مقالة منهجية

تشريح Aedes albopictus واستخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) الكلي من الأنسجة بعد التشريح

19 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/72811

⸱

أكتوبر 30, 2026

 ,  , 
1School of Public Health, Nanjing Medical University, 2School of Medicine, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, 3National Health Commission Key Laboratory on Parasitic Disease Prevention and Control, Jiangsu Provincial Key Laboratory on Parasites and Vector Control Technology, Jiangsu Institute of Parasitic Diseases

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يُعرض هنا بروتوكول لتشريح المعي المتوسط والمبايض والغدد اللعابية من Aedes albopictus، يليه استخلاص الحمض النووي الريبي (RNA) الكلي للتوصيف الجزيئي لأنسجة النواقل في دراسات انتقال الفيروسات التي تنقلها البعوض.

الملخص

في مدينة فوشان بمقاطعة قوانغدونغ في الصين، حدث تفشٍ لحمى الضنك وفيروس شيكونغونيا في يوليو 2025. وتعد بعوضة Ae. albopictus ناقلاً رئيسياً لهذه الفيروسات. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وموحدة لتشريح المعي المتوسط، والغدد اللعابية، والمبايض لبعوضة Ae. albopictus واستخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (total RNA) من الأنسجة المشرحة. تم تخدير إناث البعوض غير المتغذية على الدم والتي يبلغ عمرها ثلاثة أيام عن طريق التجميد عند −20 °C لمدة 2 min، وبعد ذلك تم تشريح الأنسجة المستهدفة. استُخلص total RNA باستخدام طقم استخلاص RNA للأنسجة، وتم قياس كميته بواسطة مقياس طيف ضوئي دقيق الحجم، واستُخدم في تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR). وتظهر النتائج أن طريقة التشريح تفصل الأنسجة بسرعة وبشكل كامل، وأن RNA المستخلص من الأنسجة المفصولة يمكن أن يحقق درجة نقاء عالية نسبياً. وأظهر تحليل RT-qPCR أنماط التعبير والاستقرار النسبي لثلاثة جينات مرجعية (GAPDH وβ-actin وRPS6). وتتميز هذه الطريقة بأنها مباشرة وموثقة، وتوفر دعماً تقنياً موحداً للأبحاث المتعلقة ببعوضة Ae. albopictus.

المقدمة

Aedes albopictus (Ae. albopictus) هو ناقل للعديد من المسببات المرضية، بما في ذلك فيروس حمى الضنك (DENV) وفيروس شيكونغونيا (CHIKV)1,2,3. وينتشر هذا النوع على نطاق واسع وتسبب في تفشيات لأمراض منقولة عن طريق البعوض في العديد من المناطق4,5. وتختلف قدرة Ae. albopictus على نقل المسببات المرضية، وهو ما يُعرف بالكفاءة الناقلة، بين المجموعات السكانية وترتبط بتعبير جيني محدد في الأمعاء المتوسطة، والمبايض، والغدد اللعابية6. ويُعد فهم بنية هذه الأنسجة واستخلاص RNA عالي الجودة أمراً بالغ الأهمية لفهم تكاثر الفيروسات المنقولة عبر النواقل وانتشارها وانتقالها7.

يعتمد الكشف عن التعبير الجيني النسبي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR) على التحليل الدقيق لـ *Ae. albopictus* الأنسجة واستخلاص حمض RNA عالي الجودة8,9وحتى الآن، ركزت بروتوكولات الفيديو المنشورة لتشريح المعي المتوسط، والمبايض، والغدد اللعابية بشكل أساسي على Aedes aegypti10وبناءً على ذلك، يوضح هذا البروتوكول كيفية تشريح المعي المتوسط والمبايض والغدد اللعابية من Ae. albopictus، حيث توضع الأنسجة المُشرحة مباشرة في أنابيب طحن تحتوي على محلول لحفظ الحمض النووي الريبوزي (RNA)، مما يغني عن خطوات نقل الأنسجة ويقلل من فقدان العينات أثناء النقل. ويُستخلص الحمض النووي الريبوزي الكلي من الأنسجة المُشرحة باستخدام طريقة تعتمد على الأعمدة، والتي تتطلب خطوات مناولة أقل ووقتًا أقصر مقارنة بطريقة TRIzol التقليدية.11وعادةً ما ينتج عن عملية الاستخلاص هذه ما يتراوح بين 0.1–0.3 µg من الحمض النووي الريبي الكلي (total RNA) من الغدد اللعابية لخمسة *Ae. albopictus*، مع نسب A260/A280 تتراوح بين 1.8 و2.0، مما يلبي متطلبات النقاء اللازمة لعملية RT-qPCR اللاحقة. ويتم إجراء RT-qPCR لقياس تعبير ثلاثة جينات مرجعية عبر *Ae. albopictus* الأنسجة، وبذلك يتم تقييم جودة الـ RNA المستخلص من كل نسيج.

