مقالة منهجية

قياس إصلاح كسور الحمض النووي DNA مزدوجة السلسلة باستخدام مقايسة DR-white في ذبابة Drosophila melanogaster

58 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/72635

⸱

أغسطس 14, 2026

 , 
1Department of Human Science, Georgetown University

في هذه المقالة

ملخص

يعد مقايسة DR-white مقايسة مراسل جيني متعددة الاستخدامات للكشف عن نتائج إصلاح كسر شريط DNA المزدوج في الكائن متعدد الخلايا Drosophila melanogaster.

الملخص

غالبًا ما تقتصر الدراسات التقليدية حول إصلاح كسر شريطي الحمض النووي (DSB) على الاستقصاءات البيوكيميائية أو الأنظمة وحيدة الخلية (مثل الخلايا والخميرة). ولتسهيل دراسات إصلاح DSB في كائن متعدد الخلايا، نستخدم مقايسة DR-white في ذبابة Drosophila melanogaster. تعد مقايسة DR-white مقايسة مراسلة لإصلاح DSB، بسيطة ومتعددة الاستخدامات، تحمل تسلسلاً واحداً للتعرف على إنزيم I-SceI، والذي يمكن شطره عن طريق التعبير عن ميغانيوكلياز I-SceI. يمكن تحفيز التعبير عن I-SceI بشكل بنيوي، أو عبر الصدمة الحرارية، أو تحت محفزات أخرى، مما يتيح استقصاء عمليات الإصلاح النوعية للأنسجة أو المراحل التنموية. وتكمن الميزة الأساسية لهذه المقايسة في قدرتها على التمييز بين نتائج الإصلاح التي تتضمن إعادة الاندماج المتماثل (HR)، والربط الطرفي غير المتماثل (NHEJ)، والالتحام أحادي الشريط (SSA). يوفر هذا المقال بروتوكولاً مفصلاً لمقايسة DR-white المعتمدة، بما في ذلك سير عمل خطوة بخطوة لتحفيز DSBs في الخط الجرثومي قبل الانقسام الاختزالي وتحليل أحداث الإصلاح ظاهرياً عن طريق تقييم النسل. كما يصف التحليل الجزيئي لأحداث الإصلاح باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والتسلسل، ونص R الخاص بتتبع عمليات الإدراج والحذف عن طريق التفكيك (TIDE). يوفر هذا البروتوكول أداة مفيدة لاستقصاء الآليات الجينية والجزيئية لإصلاح الحمض النووي في نموذج كائن حي.

المقدمة

تتعرض السلامة الجينومية بشكل متكرر لتلف في الحمض النووي DNA، وتعتبر الكسور مزدوجة السلسلة (DSBs) سامة بشكل خاص من بين هذه الآفات. وإذا تُرِكت هذه الكسور دون إصلاح، فقد تؤدي إلى فقدان جيني، وإعادة ترتيب الكروموسومات، وموت الخلايا1. وبناءً على ذلك، طورت الخلايا مسارات متعددة لإصلاح الكسور مزدوجة السلسلة. حيث يقوم الربط الطرفي غير المتماثل (NHEJ) بربط طرفي الكسر مزدوج السلسلة مباشرة، مما قد يؤدي إلى حدوث إدراجات أو حذف (indels) في موقع الكسر؛ بينما يستغل التلدين أحادي السلسلة  (SSA) التسلسلات المكملة المجاورة لموقع الكسر من أجل الإصلاح، مما ينتج عنه عمليات حذف في موقع الكسر؛ في حين يستخدم التأشيب المتماثل (HR) تسلسلاً متماثلاً كقالب للإصلاح2,3.

تاريخياً، اقتصرت دراسات إصلاح الكسور مزدوجة الشريط (DSB) على المقايسات الكيميائية الحيوية4 أو أنظمة الخلية الواحدة، مثل البكتيريا5,6، والخميرة7,8، ومزارع الخلايا الثديية9,10. وبالرغم من أن هذه النماذج كانت أساسية في تحديد بروتينات الإصلاح الجوهرية وآلياتها، إلا أنها تفتقر إلى التعقيد البيولوجي للكائن متعدد الخلايا. وقد أصبحت ذبابة Drosophila melanogaster نموذجاً شائعاً متعدد الخلايا لدراسة إصلاح الحمض النووي (DNA). ومع ذلك، فإن العديد من المقايسات الحالية مصممة لمسارات إصلاح محددة11، أو تعتمد على انحرافات كروموسومية كبيرة، مثل استئصال عنصر-P12، أو تتطلب تحليلات جزيئية تستغرق وقتاً طويلاً13. ويعالج مقايسة DR-white هذه التحديات من خلال توفير مراسل جيني بسيط لإصلاح الحمض النووي في Drosophila14. وتقدم هذه الدراسة سير عمل كاملاً وعملياً ومفصلاً خطوة بخطوة لإجراء المقايسات الجينية والجزيئية لقياس إصلاح الكسور مزدوجة الشريط في الحمض النووي باستخدام مقايسة DR-white المعتمدة.

يعتمد المقايسة على تكرارين مباشرين من الـ ذباب الفاكهة (Drosophila) أبيض (وجين ()، الذي يمنح لون العين الأحمر من النوع البري (الشكل 1). وكلتا النسختين غير وظيفيتين: فالأولى، Sce.white، يحتوي على إدراج يحمل تسلسل التعرف على ميجانوكلياز I-SceI عند موقع SacI من النوع البري ويقدم كودون وقف مبكر؛ أما الثاني، أبيض، يكون مبتوراً عند الطرفين '5 و '3 ويعمل كقالب لإصلاح إعادة التركيب المتماثل (HR). أ ذباب الفاكهة (Drosophila) أصفر الجين المنقول (ي+)، والذي يمنح لون الجسم البني من النوع البري، يوجد بين الاثنين أبيض تكرارات. وبما أن الـ DR-أبيض تُدمج الخرطوشة في ي و الخلفية الطافرة، DR-أبيض تتميز الذباب بنمط ظاهري من النوع البري بجسم بني، وبنمط طافر بعيون بيضاء.

يمكن تحفيز كسور الشريط المزدوج (DSBs) عند Sce.white عن طريق تهجين ذباب DR-white مع ذباب يحمل جين I-SceI منتقل. ويمكن قياس إصلاح كسور الشريط المزدوج في الخط الجرثومي قبل الانقسام الاختزالي من خلال تقييم نسل عملية تهجين اختبارية. يؤدي الإصلاح عن طريق الانضمام الطرفي غير المتماثل (NHEJ) إلى ظهور النمط الظاهري الأبوي ذو الجسم البني والعيون البيضاء (الشكل 1A)، بينما يؤدي الإصلاح عن طريق إعادة الاندماج المتماثل (HR) إلى استعادة تسلسل white من النوع البري وينتج عنه نسل ذو جسم بني وعيون حمراء (الشكل 1B). أما إصلاح كسر الشريط المزدوج عن طريق تلدين الشريط الواحد (SSA) أو حدوث عبور ميتوزي فيؤدي إلى فقدان جين yellow المتدخل، مما ينتج عنه ذباب ذو جسم أصفر وعيون بيضاء (الشكل 1C). ولتحليل نتائج الإصلاح في الخلايا الجسدية، قمنا بتكييف خوارزمية تتبع عمليات الحذف والإدراج عن طريق التفكيك (TIDE) للكشف عن إصلاح NHEJ مع المعالجة وإصلاح HR خصيصاً في مقايسة DR-white 15,16.

