما يكون مقياس واحد كافيا للتصوير. عادة ما تنتج مجموعة من 10–20 قشرفة >1,000 خلية لمفاوية من أسماك WT، ويوصى بها للتحليلات اللاحقة مثل قياس خلوي التدفق وqRT-PCR.
  7. اليد المسيطرة (الإبرة): استخدم إبرة حقنة عيار 31، ضع طرف الإبرة برفق تحت الحافة الخلفية للقشور، واقلبها للأمام (أي الرأس). استخدم إبرة معقمة مختلفة لكل سمكة. ملاقط نظيفة بين الأسماك؛ التعقيم إذا كانت الإجراءات المؤسسية مطلوبة.
    ملاحظة: رفع الميزان بالإبرة أفضل من استخدام الملقط فقط، لأنه يرفع القشرة لتقليل كشط السطح. هذا يضمن بقاء الطبقة الرقيقة تحت القشور ملتصقة بسطح الحشرة، وهو أمر حاسم لتعظيم إنتاج الخلية.
  8. اليد غير المسيطرة (الملقط): عند إمساك الميزان في وضعية مقلوبة للأمام باستخدام الإبرة، أمسك السطح الخارجي الصلب للميزان باستخدام الملقط. بحركة سلسة، انتزع الميزان من جيبه.
    ملاحظة: قد يحدث نزيف بسيط في مواقع استخراج الحراشف، والذي يكون عادة محدودا ذاتيا.
  9. إذا حدث نزيف زائد، اضغط بلطف باستخدام الملقط واشطف لفترة وجيزة ب MS-222 بنسبة 0.02٪ في ماء الجسم.
    ملاحظة: يمكن تحقيق التعقيم الدموي خلال ثوان قبل الانتقال إلى السلم التالي.
  10. لأخذ خزعة من عدة قشور، اجمع 10–20 قشور لكل سمكة، مع إزالة القشور المجاورة من منطقة متجاورة في شريط أفقي واحد مصبوغ، بدلا من عدة مناطق من الجسم أو كلا جانبي الحيوان.
  11. قم بنزع القشور الفردية بشكل متسلسل واحتفظ بها على أطراف الملقط أثناء الجمع مع مواجهة سطح القشرة الوسطى للأعلى.
  12. لتجنب تداخل القشور المتراكمة مع إزالة الحراشف لاحقا، اقلب كل قشرة للأمام أولا ثم أمسكها من حافتها الخلفية. نقل القشور إلى أنبوب يحتوي على وسط فرز بعد جمع كل 5 قشور، أو عندما لا يمكن الاحتفاظ بقشور إضافية بأمان على أطراف الملقط.
  13. بعد جمع المقياس، قم بمعالجة العينات بأسرع وقت ممكن. نقل القشور فورا من الملقط إلى أنابيب بسعة 1.5 مل تحتوي على 500 ميكرولتر من وسائط الفرز الباردة على الجليد للحفاظ على بقاء الخلية. قم بتطهير الملقط بين الأسماك باستخدام 70٪ إيثانول قبل جمع العينات التالية. معالجة القشور من كل سمكة في أنابيب منفصلة خلال الجمع، والتفكيك، والتحليلات في اتجاه مجرى النهر.
  14. بعد جمع القشور، انقل الأسماك فورا إلى حوض استعادة مع مياه عذبة بدون نظام MS-222.
  15. راقب حركة العمليات وسلوك السباحة حتى تستعيد التنفس والوضعية الطبيعية. راقب موقع الخزعة بحثا عن نزيف مستمر أو علامات ضيق قبل إعادة السمكة إلى الجهاز المعاد تدويرها.
  16. أعد السمكة إلى حوضها الأصلي بعد التوازن الطبيعي واستئناف السباحة.

