مقالة منهجية

إنتاج أجنة معدلة وراثياً باستخدام تحرير الجينات ونقل نوى الخلايا الجسدية لإنتاج نماذج أغنام للأمراض البشرية

30 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72709

⸱

سبتمبر 15, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah State University

في هذه المقالة

ملخص

نصف هنا نهجاً لإنتاج أجنة معدلة وراثياً باستخدام تحرير الجينات بواسطة CRISPR-Cas9 ونقل نوى الخلايا الجسدية لإنشاء نماذج أغنام للأمراض البشرية. ويعد هذا النهج مثالياً لتحرير الجينات بدقة في الخلايا المانحة وإنتاج أجنة مستنسخة خالية من التزيق الوراثي.

الملخص

تُعد نماذج الحيوانات الكبيرة أدوات قيمة لاستقصاء الأمراض البشرية. فغالباً ما تحاكي الأغنام والخنازير والماعز التشريح والوظائف الفسيولوجية للأعضاء البشرية وتعقيد الأمراض البشرية بشكل أفضل، مما يعز صلتها السريرية مقارنة بالقوارض. تتيح تقنية CRISPR-Cas9 ونقل نوى الخلايا الجسدية (SCNT) توليد نماذج حيوانية كبيرة بدقة وتعددية وتجانس جيني أكبر. وتتمثل الفائدة الرئيسية لهذا النهج، مقارنة بالحقن المجهري للزيجوت، في القدرة على التأكد in vitro من وجود التعديل الجيني المطلوب والطفرات المحتملة خارج الهدف في الخلايا المعدلة جينياً قبل إنتاج الحيوان. علاوة على ذلك، يقضي نقل نوى الخلايا الجسدية (SCNT) على احتمالية حدوث الفسيفساء الجينية، والتي تنتج تكراراً عن الحقن المجهري للزيجوت. نصف هنا عملية توليد خلايا أغنام معدلة جينياً من خلال الربط الطرفي غير المتماثل (NHEJ) والإصلاح الموجه بالتماثل (HDR)، يليه إنتاج أجنة مستنسخة تحمل الطفرات المطلوبة. يتم إدخال التعديلات الجينية عن طريق ترنسفكشن الخلايا الجسدية المستزرعة، وعادة ما تكون أرومات ليفية جنينية، بنظام CRISPR-Cas9. ويتم تقييم كفاءة الطفرة في الخلايا المجمعة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتسلسل سانجر للجينات المعدلة، وتحليلها باستخدام برنامج Tracking of Indels by DEcomposition (TIDE)/Tracking of Insertions, Deletions, and Recombination events (TIDER). يتم إجراء التخفيف المحدود للخلايا المجمعة للحصول على مستعمرات مشتقة من خلية واحدة، والتي يتم فحصها بواسطة PCR وتسلسل DNA للجينات المعدلة. بعد ذلك، يتم تكثير الخلايا المانحة التي تحمل التعديل (أو التعديلات) المطلوبة واستخدامها لتوليد الأجنة عن طريق SCNT. بعد التخفيف المحدود وفحص الخلايا، احتوت 2/14 (19.3%) من المستعمرات المعدلة عبر NHEJ على طفرات تعطيل جيني (KO)، واحتوت 4/56 (7.1%) من المستعمرات المعدلة بواسطة HDR على طفرة F508del. تم تخليق ما مجموعه 370 جنيناً معدلاً جينياً من أربع مستعمرات. تُستخدم هذه الطرق بنجاح للتعديل الجيني الدقيق في الأرومات الليفية الجنينية وتوليد أجنة مهندسة وراثياً لإنتاج نماذج أغنام للأمراض البشرية.

المقدمة

تُعد النماذج الحيوانية أدوات أساسية لفهم الآليات البيولوجية للأمراض البشرية وتطوير علاجات جديدة. ولا تستطيع النماذج المخبرية In vitro، مثل زراعة الخلايا أو العضوانيات، إعادة إنتاج تعقيد الأنواع الفرعية للخلايا والتفاعلات بين الخلايا التي تحدث in vivo داخل الأعضاء1,2. وبناءً على ذلك، توفر الحيوانات نماذج للكائن الحي بأكمله تتيح تفاصيل أكبر عن التفاعلات على المستوى الخلوي والجهازي، وتطور المرض، وسلامة العلاجات. وتُعتبر القوارض كائنات نموذجية عملية نظراً لتكلفتها المنخفضة، وسرعة دورة تكاثرها، وتوصيفها الجيني الشامل. ومع ذلك، فإن نماذج القوارض للأمراض البشرية محدودة بسبب الاختلافات الفسيولوجية والتشريحية عن البشر، فضلاً عن سرعة عملية التمثيل الغذائي لديها وقصر أعمارها3,4. ويتضح ذلك من خلال النسبة العالية من العلاجات التي تم اختبارها في نماذج حيوانية ثم فشلت في التجارب السريرية، والتي استخدمت الغالبية العظمى منها القوارض5,6,7,8. وقد استُخدمت الأغنام والخنازير والماعز والكلاب والرئيسيات غير البشرية لإنتاج نماذج لمجموعة واسعة من الأمراض البشرية، مما قد يساعد في زيادة معدل الترجمة السريرية للعلاجات والأدوية الجديدة3,9,10,1,12. كما توفر هذه الأنواع العديد من المزايا مقارنة بنماذج القوارض بسبب زيادة تشابهها مع البشر. ومن ثم، توفر نماذج الحيوانات الكبيرة للأمراض البشرية أدق النماذج المتاحة وتلعب دوراً حاسماً في ترجمة الدراسات الحيوانية إلى تطبيقات سريرية.

تُعد التكرارات العنقودية المتناوبة منتظمة التباعد القصيرة المتقابلة (CRISPR)-Cas9 طريقة متعددة الاستخدامات وقابلة للبرمجة للتعديل الوراثي للخلايا الحيوانية وإدخال طفرات دقيقة مسببة للأمراض. يعتمد تحرير الجينات بواسطة CRISPR-Cas9 على حمض نووي ريبوزي موجه (gRNA) مكمل للموقع المستهدف، مما يسمح للبروتين 9 المرتبط بـ CRISPR (Cas9) بإحداث كسر مزدوج السلسلة (DSB) بطريقة محددة13. وتتم عملية الإصلاح الخلوي لكسور DSBs بشكل أساسي من خلال آليتين: الربط النهائي غير المتماثل (NHEJ) والإصلاح الموجه بالتماثل (HDR). يقوم مسار NHEJ بإصلاح كسر DSB عن طريق ربط نهايات DNA، وهي آلية عرضة للخطأ قد تؤدي إلى تكوين عمليات إدخال أو حذف عشوائية (indels) في موقع الكسر14. وقد تؤدي هذه الطفرات إلى تعطيل (KO) الجين عن طريق إحداث طفرة إزاحة الإطار أو كودون وقف مبكر، مما يؤدي إلى تعطيل وظيفة الجين. أما عملية HDR، التي تحدث بشكل أساسي خلال مرحلتي S و G2 من الدورة الخلوية، فهي العملية التي تقوم فيها الخلية بإصلاح كسر DSB باستخدام أليل متماثل كقالب للإصلاح15,16. ومن الممكن دمج عمليات إدخال أو حذف أو استبدال محددة، والمعروفة باسم الإدخال الجيني (KI)، عن طريق إدخال قليلة ديوكسي نوكليوتيد أحادية السلسلة (ssODN) اصطناعية أو قالب DNA آخر يحتوي على التعديل المطلوب، والذي يمكن للخلية استخدامه لإصلاح الكسر. كما يمكن استخدام CRISPR-Cas9 للتعديل المتعدد لإدخال طفرات متعددة في وقت واحد لنمذجة الأمراض متعددة الجينات3. ومقارنة بتقنيات تحرير الجينات السابقة مثل نوكليازات إصبع الزنك (ZFNs) أو نوكليازات تأثيرات شبيهة بمنشط النسخ (TALENs)، فإن CRISPR-Cas9 أبسط بكثير وأكثر كفاءة من حيث الموارد للاستخدام في خلايا الحيوانات الكبيرة17. ويمكن استهداف مواقع مختلفة بسهولة عن طريق تصميم gRNA جديد، مما ساعد في تسريع إدخال نماذج حيوانية كبيرة جديدة باستخدام CRISPR-Cas93,13. ومع ذلك، لا تزال هناك عدة قيود، بما في ذلك كفاءة تحرير CRISPR-Cas9، التي يمكن أن تختلف بشكل كبير اعتمادًا على النوع، والبيئة الخلوية، وطبيعة التعديل18,19. وعلى وجه الخصوص، تكون معدلات HDR أقل من معدلات NHEJ وتعتمد بشكل كبير على نوع الخلية، والمواقع الجينومية، ومرحلة الدورة الخلوية20,21. علاوة على ذلك، لا يزال إدخال تعديلات غير مقصودة في مواقع خارج الهدف، أو حتى في مواقع مستهدفة، يمثل مشكلة2. ورغم ذلك، أصبح CRISPR-Cas9 المنصة الأساسية لتحرير الجينات لإنتاج نماذج حيوانية كبيرة مهندسة وراثياً.

