هذا الفيديو يبين عملية خلية كاملة التسجيلات المشبك الجهد في شريحة الشبكية من السمندل النمر المائية. نبدي استعدادا لشريحة وكذلك كيفية تنفيذ تسجيلات المشبك التصحيح خلال التحفيز البصري لشبكية العين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مستدعى خلية كاملة تسجيلات الضوء التيارات متشابك مثير في شريحة الشبكية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نستخدم المشبك التصحيح خلية كاملة لدراسة تقنية الدارات متشابك التي ترتكز عليها معالجة المعلومات البصرية في الشبكية. في هذا الفيديو ، فإننا سوف دليل لكم من خلال عملية تنفيذ كامل الخلية تسجيلات ضوء التيارات أثار الخلايا الفردية في إعداد شريحة الشبكية. نستخدم نمر المائية السمندل كنموذج للحيوانات. نبدأ بوصف تشريح العين وكيفية عرض الشرائح هي التي شنت للتسجيلات الكهربية. مرة واحدة يتم وضع شريحة في غرفة تسجيل ، ونحن لشرح كيفية تنفيذ كامل الخلية التسجيلات المشبك الجهد. نحن المشروع ثم محفزات بصرية وعلى المستقبلات الضوئية في لانتزاع شريحة ضوئية أثار ردود الحالي. خلال تسجيل يروي لنا شريحة مع وكلاء الدوائية ، حيث نظام الارواء 8 قنوات تسمح لنا التبديل بسرعة بين وكلاء مختلفة. ويستخدم على نطاق واسع في إعداد شريحة الشبكية للتسجيلات المشبك التصحيح في شبكية العين ، لا سيما لدراسة الخلايا أو عديم الاستطالات القطبين ، والتي لا يمكن الوصول إليها في إعداد كامل جبل.
البروتوكول
الحلول
- الحل بين الخلايا لخلايا العقدة (مم) : 100 K - غلوكونات ، 8 بوكل ، 1 MgCl 2 ، 1 EGTA ، 10 HEPES ، 4 ATP ، GTP 0.5 و 90 ميكرومتر Sulforhodamine باء (لتلوين) ، بعد تعديلها لدرجة الحموضة = 7.4 مع KOH
- الحل بين الخلايا لخلايا القطبين (مم) : 90 K - غلوكونات ، 8 بوكل ، 1 MgCl 2 ، 10 BAPTA ، 10 HEPES ، 4 ATP ، GTP 0.5 و 90 ميكرومتر Sulforhodamine باء (لتلوين) ، بعد تعديلها لدرجة الحموضة = 7.4 مع KOH
- محلول رينغر خارج الخلية (مم) : 112 كلوريد الصوديوم ، الجلوكوز 5 ، 5 HEPES ، 2 بوكل ، 2 CaCl 2 ، 1 2 MgCl ، بعد تعديلها لدرجة الحموضة = 7.75 مع هيدروكسيد الصوديوم. الأوكسجين من الحل وليس من الضروري.
إعداد غرف تسجيل
لدينا غرفة تسجيل تتكون من شريحة المجهر بمادة لاصقة جيدا في السيليكون الذي يمنع قطع صغيرة أخرى لاصقة وضعت بشكل جيد لتوفير الاستقرار لشرائح الأنسجة.
إعداد شرائح الشبكية
لتجنب التبييض من المستقبلات الضوئية ، ويتم تشريح في ضوء الأشعة تحت الحمراء أو خافت الضوء الأحمر. إذا كان أحد يرغب في تسجيل الاستجابات من المسار قضيب ، يجب استخدام الضوء الوحيد IR (الأشعة تحت الحمراء المجهر وتشريح أي ضوء الغرفة ، وينبغي استخدام نظارات الأشعة تحت الحمراء الإضافية لإجراءات لم تفعل تحت المجهر). يمكن إذا كان أحد يهتم أساسا في ضوء تسجيل الاستجابات المخروط ، الضوء الخافت الغرفة الحمراء أو ضوء الفلاش الحمراء يمكن استخدامها. المجهر ، ومع ذلك ، ينبغي أن يكون لا يزال oculars الأشعة تحت الحمراء.
