Why is PCR better than culturing for detecting microorganisms in environmental samples?

PCR can detect non-culturable microorganisms that have low metabolic activity or stringent growth requirements impossible to replicate in labs. Unlike culturing, which may not reflect actual environmental abundance, PCR amplifies even small amounts of DNA from mixed samples, enabling rapid identification of specific microbes regardless of their viability or culturability status.

What are the three temperature phases in a PCR cycle and what happens at each?

Denaturation above 92°C breaks DNA into single strands. Annealing at 50-65°C allows primers to bind target sites on the template. Extension at 72°C enables Taq polymerase to synthesize new DNA strands. After each cycle, the amplified DNA serves as new template, causing exponential product increase.

How do primers enable specific detection of target organisms in PCR?

Primers are short nucleotide sequences designed to bind only to unique DNA sequences of the organism of interest. Their high specificity for complementary nucleic acid binding allows targeted amplification of specific sequences from complex environmental samples. By designing primers for unique or combination sequences, PCR differentially detects target organism DNA among all genetic material present.

What is the role of gel electrophoresis in PCR-based microorganism detection?

Gel electrophoresis resolves PCR products by size using an agarose gel matrix. An electric field causes negatively charged DNA molecules to migrate toward the positive electrode, with larger linear DNA traveling slower through the gel. Band positions are analyzed to confirm whether the expected amplicon size matches the target organism, indicating its presence in the environmental sample.

How can multiplexed PCR differentiate between bacterial strains?

Multiplexed PCR combines multiple primer sets targeting different unique genome regions in a single reaction. Individual primer sets are designed to produce products from only specific strains. Unique band patterns result from each strain, allowing researchers to differentiate antibiotic-resistant bacterial strains like Staphylococcus aureus and identify which strains are present in clinical or environmental samples.

What controls should be included when performing PCR on environmental samples?

Include a positive control template containing the target DNA region to verify the reaction works properly. Include a negative control with no DNA template to rule out contamination in reaction components. These controls ensure reliable results and help identify potential issues with reagents or technique during PCR amplification of environmental DNA.

What practical applications does PCR have for detecting pathogens in environmental and clinical settings?

PCR detects disease-causing organisms like Naegleria fowleri in water samples and cerebrospinal fluid. It identifies pathogenic bacteria such as Salmonella and Listeria in flies near food establishments for public health monitoring. PCR also identifies antibiotic-resistant strains in clinical samples, supporting outbreak investigations and disease surveillance across environmental and clinical contexts.

الكشف عن الكائنات الحية الدقيقة البيئية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي للهلام

0 مشاهدة13:34 دقيقة

1. مجموعة العينات

اجمع التربة باستخدام مثقاب أو مجرفة إلى عمق محدد. إذا كنت تجمع التربة من الجذور (المنطقة الضيقة من التربة المحيطة بجذور النباتات والميكروبات المرتبطة بها وتتأثر بها) ، فقم فقط بالجمع مباشرة من حول جذور النبات عن طريق ضرب التربة في برميل التجميع.
اجمع عينة الماء عن طريق غمس زجاجة بلاستيكية معقمة في الماء مع إمساك نهاية عصا الغمس.

فئة 2. استخراج وتحضير الأحماض النووية

اجمع الكائنات الحية والفيروسات من العينة ، واستخرج منها الحمض النووي والحمض النووي الريبي. للحصول على التفاصيل ، يرجى الرجوع إلى فيديو JoVE Science Education حول استخراج الحمض النووي في المجتمع.
قم بتخزين الحمض النووي المستخرج في أنابيب ميكروفوج مصنفة. إذا احتاج الحمض النووي إلى التخزين طوال الليل أو لفترات أطول من الوقت ، فقم بتجميده عند -20 درجة مئوية ، وقم بإذابة الأنابيب في درجة حرارة الغرفة عندما تكون جاهزة للاستخدام.
إذا كانت المادة الوراثية المراد فحصها هي الحمض النووي الريبي (سواء كان جينوم فيروسات الحمض النووي الريبي ، أو الحمض النووي الريبي المنسوخ للكائنات الخلوية) ، فقم بإجراء النسخ العكسي (RT) على العينة لإنشاء الحمض النووي التكميلي (cDNA) قبل المتابعة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لمزيد من التفاصيل ، يرجى الرجوع إلى فيديو JoVE Science Education على RT-PCR.

