الماوس البشرة الجذعية العصبية خلية كريست (EPI - NCSC) الثقافات

ملخص

نعرض هنا لدينا وسيلة لعزل الماوس البشرة الجذعية العصبية قمة الخلايا (EPI - NCSC). الأسلوب الذي ينطوي على تشريح المسام الدقيقة ضئيلة للغاية ، وعزل انتفاخ placeing عليه في زراعة الأنسجة. EPI - NCSC بدء الهجرة من explants انتفاخ على الطبقة التحتية في غضون 3 -- 4 أيام.

الملخص

EPI - NCSC هي من مخلفات العصبية الجنينية للقمة في مكان غير أخلاقي ، وانتفاخ في بصيلات الشعر. هم الخلايا الجذعية multipotent التي لديها خاصية فسيولوجية لتوليد مجموعة واسعة من أنواع الخلايا المختلفة ، بما في ذلك الخلايا العصبية ، الخلايا العصبية الداعمة ، وخلايا العضلات الملساء والعظام / خلايا الغضاريف والخلايا الصباغية. EPI - NCSC يمكن الحصول عليها بسهولة في الجلد وشعر كما يمكن عزل السكان نقية للغاية من الخلايا الجذعية. هذا الفيديو يوفر بروتوكول مفصلة لإعداد الماوس EPI - NCSC الثقافات من بصيلات ضئيلة للغاية. إزالة لوحة من الخط الطولي ماوس الكبار ، وتشريح بصيلات الطولي. المسام تقطع طوليا ثم في وقت لاحق وبشكل مستعرض فوق وتحت منطقة انتفاخ. إزالة انتفاخ من كبسولة الكولاجين وضعت في لوحة الثقافة. EPI - NCSC بدء الهجرة من انتفاخ explants 3 إلى 4 أيام في وقت لاحق.

البروتوكول

تشريح من الانتفاخ من الكبار المسام الشارب ماوس

1. نحن نستخدم 10 أسابيع إلى 6 أشهر من العمر الفئران. الفئران الأصغر الغلة غالبا ما تكون أكثر الخلايا. الموت ببطء والفأر حيوان تغرق بالكامل في خليط من betadine 01:01 (محلول اليود) وبيروكسيد الهيدروجين (المتوفر من الصيدلية) لحوالي 3 دقائق.
   
2. بخ كامل الماوس ، لا سيما في منطقة الوجه ، مع الايثانول 75 ٪ ، وحمل الماوس لمجهر تشريح هود في التدفق الصفحي.
3. تشريح منصات الطولي ، وتجنب القطع بعناية في بصيلات الشعر ، وحمام سباحة في HBSS.
4. تشريح بصيلات الطولي وحمام سباحة في HBSS في درجة حرارة الغرفة. القيام بذلك عن طريق عقد الجلد بجانب بصيلات الشعر مع ملقط ، ومن ثم قطع جميع أنحاء جراب مع المقص مباشرة. قطع عميق لتجنب اصابة بصيلات الشعر.
5. رفع جريب شعرة شعرة من لوحة ووضعها في لوحة جديدة مع HBSS الطازجة.
6. تدفق adipous فضفاضة والنسيج الجلدي مع النافورات من العازلة ، وحتى المسام نظيفة ضئيلة للغاية. إذا لزم الأمر ، وقطع العصب للجريب شعرة وإزالة الأنسجة الملتصقة عن طريق كشط والهبات المتكررة HBSS.
7. دبوس شعر على تنظيف follilce Sylgard المغلفة الزجاج طبق بتري باستخدام الإبر التنغستن شحذ ، وذلك باستخدام microforceps عن التمسك الجزء الجلد المجاور للجريب.
8. قطع شعرة جراب longitudically مع microblade. تجنب قطع عميق جدا ، حيث سيؤدي ذلك إلى إصابة انتفاخ. إزالة الدم مع النافورات المتكررة HBSS حتى ذهب. ظهور الدم يعتبر مؤشرا جيدا على أن خفض كانت عميقة بما فيه الكفاية. إذا لم يتم خفض longitudial طويلة بما فيه الكفاية ، يجوز إطالتها مع microscissors عازمة.
9. اجراء خفض عرضية فوق مستوى الجيوب الكهفية ، وبعد ذلك بخفض ثان على مستوى عرضية داخل تجويف حلقة ، على مقربة من الجلد.
10. سترى الآن انتفاخ داخل الكبسولة.
11. الاستيلاء على وضع حد لكبسولة من الكولاجين مع ملقط وطرح انتفاخ بإبرة التنغستن عازمة. سترى الآن الكبسولة الفارغة وانتفاخ معزولة.
12. عزل تجمع الانتفاخات في صفيحة ثقافة منفصلة في HBSS في درجة حرارة الغرفة. تأكد من عدم الأنسجة الأخرى هي تلوث الانتفاخات المجمعة.