تجدر الإشارة إلى أن هذا البروتوكول قد تم التحقق من صحته فقط لعينات المعي المتوسط، والمبايض، والغدد اللعابية لإناث Ae. albopictus بعمر 3 أيام وغير المتغذية على الدم، وهو غير مناسب لاستخلاص الـ RNA من الجسم الدهني. إن الحصول على أنسجة سليمة ومنفصلة هو الأساس للتحليلات اللاحقة. ومن خلال التشريح المنهجي لأنسجة Ae. albopictus واستخلاص الـ RNA بجودة عالية، يوفر هذا البروتوكول الدعم الفني للكشف اللاحق عن التعبير الجيني، وتقييم كفاءة النواقل على مستوى المجتمع، والسيطرة على انتقال الفيروسات المنقولة بالمفصليات.

البروتوكول

استخدمت هذه الدراسة فقط بعوض  Ae. albopictus  المربى مختبرياً. وبناءً على ذلك، لم تتطلب هذه الدراسة موافقة أخلاقية مؤسسية. تم توفير سلالة  Ae. albopictus  المستخدمة في هذه التجربة من قبل المختبر الرئيسي لمكافحة الأمراض الطفيلية والوقاية منها التابع للجنة الصحة الوطنية في الصين (جيانغسو). جُمعت هذه المستعمرة في الأصل من مدينة ووشي في الثمانينيات، وتم الحفاظ عليها في منحل الحشرات في  Jiangsu Institute of Parasitic Diseases  تحت ظروف قياسية. وُضعت مستعمرة البعوض في غرفة مناخ اصطناعية عند 25 °C ± 1 °C، ورطوبة نسبية 75% ± 5%، مع فترة ضوئية تتكون من 10 h ضوء و 14 h ظلام. رُبيت اليرقات في مياه فائقة النقاء وغُذيت على خليط من مسحوق كبد الخنزير ومستخلص الخميرة (Shanghai Brewery) بنسبة 2:1. أما البعوض البالغ فقد تم الحفاظ عليه باستخدام محلول جلوكوز 5%. الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير المواد

  1. تحضير المحاليل
    1. تحضير محلول منظم PBS بتركيز 1x: وزن 8.0 g من NaCl، و 0.2 g من KCl، و 1.44 g من Na2HPO4، و 0.24 g من KH2PO4. تُذاب هذه المكونات في 800 mL من الماء شديد النقاء مع التقليب. يُضبط الـ pH عند 7.4. يُكمل الحجم النهائي إلى 1 L. يُعقم بجهاز الأوتوكليف عند 121 °C لمدة 20 min.
    2. تحضير محلول DEPC: إضافة 1 mL من محلول DEPC المركز إلى 1 L من الماء شديد النقاء. يُقلب بقوة باستخدام محرك مغناطيسي لمدة 12–16 h. يُعقم بجهاز الأوتوكليف عند 121 °C لمدة 20 min.
      تنبيه: مادة DEPC شديدة السمية ومسرطنة. يجب ارتداء القفازات ونظارات السلامة والتعامل معها داخل خزانة استخلاص الأدخنة.
      ملاحظة: يُغطى الكأس بورق ألومنيوم أثناء التقليب القوي. يُقسم محلول DEPC إلى حصص صغيرة وتُخزن عند -20 °C لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  2. تحضير المستهلكات
    1. تعقيم أدوات التشريح: توضع إبر التشريح بقياس 1 mm والملاقط دقيقة السن في حاوية ألومنيوم وتُعقم بجهاز الأوتوكليف عند 121 °C لمدة 20 min.
    2. تحضير أنابيب طحن سعة 2 mL تحتوي على خرزات سيليكا بقياس 0.5–1.0 mm. توضع في حاوية ألومنيوم وتُعقم بجهاز الأوتوكليف عند 121 °C لمدة 20 min.
    3. إضافة 200 µL من محلول حفظ RNA المرفق مع الطقم إلى كل أنبوب طحن.
      ملاحظة: تنخفض جودة RNA داخل الأنسجة بشكل ملحوظ خلال 1 min من إزالتها من الكائن الحي. لذا يجب تحضير أنابيب الطحن مع محلول الحفظ مسبقاً.

2. جمع Ae. albopictus

ملاحظة: يرجى ارتداء معاطف المختبر البيضاء والقفازات. تجنب ارتداء الملابس الداكنة، لأن الألوان الداكنة تجذب البعوض.

  1. أغلق جميع الأبواب والنوافذ وأنظمة التهوية في الغرفة التي تحتوي على قفص البعوض لمنع هروب Ae. albopictus.
  2. قم بتشغيل الشفاط الكهربائي وأدخله في قفص البعوض. وجه الشفاط نحو Ae. albopictus المستقرة على الجدران الداخلية للقفص واجمع البعوض.
  3. استمر في تشغيل الشفاط أثناء سحبه ببطء من القفص. أحكم إغلاق القفص فوراً وأغلق غطاء الشفاط.
  4. أخرج غرفة التجميع وضعها في درجة حرارة -20 °C لمدة 2 min للتثبيت بالتبريد لـ Ae. albopictus.
  5. ضع طبقاً زجاجياً بقطر 10 cm على الثلج للتبريد المسبق. انقل Ae. albopictus المثبتة من غرفة التجميع إلى الطبق الزجاجي.
    ملاحظة: يجب التحكم بدقة في وقت التثبيت بالتبريد لمنع تلف الأنسجة.