فئة

3. تفاعل البوليميراز المتسلسل

ضع إنزيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (على سبيل المثال ، Taq polymerase) على الجليد وقم بإذابة الكواشف الأخرى (المخزن المؤقت PCR ، dNTPs ، الاشعال) داخل غطاء "نظيف" مخصص في درجة حرارة الغرفة. يتم تخزين الإنزيم عند -20 درجة مئوية ولكنه لا يتجمد أبدا. إنه حساس لدرجة الحرارة ، وبالتالي يجب أن يظل باردا وتقليل تعرضه لدرجة الحرارة المحيطة
احسب حجم كل كاشف مطلوب لعمل "مزيج رئيسي" لجميع الكواشف الثابتة بين جميع التفاعلات (الجدول 1). تأكد من مراعاة عناصر التحكم الإيجابية (على سبيل المثال، نموذج معروف باحتوائه على المنطقة المستهدفة) والسلبية (على سبيل المثال، لا يوجد نموذج) في العمليات الحسابية. أضف 10٪ إضافية إلى الحجم النهائي لمراعاة خطأ سحب العينات. تعتمد أحجام التمهيدي على فحوصات لكائنات معينة. راجع الأدبيات المنشورة للحصول على القيم المناسبة.
باستخدام أنبوب ميكروفيج منخفض الارتباط ، مما يقلل من التصاق جزيئات الكاشف بالجدران البلاستيكية ، أضف الأحجام المحسوبة لكل كاشف لتجميع المزيج الرئيسي. قم بتدوير كل كاشف برفق وجهاز طرد مركزي قبل الإضافة. بمجرد تحضير المزيج الرئيسي ، قم بخلط الدوامة وتجميعها عن طريق الطرد المركزي
تحضير شرائط PCR ذات 8 أنابيب. تعيين أنبوب لكل عينة ، بما في ذلك عناصر التحكم الإيجابية والسلبية
قم بتوزيع الحجم المناسب من خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل في كل أنبوب من الشريط
أضف الحجم المناسب لقالب الحمض النووي من العينات ، بالإضافة إلى 5 ميكرولتر من القالب الموجب و 5 ميكرولتر من الماء من الدرجة الجزيئية كتحكم سلبي ، في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل المعنية.
ضع الغطاء بإحكام على الشريط المكون من 8 أنابيب وجهاز الطرد المركزي لبضع ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي صغير
ضع الشريط المكون من 8 أنابيب في جهاز تدوير حراري
اضبط برنامج PCR المناسب لتشغيله على الدراجة الحرارية. يتكون البرنامج النموذجي مما يلي
1. التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
2. 30-40 دورة من التضخيم: التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، التلدين عند درجة حرارة خاصة بالتمهيدي (عادة بين 50-60 درجة مئوية) لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية / 500 نقطة أساس.
3. التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 7-10 دقائق.