إذا الإدخال مبصرة لا يمت بصلة لهذه التجربة ، يمكن القيام بإجراءات في ضوء الغرفة العادي باستخدام المجهر العادية.
- تحضير الشرائح المجهر two مع سيليكون لاصقة أيضا : إنشاء اثنين من نطاقات متوازية من الشحوم السيليكون (حوالي 0.5 سم بعيدا) على كل الشرائح ووضع قطعة مستطيلة من الورق تصفية على جانب واحد من الشرائح ، سواء معبر العصابات الشحوم (دفع التصفية مع جزء من ورقة شفرة حلاقة بحيث يتم المرفقة جيدا إلى الشريحة)
- تضحية السمندل المنشأة وفقا لبروتوكولات : يتم وضع الحيوانات في حمام الثلج لمدة 30 دقيقة ، ثم مقطوعة الرأس وضعف pithed.
- مبلل إزالة العين من الرأس السمندل ووضعه تحت مجهر تشريح على قطعة من المناديل الورقية مع الحل الجليد الباردة رينغر
- إزالة النسيج الضام من العين
- استخدام شفرة حلاقة لإجراء قطع صغير في القرنية
- عقد قطع القرنية مع ملقط حين إزالته بالمقص على طول حرصه على العين
- إزالة العدسة مع ملقط
- عقد القزحية مع ملقط وقطع على طول مشرشر أورا لإزالة قزحية
- قطع فنجان العين في اثنين قطع مستطيلة
- التقط واحدة من القطع الصلبة وضعه الجانب حتى على ورقة الترشيح (للتأكد من أصل قطعة تتسطح في حين تضغط عليه بعناية فائقة)
- رفع بلطف الصلبة قبالة شبكية العين ، والتي ينبغي الآن على الورقة المرفقة المدون
- إضافة الحل بسرعة الجليد الباردة رينغر إلى البئر
- تكرار نفس القطعة الثانية
- استخدام شفرة حلاقة وضعت في تقطيع اللحم والعرف لخفض 200 300μm شرائح واسعة.
- استخدام زوج من ملقط لالتقاط الشرائح على جانب ورقة الترشيح ، تسليمهم حتى طبقات الشبكية تصبح مرئية ، ووضعها على نطاقات الشحوم فراغ
- اختيار شريحة التي تبدو سليمة ويبين الفرق أفقي يشير إلى طبقات الشبكية (طبقات في بعض الأحيان من الصعب أن نرى تحت مجهر التشريح والتكبير ليست عالية بما فيه الكفاية ، ولكن إذا كان يمكن للمرء أن يتعرف على بعض طبقات شريحة عادة جيدة بما فيه الكفاية. القرار النهائي بشأن ما إذا كان استخدام شريحة ، ولكن ، مرة واحدة وينظر تحت المجهر تستقيم). نقله إلى غرفة تسجيل الشريحة من خلال بناء جسر بين الشرائح رينغر two
- تأكد من دفع ورقة الترشيح ضد كتل المطاط في غرفة تسجيل شريحة بحيث لا يميل (خلايا العقدة مبصرات وينبغي أن يكون في التركيز في نفس الوقت)
وضع الأنسجة في تلاعب تسجيل
- يتم وضع الشريحة تسجيل تحت المجهر وperfused مع حلول رينغر من خلال الجاذبية التنفسي نضح
- إعداد تصور هو مع المجهر تستقيم مع الهدف الماء الغمر 10x و40X.
- مرة أخرى ، ونحن فقط استخدام ضوء الأشعة تحت الحمراء لمنع تبييض للمبصرات. ويرد كاميرا الأشعة تحت الحمراء إلى جانب منفذ المجهر ، وهذا مرتبط إلى شاشة التلفزيون.