يوفر مقايسة DR-white عدة مزايا مقارنة بمقايسات إصلاح DNA التي تم إرساؤها سابقاً في Drosophila. ونظراً لأن الكسور يتم إنتاجها وإصلاحها في الخط الجرثومي، يمكن الكشف عن نتائج الإصلاح بسهولة من خلال التحليل المظهري. وفي الوقت نفسه، تتميز هذه المقايسة بتعدد استخدامات كبير؛ فبينما صُممت المقايسة في الأساس لقياس إصلاح HR، إلا أنها تستطيع الكشف عن مسارات الإصلاح الثلاثة جميعها. كما قمنا بتطوير قالبين إضافيين لإصلاح وظيفي (الشكل 2). يحتوي قالب iwhite.mu على 28 تعدد شكل للنوكليوتيدات المفردة (SNPs) صامتة، وينتج أيضاً نسلاً بعيون حمراء (الشكل 2A)، مما يسهل دراسات أطوال مسار تحويل الجينات (GCT) وإصلاح HR بين التسلسلات المتباعدة14. أما قالب iwhiteΔ9 فيحتوي على حذف تسعة أزواج قاعدية عند موقع SacI من النوع البري، وينتج نسلاً بعيون برتقالية (الشكل 2B). تسمح هذه الميزة للباحثين بتتبع إصلاح HR من قوالب متميزة، وهي ميزة فريدة في مقايسة DR-white15.

البروتوكول

1. مقايسة DR-white

  1. التزاوجات الجينية (الشكل 3أ)
    ملاحظة: بالنسبة للمعياري ذبابة الفاكهة (Drosophila) بروتوكولات الاستزراع وعلم الوراثة، يُرجى الرجوع إلى "دفع الذباب: نظرية وتطبيق علم وراثة الدروسوفيلا" بقلم رالف ج. جرينسبان17يتم توفير معلومات النمط الجيني للسلالة في الـ جدول المواد.
    1. يتم الحفاظ على الذباب عند درجة حرارة 25 °دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة في الظروف القياسية ذبابة الفاكهة (Drosophila) غذاء، مرشوش بالخميرة النشطة.
    2. قم بتجهيز خمس قوارير لصدمة حرارية عن طريق نقل 8-10 من DR-أبيض إناث بكر إلى 3-5 ذكور يحملون I-SceI الجين المنقول (التهجين 1، الشكل 3ألكل قارورة.
      ملاحظة: مختلفة I-SceI يمكن استخدام الجينات المنقولة بناءً على التطبيق المطلوب. وفي هذا البروتوكول، فإن الـ hsp70-I-SceI استُخدم الجين المنقول للتحريض بالصدمة الحرارية11لمنع التسرب I-SceI التعبير في الأجيال السابقة، من المهم التأكد من أن DR-أبيض و I-SceI يتم دمج الجينات المنقولة في الذبابة نفسها في هذا الجيل فقط.
    3. في اليوم نفسه، يتم تحضير زجاجات التوسيع لـ a ي و المخزون. ستكون هذه هي ذباب الاختبار. وتكفي ثلاث زجاجات توسيع لما يقرب من 60-80 عملية تهجين اختبارية.
    4. زراعة أنابيب الصدمة الحرارية و ي و زجاجات التمدد عند درجة حرارة 25 °(ج) لمدة 3 أيام.
    5. في اليوم الثالث، اقلب أنابيب الصدمة الحرارية و ي و زجاجات تمدد إلى أغذية طازجة لتكون بمثابة مجموعة احتياطية.
  2. استحثاث الصدمة الحرارية/كسور الشريط المزدوج في الحمض النووي
    ملاحظة: في حال عدم استخدام نظام قابل للاستحثاث بالصدمة الحرارية I-SceI الجين المنقول، انتقل إلى الخطوة 1.2.5، والتي يتم تنفيذها عادةً بعد 3 أيام من الخطوة 1.1.5.
    1. اترك أنابيب الصدمة الحرارية لتعتق لمدة 3 ساعات عند 25 درجة مئوية °ج لضمان مرور جميع النسل بمرحلة الانتقال من المرحلة الأمومية إلى الزيجوتية.
    2. قم بإجراء صدمة حرارية للقوارير الأصلية في درجة حرارة 38 °في حمام مائي بدرجة حرارة C لمدة ساعة واحدة. تأكد من أن مستوى الماء يوازي على الأقل الجزء السفلي من كرة القطن لضمان عدم زحف اليرقات فوق مستوى الماء.
    3. راقب درجة حرارة الحمام المائي كل 15 دقيقة وحافظ عليها عند 38 درجة مئوية. ± 0.5 °ج؛ لأن نتائج الحث والإصلاح تعتمد على مدة الصدمة الحرارية ودرجتها.
    4. أعِد القوارير إلى درجة حرارة 25 مئوية °ج.
    5. وفي اليوم التالي، أضف ثلث مسحة مختبر مطوية إلى الغذاء لامتصاص الرطوبة الزائدة. وإذا كان الغذاء جافاً، فأضف حوالي 100 µلتر من الماء إلى الممسحة المختبرية. أضف كرة قطنية إلى ي و زجاجات التمدد.
    6. يتم استنبات القوارير التي تعرضت لصدمة حرارية لمدة 6 أيام إضافية عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. °ج، أو حتى تبدأ الذباب في الخروج من الشرنقة.
    7. نظف قوارير الاحتياط وزجاجات التوسيع بعد 3 أيام من عملية القلب. أضف كرة قطنية إلى قوارير الاحتياط. ي و زجاجات التوسيع بعد حوالي 4 أيام من عملية الترويق.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن تعريض الأنابيب الاحتياطية لصدمة حرارية كما هو موضح في الخطوات من 1.2.1 إلى 1.2.6، ومعالجتها وفقاً لما هو موصوف أدناه.
  3. تلقيحات الاختبار
    1. اجمع الذباب المعرض للصدمة الحرارية والذي يحمل DR-أبيض و I-SceI تبدأ الجينات المنقولة لمدة 4-5 أيام بعد الخروج من الشرنقة في تقليل الانحياز للمرحلة التنموية.
      ملاحظة: الذباب الذي خضع للصدمة الحرارية بنجاح ويحمل DR-أبيض و I-SceI يتواجد الجين المنقول مع وجود عيون فسيفسائية نتيجة لأحداث ترميم في المراحل الجنينية واليرقية تطورت إلى أنسجة بالغة. ولا يرتبط مدى الفسيفسائية دائمًا بأحداث ترميم الخط الجرثومي، وبالتالي لا ينبغي أن يكون عاملاً محددًا عند اختيار الذباب التجريبي لعمليات التهجين الاختبارية (الخطوة 1.3.3).
    2. جمع ي و إناث عذارى لمدة 5 أيام. يتم جمع 5 إناث عذارى لكل عدد متوقع من العينات. يتم الجمع من زجاجات التوسع الاحتياطية بمجرد أن تبدأ في الخروج من الشرنقة.
    3. جهز قنينات الاختبار عن طريق تزاوج ذكر واحد تعرض للصدمة الحرارية مع 4-5 ي و إناث عذارى (التهجين 2؛ الشكل 3A). اختر الذكور عشوائياً من المجموعة المجمعة في الخطوة 1.3.1 لتقليل الانحياز المرتبط بمرحلة النمو. يتم استزراع تزاوجات الاختبار عند درجة حرارة 25 °ج.
      ملاحظة: لتجنب حدوث العبور الجيني لـ DR-أبيض و I-SceI، وعادةً ما يتم تحليل الخطوط الجرثومية الذكرية؛ ومع ذلك، يمكن أيضاً تحليل النسل الأنثوي. وفي حال تحليل النسل الأنثوي، يتم إعداد أنابيب اختبار التهجين 2 بنسبة 2:5 للإناث:ي و نسبة الذكور، والزراعة لمدة 5-6 أيام (الخطوة التالية) لضمان الإنتاجية.
    4. افحص الإنتاجية بعد 4 أيام من إعداد قوارير الاختبار لتقييم الموعد الذي ينبغي فيه تفريغها.
      ملاحظة: تأكد من وضع عدد كافٍ من البيض لضمان الحصول على 20 نسلاً قابلاً للتقييم على الأقل، مع مراعاة عدم السماح بنمو المزارع بشكل مفرط، وإلا فمن المرجح أن تلتصق الذباب بالوسط الغذائي.
    5. عندما تصبح قوارير الاختبار جاهزة (خلال فترة تصل إلى 4-5 أيام بعد إجراء تهجينات الاختبار)، يتم التخلص من الذباب وإضافة ثلث مسحة مخبرية مطوية إلى الغذاء لامتصاص الرطوبة الزائدة.
      ملاحظة: يمكن جمع الذكور في هذه المرحلة إذا كانت هناك حاجة لإجراء تحليلات إضافية (مثل التنميط الجيني الجزيئي).
    6. تُحضن أنابيب الاختبار لمدة إضافية تتراوح بين 5 إلى 6 أيام عند درجة حرارة 25 درجة مئوية. °ج.
  4. التقييم
    ملاحظة: يتم تجهيز 25 قارورة اختبار تقريبًا لكل حالة في كل تجربة جينية (على سبيل المثال، الطفرات متماثلة الزيجوت والضوابط متغايرة الزيجوت). وتُكرر كل تجربة جينية من 2 إلى 3 مرات، ثم تُجمع البيانات الفردية لكل قارورة.
    1. تقييم نسل التهجين 2 (الشكل 3ألمدة 9 أيام تقريبًا بعد بدء خروج الذباب الأول من الشرنقة.
    2. تخدير الذباب باستخدام CO22 أو عن طريق نقل الذباب إلى أنبوبة فارغة خالية من الغذاء وتجميدها عند -20 درجة مئوية °في درجة حرارة C لمدة 30 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: في حال تجميد الذباب، يمكن إجراء التقييم حتى بعد عدة أيام.
    3. ضع الذباب على وسادة ذباب وقم بتقييم الأنماط الظاهرية المناسبة (الشكل 3أتضمين القنينات التي تحتوي على 20 ذبابة مُقيّمة على الأقل فقط في مجموعة البيانات.
      1. لإجراء التقييم، قم أولاً بفرز الذباب الذي يحمل DR-أبيض كاسيت (باستخدام الفلورة الإيجابية للبروتين الفلوري الأحمر [RFP+] كعلامة)، ثم تقييم لون العين والجسم.
      2. الـ عذرًا، ولكن يبدو أنك أرسلت حرفًا واحدًا فقط ("y"). يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته إلى العربية، وسأقوم بترجمته فورًا وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.+ جين منقول مرتبط بـ DR-أبيض تؤدي الكاسيت إلى ظهور لون بني متوسط للجسم، وهو لون لا يماثل تماماً النمط البري. وللتمييز بين عدم حدوث كسر مزدوج في شريط الحمض النووي/الانضمام الطرفي غير المتماثل (جسم بني؛ ي+ و-) وSSA (الجسم الأصفر؛ لماذا- و-)، ومقارنة الذباب بـ عفواً، يبدو أن النص الذي أدخلته غير مكتمل أو غير واضح. يرجى تزويدي بالنص العلمي الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية، وسأقوم بترجمته بدقة وفقاً للمعايير الأكاديمية والعلمية المطلوبة. النسل الذي لا يمتلك الـ DR-أبيض كروموسوم (-RFP). وستظهر أحداث SSA باللون الأصفر نفسه الذي تظهر به هذه الذباب. يتم تسجيل الذباب الأكثر قتامة (أكثر بنياً) من هذه الذباب على أنها No DSB/NHEJ.
        ملاحظة: الانحرافات عن الأنماط الظاهرية الموصوفة في الشكل 3A قد يشير ذلك إلى حدوث تلوث، وفي هذه الحالة يجب عدم تسجيل القارورة. وبينما يمكن تسجيل الذباب الميت كاملاً، يجب استبعاد الذباب التالف إذا تعذر تحديد الأنماط الظاهرية.