3. تحديد إناث Ae. albopictus قبل عملية التشريح

  1. اختر بعوض Ae. albopictus السليم مورفولوجياً والمخدر بالبرودة من الطبق الزجاجي وانقله إلى شريحة زجاجية. افحصه تحت مجهر ستيريو بقوة تكبير 80x.
  2. حدد الشريط الطولي الأبيض على الصدر المتوسط (mesonotum).
  3. تحقق من وجود النطاقات البيضاء عند قاعدة قطع الرصغ وعند قاعدة التيرجيتات البطنية II-VI12.
  4. افحص قرون الاستشعار بقوة تكبير 80x. ميز بين قرون الاستشعار الخيطية (للإناث) وقرون الاستشعار الريشية (للذكور) لتحديد الإناث.

4. التشريح البطني لـ Ae. albopictus

  1. ضع ثلاث قطرات من محلول PBS المعقم بتركيز 1x من اليسار إلى اليمين على شريحة زجاجية معقمة، بحيث يكون حجم كل قطرة 20 µL تقريباً وبمسافة تبعد عن الأخرى 5 mm تقريباً.
    ملاحظة: يجب أن تكون قطرات PBS كبيرة بما يكفي لغمر بعوضة Ae. albopictus بالكامل.
  2. استخدم ملقطاً دقيقاً للإمساك بأجنحة Ae. albopictus ووضع البعوضة في قطرة PBS الموجودة في أقصى اليسار.
  3. وجه بعوضة Ae. albopictus بحيث يكون الجانب البطني متجهاً للأعلى. استخدم اليد اليسرى للإمساك بإبرة تشريح والضغط على القطعة البطنية الثانية لتثبيت Ae. albopictus.
  4. استخدم اليد اليمنى لإدخال إبرة تشريح مقاس 1 mm في منتصف القطعة البطنية السادسة. قم بعمل شق عرضي نصف دائري لفتح التجويف البطني.
  5. حرك إبرة التشريح الممسوكة باليد اليمنى بمقدار 2 mm تقريباً نحو الخلف واضغط على المنطقة الوسطى من القطع البطنية VI–VIII لتثبيت البطن.
    ملاحظة: تقع المبايض ظهرياً ضمن القطع البطنية II-VI. لا تحرك الإبرة بشكل عشوائي عند الضغط على القطع VI-VIII لتجنب إتلاف المورفولوجيا السليمة للمبايض.
  6. استخدم اليد اليسرى للإمساك بالقطعة البطنية الثانية باستخدام إبرة التشريح واسحبها بلطف للخارج لفصل البطن عند القطعة السادسة. أثناء الفصل، سيظهر المعي الأمامي، والمعي المتوسط، وأنابيب ملبيجي بشكل كامل.
    ملاحظة: تكون أنابيب ملبيجي بيضاء ونحيلة، بينما يكون المعي المتوسط شبه شفاف ومغزلي الشكل.
  7. افصل المعي المتوسط عن المعي الأمامي والمعي الخلفي. اغسل المعي المتوسط في قطرة PBS المركزية مرتين.
  8. انقله إلى أنبوب طحن يحتوي على 200 µL من محلول حفظ RNA المرفق في طقم استخلاص RNA التجاري.
  9. اضغط على منتصف القطعة البطنية الثامنة بإبرة التشريح لإظهار المبايض المزدوجة على كلا الجانبين. قم بإزالة المبايض، واغسلها في قطرة PBS المركزية مرتين، ثم انقلها إلى أنبوب طحن يحتوي على 200 µL من محلول حفظ RNA.
    ملاحظة: تكون المبايض المزدوجة متماثلة، وشكلها يشبه حبة الأرز، ولونها أبيض حليبي. تعامل معها بحذر لضمان السلامة الهيكلية للمبايض أثناء استخراجها.

5. تشريح الغدة اللعابية لـ Ae. albopictus

  1. ارفع تكبير المجهر إلى 400x. انقل بعوضة Ae. albopictus التي تم تشريح بطنها إلى قطرة PBS الموجودة في أقصى اليمين.
  2. طبق ضغطاً خفيفاً على الصدر الأوسط باستخدام إبرة التشريح باليد اليسرى حتى يرتفع الرأس قليلاً.
  3. استخدم اليد اليمنى لرفع الرأس عند منطقة العنق باستخدام إبرة التشريح واسحبه ببطء نحو الخارج. لاحظ الغدد اللعابية (بنية ثلاثية الفصوص) أثناء انفصالها عن الصدر مع الرأس.
    ملاحظة: تقع الغدد اللعابية في الجزء الأمامي من الصدر وتتصل بالرأس عبر القناة اللعابية. إن تطبيق ضغط ثابت على الصدر يمنع تمزق القناة اللعابية ويسمح بانفصال الغدد اللعابية سليمة من الصدر مع الرأس. تتطلب السيطرة على القوة في هذه الخطوة ممارسة متكررة.
  4. افصل الغدد اللعابية عن الرأس. اشطفها في قطرة PBS المركزية مرتين وانقلها إلى أنبوب طحن مُجهز.
    ملاحظة: يبلغ حجم الغدد اللعابية حوالي 1 mm تقريباً. انقلها إلى أنبوب طحن يحتوي على 200 µL من محلول حفظ RNA وافحصها مقابل مصدر ضوء أبيض للتأكد من وجود نقاط بيضاء صغيرة تطفو في المحلول.