تسهل عملية نقل نواة الخلية الجسدية (SCNT) إنشاء أجنة معدلة وراثياً بدقة وتجانس عاليين. تتضمن هذه العملية، التي أُجريت بنجاح لأول مرة في الثدييات عام 1997، نقل نواة خلية إلى بويضة منزوعة النواة23. وتتمتع تقنية SCNT بمزايا عديدة مقارنة بالتقنيات الأخرى، مثل الحقن المجهري للزيجوت، حيث يتم حقن المادة الوراثية أو أنظمة تحرير DNA مباشرة في الزيجوت أو الجنين المبكر24,25,26. وينطوي الحقن المجهري للزيجوت على مخاطر متأصلة من التباين الوراثي، أو الفسيفساء الوراثية (mosaicism)، بين خلايا الجنين، وهو ما قد يحدث إذا تم تضاعف DNA أو انقسام الخلايا قبل التعديل الوراثي27,28,29. وتنخفض قيمة هذه الأجنة الفسيفسائية في النماذج الحيوانية بسبب صعوبة التنميط الجيني والتوصيف الظاهري29. أما في تقنية SCNT، فينفصل تحرير الجينات عن إنتاج الجنين؛ إذ يُشتق كل جنين مستنسخ من خلية واحدة، مما يلغي خطر الفسيفساء الوراثية ويضمن أن يكون الجنين متجانساً وراثياً30,31,32. بالإضافة إلى ذلك، يتم تحرير الخلايا المانحة وفحصها بدقة in vitro للتأكد من النسيلية ووجود التعديل المطلوب قبل البدء بإجراء SCNT، مما يوفر الوقت والموارد25,26. ويكتسب هذا الأمر أهمية خاصة عند إدخال طفرات إدخال محددة (KIs). كما يسمح فحص الخلايا بتحديد الطفرات المحتملة في المواقع غير المستهدفة، مما يقلل من خطر الاضطراب الوراثي في مواقع أخرى. وتعالج هذه المزايا العديد من المخاوف المرتبطة بنظام CRISPR-Cas9. وبناءً على ذلك، توفر تقنية SCNT تحكماً أكبر في الوراثة الجينية للأجنة الناتجة مقارنة بالحقن المجهري للزيجوت، لا سيما في التعديلات الأكثر تعقيداً مثل التعديلات المتعددة، والإدخالات الكبيرة، والأليلات المأنسنة3. ورغم ذلك، تظل تقنية SCNT محدودة بسبب انخفاض كفاءة الاستنساخ، والمتطلبات التقنية، وإعادة البرمجة فوق الجينية غير الطبيعية، والتي قد تؤدي الأخيرة إلى اضطرابات جزيئية وظاهرية في المستنسخات، مما قد يحجب آثار التعديل الوراثي في الحيوانات المؤسسة. ومع ذلك، فإن هذه التغيرات فوق الجينية لا تنتقل إلى الذرية32,3. وبالرغم من هذه القيود، فإن الجمع بين SCNT وCRISPR-Cas9 يتيح هندسة دقيقة للجينوم مع تحكم صارم في وراثة الأجنة، مما يدعم الإنتاج الموثوق لنماذج أمراض الحيوانات الكبيرة دون فسيفساء وراثية. نصف هنا نهجاً مفصلاً للتعديل الوراثي للخلايا الليفية الجنينية للأغنام (SFF) باستخدام إما NHEJ أو HDR، يليه إجراء SCNT لإنتاج أجنة مستنسخة، وذلك بهدف نهائي هو توليد نماذج أغنام للأمراض البشرية. ويعد هذا النهج قابلاً للتطبيق إلى حد كبير على أنواع أخرى من الماشية، على الرغم من أن تحرير الجينات قد يتطلب تحسيناً في أنواع الخلايا المختلفة، حيث يعمل هذا البروتوكول كنقطة بداية مفيدة.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسي للحيوان (IACUC: #15508 و #1089) في جامعة ولاية يوتا، وأُجريت وفقاً لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH). في هذه الدراسة، استُخدمت أغنام رومني المحلية (Ovis aries) لعزل الخلايا الليفية الجنينية للأغنام (الملف التكميلي 134). انظر الشكل 1 للحصول على نظرة عامة على البروتوكول.

figure-protocol-1
الشكل 1: نظرة عامة على طرق CRISPR-Cas9 وSCNT المستخدمة لإنتاج أجنة معدلة وراثياً. يظهر في الشكل ملخص لكل خطوة من الخطوات السبع الرئيسية للبروتوكول. تم التصميم بواسطة BioRender. Perisse, I. (2026). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. تصميم بادئات PCR، وgRNA، وقالب ssODN

  1. افتح المنطقة الجينومية المراد تحريرها في برنامج Benchling عبر الرابط (https://www.benchling.com/academic).
  2. صمم بادئات PCR لتضخيم وتسلسل المنطقة الجينومية المستهدفة.
    1. ظلل المنطقة المستهدفة المراد تضخيمها، بالإضافة إلى 20 زوج قاعدي قبل وبعد المنطقة المستهدفة لضمان وجود مسافة كافية للحصول على قراءات دقيقة لآثار التسلسل وتحليل دقيق لكفاءة الطفرة باستخدام برنامج TIDE.
    2. في شريط التنقل جهة اليمين، انقر على Primers > Create Primers > Wizard.
    3. ضمن قائمة Region، انقر على Use Selection. وضمن قائمة Amplicon، اضبط Size وفقاً لذلك، واضبط أي معاملات أخرى حسب الرغبة.
    4. انقر على Generate Primers. اختر زوجاً واحداً أو أكثر من البادئات ذات درجات الجزاء المنخفضة لطلبها.
      ​ملاحظة: بناءً على التعديل الذي سيتم إدخاله، يوصى بتصميم بادئات ترتبط فقط بالـ DNA المحرر بشكل صحيح للسماح بفحص أسرع للمستعمرات الإيجابية.
  3. صمم gRNA لتحرير الـ DNA باستخدام تقنية CRISPR-Cas9.
    1. في برنامج Benchling، ظلل المنطقة المستهدفة المراد تحريرها، ثم في شريط التنقل جهة اليمين، انقر على CRISPR > Design and analyze guides.
    2. انقر على القائمة المنسدلة Genome واختر أو استورد جينوم الكائن النموذجي. اضبط أي معاملات أخرى حسب الرغبة.
    3. انقر على Finish > +.
    4. ضمن Genome Region، انقر على No region set واختر أو أدخل المنطقة الجينومية التي تحتوي على الموقع المستهدف. انقر على Set genome region.
    5. اختر دليلاً واحداً أو أكثر من الأدلة التي تتمتع بدرجات عالية لكل من استهداف الموقع الصحيح (on-target) وتجنب المواقع غير المستهدفة (off-target) لطلبها.
  4. في حال إجراء تعديلات الإدخال (KI)، صمم قالب ssODN.
    1. في شريط التنقل جهة اليمين، انقر على CRISPR > Design HR template (ssODN).
    2. انقر على القائمة المنسدلة Genome واختر أو استورد جينوم الكائن النموذجي. انقر على Create.
    3. انقر على تبويب SEQUENCE MAP، وظلل القواعد المراد تحريرها، وأنشئ النسخة المعدلة من تسلسل الـ DNA عن طريق كتابة التعديلات المطلوبة باستخدام لوحة المفاتيح. ارجع إلى تبويب DESIGN HR TEMPLATE وانقر على Next.
    4. اضبط Template region لتشمل ما لا يقل عن 50 زوج قاعدي من أذرع التماثل (homology arms) على كل جانب من التعديل، ثم انقر على Next.
    5. أدخل تسلسل gRNA الذي تم اختياره في الخطوة 1.3.5 في مربع Guide لإدخال طفرات صامتة تعطل تسلسل Protospacer Adjacent Motif (PAM). انقر على Next.
    6. انقر على Copy the template واطلب قالب ssODN الذي تم إنشاؤه.
      ملاحظة: تظهر تسلسلات بادئات PCR، وgRNAs لتقنية CRISPR-Cas9، وقوالب ssODN المصممة باستخدام برنامج Benchling لإنشاء نموذج التليف الكيسي في الأغنام الذي يحمل إما طفرة تعطيل (KO) أو طفرة F508del في الجدول 1.

2. تحضير الأوساط الزرعية

  1. قم بتحضير وسط زراعة الخلايا عن طريق تزويد وسط Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) عالي الجلوكوز بنسبة 15% من مصل جنين البقر (FBS) و1% من البنسلين-ستربتومايسين (Pen/Strep) (حجم/حجم). يُسخن الوسط مسبقاً في حمام مائي عند 37 °C قبل الاستخدام.
  2. قم بتحضير وسط التجميد عن طريق تزويد DMEM بنسبة 45% من FBS و10% من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
  3. قم بتحضير وسط جمع البويضات عن طريق تزويد وسط M19 بنسبة 1% من Pen/Strep، و0.3% من ألبومين المصل البقري (BSA) الجزء V، و1% من FBS، و0.06% من ملح هيبارين الصوديوم.
  4. اطلب أوساط الإنضاج المختبري (IVM) والاستزراع المختبري (IVC) ، وهي أوساط خالية من المصل متوفرة تجارياً ومصاغة لإنضاج البويضات البقرية واستزراع الأجنة، على التوالي.
    ملاحظة: يتم تحضير أطباق ما بعد الاندماج وIVC بوضع سبع قطرات بحجم 40 µL من وسط IVC وتُغطى بزيت معدني مختبر للأجنة.
  5. قم بتحضير وسط تجويع الخلايا عن طريق تزويد DMEM عالي الجلوكوز بنسبة 0.5% من FBS و1% من Pen/Strep (حجم/حجم). يُسخن الوسط مسبقاً في حمام مائي عند 37 °C قبل الاستخدام.
  6. قم بتحضير وسط سائل قناة فالوب الاصطناعي المزوّد بـ HEPES (HSOF) كما وصف سابقاً35.
  7. قم بتحضير وسط إزالة النواة عن طريق تزويد 50 µL من وسط HSOF بـ 4.5 mM من السكروز و10 µg/mL من Cytochalasin B (CB).
  8. قم بتحضير أوساط الحقن عن طريق تزويد 50 µL من وسط HSOF بـ 10 µg/mL من Cytochalasin B (CB).
    ملاحظة: يتم تحضير أوساط إزالة النواة والحقن طازجة في يوم عملية SCNT. توضع قطرة واحدة (200 µL) من كل وسط في أطباق قطرها 100 مم وتُغطى بزيت معدني مختبر للأجنة.
  9. قم بتحضير وسط الاندماج كما وصف سابقاً35. يتم إخراج 5–10 mL من وسط الاندماج من درجة حرارة 4 °C ويُترك في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
  10. قم بتحضير وسط CB عن طريق تزويد وسط IVC بـ 10 µg/mL من CB.
    ملاحظة: يتم تحضير طبق CB بوضع سبع قطرات بحجم 40 µL من وسط CB وتُغطى بزيت معدني مختبر للأجنة.
  11. قم بتحضير وسط الأيونوميسين عن طريق تزويد وسط HSOF بـ 5 µM من ملح كالسيوم الأيونوميسين.
  12. قم بتحضير وسط التنشيط عن طريق تزويد وسط IVC بـ 2 mM من 6-Dimethylaminopurine (DMAP) و10 µg/mL من Cycloheximide (CHX).
    ملاحظة: يتم تحضير طبق التنشيط بوضع سبع قطرات بحجم 40 µL من وسط التنشيط وتُغطى بزيت معدني مختبر للأجنة.