4. تفكك الخلايا والترشيح

  1. تحقق من الموازين في أسفل الأنبوب. تكون القشور مرئية بسهولة بالعين المجردة قبل الانفصال. قم بفصل القشور باستخدام أداة تجانس مدقة أنابيب دقيقة بلاستيكية معقمة عن طريق تطبيق ضغط يدوي لطيف ومتحكم فيه لمدة 30–60 ثانية.
  2. استخدم حركة دورانية بطيئة وصعودا وهبوطا لتحرير خلايا البشرة مع تجنب القص المفرط للقشور.
  3. استمر في الانفصال حتى يصبح الوسائط التحليلية عبيثة بشكل واضح.
    ملاحظة: يشير نجاح الإجراء إلى تشويش الوسط، مما يشير إلى تركيز عال من الخلايا المحررة المعلقة.
  4. تمرير عينات متجانسة عبر فلتر شبكي نايلون بحجم 35 ميكرومتر لإزالة الحطام وتوليد تعليق خلية واحدة لفرز الخلايا المنشطة بالفلورية.
  5. إذا كانت هناك تجمعات خلوية مرئية بعد الترشيح الأولي، مرر العينة عبر مرشح شبكة جديد بحجم 35 ميكرومتر مرة أخرى مباشرة قبل تحليل التدفق الخلوي. لا يتجاوز الترشيح مرتين إجمالا لتقليل فقدان الخلايا.

5. تحليل التدفق الخلوي

  1. تحليل العينات باستخدام قياس تدفق الخلية.
    ملاحظة: يمكن إجراء قياس تدفق الخلايا قبل تنقية فرز الخلايا بالفلورة أو استخراج الحمض النووي الريبي لتقييم تركيب العينة.
  2. تحليل أنظمة التعليق أحادية الخلية باستخدام مقياس تدفق خلوي مزود بليزر 488 نانومتر للكشف عن GFP وليزر 561 نانومتر للكشف عن mCherys.
  3. استبعد الحطام باستخدام معلمات التشتت الأمامي (FSC) والتشتت الجانبي (SSC). حدد الخلايا اللمفاوية باستخدام بوابة الخلايا اللمفاوية الموصوفة سابقا 10,13,21.
  4. استبعد تجمعات الخلايا عبر معايير البوابات المفردة (أي المساحة في ال SSC [SSC-A] مقابل ارتفاع SSC [SSC-H]).
  5. تقييم بقاء الخلايا باستخدام يوديد البروبيديوم (PI) أو صبغة مكافئة من الصبغة الحية/الميتة. استبعاد الخلايا الإيجابية ل PI من التحليلات وإجراءات الفرز اللاحقة.
  6. إنشاء بوابات فلورية باستخدام ضوابط أسماك الزرد غير المعدلة وراثيا وضوابط فلورية معدلة وراثيا بلون واحد. حدد مجموعات إيجابية ل GFP وmCherry الإيجابية مقارنة بمجموعة التحكم السلبية.
  7. تصدير ملفات معيار قياس التدفق الخلوي (FCS) وتحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل التدفق الخلوي.

6. فرز الخلايا المنشطة بالفلورة

  1. لفرز الخلايا، استخدم فرز الخلايا المنشط بالفلورة مزود بليزر 488 نانومتر و/أو 561 نانومتر للكشف عن GFP وmCherys.
  2. الخلايا اللمفاوية ذات البوابة التسلسلية (FSC/SSC)، والخلايا المفردة (SSC-A مقابل SSC-H)، والخلايا الحية (PI-سالبة) قبل الفرز القائم على التألق.
  3. حدد مجموعاتGFP الإيجابية lo، GFPhi، وmCherry باستخدام بوابات فلورية تم إنشاؤها من عينات تحكم سلبية.
  4. فرز مجموعات GFPlo،GFP hi، وmCherry الإيجابية في أنابيب جمع تحتوي على وسط فرز مبرد.
    ملاحظة: في هذا العمل مع خط lck:GFP ، الخلايا ذات GFP عالية (GFPhi) مقابل منخفضة GFP (GFP lo) هي سلالات لmphocyte مميزة، كما هو موضح سابقا10،13،15،21.
  5. حافظ على العينات المرتبة على الجليد والتوجه فورا إلى التطبيقات اللاحقة، مثل عزل RNA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باتباع الخطوات السابقة، قمنا بتخدير وفحصنا سمك الزرد البالغ للكشف عن الخلايا اللمفاوية الفلورية أو ALL عبر المجهر. أظهرت أسماك النوع البري (WT) lck:GFP فلورة بشكل رئيسي في منطقة الغدة الزعترية، بينما أظهرت أسماك cd79b:GFP فلورة في منطقة الرأس/الخياشيم، متوافقا مع الملاحظات السابقة10 (الشكل 1A، على اليسار). على النقيض من ذلك، أظهرت أسماك rag2:hMYC; lck:GFP/lck:mCherry ذات T-ALL أو rag2:hMYC ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول طريقة خزعة غير قاتلة بالقشور لجمع الخلايا اللمفاوية الجلدية لسمكة الزرد، بما في ذلك الخلايا اللمفاوية غير الخبيثة وخلايا سرطان الدم اللمفاوي الحادة (ALL). تعد أسماك الزرد نماذج راسخة لتكوين اللمفاوية والأورام اللمفاوية، لكن معظم الطرق للحصول على الخلايا اللمفاوية تتطلب القتل الرحيم وتشريح الأنسجة، مما يمنع الدراسات الطولية للحيوانات الفردية 8,10,13,15.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد تضارب مالي في المصالح لدى المؤلفين.