< ص الفئة = "jove_title" >4. تحضير جل الاغاروز

بناء على حجم الجل المطلوب وتركيز الجل (الجدول 2) ، قم بوزن الكمية المناسبة من مسحوق الاغاروز في قارورة إرلينماير سعة 125 مل.
أضف الحجم المناسب من المخزن المؤقت لتشغيل الهلام في القارورة ، وقم بتدوير القارورة يدويا.
سخني خليط العازلة الاغاروز في فرن ميكروويف على طاقة عالية لمدة 1 دقيقة.
أخرجي القارورة من الميكروويف ولفيها باليد للتأكد من ذوبان كل الاغاروز. إذا لم يذوب الاغاروز تماما ، كرر الميكروويف بزيادات 30 ثانية.
بعد تثبيت الغطاء بإحكام على القارورة ، قم بتبريده إلى 50 درجة مئوية عن طريق الدوران تحت الماء البارد الجاري.
أضف 1 ميكرولتر من بروميد الإيثيديوم (EtBr) إلى خليط الاغاروز باستخدام ميكروبيبت مخصص ل EtBr. EtBr هي صبغة تربط الأحماض النووية مزدوجة الشريطة واللون البرتقالي الفلوري عند إضاءتها بالأشعة فوق البنفسجية. لاحظ أن EtBr يحتمل أن يكون مسببا للسرطان ، لذلك يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية (نظارات واقية ، معطف مختبر ، قفازات مقاومة ل EtBr).
صب الجل المنصهر في صينية صب هلام الرحلان الكهربائي. تأكد من عدم وجود فقاعات محاصرة داخل الاغاروز. ضع مشطا في الجل وقم بتثبيته بإحكام. انتظر حوالي 20-30 دقيقة حتى يتجمد الجل.
بمجرد أن يصلب الجل ، قم بإزالة المشط بعناية دون التسبب في أي تمزق في الجل. يخلق المشط آبارا في الجل لتحميل العينات.

5. الرحلان الكهربائي للهلام

ضع جل الاغاروز المتصلب في غرفة الرحلان الكهربائي.
أضف المخزن المؤقت المناسب للتشغيل في الغرفة حتى يتم غمر الجل بالكاد.
على قطعة من Parafilm ، بقع ماصة لتركيز صبغة التحميل. قم أيضا بتضمين سلم الحمض النووي بنطاق مناسب للأحجام المتوقعة لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بدلا من ذلك ، استخدم مجموعة جديدة من أنابيب الطرد الدقيق ، واحدة لكل عينة.
بمجرد اكتمال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، استرجع هذا الشريط المكون من 8 أنابيب من التدوير الحراري ، وجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع أي مكثفات. أضف حجما مناسبا من منتج الحمض النووي إلى صبغة التحميل والماصة لأعلى ولأسفل للخلط. على سبيل المثال ، يتم خلط 2 ميكرولتر من صبغة التحميل 10x مع 8 ميكرولتر من العينة لإعطاء حجم نهائي يبلغ 10 ميكرولتر ، مع الصبغة عند 1x.
ماصة كل خليط من عينات الصبغة في الآبار المخصصة في هلام الاغاروز ، مع الحرص على عدم ثقب الآبار.
قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بغرفة الرحلان الكهربائي. الحمض النووي سالب الشحنة ، لذلك "يركض" نحو القطب الموجب. لذلك ، قم بتوصيل القطب الموجب بالجانب الآخر من الغرفة ، حيث تم تحميل الآبار. اضبط مصدر الطاقة على جهد مناسب لنظام المخزن المؤقت وحجم حجرة الهلام ، واضبطه على التشغيل. يجب أن تكون الفقاعات الصغيرة مرئية تتحرك على جوانب الغرفة إذا كان الرحلان الكهربائي يسير بشكل صحيح.
بمجرد أن تتقدم واجهة الصبغة بدرجة كافية أسفل الجل ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة. انقل الجل بعناية إلى جهاز الإضاءة، أو التصوير المرئي، وقم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتصور نطاقات الحمض النووي على الجل.
قم بتحليل حجم السوار ومواضعه على الجل. قارن مواضع نطاق العينات بالتحكم الإيجابي لتحديد ما إذا كان الحمض النووي من الكائن الحي المعني موجودا في العينة (الشكل 1).