3. ترنسفكشن CRISPR-Cas9 في الخلايا الليفية الجلدية (SFFs)

  1. (الظروف) تُنفذ جميع إجراءات زراعة الخلايا داخل كابينة السلامة البيولوجية أو غطاء التدفق الصفائحي. تُزرع الخلايا الليفية الجلدية (SFFs) في دورق T-25 يحتوي على وسط زراعة الخلايا عند درجة حرارة 37 °C في جو مكون من 5% CO2 و5% O2 و90% N2 حتى تصل درجة التلاقي (confluency) إلى 70%–80% تقريبًا قبل عملية التعداء (transfection).
  2. يُزال جميع الوسط من الدورق وتُغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 5 mL من محلول Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS). تُحضن الخلايا مع 1 mL من إنزيم تفكيك شبيه بالتربسين لمدة 5–10 دقائق حتى تتفكك الخلايا.
  3. يُخف إنزيم التفكيك الشبيه بالتربسين باستخدام حجم مساوٍ من وسط زراعة الخلايا، ثم تُطرد الخلايا مركزياً عند 20 × g لمدة 5 دقائق.
  4. (التوقيت) يتم تحضير معقد البروتين النووي الريبوزي (RNP) المكون من gRNA: Cas9 عن طريق تحضين 2.5 µL من gRNA بتركيز 10 µM مع 2.5 µL من بروتين Cas9 بتركيز 5 µg/µL لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قد تتطلب نسب Cas9 RNP: gRNA تحسيناً بناءً على نوع الخلية، والجين المستهدف، وعدد الأهداف.
  5. يُحضر محلول التثقيب النووي (nucleofection) بخلط 82 µL من محلول التثقيب النووي مع 18 µL من المحلول المكمل.
  6. يُخلط محلول التثقيب النووي مع معقد RNP، وفي حال استخدام ssODN، يُضاف 2 µL من ssODN بتركيز 200 µM، ثم يُمزج الخليط برفق باستخدام الماصة.
  7. بعد الطرد المركزي، يُزال الطافي بعناية ويوضع الأنبوب مقلوباً على منديل خالٍ من الوبر لإزالة بقايا الوسط.
    ملاحظة: قد تؤثر بقايا وسط الزراعة على كفاءة التعداء وحيوية الخلايا. يجب التأكد من إزالة السوائل الزائدة تماماً قبل إعادة تعليق كتلة الخلايا في محلول التثقيب النووي.
  8. (خطوة حرجة) تُعاد تعليق الخلايا الليفية في محلول التثقيب النووي، ثم يُنقل الخليط إلى كوفيت نووية (nucleocuvette) سعة 100 µL، مع تجنب تكون الفقاعات. تُنقر الكوفيت النووية برفق على سطح صلب لضمان وصول الخليط إلى قاع الكوفيت.
    ملاحظة: قد تتداخل الفقاعات الموجودة داخل الكوفيت النووية مع عملية التثقيب الكهربائي (electroporation).
  9. (إعداد ذي صلة) تُجرى عملية التثقيب الكهربائي للخلايا باستخدام البرنامج EH-100، أو وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة. تُترك الخلايا لتتعافى لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  10. تُنقل الخلايا التي خضعت للتثقيب الكهربائي باستخدام ماصة نقل إلى 5 mL من وسط زراعة خلايا متوازن مسبقاً ومُدعم بمحسن HDR بتركيز نهائي يتراوح بين 1–2 µM، وهو تركيز قد يتطلب تحسيناً في أنواع الخلايا الأخرى.
  11. (الظروف) تُزرع الخلايا في وسط زراعة الخلايا عند درجة حرارة 37 °C في جو مكون من 5% CO2 و5% O2 و90% N2 لمدة 48 ساعة قبل عزل الحمض النووي الجينومي (gDNA).
  12. يُزال الوسط من الخلايا، وتُغسل مرة واحدة بـ DPBS، ثم يُضاف 1 mL من إنزيم تفكيك شبيه بالتربسين.
  13. بعد انفصال الخلايا، يُضاف 1 mL من وسط زراعة الخلايا لتخفيف إنزيم التفكيك الشبيه بالتربسين.
  14. يُخصص حوالي ثلثي معلق الخلايا للحفظ بالتجميد والثلث المتبقي لاستخلاص الحمض النووي الجينومي في أنابيب سعة 1.5 mL مصنفة. تُطرد جميع الأنابيب مركزياً عند 20 × g لمدة 5 دقائق.
  15. تُعاد تعليق كتلة الخلايا المخصصة للحفظ بالتجميد في 50 µL من وسط التجميد. تُنقل الخلايا المعاد تعليقها إلى أنابيب تجميد (cryovials) وتوضع في حاوية تجميد ذات معدل محكوم عند -80 °C، مع تقليل الوقت الذي تقضيه الخلايا في وسط التجميد قبل نقلها إلى -80 °C.
  16. تُعاد تعليق كتلة الخلايا المخصصة لاستخلاص الحمض النووي في 20 µL من DPBS. يُستخلص الحمض النووي الجينومي باستخدام طقم تنقية الحمض النووي الجينومي وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

4. تحليل كفاءة تحرير الجينوم

  1. تضخيم المواقع المستهدفة من الـ DNA المعزول باستخدام DNA polymerase عالي الدقة وبادئات PCR المصممة مسبقاً.
  2. تأكيد تضخيم PCR عن طريق الفصل الكهربائي بهلام الأجاروز في هلام أجاروز بتركيز 1% مع استخدام DNA ladder بحجم 1 kb.
  3. تنقية نواتج PCR باستخدام طقم تنقية PCR وإرسالها لإجراء تسلسل سانجر (Sanger sequencing).
  4. في حال إجراء تعطيل جيني (KO)، استخدم برنامج TIDE (https://apps.datacurators.nl/tide) لتقييم كفاءة التحرير36. استخدم مخططات كروماتوجرام عالية الجودة مع الحد الأدنى من إشارات الخلفية لضمان دقة تحليل كفاءة التحرير.
    1. افتح برنامج TIDE وقم بتسمية العينة في مربع Title plot. وفي خانة Guide sequence، أدخل تسلسل الـ gRNA المستخدم.
    2. ضمن Control Sample Chromatogram، انقر فوق Browse وقم بتحميل الكروماتوجرام الخاص بعينة التحكم غير المحررة.
    3. ضمن Test Sample Chromatogram، انقر فوق Browse وقم بتحميل الكروماتوجرام الخاص بعينة الاختبار المحررة.
    4. انتقل إلى علامة التبويب Decomposition لعرض طيف الإضافات والحذوفات (indel spectrum) وكفاءة الطفرة. تحقق من قيمة R2 في الزاوية العلوية اليمنى من طيف الإضافات والحذوفات.
    5. إذا كانت قيمة R2 أقل من 0.9، قم بتفعيل مربع Advanced settings ضمن Parameters واضبط منزلقات نافذة المحاذاة (alignment window)، ونافذة التحلل (decomposition window)، وحجم الإضافات والحذوفات (indel size) حتى تصبح قيمة R2 أكبر من 0.9 ويتم تحقيق المحاذاة الصحيحة.
  5. في حال إجراء إدخال جيني (KI)، استخدم برنامج TIDER (https://apps.datacurators.nl/tider) لتقييم كفاءة التحرير37.
    1. افتح برنامج TIDER. قم بتسمية العينة في مربع Title plot. وفي خانة Guide sequence، أدخل تسلسل الـ gRNA المستخدم.
    2. ضمن Control Sample Chromatogram، انقر فوق Browse وقم بتحميل الكروماتوجرام الخاص بعينة التحكم غير المحررة.
    3. ضمن Reference Chromatogram، انقر فوق Browse وقم بتحميل كروماتوجرام لعينة مرجعية تحمل التحرير المطلوب.
      ملاحظة: في حال عدم وجود مثل هذا التسلسل، يمكن توليده عن طريق تضخيم PCR باستخدام بادئات إضافية مصممة لإدخال الطفرة في تسلسل DNA38.
    4. ضمن Test Sample Chromatogram، انقر فوق Browse وقم بتحميل الكروماتوجرام الخاص بعينة الاختبار المحررة.
    5. انتقل إلى علامة التبويب Decomposition لعرض طيف الإضافات والحذوفات، وكفاءة الطفرة، وكفاءة الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR efficiency). تحقق من قيمة R2 في الزاوية العلوية اليمنى من طيف الإضافات والحذوفات.
    6. إذا كانت قيمة R2 أقل من 0.9، قم بتفعيل مربع Advanced settings ضمن Parameters واضبط منزلقات نافذة المحاذاة، ونافذة التحلل، والمسافة upstream من موقع الكسر، وحجم الإضافات والحذوفات حتى تصبح قيمة R2 أكبر من 0.9 ويتم تحقيق المحاذاة الصحيحة.
      ملاحظة: (هام) قد يتطلب الأمر إجراء تسلسل جديد إذا كانت جودة تسلسل الملف رديئة.