6. استخلاص الـ RNA من Ae. albopictus وغددها اللعابية ومبايضها ومعيها المتوسط

ملاحظة: تم تنفيذ جميع خطوات استخلاص الـ RNA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لطقم استخلاص الـ RNA التجاري الخاص بالأنسجة، دون أي تعديل.

  1. يُبرد طاحن الأنسجة مسبقاً حتى 4 °C. تُضبط المعايير على 30 Hz، وزمن طحن قدره 30 s، و10 دورات، وزمن توقف قدره 8 s.
  2. توضع أنابيب الطحن التي تحتوي على عينات الأنسجة في الطاحن ويُشغل البرنامج.
    ملاحظة: بعد الطحن، يتم التحقق مما إذا كانت الأنسجة قد تشتتت تماماً في محلول حفظ RNA. إذا كان الطحن غير مكتمل، تُشغل 5 دورات إضافية.
  3. يُنقل المتجانس إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 mL. يُجرى الطرد المركزي عند 12,000 x g عند 4 °C لمدة 5 min.
  4. يُنقل السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي معقم جديد سعة 1.5 mL. يُضاف 30 µL من الكلوروفورم.
    تنبيه: الكلوروفورم مادة سامة ومسرطنة. يجب ارتداء القفازات ونظارات السلامة والتعامل معه داخل خزانة استخلاص الغازات.
  5. يُرج المزيج بقوة باستخدام جهاز Vortex لمدة 20 s. يُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 min، ثم يُجرى الطرد المركزي عند 12,000 x g عند 4 °C لمدة 15 min.
    ملاحظة: يُسحب الطور المائي العلوي بعناية، مع تجنب الطبقة البيضاء الوسطى لمنع تلوث البروتين.
  6. يُنقل الطور المائي العلوي إلى أنبوب طرد مركزي معقم جديد سعة 1.5 mL. يُضاف 75 µL من الإيزوبروبانول.
  7. يُخلط المزيج عن طريق القلب ونقل الخليط بالكامل إلى عمود دوران السيليكا (silica spin column). يُجرى الطرد المركزي عند 12,000 x g لمدة 1 min.
  8. يُضاف 600 µL من محلول الغسل المنظم إلى العمود. يُجرى الطرد المركزي عند 12,000 x g لمدة 30 s، ثم يتم التخلص من السائل النافذ.
  9. يُضاف 600 µL من الإيثانول بتركيز 80% إلى العمود. يُجرى الطرد المركزي عند 12,000 x g لمدة 30 s، ثم يتم التخلص من السائل النافذ. تُكرر خطوة الغسل هذه مرة واحدة، ليصبح المجموع غسلتين.
  10. يُضاف 30 µL من ماء DEPC إلى مركز غشاء العمود. يُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 min.
  11. يُوضع العمود في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 mL. يُجرى الطرد المركزي عند 12,000 x g لمدة 1 min لاستخلاص RNA.
  12. تُؤخذ عينة بحجم 1 µL من RNA المستخلص ويُقاس التركيز والنقاء باستخدام مقياس الطيف الضوئي للميكرو-حجوم (microvolume spectrophotometer).

7. النسخ العكسي للحمض النووي الريبي RNA

  1. تحضير نظام التفاعل
    1. إذابة المزيج الرئيسي للنسخ العكسي بتركيز 4x، والماء الخالي من النيوكلييز، وقالب RNA على الثلج.
    2. في أنبوب PCR سعة 200 µL، يتم تحضير نظام تفاعل بحجم 20 µL عن طريق إضافة 5 µL من المزيج الرئيسي للنسخ العكسي بتركيز 4x، و10 µL من قالب RNA الكلي، و5 µL من الماء الخالي من النيوكلييز.
    3. يتم الطرد المركزي لفترة وجيزة بسرعة 1,000 x g لمدة 1 min لتجميع خليط التفاعل في قاع الأنبوب.
    4. يُوضع أنبوب PCR في جهاز الدورات الحرارية ويُشغل برنامج النسخ العكسي: 50 °C لمدة 5 min؛ ثم 85 °C لمدة 5 s.
      ملاحظة: يُخفف ناتج النسخ العكسي بمقدار 20 ضعفاً قبل الاستخدام لتقليل تأثير المثبطات المحتملة على RT-qPCR.

8. تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)