2. تحليل TIDE (الشكل 4)

  1. استخلاص الحمض النووي الجينومي (gDNA)18
    1. جمع الذباب (أو اليرقات) التي تعرضت للصدمة الحرارية وتحمل كلًا من transgene الخاص بـ DR-white و I-SceI، كما هو موضح في نسل التزاوج 1 (الشكل 3A).
    2. وضع ذباب منفرد في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL وتجميده سريعًا (على سبيل المثال، باستخدام حمام من الثلج الجاف/الإيثانول أو النيتروجين السائل).
      تحذير: يجب التعامل مع الثلج الجاف، والنيتروجين السائل، والإيثانول، والإيزوبروبانول، والمواد الكيميائية الأخرى باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة وإجراءات السلامة المؤسسية.
      نقطة توقف:  يمكن تخزين العينات عند -80 °C ومعالجتها لاحقًا إذا لزم الأمر. في حالة تحليل الذباب أو اليرقات، استخدم ذبابة واحدة (واحدة) أو يرقة واحدة لكل عينة. أما عند تحليل الأنسجة الأصغر (مثل الأدمغة أو الأقراص التخيلية)، فيتم تجميع العينات لزيادة عائد الـ DNA.
    3. تجنيس كل عينة في 50 µL من Buffer A (عبارة عن 100 mM Tris-Cl، pH 7.5؛ و100 mM حمض إيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك [EDTA]؛ و100 mM كلوريد الصوديوم؛ و0.5% دوديسيل كبريتات الصوديوم [SDS]) باستخدام مجنس كهربائي.
    4. حضن العينات في حمام مائي عند 65 °C لمدة 30 min.
    5. إضافة 100 µL من Buffer B (عبارة عن 1.4 M أسيتات البوتاسيوم، و4.3 M كلوريد الليثيوم) إلى كل عينة والخلط لفترة وجيزة عن طريق قلب الأنابيب.
      ملاحظة: في حالة استخدام الذباب الكامل، قد تكون هناك حاجة إلى أحجام أكبر لتجنيس العينات تمامًا. إذا كان الأمر كذلك، يجب الحفاظ على نسبة حجمية 1:2 بين Buffer A وBuffer B.
    6. حضن العينات على الثلج لمدة 30 min على الأقل.
    7. طرد العينات مركزيًا بسرعة 16,000 x g تقريبًا لمدة 15 min عند 4 °C.
    8. نقل 125 µL من السائل الطافي الرائق إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة سعة 1.5 mL، مع تجنب أي رواسب.
    9. إضافة 100 µL من الإيزوبروبانول بتركيز 100% في درجة حرارة الغرفة لكل 125 µL من السائل الطافي، والخلط لفترة وجيزة عن طريق قلب الأنابيب.
    10. طرد العينات مركزيًا بسرعة 16,000 x g تقريبًا لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة.
    11. سحب السائل الطافي، مع الحرص على عدم تعكير كتلة الـ DNA الراسبة.
      ملاحظة: قد لا تكون كتلة الـ DNA مرئية في هذه المرحلة. لذا، يجب تدوين اتجاه الأنابيب عند وضعها في جهاز الطرد المركزي الدقيق، والسحب من الوجه المقابل للمكان المتوقع وجود الكتلة فيه.
    12. غسل الكتل الراسبة باستخدام 250 µL من الإيثانول بتركيز 70% المبرد بالثلج، ثم الخلط لفترة وجيزة عن طريق قلب الأنابيب برفق.
    13. طرد العينات مركزيًا بسرعة 16,000 x g تقريبًا لمدة 5 min عند 4 °C.
    14. سحب السائل الطافي، مع الحرص على عدم تعكير الكتلة الراسبة.
      ملاحظة: قد تكون الكتلة أكثر وضوحًا بعد غسلها بالإيثانول. إذا لم يكن الأمر كذلك، راجع الملاحظة الخاصة بالخطوة 2.1.11.
    15. ترك الأنابيب بدون أغطية في درجة حرارة الغرفة لتبخير أي إيثانول متبقٍ. يجب تجنب تجفيف الكتلة بشكل مفرط، وإلا فقد لا يتم استعادتها بالكامل.
    16. إضافة 20 µL من الماء الخالي من النيوكلييز وترك الكتل الراسبة لتستعيد حالتها طوال الليل عند 4 °C.
      نقطة توقف: إذا لم تذب كتلة الـ DNA تمامًا، يمكن إضافة المزيد من الماء.
    17. في اليوم التالي، يتم قلب الأنابيب برفق وقياس تركيز الـ DNA. تُخزن العينات عند -20 °C إذا لم يتم معالجتها على الفور.
      ملاحظة: بالنسبة لاستخلاص ذبابة واحدة، يكون العائد عادةً حوالي 100 ng/µL. من المهم الحصول على عينات عالية الجودة؛ إذ يجب أن تكون قيمة الامتصاص A260/A280 بين 1.7 و2.0، وتشير القيم خارج هذا النطاق إلى وجود ملوثات مثل البروتينات. كما يجب أن تكون قيمة A260/A230 بين 2.0 و2.2، وتشير القيم خارج هذا النطاق إلى ملوثات مثل الإيثانول وأملاح المنظم. قد تؤدي العينات ذات العوائد المنخفضة والجودة الرديئة إلى تضخيم ضعيف في تفاعل PCR.
  2. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
    1. تضخيم المنطقة عبر Sce.white بواسطة PCR باستخدام 100 ng من gDNA والبادئات DR-white_8f (5’-GTGGATCAGGTGATCCAGG) وDR-white_8a (5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بتضمين عينة ذبابة ضابطة لـ DR-white (أي السلالة الأبوية لـ DR-white، مع عدم وجود transgene الخاص بـ I-SceI). استخدم ظروف الدورات التالية: 94 °C لمدة 3 min؛ ثم {94 °C لمدة 30 s؛ وتخفيض تدريجي (touchdown) عند 66 °C (-0.5 °C / دورة) لمدة 30 s؛ و72 °C لمدة 30 s} عدد 16 دورة؛ ثم {94 °C لمدة 30 s؛ و58 °C لمدة 30 s؛ و72 °C لمدة 30 s} عدد 20 دورة؛ ثم 72 °C لمدة 5 min؛ وتُحفظ عند 12 °C.