5. عزل وفحص مستعمرات الخلايا المفردة

  1. (الظروف) قم بإذابة واستزراع خلايا SFFs المنقولة في دورق T-25 طوال الليل عند 37 °C مع 5% CO2، و5% O2، و90% N2، أو حتى تصل الخلايا إلى تلاحم بنسبة 80% تقريبًا.
  2. قم بإزالة الوسط، واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 5 mL من DPBS، ثم قم بفصل الخلايا باستخدام 1 mL من إنزيم تفكيك شبيه بالتريبسين.
  3. أضف وسط استزراع الخلايا لتخفيف إنزيم التفكيك الشبيه بالتريبسين وانقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 20 × g لمدة 5 min.
  4. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق كتلة الخلايا في 1 mL من وسط استزراع الخلايا. اخلط المزيج بلطف ولكن بدقة للحصول على معلق متجانس من الخلايا المفردة.
  5. (خطوة حرجة) قم بتحضير تخفيف بنسبة 1:10 من معلق الخلايا، ثم قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كروي (hemocytometer) مع صبغة Trypan blue.
  6. احسب حجم معلق الخلايا المخف المطلوب لزراعة خلية واحدة تقريباً في كل بئر.
    ملاحظة: بالنسبة لخمس لوحات ذات 96 بئراً، قم بتحضير 50 خلية تقريباً.
  7. قم بتحضير 10 mL من وسط استزراع الخلايا لكل لوحة ذات 96 بئراً في أنبوب مخروطي سعة 50 mL.
  8. أضف الحجم المحسوب من معلق الخلايا المخف بنسبة 1:10 إلى وسط الاستزراع واخلط جيداً عن طريق السحب والضخ اللطيف بالماصة والقلب.
  9. صب معلق الخلايا المخف في خزان كواشف معقم.
  10. وزع 10 µL من معلق الخلايا في كل بئر من لوحة الـ 96 بئراً.
  11. (الظروف) حضن اللوحات عند 37 °C في 5% CO2، و5% O2، و90% N2 لمدة 5 days.
  12. افحص كل بئر تحت المجهر وحدد الآبار التي تحتوي على مستعمرة واحدة. استبعد الآبار التي تحتوي على أكثر من مستعمرة واحدة.
    ملاحظة: تكون المستعمرات المشتقة من خلية واحدة عادةً مستديرة، ومتراصة، ومتجانسة مورفولوجياً.
  13. أعد اللوحات إلى الحاضنة واستزرعها لمدة يومين إضافيين تحت نفس الظروف.
  14. بعد مرور 7 days إجمالاً من الاستزراع في لوحات الـ 96 بئراً، قم بإزالة الوسط من الآبار التي تحتوي على مستعمرة واحدة نامية. اغسل كل بئر مختار مرة واحدة باستخدام DPBS.
  15. أضف 10 µL من إنزيم التفكيك الشبيه بالتريبسين إلى كل بئر مختار وحضنه حتى تنفصل الخلايا. أضف 10 µL من وسط استزراع الخلايا إلى كل بئر لتخفيف إنزيم التفكيك الشبيه بالتريبسين.
  16. انقل الحجم بالكامل من كل بئر إلى بئر واحد في لوحة ذات 24 بئراً.
  17. اغسل لوحة الـ 96 بئراً الأصلية بوسط استزراع خلايا إضافي وانقل سائل الغسل إلى البئر المقابل في لوحة الـ 24 بئراً لزيادة استعادة الخلايا إلى أقصى حد. أكمل الحجم النهائي في كل بئر من لوحة الـ 24 بئراً ليصل إلى 50 µL باستخدام وسط استزراع الخلايا.
  18. (الظروف) حضن لوحات الـ 24 بئراً عند 37 °C في 5% CO2، و5% O2، و90% N2 لمدة 3 days.
  19. افحص الآبار تحت المجهر واختر المستعمرات القريبة من حالة التلاحم.
  20. أزل الوسط من الآبار المختارة للجمع، واغسلها مرة واحدة باستخدام DPBS، وأضف 50 µL من إنزيم التفكيك الشبيه بالتريبسين.
  21. بعد انفصال الخلايا، أضف 1 mL من وسط استزراع الخلايا لتخفيف إنزيم التفكيك الشبيه بالتريبسين.
  22. قم بتجميد الخلايا وعزل الحمض النووي الجينومي (genomic DNA) وفقاً للخطوات 3.14–3.16.
  23. قم بتضخيم المواضع المستهدفة بواسطة تقنية PCR وتأكيد النمط الجيني بواسطة تسلسل سانجر (Sanger sequencing).
  24. حدد المستعمرات من النوع البري (wild-type)، والمعطلة جينياً (KO)، والمعدلة جينياً (KI) بناءً على نتائج التسلسل. استخدم تحليل TIDE/TIDER كما هو موضح في الخطوات 4.4 و4.5 لتقدير معدلات HDR وأطياف الإندل (indel spectrums) للتحقق من صحة التحرير وتحديد المستعمرات غير المشتقة من خلية واحدة.
    ملاحظة: يمكن أيضاً إجراء تحليل التأثيرات خارج الهدف (Off-target analysis) في هذه الخطوة (الملف التكميلي 1).
  25. قم بتوسيع المستعمرات ذات النمط الجيني المطلوب والمورفولوجيا الخلوية الطبيعية فقط لإجراء تجارب SCNT اللاحقة.

6. جمع البويضات الغنمية والإنضاج in vitro

  1. اجمع مبايض الأغنام من مسلخ محلي وانقلها إلى المختبر في محلول ملحي بتركيز 0.9% عند درجة حرارة 25 °C خلال 4 h من وقت الجمع.
  2. إنضاج البويضات in vitro.
    1. أطلق معقدات الخلايا الركامية والبويضية (COCs) من المبايض باستخدام شفرة مشرط عن طريق قطع سطح المبيض أثناء غمره في وسط جمع البويضات.
    2. (التوقيت) اختر معقدات COCs التي تحتوي على 1–3 طبقات على الأقل من الخلايا الركامية المتراصة وسيتوبلازم متجانس لعملية IVM. اغسل معقدات COCs في وسط جمع بويضات جديد واستنبتها في وسط IVM متوازن مسبقاً، بمعدل يصل إلى 40 من معقدات COCs لكل بئر يحتوي على 50 µL من وسط IVM في طبق مكون من 4 آبار، ثم حضنها عند درجة حرارة 38.5 °C مع 5% CO2 لمدة 21–2 h.
  3. تحقق من نضج البويضات.
    1. انقل العدد المطلوب من معقدات COCs باستخدام ماصة 20 µL إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL، مع إضافة نفس الحجم (1:1) من إنزيم hyaluronidase بتركيز 0.6 mg/mL إلى الأنبوب.
    2. اسحب المحلول المختلط بالماصة للأعلى والأسفل حتى تتم إزالة جميع الخلايا الركامية. انقل البويضات إلى قطرة من وسط HSOF سعة 1 mL واغسل البويضات عبر ثلاث قطرات إضافية من وسط HSOF.
    3. باستخدام ماصة فموية أو ماصة 10 µL مع طرفها، قم بدحرجة واختيار البويضات التي تظهر جسماً قطبياً تحت المجهر المجسم. تتراوح معدلات طرد الجسم القطبي المقبولة بين 50%–80%.