ثقافة Explants انتفاخ

1. معطف 35 ملم مع لوحات ثقافة الكولاجين الكولاجين من خلال وضع 50 و 10 ميكرولتر ميكرولتر العقيمة كلوريد الصوديوم 6 ٪ بجانب بعضها البعض. تخلط جيدا مع الماصة Pasteyr المزدوج عازمة والدفع باتجاه حافة صفيحة الثقافة. يحضن بين عشية وضحاها في dessicator نظيفة ، ولكن لا تدع الجافة. قبل الاستخدام ، لوحات شطف مع المياه المالحة.
2. قبل احتضان الثقافة لوحات الكولاجين المغلفة وتشطف لحوالي 3 دقائق مع متوسط ​​الثقافة. مستنبت يتكون من 85 ٪ الفا تعديل MEM ، و 10 ٪ مصل بقري جنيني و 5 ٪ اليوم استخراج الجنين الفرخ 11.
3. بعد إعادة حضانة ، وإزالة لوحات مستنبت من الانتفاخات وإضافة عدة مع متوسط ​​أقل قدر ممكن. إزالة الزائدة متوسطة الثقافة.
4. احتضان لمدة 1 ساعة ، ولكن لم يعد ، في الخلية الحاضنة في جو مرطب مع الأكسجين 10 ٪ و 5 ٪ CO _2.
5. بعد 1 ساعة ، إضافة بلطف 1.5 مل من المتوسط ​​الثقافة. ينبغي explants انتفاخ التمسك التحتية الكولاجين. استبدال 50 ٪ من متوسط ​​الثقافة اليومية.
6. في غضون 3 -- 4 أيام ، وسوف الخلايا الكثيرة الارتحال الهجرة من explants انتفاخ. علما التشكل على نجمي ، حركية ، وعدم وجود الغالبة من خلية خلية الاتصالات. خلال الأيام القليلة المقبلة ، سيكون أكثر الخلايا الهجرة ، وهاجر وسوف تتكاثر الخلايا بسرعة.
7. إزالة انتفاخ 2 -- 3 أيام بعد ظهور EPI - NCSC الهجرة بإبرة التنغستن شحذ. إذا ترك الانتفاخات أطول ، فإنها تميل إلى تسطيح ويجعل من المستحيل الحصول على برنامج التحصين الموسع ، نقية NCSC الثقافات.
8. المهم : خلايا نادرة مع التشكل بالارض ، والتي أصبحت واضحة في بعض الأحيان عدة أيام في وقت لاحق من البرنامج الموسع للتمنيع ، NCSC ، والتي هي أقل متحركة وغير EPI - NCSC ، ولكن المفترض الخلايا الجذعية البشرة / الأسلاف. الثقافات التي تتكون من هذه الخلايا ، أو الثقافات المختلطة التي تحتوي على برنامج التحصين الموسع ، والمفترض NCSC الخلايا الجذعية البشرة / الأسلاف يجب أن يتم التخلص منها.
9. تلميح : لا تبقي الخلايا لفترة طويلة جدا في المتوسط ​​يزدرع الابتدائية ، كما أنها تميل إلى التفريق في كثافة الخلايا بسرعة عالية ، وبسبب مزعومة autocrine / نظير الصماوي النمو يشير عامل.

المناقشة

بحكم قدرتها على الهجرة ، ويمكن أن تكون معزولة EPI - NCSC كما يبلغ عدد سكانها نقية للغاية من الخلايا الجذعية ، التي يمكن توسيعها في المختبر. كبقايا الجنينية في موقع الكبار ، EPI - NCSC المرشحين يحتمل أن تكون جذابة بالنسبة لمستقبل العلاجات البديلة للخلية ، الهندسة الطبية و / أو الطب التجديدي. لقد اختبرنا EPI - NCSC في نموذج الفأر من اصابات الحبل الشوكي ، حيث أنها تظهر الصفات المرغوب فيه. من خلال التعبير الجيني التنميط التي LongSAGE (www.ncbi.nlm.nih.gov / الجغرافية ، سلسلة عدد GSE4680) أظهرنا ذلك ، كما ...