      ملاحظة: في حالة استخدام كاشف مختلف، قد يلزم تعديل ظروف الدورات.
    2. تشغيل حوالي 2 µL من ناتج PCR على هلام أغاروز تشخيصي بتركيز 1% من tris-acetate-EDTA (TAE) للتأكد من تضخيم Sce.white. حجم القطعة المضخمة المتوقع هو 1.7 kb تقريبًا.
    3. تنقية القطع المضخمة لـ Sce.white باستخدام PCR وقياس تركيز الـ DNA.
    4. تحديد تسلسل ناتج PCR المنقى باستخدام البادئة DR-white_9f (5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC).
      ملاحظة: نقوم عادةً بتحديد تسلسل 40 ng من ناتج PCR المنقى، ولكن قد يختلف هذا وفقًا لتعليمات خدمة تحديد التسلسلات.
  3. تحليل TIDE
    ملاحظة: يمكن إرجاع معظم الأخطاء الناتجة عن استخدام سكريبت TIDE R إلى التنسيق غير الصحيح للكود.
    1. تحميل حزم R المطلوبة (أي sangerseqR وBiostrings) من Bioconductor.org. استخدم شريط البحث لتحديد أحدث إصدار من كل حزمة.
    2. تحليل مخططات الكروماتوغرام للتسلسلات للتأكد من جودتها. قم بتحليل المخططات التي تحتوي على القليل من الضجيج الخلفي أو لا تحتوي عليه إطلاقًا قبل موقع الكسر.
    3. تحميل ملفات تتبع التسلسل (باستخدام امتداد الملف .ab1) ووضع جميع ملفات تتبع التسلسل في مجلد واحد على الكمبيوتر. قم بتبسيط أسماء ملفات التسلسل قدر الإمكان (مثل F1، Het2، Hom3) لتسهيل تعديلات السكريبت في الخطوات التالية.
    4. افتح سكريبت TIDE R (الملف التكميلي 1) في بيئة التطوير المتكاملة RStudio (IDE؛ انظر جدول المواد). في لوحة المصدر (Source pane)، حدد السطر الذي يبدأ بـ Control <- (الملف التكميلي 2A) وأدخل اسم ملف تسلسل الضابط تمامًا كما هو محفوظ، بما في ذلك امتداد .ab1، بين علامتي تنصيص.
      ملاحظة: "تسلسل الضابط" هو تسلسل PCR من السلالة الأبوية DR-white بدون transgene الخاص بـ I-SceI أو تحفيزه.
    5. حدد السطر الذي يبدأ بـ samplename <- c( وأدخل اسم ملف تسلسل كل عينة داخل الأقواس (الملف التكميلي 2A). قم بتضمين امتداد .ab1، وضع كل اسم ملف بين علامتي تنصيص منفصلتين، وافصل بين أسماء الملفات بفواصل.
    6. احفظ ملف سكريبت TIDE R المعدل في نفس المجلد الذي توجد به التسلسلات المراد تحليلها. حافظ على بساطة اسم الملف لتجنب الأخطاء في الخطوات التالية.
    7. في بيئة IDE، انتقل إلى مجلد TIDE باستخدام علامة التبويب "Files" في لوحة المخرجات (Output pane) (الملف التكميلي 2B).
    8. انقر على القائمة المنسدلة More واختر Open New Terminal Here (الملف التكميلي 2C). سيفتح طرفية (Terminal) جديدة في لوحة وحدة التحكم (Console pane) (أسفل اليسار).
    9. في الطرفية المفتوحة حديثًا، اكتب “R” واضغط على Enter (الملف التكميلي 2D).
    10. بمجرد تشغيل R في الطرفية، قم بتشغيل سكريبت TIDE R عن طريق كتابة source("TIDE_analysis.R") واضغط على Enter (الملف التكميلي 2E). ستقوم الطرفية بتشغيل السكريبت وإنتاج تمثيل رسومي (الملف التكميلي 2F) وملف .csv يحتوي على البيانات الخام لكل عينة (الملف التكميلي 2G و الملف التكميلي 3). تُحفظ ملفات المخرجات في نفس المجلد الذي يوجد به سكريبت R وملفات التسلسل.
      ملاحظة: إذا تمت إعادة تشغيل سكريبت R نفسه، فإن أي ملفات .csv جديدة يتم إنشاؤها ستستبدل الملفات القديمة. إذا كنت تجري تحليلات متعددة على نفس الملفات، فقم بعمل نسخة من المجلد.
    11. تحليل البيانات عن طريق فتح كل ملف .csv.
      1. تفسير البيانات الخام كنسب من عمليات الإدراج والحذف (indels) في تسلسل العينة. يؤدي تحويل الجينات عن طريق إعادة الاندماج المتماثل من تسلسل التعرف على I-SceI إلى تسلسل SacI من النوع البري إلى حذف 23-bp النموذجي؛ ويقوم السكريبت بتقرير قيمة HR هذه في صف منفصل في أسفل المخرجات (الملف التكميلي 2G). تمثل قيمة 0-indel عدم حدوث كسر مزدوج الشريط (DSB) أو حدوث NHEJ بدون عمليات إدراج وحذف. اجمع جميع قيم indel الأخرى للحصول على NHEJ مع المعالجة. مجموع NHEJ مع المعالجة وHR هو العدد الإجمالي لأحداث إصلاح DSB القابلة للكشف.
      2. حساب نسب مسارات الإصلاح بين أحداث إصلاح DSB القابلة للكشف باستخدام المعادلات التالية:
        نسبة NHEJ مع المعالجة = (NHEJ مع المعالجة) / (NHEJ مع المعالجة + HR)
        نسبة HR = (HR) / (NHEJ مع المعالجة + HR)
        ملاحظة: يتم استخدام ما يقرب من 10-15 عينة لكل حالة في كل تجربة جينية (مثل الطفرات متماثلة الزيجوت والضوابط متباينة الزيجوت). تُكرر كل تجربة جينية 2-3 مرات، ويتم تجميع البيانات الفردية.