شكر وتقدير

نشكر أميرة حسن، M.B.B.S. ودكتوراه، وبراشي وود على مساهماتهم في هذا المشروع. وقد دعمت الدراسات برنامج منح مركز ستيفنسون للسرطان التجريبي التابع لمركز OUHSC، ومركز أوكلاهوما لأبحاث الخلايا الجذعية البالغة (OCASCR)، وبرامج منح العلوم والبذور التابعة لمؤسسة الصحة المشيخية المشيخية، ومؤسسة عائلة دبليو. جي. جونز. تم تمويل مركز ستيفنسون للسرطان في مركز ستيفنسون لأبحاث علم الأحياء الجزيئي والقياس الخلوي بتمويل من منحة دعم مركز NCI للسرطان P30 CA225520. وقد تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال تمويل من الجمعية الأمريكية للسرطان (ACS-POST-BACC-23-1156971-01-DPBACC). إيمان أوينز هي باحثة في برنامج "STRONG" بعد البكالوريوس في ACS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Reagents & Consumables:
Tricaine methanesulfonate (MS-222)Sigma-AldrichE10521عامل التخدير
RPMI 1640 mediumThermoFisher11875093وسط لبقاء الخلايا الليمفاوية
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF2442لبقاء الخلايا
Penicillin-StreptomycinThermoFisher15140122لتحديد التلوث البكتيري
70% ethanolThermoScientificT038181000لتعقيم الملاقط
CellPro 1x PBSVWR104027-280للتخفيف إلى 0.9x بالماء المعقم
Propidium IodideInvitrogenP1304MMPتمييز الخلايا الحية/الميتة لتدفق/FACS
Cut Goods Misc-Pn; Size: 12 x 12 IN. 35um filter paper
Lab Pak 03-35/16		Sefarلفرز الخلايا
المرجع: Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. عزل الخلايا ب وسرطانية وغير سرطانية من الأسماك الزريقة lck:Egfp. J Vis Exp. 10.3791/59191 (144), (2019).
Alternative for filter paper: EASYstrainer Cell Sieves, Greiner Bio-OneGreiner89508-342لفرز الخلايا
Eppendorf® Flex-Tubes® Microtubes, 1.5 mlEppendorf®20901-551أنبوب الميكروسنتيفوج لفرزة الخلايا
UltiCare VetRx U-100 Insulin Syringes 3/10cc 31G x 5/16" Half Unit MarkingUltiCare9436للخزعات
100 x 25 mm Deep Petri DishUSA Scientific8609-0625للخزعات
Bel-Art® Disposable PestlesBel-Art®BAF199230001لتفكيك الخزعات
E-Z Pik 6-Piece Tweezer SetAven18480EZللخزعات
Corning® microscope slides, frosted one side, one endSigma-AldrichCLS294875X25للتصوير
Cover glassesSigma-AldrichC8181للتصوير
SlowFade™ Glass Soft-set Antifade Mountant, with DAPIThermoFisherS36920لتركيب الخزعات على الشريحة
RNeasy Mini KitQiagen74104لإستخراج الحمض النووي الريبي
المعدات:
Nikon AZ100 microscope and DS-Qi1MC cameraNikonمجهر فلوريسنت وكاميرا
CFX96 Touch-PCR SystemBio-Rad3600037
CytoFLEXBeckman-Coulterتحليلات التدفق الخلوي
Leica SP8Leicaمجهر متحد البؤر
البرنامج:
Kaluza Analysis software version 2.1Beckman-Coulterتحليلات التدفق الخلوي
المرجع: https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads
LAS-X software version 3.7.4.23463Leicaمجهر متحد البؤر
المرجع: https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/