  1. تحضير نظام تفاعل RT-qPCR
    1. أذب 2x SYBR Green qPCR master mix، وقالب cDNA، والبادئات الأمامية والعكسية بتركيز 10 µM على الثلج، مع الحماية من الضوء طوال الوقت.
    2. في لوحة PCR ذات 96 بئراً، حضّر نظام تفاعل بحجم 20 µL لكل بئر عن طريق إضافة 10 µL من 2x SYBR Green qPCR master mix، و0.8 µL من كل من البادئات الأمامية والعكسية بتركيز 10 µM (التركيز النهائي 400 nM)، و2 µL من قالب cDNA مخفف بمقدار 20 ضعفاً، و6.4 µL من ماء خالٍ من النوكلياز.
    3. أغلق اللوحة ذات 96 بئراً بغشاء لاصق بصري، مع التأكد من إغلاق جميع الآبار تماماً.
    4. قم بالطرد المركزي عند 1,000 x g لمدة 1 min لتجميع خليط التفاعل في قاع الآبار.
    5. ضع لوحة PCR في نظام كشف PCR في الوقت الحقيقي وقم بتشغيل برنامج الدورة الحرارية.
      ملاحظة: برنامج الدورة الحرارية: مرحلة ما قبل المسخ عند 95 °C لمدة 30 s (دورة واحدة)؛ التضخيم: 95 °C لمدة 30 s، و60 °C لمدة 30 s (40 دورة)؛ تحليل منحنى الانصهار: 95 °C لمدة 15 s، و60 °C لمدة 1 min، ثم الرفع التدريجي إلى 95 °C بمعدل 0.15 °C/s. تخضع كل عينة RNA من الأنسجة لـ qPCR في أربع مكررات تقنية. تتكون كل عينة نسيجية من أنسجة مجمعة من 5 Ae. albopictus. تسلسلات البادئات المستخدمة في RT-qPCR مدرجة في الجدول 1.
  2. تحليل البيانات
    1. افحص منحنى الانصهار لكل زوج من البادئات للتأكد من وجود ذروة تفكك واحدة محددة جيداً.
    2. قم بتصدير قيم Ct من برنامج الجهاز. يتم إجراء الرسم البياني وتحليل البيانات باستخدام برنامج إحصائي وبرنامج رسم بياني.
اسم البادئتتابعات البادئات (5'-3')
Ae. albopictus β-actin البادئ الأمامي GGAGAAGATCTGGCATCACA
Ae. albopictus β-actin البادئ العكسيTGTCATCTTCTCGCGGTTAG
Ae. albopictus GAPDH البادئ الأماميCTGCCAAGGCTGTCGGTAA
Ae. albopictus GAPDH البادئ العكسيTCATAGGAGGCAGGCTTGGA
Ae. albopictus RPS6 البادئ الأماميACAAGCTGCGTCACTTCTACGACA
Ae. albopictus RPS6 البادئ العكسيCTTGTCGTTTCCACCGGCAATCTT

الجدول 1: تتابعات البادئات لـ Ae. albopictus المستخدمة في تقنية RT-qPCR.

النتائج

تتكون هذه الدراسة من جزأين: تشريح Ae. albopictus واستخلاص الـ RNA من الأنسجة بعد التشريح. يظهر سير العمل العام في الشكل 1، حيث يوضح الشكل 1A عملية تشريح Ae. albopictus ويوضح الشكل 1B استخلاص الـ RNA والكشف اللاحق عن مستويات تعبير الجينات المرجعية.

figure-results-1
الشكل 1: مخطط توضيحي لتشريح Ae. albopictus واستخلاص الحمض النووي الريبي الشامل (total RNA) من الأنسجة بعد التشريح. (A) جمع وتخدير وتشريح Ae. albopictus. (B) استخلاص RNA من الأنسجة بعد التشريح، وتحديد درجة النقاء، والكشف عن مستويات التعبير للجين المرجعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم تشريح خمسة من بعوض Ae. albopictus المربى مختبرياً لعزل المعي المتوسط، والغدد اللعابية، والمبايض. وعند تكبير 80×، ظهر المعي الأمامي والمعي المتوسط والمعي الخلفي الشفاف لبعوض Ae. albopictus بشكل واضح، مع تموضع المبايض الشبيهة بالحبوب على كلا الجانبين وتغطيتها بأنابيب مالبيجي البيضاء (الشكل 2A). وعند ضبط الحقل على تكبير 400×، أصبحت الغدد اللعابية الشفافة لبعوض Ae. albopictus مرئية بوضوح (الشكل 2B). ويوضح الشكل 2C،D  أنسجة المعي المتوسط والمبايض المعزولة. وأشارت النتائج إلى أن الأنسجة المعزولة من خلال طريقة التشريح هذه قد حافظت على سلامتها البنيوية، وهو أمر ضروري لاستخلاص الـ RNA الكلي لاحقاً من العينات بعد التشريح.

figure-results-2
الشكل 2: تحليل أنسجة Ae. albopictus بعد التشريح. (أ) يتم عزل الأنسجة من بطن Ae. albopictus. (ب) الغدد اللعابية ثلاثية الفصوص والشفافة لـ Ae. albopictus. (ج) المعي الأمامي والمعي المتوسط لـ Ae. albopictus. (د) المبيضان المزدوجان اللذان يشبهان حبة الأرز لـ Ae. albopictus. I: المعي الأمامي؛ II: المعي المتوسط؛ III: المعي الخلفي؛ IV: أنابيب مالبيجي؛ V: المبيضان. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم استخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (Total RNA) من أنسجة تم تشريحها من Ae. albopictus. وقد طُحنت عينات الأنسجة (الغدد اللعابية، والمعي المتوسط، والمبايض) طحناً كاملاً قبل عملية الاستخلاص. تباينت تركيزات RNA حسب نوع النسيج: حيث كانت الغدد اللعابية 7.8 ng/µL، بينما كانت المعي المتوسط، والمبايض، ومجانسات الجسم الكامل لإناث Ae. albopictus على التوالي 55.3 و45.7 و42.7 ng/µL. وأظهرت جميع العينات نقاءً عالياً، حيث تراوحت نسب A260/A280 بين 1.87 و2.10، ونسب A260/A230 بين 1.73 و2.13 (الجدول 2). تم تقييم مستويات تعبير ثلاثة جينات مرجعية مرشحة (GAPDH وβ-actin وRPS6) بواسطة تقنية RT-qPCR في جميع الأنسجة. وعلى الرغم من تباين تعبيرها نوعاً ما مع تركيز RNA، إلا أن الجينات الثلاثة ظلت مستقرة نسبياً عبر أنواع الأنسجة المختلفة (الشكل 3). وتعتبر جينات GAPDH وβ-actin وRPS6 مناسبة كجينات مرجعية مستقرة لمعايرة التعبير الجيني في أنسجة مختلفة من Ae. albopictus.