النتائج

Drosophila متطلبات Rad51 للإصلاح عن طريق إعادة التركيب المتجانس

تؤدي تجارب الخط الجرثومي الناجحة إلى ظهور الفئات المظهرية المتوقعة الموضحة في الشكل 3A، وتنتج ما لا يقل عن 20 من النسل القابل للتقييم في كل قارورة. وتشير المظاهر غير المتوقعة أو وجود أقل من 20 من النسل القابل للتقييم إلى حدوث تلوث أو عدم كفاية الإنتاجية، ويجب استبعاد هذه الحالات كما هو محدد في الخطوة 1.4.3. وبالنسبة لتحليل TIDE، تنتج العينات الناجحة قطعة تضخيم (amplicon) بطول 1.7 kb تقريباً، ومخططات كروماتوغرافية ذات خلفية ضئيلة قبل موقع القطع؛ أما الحمض النووي DNA منخفض المردود أو الملوث والمخططات الكروماتوغرافية المشوشة فهي غير مثالية ولا ينبغي تحليلها.

عند استخدام مقايسة DR-white مع مصدر I-SceI قابل للاستحثاث بالصدمة الحرارية، يكون تردد إصلاح HR في ذباب النوع البري 38.5 ± 1.2% (المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط SEM)، بينما يحدث SSA بنسبة 3.2 ± 0.35% تقريبًا (الشكل 3B و الملف التكميلي 4). يعد Rad51 (الذي يشفره نظير spnA في Drosophila) ضروريًا لخطوة غزو الشريط في إعادة الاندماج المتماثل14,19. وبالتالي، يجب أن يؤدي فقدان Rad51 إلى عدم كفاءة HR. وبالفعل، في خلفية DmRad51-/-، ينخفض إصلاح HR إلى 1.3 ± 0.4%، مع زيادة مصاحبة في إصلاح SSA (34.5 ± 1.8%؛ الشكل 3B و الملف التكميلي 4)14. ويرجع ذلك على الأرجح إلى أن أحداث الإصلاح الموجهة نحو إعادة الاندماج المتماثل يتم إصلاحها بدلاً من ذلك عن طريق التلدين أحادي الشريط لتسلسلات white المتكررة.

Drosophila مساهمة CtIP في الإصلاح الفعال عن طريق إعادة التركيب المتجانس في الأنسجة الجسدية

تتيح خوارزمية TIDE قياس اختيار مسار الإصلاح في الخلايا الجسدية. في خلفية غير طافرة، يحدث NHEJ مع المعالجة في 59.0% من أحداث الإصلاح القابلة للكشف، ويحدث HR في 41.0% (الشكل 4B والملف التكميلي 4). يلعب CtIP دوراً هاماً في بدء إصلاح HR من خلال تعزيز استئصال طرف DNA20. وبناءً على ذلك، في خلفية DmCtIP-/- ، ينخفض اختيار مسار HR بشكل ملحوظ في الخلايا الجسدية، من 41.0% في الضوابط متغايرة الزيجوت إلى 10.9% في الطفرات متماثلة الزيجوت (الشكل 4B والملف التكميلي 4)16. وهذا يشير إلى أن CtIP في Drosophila يساهم في إصلاح HR، ولكنه ليس ضرورياً له.