<جدول cellpadding = "0" cellpacing = "0" > مكون الحجم لكل أنبوب (ميكرولتر) حجم 5 أنابيب (ميكرولتر) التركيز النهائي 10x عازلة Ex Taq 5.0 25 1x 2.5 ملي مولار dNTPs 4.0 20 0.2 ملي التمهيدي الأمامي * 2.0 10 400 نانومتر التمهيدي العكسي* 2.0 10 400 نانومتر الجزيئي H₂O 31.75 دولار 158.75 - اكس طاق 0.25 1.25 2.5 وحدة خليط PCR 45 225 الجدول 1. أحجام الكاشف لمزيج PCR الرئيسي. * تختلف أحجام التمهيدي حسب مقايسة الكائن الحي. اضبط حجم الماء من الدرجة الجزيئية لجعل الحجم النهائي 45 ميكرولتر ، ويجب ألا تختلف أحجام المكونات الأخرى.

النسبة الموصى بها من الاغاروز الدقة المثلى لشظايا الحمض النووي الخطي (أزواج القواعد) 0.5 1,000-30,000 0.7 800-12,000 1.0 500-10,000 1.2 400-7,000 1.5 200-3,000 2.0 50-2,00 الجدول 2. يتراوح حجم جزء الحمض النووي على النحو الأمثل من خلال نسب مختلفة من هلام الاغاروز.

تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل ، هو تقنية بيولوجية أساسية يتم تطبيقها على نطاق واسع لاكتشاف وتحديد الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في التربة والمياه والعينات البيئية الأخرى.

بشكل كلاسيكي ، يتم استزراع الكائنات الحية الدقيقة في المختبرات باستخدام وسائط نمو متخصصة. ومع ذلك ، فإن العديد من الميكروبات في البيئة الطبيعية "غير قابلة للزراعة" - إما لأن نشاطها الأيضي المنخفض جدا أو معدل النمو ، أو لأن لديها متطلبات نمو صارمة للغاية قد لا تكون قابلة للتكرار في طبق الاستزراع. تعني الاختلافات في قابلية الزراعة بين الميكروبات أيضا أنه عندما يتم استزراع الكائنات الحية الدقيقة من عينة بيئية ، فإن وفرة نسبية في الثقافة قد لا تعكس مستوياتها الفعلية في البيئة.

إن ظهور تفاعل البوليميراز المتسلسل ، الذي يمكن أن يؤدي على وجه التحديد إلى تضخيم كميات صغيرة من الحمض النووي الموجودة في عينة مختلطة ، يجعل من الممكن اكتشاف وتحديد ميكروبات معينة ذات أهمية بسرعة ، حتى تلك غير القابلة للزراعة ، ضمن مجموعة معقدة من الكائنات الحية الموجودة في عينة بيئية.

سيقدم هذا الفيديو مبادئ تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). سيناقش بعد ذلك بروتوكولا عاما لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على الحمض النووي المعزول من عينة بيئية من أجل الكشف عن وجود كائن حي مهم. أخيرا ، سيتم استكشاف العديد من تطبيقات تحديد الميكروبات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

تتمثل الفرضية الأساسية ل PCR في استخدام دورات متكررة من التغيرات المتسلسلة في درجات الحرارة لتحقيق تضخيم أسي للحمض النووي ، عادة باستخدام آلة تعرف باسم thermocycler للتنقل تلقائيا عبر درجات الحرارة المختلفة. يتم تخليق الحمض النووي بواسطة إنزيمات بوليميراز الحمض النووي التي يتم الحصول عليها من البكتيريا التي تعيش في الينابيع الساخنة ، مثل Thermus aquaticus أو "Taq". هذه البوليميرات مستقرة للحرارة ، مما يسمح لها بتحمل درجات الحرارة المرتفعة المستخدمة أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

يتم تضخيم التسلسل المستهدف ، المعروف باسم amplicon ، من قالب الحمض النووي باستخدام امتدادين قصيرين من النيوكليوتيدات المعروفة باسم "الاشعال". نظرا للخصوصية العالية لربط الحمض النووي التكميلي ، تسمح الاشعال بالتضخيم المستهدف لتسلسلات محددة للغاية ذات أهمية. من خلال تصميم بادئات من شأنها تضخيم تسلسل فريد فقط ، أو مجموعة فريدة من التسلسلات ، من كائن حي محل اهتمام ، يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل للكشف التفاضلي عن وجود الحمض النووي لهذا الكائن الحي بين جميع المواد الوراثية الموجودة في عينة بيئية معقدة.

