هذا الفيديو يصف التلاعب في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الليزر ملاقط في المختبر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
باستخدام الملقط ليزر لمعالجة الخلايا العصبية معزولة في المختبر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في هذه الورقة ، والفيديو ، ونحن تصف البروتوكولات المستخدمة في المختبر لدينا لدراسة تفضيلات استهداف عمليات تجديد الخلايا من الخلايا العصبية للشبكية الكبار في المختبر. إجراءات لإعداد الثقافات خلايا شبكية تبدأ عملية الهضم ، وتشريح سحن من شبكية العين ، وتنتهي مع طلاء للخلايا الشبكية معزولة على أطباق مصنوعة خصيصا للاستخدام مع ملاقط الليزر. وتنقسم هذه الأطباق في خلية half اللاصقة والمواد الطاردة للنصف الخلية. وهي مغلفة الجانب اللاصق الخلية بطبقة من الأضداد - 1 سال ، والتي توفر الركيزة التي تقوم عليها خلايانا النمو. ويمكن استخدام لاصق ركائز أخرى لأنواع الخلايا الأخرى. وهي مغلفة الجانب طارد الخلية بطبقة رقيقة من البولي HEMA. محاصرون الخلايا مطلي على الجانب بولي HEMA للطبق مع ملاقط الليزر ونقلها ثم وضعت في زنزانة مجاورة على الجانب - 1 سال لخلق الزوج. وينبغي تشكيل مجموعات من أي حجم الخلية يكون ممكنا مع هذه التقنية. "الليزر ملاقط المجهرية التي تسيطر عليها" يعني أن المحقق يمكن اختيار أي خلايا للتحرك ، والمسافة المطلوبة بين الخلايا يمكن أن تكون موحدة. لأن شعاع الليزر يمر عبر سطوح شفافة من صحن والثقافة ، وتتم تحديد الخلية والتنسيب في بيئة مغلقة معقمة. يمكن رصد الخلايا الفيديو مرور الزمن وتستخدم مع أي تقنية بيولوجية الخلية المطلوبة. هذه التقنية قد تساعد التحقيق في خلية خلية التفاعلات.
البروتوكول
ملاقط بصرية لمعالجة الخلايا المعزولة في الثقافة
تتولد من محاصرة القوات ملاقط بصرية من الزخم للضوء (Ashkin ، 1991 ؛. Ashkin وآخرون ، 1986). على الرغم من أن هذه القوات الفخ بسهولة الخلايا في التعليق ، فهي ليست قادرة على نقل الخلايا التي تلتزم السطح. لذلك ، للحد من الالتصاق على طبق الثقافة في النقطة التي يتم فيها محاصرة الخلايا ، ساترة المغلفة مع البولي - 2 - hydroxyethylmethacrylate (بولي هيما) (سيغما كيميكال ، وسانت لويس ، MO) مركب ، غير سامة مع الخلية طارد الخصائص المستخدمة سابقا للدراسات على التصاق الخلايا البطانية (فوكمان وموسكونا ، 1978). بينما بولي HEMA....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الضوء والزخم ، وعندما شعاع الضوء ينكسر عند مروره من خلال خلية ، لا بد من القوة لتغيير اتجاه الزخم. بسبب قانون الحفاظ على الزخم ، يجب أن يشكل قوة في الاتجاه المعاكس ، في المقابل ، رد فعل مرة أخرى على الخلية. وأظهرت Ashkin (1991) أن القوة التي تم إنشاؤها بواسطة أشعة الليزر التي تركز عدسة المجهر الهدف ستتحرك خلية نحو وسط التركيز. على الرغم من شعاع الليزر يولد سوى عدد قليل من piconewtons القوة ، هذه القوة غير كافية لسحب خلية من خلال المتوسط. ويستخدم طول موجة الأشعة تحت الحمراء القريبة التي تمتص المياه سيئ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
كان مدعوما من قبل المنح البحثية والمعاهد الوطنية للصحة EY012031 EY0182175 ومؤسسة كيربي FM.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| غطاء زجاجي دائري مقاس 25mm رقم 1 | VWR international | 48380 080 | |
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | P-3932 | يُذاب في ethanol بتركيز 95% |
| جسم مضاد IgG من الماعز مضاد للفأر | Chemicon International | AP181 | 1mg في 1ml، يُخفف بمقدار 10x عند الاستخدام |
| طافي Sal-1 يحتوي على جسم مضاد للفأر مضاد للسمندل | مقدم بسخاء من Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | |
| ماصات pyrex disposable سعة 5ml بفتحة 3 mm | Corning | 7078A-5 | |
| أطباق زراعة الخلايا 35mm x 10mm | Corning | 430165 | |
| طقم elastomer السيليكون Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| ملاقط بصرية-أداة مجهرية أو ملاقط ليزر | Cell Robotics Inc. | ||
| ليزر دايود بموجة مستمرة بقدرة 1 W وطول موجي 980nm | Cell Robotics Inc. | ||
| مجهر ضوئي مقلوب Axiovert 100 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| عدسة شيئية neofluor مستوية بغمر زيتي تكبير 40x | Carl Zeiss, Inc. | الفتحة العددية (N.A. 1.3) | |
| كاميرا CCD بالأبيض والأسود | Sony Corporation | ||
| حاسوب وعصا تحكم مع برنامج تشغيل | Cell Robotics Inc. | للتحكم في منصة آلية |
المراجع
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