مخطط مقايسة DR-white يوضح مسارات إصلاح DNA؛ طرق HR وNHEJ وSSA مع عناصر جين Sce.white.
الشكل 1: مقايسة مراسل DR-white لكسور DNA مزدوجة السلسلة (DSB) ونتائج الإصلاح. تحتوي مقايسة التكرار المباشر لجين white على نسختين غير وظيفيتين من جين white: Sce.white (مع إدخال 23-bp يحتوي على موقع تعرف I-SceI ويؤدي إلى ظهور كودون وقف مبكر) و iwhite (تسلسل مانح مبتور من الطرفين 5′- و 3′-). يؤدي تزاوج الذباب الذي يحمل DR-white مع جين I-SceI منقول إلى إحداث DSB محدد الموقع يمكن تحليله ظاهرياً أو جزيئياً. الأنماط الظاهرية الناتجة هي (A) نسل بعيون بيضاء (y+ w−)، مما يشير إلى عدم حدوث DSB، أو حدوث HR بين الكروماتيدات الشقيقة، أو NHEJ؛ و (B) نسل بعيون حمراء (y+ w+)، مما يشير إلى حدوث HR داخل الكروموسوم يستعيد تسلسل SacI من النوع البري من المانح iwhite؛ و (C) نسل بجسم أصفر وعيون بيضاء (y− w−)، مما يشير إلى حدوث SSA أو CO ميتوزي. الشكل مقتبس من Do et al.14. الاختصارات: CO = عبور وراثي؛ DR-white = التكرار المباشر لجين white؛ DSB = كسر مزدوج السلسلة؛ HR = إعادة التركيب المتماثل؛ NHEJ = ربط النهايات غير المتماثلة؛ SSA = تلدين السلسلة الواحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط لتحرير الجينات: إعادة الاندماج المتماثل، وتقطيع I-SceI، وDR-white.mu، وDNA، وiwihiteΔ9، ومواقع SacI.
الشكل 2: مشتقات مقايسة DR-white. (A) تحتوي مقايسة DR-white.mu على 28 من تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) الصامتة في تسلسل المانح iwhite.mu، مما يؤدي إلى تباعد في التسلسل بنسبة 1.4% بين التكرارات المباشرة. يختلف تحول الجينات لتعدد الأشكال الفردية بين أحداث إعادة الاندماج المتماثل (HR) ويمكن تحديده عن طريق التسلسل. (B) تميز مقايسة DR-white مع المانح iwhiteΔ9 بين إعادة الاندماج بين المتماثلات وإعادة الاندماج داخل الكروموسوم. تؤدي عملية HR من المانح iwhite داخل الكروموسوم إلى استعادة تسلسل SacI من النوع البري وتنتج ذرية ذات عيون حمراء. أما عملية HR من المانح iwhiteΔ9 بين المتماثلات فتنتج ذرية ذات عيون برتقالية لأن الحذف بطول 9-bp يقلل من تعبير جين white. تم اقتباس الشكل من Do et al.14 و Fernandez et al.15. الاختصارات: DSB = كسر مزدوج الخيط؛ HR = إعادة الاندماج المتماثل؛ SNP = تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مسارات إصلاح الجينات في ذبابة الفاكهة (Drosophila)، مخطط التزاوجات الجينية، تحليل الرسم البياني الشريطي لتوزيع النسل.
الشكل 3: سير العمل التجريبي للكشف عن نتائج إصلاح كسور الحمض النووي المزدوجة في الخط الجرثومي قبل الانقسام الاختزالي. (Aتجمع التهجين الأولى (Cross 1) بين الـ DR-أبيض مراسل (أو أحد مشتقاته) مع I-SceI الجين المنقول (في هذا المثال، على الكروموسوم الثاني). السلالات التي تحتوي على كل من DR-أبيض مقايسة و I-SceI أحداث إصلاح الحفاظ على الجينات المنقولة في خطوطها الجرثومية وأنسجتها الجسدية. ولتحليل أحداث الإصلاح الفردية في الخط الجرثومي قبل الانقسام الاختزالي، يتم تهجين النسل الذي يحمل كلا الجينين المنقولين مع لا يمكن معالجة هذا الطلب نظراً لعدم وجود نص مصدر صالح للترجمة. يرجى تقديم النص العلمي المراد ترجمته. ذباب الاختبار (التهجين 2)، ويتم تسجيل نتائج النسل كما هو موضح في الشكل 1. (B( أحداث إصلاح كسور الحمض النووي مزدوجة الخيط الفردية في الخط الجرثومي للذباب من النوع البري (ن = ١٠٦ خطوط جرثومية) و DmRad51 طفرات متماثلة الزيجوت (ن = 46 خطاً جرثومياً). **P < 0.01; ****P < 0.0001 بواسطة تحليل التباين الثنائي (two-way ANOVA) متبوعاً باختبار سيداك (Sidak) للمقارنات المتعددة. تمثل الأعمدة المتوسطات؛ وتمثل أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). أُعيد تحليل البيانات من دراسة Do et al.14الاختصارات: ANOVA = تحليل التباين؛ CO = التقاطع؛ DSB = كسر الشريط المزدوج؛ HR = إعادة الاندماج المتماثل؛ NHEJ = الربط الطرفي غير المتماثل؛ SEM = الخطأ المعياري للمتوسط؛ SSA = التلدين أحادي الشريط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

عملية تحرير الجينات عبر تسلسل سانجر مع تحليل TIDE؛ تتضمن مخطط مقارنة لطرق الإصلاح.
الشكل 4: سير العمل التجريبي للكشف عن نتائج إصلاح DSB باستخدام تتبع الإنديلات عن طريق التحلل (TIDE). (A) يتم تحليل الذباب الذي يحمل DR-white وجين I-SceI المُحفز عن طريق استخلاص gDNA، وتضخيم PCR عبر موقع DSB، وتسلسل سانجر، وتحليل TIDE باستخدام نص R البرمجي. (B) بيانات تمثيلية من طفرات DmCtIP-/- (n = 23) وضوابط متغايرة الزيجوت DmCtIP+/-  (n = 31). يتم حساب أحداث الإصلاح القابلة للكشف على أنها مجموع HR وNHEJ مع المعالجة، باستثناء الحالات التي لا يوجد بها DSB أو NHEJ بدون إنديلات. ****P < 0.0001 بواسطة اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعاً باختبار سيداك للمقارنات المتعددة. تمثل الأعمدة المتوسطات؛ وتمثل أشرطة الخطأ SEM. تمت إعادة تحليل البيانات من Thomas et al.16. الاختصارات: ANOVA = تحليل التباين؛ DSB = كسر مزدوج السلسلة؛ gDNA = الحمض النووي الجينومي؛ HR = إعادة الاندماج المتجانس؛ NHEJ = الربط الطرفي غير المتجانس؛ PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل؛ SEM = الخطأ المعياري للمتوسط؛ TIDE = تتبع الإنديلات عن طريق التحلل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1: برنامج TIDE المكتوب بلغة R لتحديد عمليات الإدخال والحذف في مخططات الكروماتوغرام للتسلسلات مقارنة بضابط خالي من كسر الشريط المزدوج (no-DSB control). تم تحديد اسم ملف الضابط، وأسماء ملفات العينات، وتسلسل هدف I-SceI القابلة للتعديل من قبل المستخدم بالقرب من نهاية البرنامج. كما تم وصف المدخلات المطلوبة، وملفات المخرجات، وكيفية التفسير في القسم 2.3. يتطلب التشغيل حزمتي sangerseqR و Biostrings.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: دليل مصور خطوة بخطوة لسير عمل نص R الخاص ببرنامج TIDE. توضح اللوحات إجراءات البرنامج الموصوفة في القسم 2.3.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: مثال لمخرجات TIDE وحسابات حدث الإصلاح. تمثل قيمة 0-indel عدم وجود DSB أو وجود NHEJ بدون إقحامات أو حذف؛ ويمثل صف HR المنفصل ناتج حذف 23-bp التقليدي؛ ويتم جمع جميع نسب الإقحامات والحذف المتبقية كـ NHEJ مع المعالجة. يُحسب إجمالي الإصلاح القابل للكشف كـ HR زائد NHEJ مع المعالجة.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: البيانات الخام الأساسية للشكل 3B والشكل 4B، منظمة في أوراق عمل منفصلة قابلة للتعديل. أُعيد تحليل هذه البيانات من الدراسات المنشورة سابقاً والمذكورة في تسميات الأشكال المقابلة.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

تعد تعددية استخدامات نظام DR-white عاملاً حاسماً يساهم في تأثيره الماضي والمستقبلي في مجال إصلاح DNA. أولاً، يتيح تسلسل تكامل attB الموجود ضمن بنية مراسل DR-white للباحثين توجيه المراسل إلى مواقع عديدة داخل جينوم Drosophila21، مع توفر العديد من السلالات الموجهة بالفعل22. ثانياً، يوفر توفر جينات I-SceI منقولة مختلفة، مثل التعبير الناجم عن الصدمة الحرارية عبر محفز hsp70 (هذه الدراسة)، والتعبير التأسيسي عبر محفز ubiquitin23، والتعبير في الخط الجرثومي قبل الانقسام الاختزالي عبر محفز Bam24، سياقات نمائية وأنسجة محددة متعددة لاستكشاف إصلاح DSB. وبغض النظر عن جين  I-SceI المنقول المستخدم، يجب تخطيط التهجينات الوراثية بعناية لضمان عدم إدخال جين I-SceI المنقول إلا في التهجين النهائي لضمان تحفيز DSB بشكل صحيح. ومن المهم ملاحظة أن ترددات الإصلاح قد تختلف بشكل كبير اعتماداً على الموقع الجينومي لـ DR-white و/أو جين I-SceI المنقول المستخدم. ويمكن للتجارب المستقبلية إجراء المزيد من المقارنات بين المواقع الجينومية وجينات I-SceI المنقولة لتحديد ما إذا كان السياق الجينومي أو خصوصية الأنسجة هي التي تحرك عملية إصلاح DSB.