النسيجعدد العيناتتركيز RNA (ng/μL)A260/A280A260/A230
الغدة اللعابية57.81.871.73
المعي المتوسط555.31.941.98
المبيض545.72.102.13
أنثى142.72.041.92

جدول 2: تركيز ونقاء الحمض النووي الريبوزي RNA المستخلص من أنسجة Ae. albopictus.

figure-results-3
الشكل 3: قيم Ct للجينات المرجعية (GAPDH وβ-actin وRPS6) التي تم الكشف عنها بواسطة RT-qPCR. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

Ae. albopictus منتشر على نطاق واسع في المناطق المعتدلة وشبه الاستوائية والاستوائية في جميع القارات باستثناء القارة القطبية الجنوبية13,14. وباعتباره ناقلاً مهماً للفيروسات المنقولة بالمفصليات مثل فيروس حمى الضنك (DENV)، وفيروس زيكا (ZIKV)، وفيروس شيكونغونيا (CHIKV)، فقد تسبب بشكل متكرر في تفشي الأمراض المنقولة بالبعوض في مقاطعة غوانغدونغ بالصين15.

للمساعدة في البحث حول *Ae. albopictus*الفيروسات المرتبطة بـ وكيفية انتقالها، قمنا بتطوير طريقة مباشرة لتحليل *Ae. albopictus* الأنسجة. في بروتوكولات التشريح التقليدية، عند فصل الرأس عن الصدر أثناء تشريح الغدد اللعابية، قد تظل الغدد اللعابية ملتصقة إما بالصدر أو بالرأس، وذلك اعتماداً على القوة المطبقة؛ وبما أن حجم الغدد اللعابية يبلغ حوالي 1 مم فقط، فإن تحديد موقعها داخل الصدر يصبح أمراً صعباً.16تعتمد هذه الطريقة على البروتوكولات القياسية لعزل أعضاء البعوض، وتعمل على تحسين عملية فصل الغدد اللعابية الموجودة أسفل الصفيحات القصية الأمامية والوسطى، والتي يجب فحصها تحت تكبير 400.× التكبير17لإجراء التشريح، اضغط برفق على الصدر الأوسط باستخدام إبرة واحدة، بينما تستخدم إبرة أخرى لتسليط ضغط يفصل الرأس، مما يسمح بانفصال الغدد اللعابية سليمة. يتجنب هذا النهج الحاجة إلى البحث عن الغدد اللعابية داخل الصدر، ويمنع تلوث الغدد وتضررها، كما يقلل من الوقت الإجمالي للتشريح. تقع المبايض بالقرب من القطع البطنية السادسة إلى الثامنة (VI–VIII)، ويتم الحفاظ عليها من خلال بدء التشريح من القطعة البطنية السادسة واستخراج المعي المتوسط، وأنابيب مالبيجي، والمبايض من البطن بعناية.18تنتج هذه الطريقة غدداً لعابية سليمة، وأشكالاً مبيضية نموذجية خالية من الالتصاقات، ومعياً وسطياً غير مقطوع.الشكل 2). وتوفر تقنية التشريح هذه إرشادات قيمة للدراسات المتعلقة بـ *Ae. albopictus* وتكرار الفيروسات المنقولة بالنواقل وانتشارها وانتقالها.

يُعد استخلاص الـ RNA من أنسجة Ae. albopictus أمراً بالغ الأهمية للكشف عن الفيروسات التي ينقلها البعوض. وتعتبر طريقة TRIzol التقليدية مستهلكة للوقت ومتطلبة تقنياً، إلا أنها توفر عادةً إنتاجية عالية من الـ RNA ويمكنها إنتاج RNA عالي الجودة عند تنفيذها بشكل صحيح. وفي المقابل، توفر الطريقة القائمة على الأعمدة (column-based method) قابلية تكرار أفضل وسهولة أكبر في التنفيذ، ولكنها قد تؤدي إلى استرداد كميات أقل من الـ RNA وتعمل بكفاءة منخفضة عند تطبيقها على الجسم الدهني19,20. وفي هذه الدراسة، تم حفظ الأنسجة المشرحة على الفور في مثبت للأحماض النووية، وطُحنت جيداً، وعُولجت باستخدام طريقة العمود الدوار (spin column method) لاستخلاص الـ RNA من أجل تخليق الـ cDNA21. ولضمان التقييس الدقيق لبيانات الـ RT-qPCR وسط التباينات في جودة الـ cDNA، تبرز الحاجة إلى جينات مرجعية مستقرة22. وبينما تم تحديد جينات مرجعية لمراحل نمو مختلفة من Ae. albopictus، فإن الجينات المرجعية الخاصة بالأنسجة تتطلب مزيداً من التحقق23,24. وقد أدى تحليل RT-qPCR للـ RNA المنسوخ عكسياً من جميع الأنسجة المشرحة إلى تضخيم متسق لكل من GAPDH و β-actin و RPS6، مما يؤكد أن جودة الـ RNA التي تم الحصول عليها من خلال بروتوكول التشريح هذا كافية لدعم دراسات التعبير الجيني الخاصة بالأنسجة في Ae. albopictus.