التحفيز البصري
مبرمجة المحفزات البصرية في Matlab باستخدام Psychtoolbox ويتوقع على شبكية العين عن طريق ميناء رأس مجهر الفحص المجهري باستخدام محقن صورة (MBF العلوم الحيوية). A بتات + + يستخدم معالج الفيديو الرقمي (كامبريدج لأبحاث الأنظمة) للحصول على نطاق والإنارة و14bit synchronize عرض الحوافز مع الحصول على البيانات. والمحفزات البصرية المستخدمة في هذا الفيديو وأشرطة مشرق أو داكنة (العرض = 460μm) على النقيض من 100 ٪ ، والتي قدمت لمدة ثانيتين على خلفية موحدة ثابتة (الإنارة = 8 * 10 4 الفوتونات / ميكرون / ثانية ، الحجم : 1.84 س 1.38mm).
الكهربية
- يتم سحبها أقطاب التصحيح من الزجاج البورسليكات (OD :. 1.5mm ، ID 84mm) مع مجتذب micropipette. للخلايا العقدة ، المقاومة هي ما بين 2 و 4 MOhms. للخلايا بين القطبين ، وتستخدم المقاومة العالي ما بين 4 و 8 MOhms.
- تجرى التسجيلات المشبك الجهد باستخدام 700A Multiclamp (الأجهزة الجزيئية) ، ومكبر للصوت المختبر البرامج المبرمجة في LABVIEW الداخلية.
- وperfused المخدرات من خلال نظام الارواء 8 قنوات. يوضع القطب microperfusion قريبة من شريحة (النسيج يجب أن تتحرك بشكل واضح عند تشغيل نضح وخارجها ، ولكن يحتاج المرء أن يكون حذرا من ان الضغوط ليست قوية جدا بحيث يمكن أن تصبح شريحة منفصلة عن ورقة الترشيح). وينبغي أن يكون خلال التجارب microperfusion تحول باستمرار على (حل perfusing السيطرة إذا ليست هناك حاجة المخدرات) بحيث لا يتم تسجيل منزعجة من الحصول على تبديل نضح وخارجها.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الفوائد :
- جميع أنواع الخلايا متاحة
- من السهل تحديد من أنواع الخلايا ، وبخاصة إذا تم إضافة صبغة الفلورسنت إلى الحل الكهربائي
- ويمكن الوصول بسهولة وكلاء الدوائية الخلايا المستهدفة
- تقنية التصحيح المشبك يسمح للتحقيق في دور مختلف القنوات الأيونية في حس...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| Multiclamp 700A | مضخم تثبيت الرقعة (Patch Clamp Amplifier) | Molecular Devices | ||
| SZX9 | مجهر تشريح | Olympus Corporation | ||
| BX50WI | مجهر رأسي | Olympus Corporation | مجهز بعدسات شيئية تكبير 40x و10x غمر مائي، ومرشحات فلورية ومصباح زئبقي | |
| P-97 | جهاز سحب الماصات الدقيقة | Sutter Instrument Co. | ||
| Lucivid | حاقن صور مجهرية | MBF Bioscience | ||
| 8-channel perfusion system | تروية دقيقة | Parker Hannifin Corporation | ||
| Bits++ | معالج فيديو رقمي | Cambridge Research Systems | ||
| Infrared Oculars | أخرى | ITT Visual Information Solutions | ||
| Adhesive silicone wells | أخرى | Molecular Probes, Life Technologies | قطر 20mm، وعمق 1.0mm | |
| Membrane Filters | مرشح | EMD Millipore | HAWPO1300 | .45μm HA |
| Borosilicate Glass Capillaries | زجاج أقطاب كهربائية | World Precision Instruments, Inc. | 1B150-4 | |
| Syringe Filters | مرشح | Whatman, GE Healthcare | 6789-0402 | مرشحات 4mm، غشاء نايلون .2um، هيكل من البولي بروبيلين |
| IR camera | كاميرا مثبتة على المجهر | Sony Corporation | SPT-M324 | Extrawave HAD، كاميرا فيديو B7W |
| Picrotoxin | كاشف | Sigma-Aldrich | P1675 | |
| Strychnine | كاشف | Sigma-Aldrich | S0532 | |
| Imidazole-4-acetic acid sodium salt | كاشف | Sigma-Aldrich | I7013 | |
| Larval tiger salamanders | حيوان | Charles E. Sullivan |
المراجع
- Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina. Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).
- Heflin, S. J., Cook, P. B. Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation. Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).
- Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells. J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