تتمثل إحدى المزايا المحددة لمقايسة DR-white ومشتقاتها في قدرتها على تحديد إصلاح كسور DNA مزدوجة الخيط (DSBs) عبر إعادة الاندماج المتماثل (HR)، والربط الطرفي غير المتماثل (NHEJ) مع المعالجة، وفي معظم الحالات، عبر عملية الاندماج المتسلسل الواحد (SSA). وبينما صُمم هذا النظام للكشف عن أحداث إصلاح الخط الجرثومي ظاهرياً، فإنه يتيح أيضاً تحليل الأنسجة الجسدية عبر تحليل خوارزمية TIDE. وبالرغم من هذه المزايا، هناك بعض القيود المتعلقة بهذه المقايسة التي يجب مراعاتها. ومن الجدير بالذكر أن مقايسة DR-white قد تقدّر ترددات HR بأقل من قيمتها الحقيقية. وكما هو الحال في مقايسات المراسل الجيني الأخرى التي تستخدم DSBs المحفزة بالنوكلييز، فإن الإصلاح عبر HR من كروماتيد شقيق (intersister HR) لا يمكن تمييزه عن حدث عدم وجود DSB أو عن NHEJ بدون معالجة. وبناءً عليه، فإن بعضاً على الأقل من فئة No DSB/NHEJ قد تكون أحداث HR. وبالنظر إلى هذا القيد، يجب توخي الحذر عند مقارنة العوامل الجينية (مثل السلالات الطافرة). وتشمل القيود الأخرى للمقايسة عدم القدرة على تسجيل أحداث ما قبل الانقسام الاختزالي التي لم تنتج ذرية قابلة للحياة. فعلى سبيل المثال، أحداث DSB التي قد لا تكون قد أُصلحت وأدت إلى موت الخلية لن يتم تسجيلها في الذرية. وبينما يمكن أن تكون الخصوبة العامة مقياساً نوعياً لموت خلايا الخط الجرثومي، فقد تكون هناك حاجة إلى مقايسات قائمة على الخلايا (مثل TUNEL). بالإضافة إلى ذلك، يوفر تحليل نص R الخاص بـ TIDE فقط نسبة الأحداث القابلة للكشف في مجموعة من الخلايا. ولتحديد نتائج تسلسل الإنديل (indel) المحددة، يلزم إجراء تسلسل لأحداث الإصلاح الفردية باستخدام تسلسل DNA المتعدد (multiplex DNA sequencing).

لقد أحدث مقايسة DR-white بالفعل تأثيرًا عميقًا في دراسة إصلاح كسر الشريط المزدوج (DSB). وقد ساعد تطبيقها في تحديد العوامل التي تساهم في إصلاح DSB في الكائنات متعددة الخلايا، بما في ذلك العمر25، والجنس26، وموقع DSB22,26، وموقع التسلسل المانح15، والدورة الخلوية، ونوع النسيج26. بالإضافة إلى ذلك، استخدمنا هذه المقايسة لتحديد العديد من البروتينات التي توجه أيضًا اختيار مسار الإصلاح و/أو إصلاح التسلسلات المتباعدة في Drosophila، بما في ذلك Msh627، وBlm28، وRif116، وCtIP16,29. وبالفعل، فإن الاستخدام الراسخ لـ Drosophila ككائن نموذجي جيني يمتلك بروتينات محفوظة لإصلاح DNA يوفر نظامًا بسيطًا متعدد الخلايا لاستقصاء العوامل الجينية والخلوية والعضوية التي تساهم في إصلاح DSB في سياقات بيولوجية معقدة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضاربات مادية أو غير مادية للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

تم تطوير هذه الطريقة بينما كان J.R.L. حاصلاً على منحة بحثية من AFAR المقدمة من الاتحاد الأمريكي لأبحاث الشيخوخة. كما تم دعم هذا العمل من خلال المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (1R15GM110454 و 1R15GM129628) لـ J.R.L. وقد تم تطوير الأشكال بمساعدة BioRender (https://BioRender.com/b8sbcjp) 2026.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مدقات سعة 0.5 مل خالية من RNAse/DNAseFisher Scientific12141363لتجانس العينات من أجل استخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي (gDNA)
كرات قطنيةGenesee Scientific51-101لاستزراع ذبابة الفاكهة (Drosophila) القياسي
حضانة مبردة بتقنية بلتير لذبابة الفاكهة (Drosophila)مختبر شيلSRI6PFلتربية ذبابة الفاكهة (Drosophila) القياسية
سلالة Drosophila: y[1] w[1]ذباب الفاكهة في بلومينغتون (Bloomington Drosophila)  مركز المخزونRRID:BDSC 1495
سلالة ذبابة الفاكهة (Drosophila): y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; P{70I-SceI}2B Sco / CyO, P{GFP, w+} مختبر LaRocqueلا يوجد بيانات متاحةتم إنشاؤه بواسطة مختبر LaRocque من خلال إعادة التركيب القياسية للسلالة المخزنية RRID:BDSC_6934 (y[1] w[*]; P{ry[+t7.2]=70FLP}11 P{v[+t1.8]=70I-SceI}2B sna[Sco]/CyO, S[2]) من مركز Bloomington لسلالات Drosophila؛ متاح عند الطلب من المؤلف المسؤول.
سلالة ذبابة الفاكهة (Drosophila): y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]مختبر LaRocqueلا ينطبقاختبار DR-white مدمج في السلالة RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C)؛ متوفرة عند الطلب من المؤلف المسؤول
سلالة Drosophila: y[2] w[Δ] cho[2] v[1] ; DR-white.mu (y+).3 51C,RFP+ / [CyO-GFP]مختبر LaRocqueلا يوجد نص متاح للترجمة. يرجى تزويدي بالنص المصدر باللغة الإنجليزية للبدء في عملية الترجمة العلمية.تحليل DR-white.mu المدمج في السلالة stock RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’(ZH-51C)؛ متوفرة عند الطلب من المؤلف المسؤول
سلالة ذبابة الفاكهة (Drosophila): y[1] w[*]; iwhite2 (y+).1 51C,RFP+ / [CyO]مختبر LaRocqueيرجى تقديم النص المراد ترجمته.أبيضΔتم دمج 9 مانحين في السلالة الأصلية RRID:BDSC_24482 (y[1] M{RFP[3xP3.PB] GFP[E.3xP3]=vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP’}ZH-51C)؛ ومتاحة عند الطلب من المؤلف المسؤول عن المراسلات
سدادات زجاجات ذباب الفاكهة Drosophila من نوع Flugsجينيسي ساينتيفيك (Genesee Scientific)49-100لاستزراع ذبابة الفاكهة (Drosophila) القياسي
مجهر ستيريوفلوريسنتي (RFP)ترايتيك ريسيرش (TriTech Research)SMT1-FLلذبابة الفاكهة (Drosophila) القياسية "دفع الذباب" والفرز بناءً على التألق
منصة تربية ذباب Drosophila من FlyStuffGenesee Scientific59-172لذباب الفاكهة (Drosophila) القياسي "دفع الذباب"
KimwipesKimberly-Clarke06-666أ
حمام مائي MyBath سعة 4 لترMidwest ScientificMB-2000-4لـ  الصدمة الحرارية
NanoDrop OneThermo Fisher Scientific13-400-518LYلقياس كمية الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA)
وسط تركيبات Nutri-fly Bloomington الغذائيةGenesee Scientific66-121لتربية ذباب Drosophila القياسية
جهاز التجانس بمحرك لاسلكي ومطرقة للقوالب الصلبةDWK Life SciencesK749540-0000لتجنيس العينات من أجل استخلاص الحمض النووي الجينومي (gDNA)
زجاجات البولي بروبيلينجينيزي ساينتيفيك (Genesee Scientific)32-130لتربية ذبابة الفاكهة (Drosophila) القياسية
قوارير بولي ستيرينGenesee Scientific32-116لتربية ذبابة الفاكهة (Drosophila) القياسية، بما في ذلك الصدمة الحرارية
بادئ/قليل نيوكليوتيد DR-white_8fغير متاح؛ أي خدمة لتصنيع قليلات النوكليوتيد تعتبر كافيةلا يوجد نص متوفر للترجمة. يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي المراد ترجمته.5'GTGGATCAGGTGATCCAGG
البادئ/قليل النوكليوتيد DR-white_8aغير متاح؛ أي خدمة تخليق قليلة النيوكليوتيد (oligonucleotide synthesis) تعتبر كافيةلا يوجد نص متاح للترجمة. يرجى تقديم النص الإنجليزي المراد ترجمته.5’-CTTAAGCCATCGTCAGTTGC
البادئ/قليل النوكليوتيد DR-white_9fغير متاح؛ تكفي أي خدمة لتخليق قليلة النوكليوتيدلا ينطبق5’-GAGCCCACCTCCGGACTGGAC
R Studioافترضالإصدار 2023.06.1+524نسخة مجانية قابلة للتنزيل؛ أي إصدار من R Studio مقبول، على الرغم من أن البيانات المعروضة قد حُللت باستخدام  الإصدار 2023.06.1+524
حزم R Studio: BiostringsBioconductor.org (الإصدار 3.24)الإصدار 2.76.0سيطلب نص R البرمجي من المستخدم تثبيت هذه الحزمة
حزم R Studio: sangerseqRBioconductor.org (الإصدار 3.24)الإصدار 1.44.0سيقوم نص R البرمجي بمطالبة المستخدم بتثبيت هذه الحزمة
تفاعل البوليميراز المتسلسل السريع SapphireAMPTakaraRR350B
مجهر ستيريو (مجهر تشريحي)LeicaM60لذبابة الفاكهة القياسية (Drosophila) "دفع الذباب"
تنقية هلام Wizard SV وتنقية نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) PromegaA9281