تنقسم كل دورة PCR إلى ثلاث مراحل. الأول ، المعروف باسم "التمسخ" ، عادة ما يتم ضبطه فوق 92 درجة مئوية ويستمر حوالي 30 ثانية. يستخدم التمسخ لتقسيم جزيئات الحمض النووي إلى خيوط مفردة ، للسماح باستمرار تفاعل التضخيم.

المرحلة الثانية ، "التلدين" ، يتم ضبطها من 2 إلى 3 درجات مئوية تحت درجة حرارة انصهار البادئات ، عادة ما بين 50 إلى 65 درجة مئوية ، وتستمر أيضا حوالي 30 ثانية. درجة حرارة الانصهار هي درجة الحرارة التي تنفصل عندها 50٪ من جزيئات الحمض النووي مزدوجة الشريطة إلى خيوط مفردة ، وبالتالي تسمح خطوة التلدين للبادئات بالارتباط بمواقعها المستهدفة في قالب الحمض النووي.

المرحلة الثالثة من دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل هي "الاستطالة" أو "الامتداد" ، عندما يرتبط بوليميراز الحمض النووي بقالب التمهيدي على الوجهين ويحفز تخليق الخيوط الجديدة. عند ضبط 72 درجة مئوية لبوليميراز تفاعل البوليميراز المتسلسل الأكثر استخداما ، Taq ، تعتمد مدة هذه المرحلة على طول الأمبليكون ، وعادة ما يكون 30 ثانية لكل 500 زوج أساسي. بعد كل دورة ، يتم تغيير طبيعة الحمض النووي المضخم مرة أخرى ويعمل كقالب جديد ، مما يؤدي إلى زيادة هائلة في كمية منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

بمجرد اكتمال التفاعل ، يمكن حل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل حسب الحجم على "هلام" مصنوع عادة من بوليمر الاغاروز ، وهي عملية تعرف باسم الرحلان الكهربائي. يتم تطبيق مجال كهربائي عبر الهلام ، وتتسبب الشحنات السالبة في العمود الفقري لجزيئات الحمض النووي في هجرتها نحو الطرف الإيجابي للمجال. بشكل عام ، ستستغرق جزيئات الحمض النووي الخطية الأكبر حجما وقتا أطول للانتقال عبر مصفوفة الهلام.

الآن بعد أن فهمت كيفية عمل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، دعنا نلقي نظرة على كيفية استخدام التفاعل لتحديد الكائنات الحية الدقيقة في عينة بيئية.

للبدء، احسب حجم كل كاشف مطلوب بناء على عدد العينات المراد معالجتها، بالإضافة إلى 10٪ إضافية لحساب أخطاء سحب العينات. يجب تضمين نموذج التحكم الإيجابي - الذي يحتوي على المنطقة المستهدفة - للتأكد من أن التفاعل يعمل. بالإضافة إلى التحكم السلبي حيث لا يتم تضمين قالب الحمض النووي ، من أجل استبعاد التلوث في أي من مكونات التفاعل. احتفظ بإنزيم بوليميراز Taq على الجليد ، وقم بإذابة بقية الكواشف وعينات الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة عند غطاء تدفق رقائقي مخصص لمنع التلوث.

بمجرد ذوبان جميع الكواشف ، قم بتكوين "المزيج الرئيسي" للكاشف عن طريق إضافة الحجم المحسوب لكل كاشف إلى أنبوب ميكرو منخفض الارتباط ، مما يقلل من التناقضات في كميات الكاشف بسبب امتصاص الجزيئات على سطح الأنبوب. قم بتدوير كل كاشف برفق وجهاز طرد مركزي قبل الإضافة. بمجرد تحضير المزيج الرئيسي ، قم بخلط الدوامة وتجميعها عن طريق الطرد المركزي.