7. نقل نواة الخلية الجسدية

  1. تجهيز الخلايا المانحة قبل عملية SCNT.
    1. إذابة الخلايا المحفوظة بالتجميد قبل 3–5 أيام من عملية SCNT في حمام مائي عند 37 °C لمدة 1–2 دقيقة حتى يختفي الثلج تماماً من الأنبوب.
    2. سحب معلق الخلايا وإضافة حجم مساوٍ من وسط زراعة الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 15 mL، ثم إجراء الطرد المركزي عند 406 x g لمدة 5 دقائق.
    3. إزالة السائل الطافي وإعادة تعليق كتلة الخلايا في 500 µL من وسط زراعة الخلايا.
    4. (الظروف) استزراع الخلايا بتراكيز مختلفة في طبق ذي 4 فجوات بحجم نهائي قدره 50 µL لكل فجوة، والتحضين عند 37 °C مع 5% CO2 و5% O2 و90% N2.
    5. استبدال وسط زراعة الخلايا كل 48 ساعة. وبعد وصول الخلايا إلى حالة التلاقي الكامل، يُستبدل الوسط بوسط تجويع الخلايا قبل 24–48 ساعة من عملية SCNT.
      ​ملاحظة: قد يؤدي تجويع الخلايا لأكثر من 48 ساعة إلى زيادة نسبة الموت الخلوي المبرمج39,40.
  2. تجهيز الخلايا المانحة (في يوم عملية SCNT).
    1. إزالة وسط التجويع من الفجوة والغسل لمرة واحدة باستخدام 500 µL من DPBS (-).
    2. إضافة 250 µL من إنزيم تفكيك شبيه بالتريبسين والتحضين عند 37 °C لمدة 5 دقائق، أو حتى تنفصل الخلايا عن الطبق.
    3. إضافة 50 µL من وسط زراعة الخلايا لتخفيف إنزيم التفكيك الشبيه بالتريبسين.
    4. نقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 mL وإجراء الطرد المركزي عند 406 x g لمدة 5 دقائق.
    5. إزالة السائل الطافي وإعادة تعليق الخلايا في 60–80 µL من وسط HSOF والحفاظ عليها عند 4 °C حتى الاستخدام.
  3. نزع النواة من البويضات.
    1. تجهيز ماصات التثبيت عن طريق سحب شعيرات زجاجية رقيقة الجدران باستخدام ساحب الماصات الدقيقة وتشكيلها بواسطة الميكروفورج للوصول إلى قطر داخلي قدره 30 µm وقطر خارجي قدره 10 µm.
      ملاحظة: يمكن أيضاً شراء كلتا الماصتين من موردين تجاريين.
    2. تجهيز ماصات الحقن عن طريق سحب شعيرات زجاجية رقيقة الجدران بماصات دقيقة، وصقل الطرف بزاوية 45° باستخدام مطحنة دقيقة، وتشكيلها بواسطة الميكروفورج للوصول إلى قطر داخلي يتراوح بين 20–25 µm. يمكن العثور على معايير ساحب الماصات الدقيقة والميكروفورج والمطحنة الدقيقة في تقرير سابق41.
    3. نقل البويضات في مرحلة الطور الاستوائي الثاني (MII) التي أظهرت جسماً قطبياً إلى قطرة من وسط نزع النواة. تثبيت البويضة باستخدام ماصة التثبيت بينما يكون الجسم القطبي في موضع الساعة 4–5.
      ​ملاحظة: يمكن الرجوع إلى التقرير السابق41 لمعرفة إجراءات التشغيل القياسية للتلاعب المجهري.
    4. (خطوة حرجة) استخدام ماصة حقن مائلة ذات طرف حاد لثقب المنطقة الشفافة وشفط الجسم القطبي و10%–20% من السيتوبلازم الموجود تحت الجسم القطبي.
    5. دفع السيتوبلازم المزال إلى القطرة وتحرير البويضة من ماصة التثبيت.
    6. تكرار الخطوات من 7.3.2 إلى 7.3.4 لجميع البويضات حتى يتم نزع النواة منها جميعاً. تُعاد البويضات منزوعة النواة إلى وسط IVM وتُحضن عند 38.5 °C و5% CO2 لمدة 30 دقيقة.
  4. حقن الخلايا المانحة في البويضات منزوعة النواة.
    1. إضافة معلق الخلايا المجهز إلى قاع قطرة وسط الحقن ونقل البويضات منزوعة النواة إلى نفس القطرة.
    2. اختيار 1–10 خلايا مستديرة وسليمة وشفطها داخل ماصة الحقن.
    3. استخدام ماصة التثبيت لتثبيت البويضة، واستخدام ماصة الحقن للثقب في المنطقة الشفافة ووضع خلية واحدة بين المنطقة الشفافة وسيتوبلازم البويضة.
    4. تكرار الخطوات من 7.4.2 إلى 7.4.3 لجميع البويضات منزوعة النواة ونقلها إلى 2–3 mL من وسط HSOF في طبق سعة 35 mm قبل دمج الخلايا.
  5. دمج البويضات منزوعة النواة والخلايا المانحة.
    1. توصيل كابلات مولد نبضات الدمج الكهربائي بأسلاك غرفة الشريحة المجهرية (0.5 mm) ووضع الغرفة على منصة المجهر.
    2. إضافة 60 µL من وسط الدمج إلى الغرفة.
    3. (ضبط حرج/ذو صلة) محاذاة 4–6 أزواج من (سيتوبلازم-خلية) بين سلكي الغرفة بحيث تكون الخلية المانحة في موضع الساعة 6 أو 12. تطبيق نبضتي دمج كهربائي تيار مستمر بقوة 2.0 kV/cm لمدة 40 µs.
    4. إزالة أزواج (سيتوبلازم-خلية) من غرفة الدمج والحفاظ عليها في طبق جديد سعة 35 mm يحتوي على 2–3 mL من وسط HSOF.
    5. (الظروف) تكرار الخطوات من 7.5.3 إلى 7.5.4 حتى تخضع جميع البويضات المحقونة لعملية الدمج. غسل الأزواج في طبق ما بعد الدمج وتحضينها عند 38.5 °C مع 5% CO2 و5% O2 و90% N2 لمدة 30 دقيقة. استبدال وسط الدمج في الغرفة كل 15–20 دقيقة.
  6. تنشيط واستزراع الأجنة.
    1. (الظروف) بعد 30 دقيقة من الدمج، تُحضن جميع الأجنة المدمجة أولاً في وسط CB عند 38.5 °C مع 5% CO2 و5% O2 و90% N2 لمدة 45 دقيقة.
    2. بعد ذلك، يتم تنشيط الأزواج في 5 µM من ionomycin المخف في HSOF لمدة 5 دقائق، يليه التحضين في وسط التنشيط لمدة 4 ساعات.
      ملاحظة: يتم تحضير وسط Ionomycin طازجاً قبل الاستخدام. يُوصى بالتنشيط بعد 24–26 ساعة من النضج لتحسين النمو حتى تمام الحمل.
    3. (الظروف) بعد التنشيط، تُغسل الأجنة المعاد تشكيلها وتُستزرع في وسط IVC، بحد أقصى 40 جنيناً لكل قطرة 40 µL عند 38.5 °C مع 5% CO2 و5% O2 و90% N2 طوال الليل أو حتى نقل الأجنة.

النتائج

تتلخص الخطوات الرئيسية للبروتوكول في الشكل 1استخدمنا تقنية CRISPR-Cas9 ونقل نواة الخلية الجسدية (SCNT) لتطوير نموذج أغنام للتليف الكيسي (CF) يحتوي إما على طفرة حذف أو إضافة (indel) ناتجة عن تعطيل الجين (KO) عبر طريق الانضمام الطرفي غير المتماثل (NHEJ)، أو طفرة F508del عبر طريق الإصلاح الموجه بالتسلسل (HDR). وقد نُشرت أجزاء من هذه النتائج سابقاً.42,43لقد صممنا حمضاً نووياً ريبوزياً موجهًا (gRNAs) وبادئات لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR primers) لكلتا الاستراتيجيتين لاستهداف الإكسون 1 من منظم التوصيل عبر الغشائي في التليف الكيسي (منظم الموصلية عبر الغشائية لسيستيك فايبروزيس (CFTR)الجين بناءً على تسلسل GenBank الخاص بالأغنام (NC_019461.2.0). كما صُمم Oligonucleotide قصير أحادي السلسلة (ssODN) لإدخال طفرة F508del، وهي حذف لثلاثة أزواج قاعدية تُعد الطفرة الأكثر شيوعاً المسببة للتليف الكيسي (CF) لدى المرضى البشر. الشكل 2أ يوضح الإكسون 1 من منظم التوصيل عبر الغشاء في التليف الكيسي (CFTR) وكلا استراتيجيتي الاستهداف للتعطيل الجيني (KO) والإدخال الجيني (KI)، بما في ذلك المواقع النسبية للحمض النووي الريبوزي الموجه (gRNAs)، وبادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR primers)، والطفرات. تم عزل الخلايا الليفية الجلدية (SFFs) أولاً من خروف رومني منزلي ذكر وأنثى (ص. برج الحملجنين في اليوم 45 من الحمل. التحول باستخدام gRNA 1 لتعطيل (KO) منظم الموصلية عبر الغشائية لسي اف تي آر (CFTR) أُجريت العملية بعد ذلك عبر التثقيب الكهربائي لبلازميد pX30-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 (بلازميد Addgene رقم 4230) كما وُصف سابقاً.43عملية ترنسفكشن مركب RNP لـ CRISPR-Cas9: تم إجراء ترنسفكشن للمركبات المكونة من gRNA 2 وssODN 1 عبر التثقيب الكهربائي (electroporation) من أجل إدخال طفرة F508del عبر تقنية الإدخال الموجه (KI). وقد كشف تحليل TIDE أن 46.9% من الخلايا في المجموعة تحتوي على حذف لـ 3 نيوكليوتيدات (nt)، مع R2 بواقع 0.96. ويظهر طيف عمليات الإدراج والحذف (indel) والكفاءة المقدرة في الشكل 2باستُخدم التخفيف المحدِد لعزل ما مجموعه 170 مستعمرة مشتقة من خلايا مفردة، والتي فُحصت بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتسلسل سانجر. تم عزل 14 مستعمرة من عملية ترانسفكشن بدون ssODN، احتوت 2 منها (19.3%) على طفرات تعطيل (KO). كما نتج عن ترانسفكشن الـ ssODN الذي يحمل طفرة F508del عدد 56 مستعمرة، كانت أربع منها (7.1%) متماثلة الزيجوت لطفرة F508del. تم اختيار مستعمرتين تحملان طفرات تعطيل واستخدامهما كخلايا مانحة لإنتاج منظم الموصلية عبر الغشاء في التليف الكيسي (CFTR)-/- الأجنة عن طريق نقل نواة الخلية الجسدية (SCNT). كانت طفرات التعطيل الجيني (KO) عبارة عن عمليات حذف لـ 2 و 7 نيوكليوتيدات (nt) على التوالي. وتظهر نتائج تسلسل سانجر لهذه المستعمرات في الشكل 2جتم اختيار مستعمرتين تحملان طفرة F508del من أجل إنتاج منظم الموصلية عبر الغشاء في التليف الكيسي (CFTR)F508del/F508del الأجنة، وتظهر نتائج تسلسل سانجر الخاصة بها في الشكل 2دأُنتج ما مجموعه 370 جنيناً، منها 233 جنيناً تحمل طفرة KO و137 جنيناً تحمل طفرة F508del (جدول 2). لـ في المختبر وفيما يتعلق بالتطور، بلغت نسبة تكوين الكيسة الأرومية (blastocyst) في أجنة الأغنام الناتجة عن نقل نواة خلية جسدية (SCNT) حوالي 10%–15%. وقد تم تطبيق هذا البروتوكول بنجاح لتعديل الـ منظم التوصيل عبر الغشاء في التليف الكيسي (CFTR) الجين في SFF وإنتاج أجنة لتوليد نموذج أغنام مصابة بالتليف الكيسي (CF).