المراجع

  1. Egawa G, Kabashima K. Skin as a peripheral lymphoid organ: revisiting the concept of skin-associated lymphoid tissues. J Invest Dermatol. 2011;131(11):2178–85.
  2. Matejuk A. Skin immunity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2018;66(1):45–54.
  3. Zhang C, Merana GR, Harris-Tryon T, Scharschmidt TC. Skin immunity: dissecting the complex biology of our body's outer barrier. Mucosal Immunol. 2022;15(4):551–61.
  4. Kupper TS, Fuhlbrigge RC. Immune surveillance in the skin: mechanisms and clinical consequences. Nat Rev Immunol. 2004;4(3):211–22.
  5. Lafouresse F, Groom JR. A task force against local inflammation and cancer: lymphocyte trafficking to and within the skin. Front Immunol. 2018;9:2454. doi:10.3389/fimmu.2018.02454
  6. Danilova N, Bussmann J, Jekosch K, Steiner LA. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nat Immunol. 2005;6(3):295–302.
  7. Hansen JD, Landis ED, Phillips RB. Discovery of a unique Ig heavy-chain isotype (IgT) in rainbow trout: implications for a distinctive B cell developmental pathway in teleost fish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(19):6919–24.
  8. Page DM, et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 2013;122(8)–e11.
  9. Sunyer JO. Evolutionary and functional relationships of B cells from fish and mammals: insights into their novel roles in phagocytosis and presentation of particulate antigen. Infect Disord Drug Targets. 2012;12(3):200–12.
  10. Park G, et al. Diverse epithelial lymphocytes in zebrafish revealed using a novel scale biopsy method. J Immunol. 2024;213(12):1902–14.
  11. Zhou Q, et al. Cross-organ single-cell transcriptome profiling reveals macrophage and dendritic cell heterogeneity in zebrafish. Cell Rep. 2023;42(7):112793. doi:10.1016/j.celrep.2023.112793
  12. Robertson TF, et al. A tessellated lymphoid network provides whole-body T cell surveillance in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(20). doi:10.1073/pnas.2301137120
  13. Park G, et al. Zebrafish B cell acute lymphoblastic leukemia: new findings in an old model. Oncotarget. 2020;11(15):1292–305.
  14. Ferrero G, et al. The macrophage-expressed gene (mpeg) 1 identifies a subpopulation of B cells in the adult zebrafish. J Leukoc Biol. 2020;107(3):431–43.
  15. Borga C, et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. 2019;33(2):333–47.
  16. Tian Y, et al. The first wave of T lymphopoiesis in zebrafish arises from aorta endothelium independent of hematopoietic stem cells. J Exp Med. 2017;214(11):3347–60.
  17. Liu X, et al. Zebrafish B cell development without a pre-B cell stage, revealed by CD79 fluorescence reporter transgenes. J Immunol. 2017;199(5):1706–15.
  18. Wan F, et al. Characterization of gamma delta T cells from zebrafish provides insights into their important role in adaptive humoral immunity. Front Immunol. 2016;7:675. doi:10.3389/fimmu.2016.00675
  19. Moore FE, et al. Single-cell transcriptional analysis of normal, aberrant, and malignant hematopoiesis in zebrafish. J Exp Med. 2016;213(6):979–92.
  20. Langenau DM, et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(19):7369–74.
  21. Burroughs-Garcia J, et al. Isolating malignant and non-malignant B cells from lck zebrafish. J Vis Exp. 2019;(144):59191. https://www.jove.com/t/59191/isolating-malignant-and-non-malignant-b-cells-from-lckegfp-zebrafish
  22. Borga C, et al. Molecularly distinct models of zebrafish Myc-induced B cell leukemia. Leukemia. 2019;33(2):559–62.
  23. Pugach EK, Li P, White R, Zon L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. 2009;(34):1645. https://www.jove.com/t/1645/retro-orbital-injection-in-adult-zebrafish
  24. Iwasaki M, Kuroda J, Kawakami K, Wada H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 2018;437(2):105–19.
  25. Traver D, et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 2003;4(12):1238–46.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

234 234
الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.