المراجع

  1. Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection. Nat Genet. 2001;27(3):247-54.
  2. Cejka P, Symington LS. DNA end resection: mechanism and control. Annu Rev Genet. 2021;55:285-307.
  3. Oh J, Myung K. Crosstalk between different DNA repair pathways for DNA double strand break repairs. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2022;873:503438.
  4. Figueroa-González G, Pérez-Plasencia C. Strategies for the evaluation of DNA damage and repair mechanisms in cancer. Oncol Lett. 2017;13(6):3982-8.
  5. Picksley SM, Attfield PV, Lloyd RG. Repair of DNA double-strand breaks in Escherichia coli K12 requires a functional recN product. Mol Gen Genet. 1984;195(1-2):267-74.
  6. Motamedi MR, Szigety SK, Rosenberg SM. Double-strand-break repair recombination in Escherichia coli: physical evidence for a DNA replication mechanism in vivo. Genes Dev. 1999;13(21):2889-903.
  7. Malkova A, Ivanov EL, Haber JE. Double-strand break repair in the absence of RAD51 in yeast: a possible role for break-induced DNA replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93(14):7131-6.
  8. Frankenberg-Schwager M, Frankenberg D. DNA double-strand breaks: their repair and relationship to cell killing in yeast. Int J Radiat Biol. 1990;58(4):569-75.
  9. Allalunis-Turner MJ et al. Radiation-induced DNA damage and repair in cells of a radiosensitive human malignant glioma cell line. Radiat Res. 1995;144(3):288-93.
  10. Pierce AJ, Johnson RD, Thompson LH, Jasin M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 1999;13(20):2633-8.
  11. Rong YS, Golic KG. Gene targeting by homologous recombination in Drosophila. Science. 2000;288(5473):2013-8.
  12. Adams MD, McVey M, Sekelsky J. Drosophila Blm in double-strand break repair by synthesis-dependent strand annealing. Science. 2003;299(5604):265-7.
  13. Rong YS, Golic KG. The homologous chromosome is an effective template for the repair of mitotic DNA double-strand breaks in Drosophila. Genetics. 2003;165(4):1831-42.
  14. Do AT, Brooks JT, Le Neveu MK, LaRocque JR. Double-strand break repair assays determine pathway choice and structure of gene conversion events in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2014;4(3):425-32.
  15. Fernandez J, Bloomer H, Kellam N, LaRocque JR. Chromosome preference during homologous recombination repair of DNA double-strand breaks in Drosophila melanogaster. G3 (Bethesda). 2019;9(11):3773-80.
  16. Thomas MS et al. The epistatic relationship of Drosophila melanogaster CtIP and Rif1 in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. G3 (Bethesda). 2024;14(11):jkae210.
  17. Greenspan RJ. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2004. 191 p.
  18. Sullivan W, Ashburner M, Hawley RS, editors. Drosophila protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, NY; 2000. 697 p.
  19. McIlwraith MJ et al. Human DNA polymerase eta promotes DNA synthesis from strand invasion intermediates of homologous recombination. Mol Cell. 2005;20(5):783-92.
  20. Sartori AA et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 2007;450(7169):509-14.
  21. Bischof J et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007;104(9):3312-7.
  22. Janssen A et al. A single double-strand break system reveals repair dynamics and mechanisms in heterochromatin and euchromatin. Genes Dev. 2016;30(14):1645-57.
  23. Preston CR, Flores CC, Engels WR. Differential usage of alternative pathways of double-strand break repair in Drosophila. Genetics. 2006;172(2):1055-68.
  24. Chen H et al. An enhanced gene targeting toolkit for Drosophila: Golic+. Genetics. 2015;199(3):683-94.
  25. Delabaere L et al. Aging impairs double-strand break repair by homologous recombination in Drosophila germ cells. Aging Cell. 2017;16(2):320-8.
  26. Graham EL et al. The impact of developmental stage, tissue type, and sex on DNA double-strand break repair in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 2024;20(4):e1011250.
  27. Do AT, LaRocque JR. The role of Drosophila mismatch repair in suppressing recombination between diverged sequences. Sci Rep. 2015;5:17601.
  28. Ertl HA et al. The role of Blm helicase in homologous recombination, gene conversion tract length, and recombination between diverged sequences in Drosophila melanogaster. Genetics. 2017;207(3):923-33.
  29. Yannuzzi I, Butler MA, Fernandez J, LaRocque JR. The role of Drosophila CtIP in homology-directed repair of DNA double-strand breaks. Genes (Basel). 2021;12(9):1430.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

DNA I SceI PCR TIDE
الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.