figure-results-1
الشكل 2توليد منظم الموصلية عبر الغشاء في التليف الكيسي (CFTR) -/- ومُنظّم التوصيل عبر الغشاء في التليف الكيسي (CFTR)F508del/F508del خلايا SFF. (Aمخطط تخطيطي للإكسون 1 من الـ منظم الموصلية عبر الغشاء في التليف الكيسي (CFTR) مواقع استهداف الجين ونظام CRISPR-Cas9 المستخدمة لإحداث طفرات التعطيل (KO) باستخدام الانضمام الطرفي غير المتماثل (NHEJ) (يساراً)، وطفرات الإدخال (KI) من نوع F508del باستخدام الإصلاح الموجه بالتوالد (HDR) (يميناً). تمثل الأسهم البادئ الأمامي والعكسي 1 (باللون الأزرق) والبادئ الأمامي والعكسي 2 (باللون الوردي) المستخدمة لتضخيم الإكسون 1.Bرسم بياني يوضح طيف عمليات الغرز والحذف (indel) وكفاءة التحرير الإجمالية المقدرة بناءً على بيانات تسلسل سانجر لخلايا مجمعة تم ترانسفكشنها بـ Cas9: gRNA 2 وssODN1 لإدخال طفرة F508del. بلغت نسبة عمليات الحذف المكونة من 3 نيوكليوتيدات في هذه الخلايا 46.9%، وهو ما يتوافق مع طفرة F508del، مع R2 بمقدار 0.96. (سينتائج تسلسل سانجر لمستعمرات الخلايا CF19F وCF49 التي تحتوي على طفرات تعطيل جيني (KO) ثنائية الأليل عشوائية. تظهر كلتا المستعمرتين عمليات حذف قصيرة (CF19F، -2 نيوكليوتيد؛ CF49، -7 نيوكليوتيد).دنتائج تسلسل سانجر للمستعمرات الخلوية التي تحتوي على طفرة F508del، مع إزالة "CTT". صُمم بواسطة BioRender. Perisse, I. (2026) https://BioRender.com/v74agcd. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الاسمطفرةتسلسل
البادئ الأمامي 1تعطيل الجين (KO)GCATAGCAGCATACCCAA
البادئ العكسي 1تعطيل جينيGTAACCAAACCAGCCCAC
الرنا الموجه 1تعطيل الجينGGGAGAATTGGAACCTTCAG
البادئ الأمامي 2F508delTGAACTCAGCACCCCATCTCTG
البادئ العكسي 2F508delTGCAGGCTTCTTATAGCAGGGG
الرنا المرشد 2F508delATTAAAGATAACATCATCTT
ssODN 1F508delT*G*CTCTCAGTATTCCTGGATCATG
CCTGGAACCATTAAAGATAACATCA
TTGGTGTTTCCTATGATGAATAGA
TATAGGAGTGTCATCAAAGCATG*C*C

الجدول 1: تسلسل القليل من النيوكليوتيدات (oligos) المصممة. تسلسلات بادئات PCR، وRNAs الموجهة لنظام CRISPR-Cas9، وssODNs القالبية التي صُممت باستخدام Benchling واستُخدمت لإنشاء نموذج تليف كيسي في الأغنام يحتوي إما على طفرة تعطيل (KO) أو طفرة F508del. تشير العلامة "*" إلى تعديل الفوسفوروثيوات.

مستعمرةالنمط الجينيعدد الأجنة
CF19F-/-134
CF49-/-99
Fd78F508del/F508del110
Fd92F508del/F508del27
إجمالي370

الجدول 2: ملخص للمستعمرات المستخدمة كخلايا مانحة والأجنة الناتجة. تم استخدام إجمالي أربع مستعمرات لإنتاج 370 جنيناً تحمل طفرات في جين CFTR. احتوت مستعمرتان على طفرات تعطيل (KO)، واحتوت مستعمرتان على طفرة إدخال (KI) من نوع F508del. جميع المستعمرات مشتقة من خلايا ذكرية، باستثناء CF19F، المشتقة من خط خلوي أنثوي.

الملف التكميلي 1: بروتوكول عزل الخلايا الليفية الجنينية للأغنام وتحليل التأثيرات خارج الهدف.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

في هذا الإجراء، يعد تصميم بادئات (primers) وRNA موجه (gRNAs) وDNA قصير أحادي السلسلة (ssODNs) فعالة أمراً بالغ الأهمية لنجاح تحرير الجينات. إذ يمكن أن يؤدي الارتباط الضعيف لهذه الجزيئات إلى إعاقة تحرير الجينات وتحديد المستعمرات المرغوبة، مما يمنع التقدم إلى عملية نقل نواة الخلية الجسدية (SCNT). ويُوصى بشراء متغيرات متعددة من كل تسلسل لاختبارها وتحسينها قبل البدء في عزل مستعمرات الخلية الواحدة. وعادةً ما يؤدي ترنسفكشن بلازميدات Cas9 لإحداث تعطيل جيني (KO) في الخلايا الليفية إلى كفاءة تحرير دون المستوى الأمثل، لذا يُوصى باستخدام بروتين Cas9 RNP لتحقيق كفاءة أعلى (70%–90%)4,45,46. كما يجب أن يؤدي التخفيف المحدود الناجح إلى الحصول على نسبة مماثلة من المستعمرات التي تعاني من تعطيل جيني (KO). وتعتمد كفاءة التحرير المتوقعة للإدخال الجيني (KI) بشكل كبير على نوع التعديل الذي يتم إدخاله؛ فوفقاً لخبرتنا، عادةً ما تكون عمليات الحذف أكثر كفاءة من عمليات الإدخال أو الاستبدال. وبناءً على ذلك، ستتفاوت أيضاً نسبة المستعمرات التي تحمل طفرة KI بعد التخفيف المحدود. وفي نتائجنا، كان معدل المستعمرات التي تحتوي على طفرة F508del (7.1%) أقل بكثير من معدل التحرير المقدر (46.9%)، وهو أمر غير مثالي. ورغم انخفاض معدلات التعديلات الصحيحة في المستعمرات المشتقة من خلية واحدة، فلا يزال من الممكن إنتاج العديد من الأجنة. ومع ذلك، كلما ارتفع معدل المستعمرات المفيدة، قل الوقت والموارد المطلوبة، مما يجعل عملية التحسين أمراً هاماً. ولحل مشكلة انخفاض كفاءة تحرير الجينات، تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الكيوفيت أثناء التثقيب الكهربائي (electroporation)، وقم بتحسين نسبة Cas9: gRNA عن طريق المعايرة، واختبر gRNAs أو ssODNs بديلة. بالإضافة إلى ذلك، يعد استخدام Cas9 RNP مهماً لكفاءة التحرير، حيث تظهر النتائج أن إيصال البلازميدات يؤدي إلى تحرير بكفاءة أقل43. أما بالنسبة لضعف الحيوية ونمو المستعمرات أثناء التخفيف المحدود، فيمكن النظر في زيادة نسبة المصل في الوسط الغذائي، أو إضافة مكملات عوامل النمو، أو تعديل كثافة الاستزراع. وتأكد من العد الدقيق للخلايا قبل الاستزراع وخلط معلق الخلايا جيداً.

باعتبارها أداة قيمة لإنتاج النماذج الحيوانية، تتضمن تقنية SCNT عدة خطوات حرجة يمكن أن تؤثر على نتائج النمو. أولاً، تتأثر جودة البويضة عادةً بعمر المتبرع والفصول، حيث أن معظم سلالات الأغنام تتكاثر موسمياً. ومع ذلك، أظهرت نتائجنا السابقة أن الموسم لم يؤثر على تطور الأجنة في المختبر عندما تم جمع المبيضان/البويضات من أغنام ما قبل البلوغ المستمدة من المسالخ47. بالإضافة إلى ذلك، عند استخدام بويضات بالغة، كان التطور في الجسم مقارباً لما لوحظ مع بويضات ما قبل البلوغ35. ويُعد وقت تنشيط أجنة SCNT في الأغنام أمراً حاسماً للنمو حتى تمام الحمل. وقد ثبت أن وقت التنشيط المبكر ما بين 24–26 h بعد النضج يقلل من فقدان الحمل المبكر ويزيد من معدل التطور حتى تمام الحمل35. قد يرتبط ذلك ببيئة ذات مستوى عالٍ من عامل تحفيز النضج (MPF)، المرتبط بالتنشيط المبكر، والذي يعز زيادة معدل تكثيف الكروموسومات المبتسر (PCC) للنواة الجسدية، وهو ما يُعتقد أنه مفيد لإعادة البرمجة48.

تتميز تقنية CRISPR-Cas9 بالعديد من المزايا مقارنة بتقنيات تحرير الجينات الأخرى وذلك بفضل تعدد استخداماتها، وقابليتها للبرمجة، وبساطتها17. ورغم قوتها، إلا أن هناك بعض القيود؛ حيث يمكن أن تختلف كفاءة تحرير CRISPR-Cas9 والنشاط خارج الهدف اعتماداً على النوع، ونوع الخلية، والمواقع الجينية، وتصميم gRNA، والتعديل المطلوب، وغالباً ما يتم تحسين الكفاءة للخلايا القارضية أو البشرية18,49. بالإضافة إلى ذلك، قد لا تكون جميع التعديلات قابلة للاستهداف باستخدام تسلسل NGG PAM التقليدي لبروتين SpCas9. وتوجد استراتيجيات عديدة للتغلب على هذه القيود، بما في ذلك تحسين تصميم gRNA وتوصيل Cas9 في صورة RNP50. كما تم اكتشاف أو هندسة العديد من متغيرات نوكلياز Cas ذات نشاط تحريري أعلى، ودقة أكبر، ونطاق استهداف أوسع لمعالجة هذه القيود. علاوة على ذلك، تم تطوير العديد من أنظمة تحرير الجينوم البديلة، بما في ذلك محررات القواعد (base editors)، والمحررات الأولية (prime editors)، والمحررات القائمة على الريكومبيناز (recombinase-based editors)، والتي يعتمد الكثير منها على البروتينات الموجهة بواسطة CRISPR50. ويعد التحرير بواسطة الريكومبيناز مفيداً بشكل خاص لإدخال قطع إدراج كبيرة. ويمكن استخدام أي من هذه الاستراتيجيات لتحسين نتائج التحرير باستخدام هذا البروتوكول.