أثناء تشريح أنسجة Ae. albopictus باستخدام هذا البروتوكول، قد يحدث أحيانًا فشل في انفصال الغدد اللعابية مع الرأس. وينتج هذا عادةً عن عدم تطبيق ضغط كافٍ على الصدر بالتزامن مع فصل الرأس بسرعة مفرطة. ولحل هذه المشكلة، يجب تطبيق ضغط ثابت على الصدر الأوسط وسحب الرأس ببطء نحو الخارج، مما يسمح بانفصال الغدد اللعابية كاملة مع الرأس. وعند نقل الغدد اللعابية إلى أنبوب طحن يحتوي على محلول حفظ الـ RNA، يجب فحص المحلول بعناية مقابل مصدر ضوئي للبحث عن بقع بيضاء صغيرة عائمة. وإذا تعذر تحديد موقع الغدد اللعابية في الأنبوب، يجب التحقق فورًا مما إذا كانت لا تزال ملتصقة بإبرة التشريح. وأثناء استخلاص الـ RNA، يجب اتباع بروتوكول الشركة المصنعة للطقم بدقة. وفي حال كان تركيز الـ RNA الذي تم الحصول عليه منخفضًا، يمكن إجراء عملية شطف ثانية باستخدام محلول الشطف (elution buffer). وفي تفاعل RT-qPCR، قد تظهر قمم متعددة في منحنى الانصهار؛ وفي هذه الحالة، يجب أولاً التحقق من خصوصية البادئات (primers). وإذا كانت قيم Ct مرتفعة، يتم ضبط درجة حرارة الارتباط (annealing temperature) في البرنامج وفقًا لدرجة حرارة انصهار البادئة. وبشكل عام، يجب ضبط درجة حرارة الارتباط في البرنامج لتكون أقل بـ 1–2 °C من درجة حرارة انصهار البادئة25.

تتضمن هذه الدراسة بعض القيود؛ حيث إن نطاق العينات ضيق نسبياً، إذ ركزت فقط على المعي المتوسط، والغدد اللعابية، وأنسجة المبيض، دون استقصاء أنسجة أخرى مثل أنابيب ملبيغي والجسم الدهني26. بالإضافة إلى ذلك، اقتصر التحليل على إناث البعوض المرباة مختبرياً والتي يبلغ عمرها 3 أيام، مع استبعاد الأفراد التي تغذت على الدم أو المصابة بالفيروس27. وينبغي أن تشمل التحسينات المستقبلية توسيع نطاق العينات ليشمل أنسجة مثل أنابيب ملبيغي، والنظر في أفراد Ae. albopictus في حالات فسيولوجية مختلفة.

باختصار، يوفر تشريح المعي المتوسط والمبايض والغدد اللعابية من Ae. albopictus، متبوعاً باستخلاص الحمض النووي الريبي (RNA) الكلي، أساساً تقنياً للتقييمات اللاحقة لكفاءة النواقل ودراسات انتقال الفيروسات المنقولة بالمفصليات (arboviruses).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ماصة باستور طويلة جداً سعة 3 ملدم كامل بـ الهيبارين (WHB)WHB-S43 مل
مزيج Master Mix الشامل ChamQ SYBR qPCRVazymeQ711-02٥٠٠ تفاعل
طقم HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix for qPCRVazymeR433-01١٠٠ تفاعل
طقم استخلاص الحمض الريبي النووي الكلي الدقيق (Micro Total RNA Extraction Kit)التكنولوجيا الطبيةMDT-CFR07١٠٠ اختبار/علبة
ماصات دقيقة 0.5-10μLEppendorf4043444
شرائح المجهرسيتوتست (CITOTEST)80302-210475 مم×٢٥ مم
المطياف الضوئي المجهريKAIAOK5600C
محلول استخلاص الحمض النوويالتكنولوجيا الطبيةMDT-TP01١٠٠ مل
محلول ملحي منظم بالفوسفات (معقم) PBSServicebioG4202٥٠٠ مل
جهاز التدوير الحراري لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)EppendorfMastercycler X50s
نظام QuantStudioTM 7 Pro للتفاعل البوليميرازي المتسلسل في الوقت الحقيقي (Real-Time PCR)Applied BiosystemsEN61326-1
طقم مجهر Stemi 305 LABZEISS435063-9010-000