بالمقارنة مع الحقن المجهري للزيجوت، تتيح تقنية نقل نواة الخلية الجسدية (SCNT) تحكماً أكبر في وراثة الأجنة نظراً للقدرة على فحص الخلايا المانحة in vitro للتأكد من الاستنساكية ومن الطفرات المستهدفة وغير المستهدفة قبل إنتاج الأجنة. وهذا يسمح بتأكيد التعديل الوراثي المطلوب ويقضي على خطر التزيق (mosaicism) في الأجنة الناتجة24,25,26. ومن الملاحظ أنه في ظل ظروف عامل تعزيز الميتوز (MPF) المرتفعة، يمكن لنوى المانح في مرحلتي G0/G1 أن تخضع لعملية إعادة البرمجة الخلوية (PCC) مع تضاعف أكثر طبيعية للحمض النووي DNA، بينما تكون نوى المانح في مرحلتي S و G2 عرضة لتلف DNA والتشوهات الكروموسومية51,52. لذلك، يعد تنسيق مراحل دورة الخلية بين المانح والمستقبل أمراً ضرورياً لنجاح إعادة البرمجة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر أوساط النضج المختبري (IVM) والاستزراع المختبري (IVC) على تطور أجنة SCNT. وغالباً ما تحدث متلازمة المواليد الكبيرة (LOS) في الأجنة المخصبة in vitro وأجنة SCNT في الماشية والأغنام. وأحد العوامل المساهمة المحتملة هو وجود المصل في أوساط نضج البويضات واستزراع الأجنة. لذا، فإن استخدام وسط خالٍ من المصل قد يقلل من حدوث متلازمة LOS في إنتاج حيوانات SCNT من الأغنام ويحسن الكفاءة العامة لتقنية SCNT. ولا تزال تقنية SCNT محدودة بسبب انخفاض الكفاءة، والتكاليف المرتفعة، والحاجة إلى معدات متخصصة، والخبرة الفنية في التعامل مع الأجنة، والحاجة إلى عدد كبير من المستقبلات، على الرغم من تطوير عدة استراتيجيات لتحسين كفاءة الاستنساخ من خلال تنظيم إعادة البرمجة فوق الجينية53. وتشمل هذه الاستراتيجيات الأدوية المعدلة للإبيجينوم أو إسكات المنظمات فوق الجينية التي تتحكم في مثيلة DNA، أو تعديلات الهيستون، أو تعطيل الكروموسوم X. وعلى الرغم من النجاح المحدود في نقل هذه النتائج من الفئران إلى أنواع الماشية، فقد تم استخدام العديد من هذه التقنيات لتحسين كفاءة الاستنساخ في الخنازير والماعز54,5,56,57.

ومع ذلك، يمثل كل من CRISPR-Cas9 وSCNT مزيجاً فعالاً من التقنيات لإنتاج أجنة معدلة وراثياً. وتتميز تقنية CRISPR-Cas9 بأنها أبسط وأكثر قابلية للبرمجة من تقنيات ZFNs أو TALENs، مما أدى إلى هيمنتها في مجال تحرير الجينات. وتعز تقنية SCNT من دقة إنتاج الأجنة من خلال السماح بالفحص الجيني قبل عملية النقل النووي والقضاء على خطر حدوث الفسيفساء الجينية (mosaicism). وبعيداً عن نماذج الأمراض الحيوانية، تمتلك هذه الطريقة تطبيقات واسعة في مجالي الزراعة والطب الحيوي؛ ففي الماشية، يمكن استخدامها لتحسين مقاومة الأمراض، والتحمل المناخي، وصفات الإنتاج25,58. علاوة على ذلك، هناك إمكانية لنمو أعضاء هندسية مناعية في الحيوانات لغرض زراعتها في البشر (xenotransplantation)، أو استخدام الحيوانات كمفاعلات حيوية لإنتاج أجسام مضادة أو إنزيمات أو بروتينات علاجية قيمة لأغراض طبية أو صناعية33,59. وباختصار، فإن CRISPR-Cas9 وSCNT يمثلان نهجين قويين يتيحان تحريراً دقيقاً ومتعدد الاستخدامات للجينوم، مقترناً بتحكم صارم في وراثة الأجنة لإنشاء نماذج حيوانية كبيرة للأمراض البشرية.

الإفصاحات

استخدم المؤلفون Grammarly (Grammarly Inc.) و ChatGPT (OpenAI) لتحسين اللغة وسهولة القراءة في المخطوطة وفقاً للاستخدامات المقبولة من قبل الناشرين العلميين. لم تُستخدم هذه الأدوات لإنشاء نصوص أصلية، أو مفاهيم بحثية، أو بيانات، أو صور، أو أشكال توضيحية في هذا المقترح. وبعد استخدام هذه الأدوات، قام المؤلفون بمراجعة وتحرير المحتوى حسب الحاجة ويتحملون المسؤولية الكاملة عن هذا المحتوى.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل جزئيًا من قبل محطة تجارب يوتا الزراعية (UTAO1328) ومؤسسة التليف الكيسي (منحة POLEJA23PO).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سلم DNA بحجم 1 kbThermo Fisher ScientificSM0313علامة تحديد حجم DNA
أنبوب طرد مركزي سعة 15 mLThermo Fisher Scientific12-565-269
أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mLThermo Fisher Scientific05-408-129
وحدة 4D-Nucleofector Core UnitLonzaAAF-103B
وحدة 4D-Nucleofector X UnitLonzaAAF-103X
طبق بـ 4 فجواتNunc144
أنبوب طرد مركزي سعة 50 mLThermo Fisher Scientific12-565-270
6-DMAPSigma-AldrichD2629
طبق بـ 24 فجوةCorning3524توسيع الخلايا
طبق بـ 96 فجوةCorning3596عزل مستعمرات الخلية الواحدة
أجاروزThermo Fisher ScientificBP160-100الترحيل الكهربائي لهلام الأجاروز
كأس زجاجي (250 mL)Kimble140-250
برنامج BenchlingBenchlinghttps://www.benchling.com/academicمحاذاة وتحليل التسلسل
وسط IVCIVF Bioscience7105
وسط IVMIVF Bioscience7101
BSAGold BioA-421-250
BTX ECMBTXECM-20معدة (متوقفة عن الإنتاج)
غرفة شرائح دقيقة BTX microslideBTX450103
بروتين Cas9Integrated DNA TechnologiesCustomتحرير الجينوم باستخدام CRISPR-Cas9
غلوكونات الكلورهيكسيدين (2%)Aspen Vet1584915
CHXSigma-AldrichC7698
برنامج CRISPORCRISPORhttps://crispor.gi.ucsc.edu/برنامج التنبؤ بالأهداف غير المقصودة
أنبوب تجميد CryovialThermo Fisher Scientific12-565-163N
سيتوكالاسين ب (Cytochalasin B)Sigma-AldrichC6762
ثنائي ميثيل سلفوكسيدFisher ScientificBP231-10كاشف للحفظ بالتجميد
وسط DMEM عالي الجلوكوزCytivaSH3022وسط زراعة الخلايا الليفية
طقم تنقية DNAThermo Fisher ScientificK0781تنقية DNA الجينومي من الدم الكامل
DPBS بدون Ca/MgCytivaSH30256يستخدم لغسل الخلايا والأنسجة
إيثانولPharco11020CSGL
مصل جنين البقريCytivaSH30396مكمل لزراعة الخلايا
ملقطSkylar6-612
طقم تنقية DNA الجينوميQiagen69504استخلاص DNA الجينومي
محلول جنتاميسينGibco15750-060يستخدم في وسط الشطف
RNA دليل (Guide RNA)Integrated DNA TechnologiesCustomRNA دليل لـ CRISPR
معز HDRIntegrated DNA Technologies107921يعز الإصلاح الموجه بالتجانس
مقياس كريات الدم (Hemocytometer)Hausser Scientific02-671-10عد الخلايا
ملاقط مرقئة (Hemostats)Roboz SurgicalRS-784
ملح صوديوم الهيبارينSigma-AldrichH3149
بوليميراز DNA ذات بداية ساخنة (Hot-Start)PromegaM5123تضخيم PCR
هيالورونيدازSigma-AldrichH3506
أيونوميسينSigma-AldrichI0634
وسط M19CytivaSH30253.01
شاشة شبكية (40 مش)Sigma-AldrichS-0770حجم الفتحة 380 μm
جهاز MicroforgeNarishigeMF-9
مطحنة دقيقة (Microgrinder)NarishigeEG-4
ساحب الماصات الدقيقةSutter Instrument CoP-87
زيت معدنيKitazato/Dibimed96014
ماصة فمويةThermo Fisher Scientific13-678-20Dماصات باستور مخصصة للاستخدام مرة واحدة
حاوية تجميد Mr. FrostyThermo Fisher Scientific15-350-50حاوية تجميد ذات معدل محكوم
NucleocuvetteLonzaV4XP-3032كوفيت للتثقيب الكهربائي
طقم P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit LLonzaV4XP-3024يتضمن محلول nucleofection، ومحلول مكمل، وnucleocuvettes، وماصات نقل
طقم تنقية PCRQiagen2806تنقية نواتج PCR
بنسلين-ستربتومايسينGibco15070-063مكمل مضاد حيوي
طبق بتري (10 mm)Nunc172958
طبق بتري (35 mm)Nunc150460
خزان كواشفCELLTREAT3054-103
مشرطMedBladesMB 2-2
مقصRoboz SurgicalRS-6802
قالب مانح من أوليجوديوكسينوكليوتيد أحادي السلسلةIntegrated DNA TechnologiesCustomقالب مانح لـ HDR
كلوريد الصوديومThermo Fisher ScientificBP358-212للمحلول الملحي
سكروزSigma-AldrichS188
صينية جراحيةApproved Vendor74262
صبغة SYBR Safe لـ DNAThermo Fisher ScientificS33102صبغة هلام DNA
دوارق T-25Thermo Fisher Scientific156367دورق لزراعة الخلايا
دورق T-75Corning430641Uدورق لزراعة الخلايا
أنبوب شعري زجاجي رقيق الجدارWorld Precision InstrumentsTW100-6
برنامج TIDE/TIDERTIDE/TIDERhttps://tide.nki.nl/برنامج تحليل تحرير الجينوم
أزرق تريبانCytivaSV3084
TrypLE ExpressGibco12605-010إنزيم تفكيك شبيه بالتريبسين

المراجع

  1. Chang MCJ, Grieder FB. The continued importance of animals in biomedical research. Lab Anim (NY). 2024;53(11):295-297.
  2. Bhaduri A, et al. Cell stress in cortical organoids impairs molecular subtype specification. Nature. 2020;578(7793):142-148.
  3. Lin Y, et al. Application of CRISPR/Cas9 system in establishing large animal models. Front Cell Dev Biol. 2022;10:919155.
  4. Seok J, et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(9):3507-3512.
  5. Ineichen BV, et al. Analysis of animal-to-human translation shows that only 5% of animal-tested therapeutic interventions obtain regulatory approval for human applications. PLoS Biol. 2024;22(6):e3002667.
  6. Schuh JCL. Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice. Toxicol Pathol. 2004;32(1):53-66.
  7. Mak IW, Evaniew N, Ghert M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. Am J Transl Res. 2014;6(2):114-118.
  8. Domínguez-Oliva A, et al. The importance of animal models in biomedical research: current insights and applications. Animals (Basel). 2023;13(7):1223.
  9. Li XJ, Lai L. A booming field of large animal model research. Zool Res. 2024;45(2):311-313.
  10. Pinnapureddy AR, et al. Large animal models of rare genetic disorders: sheep as phenotypically relevant models of human genetic disease. Orphanet J Rare Dis. 2015;10(1):107.
  11. Polejaeva IA, Rutigliano HM, Wells KD. Livestock in biomedical research: history, current status and future prospective. Reprod Fertil Dev. 2015;28(2):112-124.
  12. Kelly OM, et al. Towards clinical translation of nanomedicines: formulation scale-up and model systems. Adv Drug Deliv Rev. 2026;234:115862.
  13. Jinek M, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816-821.
  14. Pfeiffer P, Vielmetter W. Joining of nonhomologous DNA double strand breaks in vitro. Nucleic Acids Res. 1988;16(3):907-924.
  15. Thomas KR, Capecchi MR. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 1987;51:503-512.
  16. Takata M, et al. Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells. EMBO J. 1998;17(18):5497-5508.
  17. Jiang S, Shen QW. Principles of gene editing techniques and applications in animal husbandry. 3 Biotech. 2019;9(1):28.
  18. Javaid N, Choi S. CRISPR/Cas system and factors affecting its precision and efficiency. Front Cell Dev Biol. 2021;9:761709.
  19. Wang J, et al. Application of gene editing technology in livestock: progress, challenges, and future perspectives. Agriculture (Basel). 2025;15(20):2155.
  20. Saleh-Gohari N, Helleday T. Conservative homologous recombination preferentially repairs DNA double-strand breaks in the S phase of the cell cycle in human cells. Nucleic Acids Res. 2004;32(12):3683-3688.
  21. Miyaoka Y, et al. Systematic quantification of HDR and NHEJ reveals effects of locus, nuclease, and cell type on genome-editing. Sci Rep. 2016;6:23549.
  22. Wen W, Zhang XB. CRISPR-Cas9 gene editing induced complex on-target outcomes in human cells. Exp Hematol. 2022;110:13-19.
  23. Schnieke AE, et al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science. 1997;278(5346):2130-2133.
  24. Tang L, González R, Dobrinski I. Germline modification of domestic animals. Anim Reprod. 2015;12(1):93-104.
  25. Perisse IV, et al. Improvements in gene editing technology boost its applications in livestock. Front Genet. 2021;11:614688.
  26. Kwon DH, Gim GM, Yum SY, Jang G. Current status and future of gene engineering in livestock. BMB Rep. 2024;57(1):50-59.
  27. Mehravar M, Shirazi A, Nazari M, Banan M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Dev Biol. 2019;445(2):156-162.
  28. Niu Y, et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 2014;156(4):836-843.
  29. Yen ST, et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Dev Biol. 2014;393(1):3-9.
  30. Ni W, et al. Efficient gene knockout in goats using CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 2014;9(9):e106718.
  31. Polejaeva IA. 25th anniversary of cloning by somatic cell nuclear transfer: generation of genetically engineered livestock using somatic cell nuclear transfer. Reproduction. 2021;162(1):F11-F22.
  32. Hodges CA, Stice SL. Generation of bovine transgenics using somatic cell nuclear transfer. Reprod Biol Endocrinol. 2003;1:81.
  33. Galli C. Current techniques of gene editing in pigs for xenotransplantation. Transpl Int. 2025;38:13807.
  34. Concordet JP, Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1):W242-W245.
  35. Liu Y, et al. A retrospective analysis of sheep generated by somatic cell nuclear transfer. Theriogenology. 2024;227:102-111.
  36. Brinkman EK, Chen T, Amendola M, van Steensel B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 2014;42(22):e168.
  37. Brinkman EK, et al. Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing. Nucleic Acids Res. 2018;46(10):e58.
  38. Brinkman EK, Van Steensel B. Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER. Methods Mol Biol. 2019;1961:29-44.
  39. Dalman A, et al. Synchronizing cell cycle of goat fibroblasts by serum starvation causes apoptosis. Reprod Domest Anim. 2010;45(5):e46-e53.
  40. Sadeghian-Nodoushan F, et al. Mimosine as well as serum starvation can be used for cell cycle synchronization of sheep granulosa cells. Chin J Biol. 2014;2014(1):851736.
  41. Page RL, Malcuit CM. Micromanipulation techniques for cloning. In: Principles of Cloning. Elsevier; 2014. p. 39-51.
  42. Viotti Perisse I, et al. Sheep models of F508del and G542X cystic fibrosis mutations show cellular responses to human therapeutics. FASEB Bioadv. 2021;3(10):841-854.
  43. Fan Z, et al. A sheep model of cystic fibrosis generated by CRISPR/Cas9 disruption of the CFTR gene. JCI Insight. 2018;3(19).
  44. Berthault C, et al. Highly efficient ex vivo correction of COL7A1 through ribonucleoprotein-based CRISPR/Cas9 and homology-directed repair to treat recessive dystrophic epidermolysis bullosa. J Invest Dermatol. 2024;144(6):1322-1333.e13.
  45. Martufi M, et al. Single-step, high-efficiency CRISPR-Cas9 genome editing in primary human disease-derived fibroblasts. CRISPR J. 2019;2(1):31-40.
  46. Bloomer H, Khirallah J, Li Y, Xu Q. CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated genome and epigenome editing in mammalian cells. Adv Drug Deliv Rev. 2022;181:114087.
  47. Blocher R, et al. Effect of laparoscopic ovum pick-up on ovine in vitro oocyte maturation and somatic cell nuclear transfer embryo development. Anim Reprod Sci. 2026;292:108251.
  48. Campbell KH, Loi P, Otaegui PJ, Wilmut I. Cell cycle co-ordination in embryo cloning by nuclear transfer. Rev Reprod. 1996;1(1):40-46.
  49. Chen Y, Niu Y, Ji W. Genome editing in nonhuman primates: approach to generating human disease models. J Intern Med. 2016;280(3):246-251.
  50. Liu D, Cao D, Han R. Recent advances in therapeutic gene-editing technologies. Mol Ther. 2025;33(6):2619-2644.
  51. Campbell K, Alberio R. Reprogramming the genome: role of the cell cycle. Biosci Proc. 2019.
  52. Chia G, et al. Genomic instability during reprogramming by nuclear transfer is DNA replication dependent. Nat Cell Biol. 2017;19(4):282-291.
  53. Wang X, et al. Epigenetic reprogramming during somatic cell nuclear transfer: recent progress and future directions. Front Genet. 2020;11:205.
  54. Loi P, Iuso D, Czernik M, Ogura A. A new, dynamic era for somatic cell nuclear transfer? Trends Biotechnol. 2016;34(10):791-797.
  55. Zhao J, et al. Histone deacetylase inhibitors improve in vitro and in vivo developmental competence of somatic cell nuclear transfer porcine embryos. Cell Reprogram. 2010;12(1):75-83.
  56. Huang J, et al. BIX-01294 increases pig cloning efficiency by improving epigenetic reprogramming of somatic cell nuclei. Reproduction. 2016;151(1):39-49.
  57. Han C, et al. Overexpression of TET3 in donor cells enhances goat somatic cell nuclear transfer efficiency. FEBS J. 2018;285(14):2708-2723.
  58. Wang S, et al. Application of gene editing technology in resistance breeding of livestock. Life (Basel). 2022;12(7):1070.
  59. Houdebine LM. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 2009;32(2):107-121.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نماذج أمراض الأغنامCRISPR-Cas9الخلايا الليفية الجنينيةالوصل غير المتماثل للنهاياتالإصلاح الموجه بالتماثلتسلسل الحمض النوويتفاعل البوليميراز المتسلسل

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.