المراجع

  1. Hafsia S et al. Vector competence of Aedes albopictus and Aedes aegypti from the islands of the Southwestern Indian Ocean for epidemic Zika, dengue, and chikungunya viruses. Parasit Vectors. 2025;19(1):34.
  2. Zhang W, Wang J, Liu Q, Gong Z. A review of pathogens transmitted by the container-inhabiting mosquitoes, Aedes albopictus, a global public health threat. China CDC Wkly. 2023;5(44):984-990.
  3. Kraemer MUG et al. Past and future spread of the arbovirus vectors Aedes aegypti and Aedes albopictus. Nat Microbiol. 2019;4(5):854-863.
  4. Zhang M et al. Epidemiological characteristics and transmission dynamics of the early stage Chikungunya fever outbreak in Foshan City, Guangdong Province, China in 2025. Infect Dis Poverty. 2025;14(1):93.
  5. Meyer AD, Guerrero SM, Dean NE, Anderson KB, Stoddard ST, Perkins TA. Predictability of infectious disease outbreak severity: Chikungunya as a case study. Sci Adv. 2025;11(40):eadt5419.
  6. Wu Y et al. The making of a dangerous vector: factors shaping the vector competence of Aedes mosquitoes. Front Cell Infect Microbiol. 2025;15:1718737.
  7. Zhu C et al. Transcriptome analysis of Aedes aegypti midgut and salivary gland post-Zika virus infection. Curr Res Parasitol Vector Borne Dis. 2025;7:100251.
  8. Liu X, Yang S, Yao Y, Wu S, Wu P, Zhai Z. Opsin1 regulates light-evoked avoidance behavior in Aedes albopictus. BMC Biol. 2022;20(1):110.
  9. Zhang Y et al. Rapid differential detection of Japanese encephalitis virus and Getah virus in pigs or mosquitos by a duplex TaqMan real-time RT-PCR assay. Front Vet Sci. 2022;9:839443.
  10. Coleman J, Juhn J, James AA. Dissection of midgut and salivary glands from Ae. aegypti mosquitoes. J Vis Exp. 2007;4(5):228.
  11. Tesena P, Korchunjit W, Taylor J, Wongtawan T. Comparison of commercial RNA extraction kits and qPCR master mixes for studying gene expression in small biopsy tissue samples from the equine gastric epithelium. J Equine Sci. 2017;28(4):135-141.
  12. Ramdini C et al. First report of Aedes albopictus in Saint Barthélemy (French West Indies) confirmed by morphological, molecular and MALDI-TOF mass spectrometry approaches. Parasit Vectors. 2025;18(1):258.
  13. Battaglia V et al. The worldwide spread of Aedes albopictus: new insights from mitogenomes. Front Genet. 2022;13:931163.
  14. Laporta GZ, Potter AM, Oliveira JFA, Bourke BP, Pecor DB, Linton YM. Global distribution of Aedes aegypti and Aedes albopictus in a climate change scenario of regional rivalry. Insects. 2023;14(1):49.
  15. Yip SSW, Charm CYC, Ng KS, Lam SC. Chikungunya fever: a re-emerging mosquito-borne threat demanding proactive prevention strategies in Asia. Front Public Health. 2026;14:1745145.
  16. Tutagata J, Pocquet N, Trouche B, Reveillaud J. Dissection of mosquito ovaries, midgut, and salivary glands for microbiome analyses at the organ level. J Vis Exp. 2024;(212):67128.
  17. Schmid MA, Kauffman E, Payne A, Harris E, Kramer LD. Preparation of mosquito salivary gland extract and intradermal inoculation of mice. Bio Protoc. 2017;7(14):e2407.
  18. Airs PM, Nazarchyk MJ, Tucker BJ, Bartholomay LC. Characterizing oogenesis and programmed cell death in the eastern tree hole mosquito Aedes (Protomacleaya) triseriatus. Front Insect Sci. 2022;2:1073308.
  19. Chomczynski P, Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 2006;1(2):581-585.
  20. De Azevedo N, Lozano A, Parsons RE, Martin TC. Optimized protocols to extract total transcripts and proteins from lipid-rich tissues. Methods Protoc. 2026;9(2):65.
  21. García-Longoria L, Ahrén D, Berthomieu A, Kalbskopf V, Rivero A, Hellgren O. Immune gene expression in the mosquito vector Culex quinquefasciatus during an avian malaria infection. Mol Ecol. 2023;32(4):904-919.
  22. Lü J, Yang C, Zhang Y, Pan H. Selection of reference genes for the normalization of RT-qPCR data in gene expression studies in insects: a systematic review. Front Physiol. 2018;9:1560.
  23. Dzaki N, Azzam G. Assessment of Aedes albopictus reference genes for quantitative PCR at different stages of development. PLoS One. 2018;13(3):e0194664.
  24. Vedururu RK et al. RNASeq analysis of Aedes albopictus mosquito midguts after chikungunya virus infection. Viruses. 2019;11(6):513.
  25. Bustin SA et al. MIQE 2.0: revision of the Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments guidelines. Clin Chem. 2025;71(6):634-651.
  26. Skowronek P, Wójcik Ł, Strachecka A. Fat body-multifunctional insect tissue. Insects. 2021;12(6):547.
  27. Goldman OV et al. A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult Aedes aegypti mosquito. Cell. 2025;188(25):7267-90.e26.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تشريح البعوضتشريح المعي المتوسطتشريح الغدد اللعابيةتشريح المبيضتحليل RT-qPCRتعبير الجينات المرجعيةنقاء الحمض النووي الريبي للأنسجة
تشريح Aedes albopictus واستخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) الكلي من الأنسجة بعد التشريح
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.