قم بتسمية شريط PCR مكون من 8 أنابيب لتعيين أنبوب واحد لكل عينة ، بما في ذلك عناصر التحكم. قم بتوزيع الكمية المناسبة من مزيج PCR الرئيسي في كل أنبوب من الشريط. ثم أضف كل عينة من الحمض النووي إلى الأنبوب المعني.

ضع غطاء الشريط بإحكام على أنبوب الشريط ، وجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي صغير باستخدام محول شريطي. بعد ذلك ، ضع الأنبوب في المدورة الحرارية ، وقم بتشغيل التفاعل وفقا لبرنامج PCR المناسب.

أثناء تشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، قم بإعداد جل الاغاروز للرحلان الكهربائي لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بوزن كمية مناسبة من مسحوق الاغاروز للحصول على هلام بتركيز يمكنه حل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بناء على أحجامها المتوقعة. أضف الاغاروز إلى قارورة سعة 125 مل ، ثم أضف الحجم المناسب من المخزن المؤقت لتشغيل الهلام في القارورة ، بناء على حجم الجل المصبوب ، وقم بتحريكه للخلط. قم بتسخين محلول الاغاروز في الميكروويف بقوة عالية لمدة 1 دقيقة. عند الانتهاء ، تحقق من ذوبان الاغاروز تماما عن طريق تدوير القارورة ، وكرر الميكروويف بزيادات 30 ثانية إذا لزم الأمر.

قم بتثبيت الغطاء بإحكام على القارورة ، وقم بتبريد محلول الاغاروز إلى 50 درجة مئوية عن طريق تحريك القارورة تحت الماء البارد الجاري. بمجرد أن يبرد ، أضف 1 ميكرولتر من بروميد الإيثيديوم إلى الاغاروز. نظرا لأن بروميد الإيثيديوم من المحتمل أن يكون مسببا للسرطان ، فتأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية مثل النظارات الواقية ومعطف المختبر والقفازات المقاومة لبروميد الإيثيديوم.

صب محلول الاغاروز في صينية صب هلام الرحلان الكهربائي ، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء محاصرة داخل الاغاروز. ضع مشطا به العدد المطلوب من الآبار في المحلول. اترك الجل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 إلى 30 دقيقة حتى يتصلب. بمجرد ضبط الجل ، قم بإزالة المشط بعناية ، وتأكد من عدم تمزيق الجل في هذه العملية.

ضع الجل المتصلب في حجرة الرحلان الكهربائي. أضف المخزن المؤقت LB إلى الغرفة حتى يتم غمر الجل للتو. على قطعة من Parafilm ، قم بوضع "بقعة" من سلم الحمض النووي بنطاق مناسب للحجم المتوقع لمنتجات PCR. استرجع أنابيب PCR مع التفاعلات المكتملة من الدراجة الحرارية. اجمع المكثفات في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الطرد المركزي القصير ، وأضف 8 ميكرولتر من كل عينة إلى البارافيلم أضف 2 ميكرولتر من صبغة التحميل 10x في كل بقعة من منتج PCR ، بحيث يكون التركيز النهائي للصبغة 2x.

قم بتحميل العينات والسلم في الآبار المخصصة في هلام الاغاروز ، مع الحرص على عدم وخز الجل. بمجرد اكتمال التحميل ، ضع الغطاء على غرفة الرحلان الكهربائي ، وقم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمصدر الطاقة. نظرا لأن الحمض النووي سالب الشحنة وينتقل نحو القطب الموجب ، تأكد من أن الآبار على الجانب الأقرب إلى القطب السالب. قم بتشغيل مصدر الطاقة ، واضبطه على جهد مناسب لحجم غرفة الرحلان الكهربائي ونظام المخزن المؤقت المستخدم. اضبط الرحلان الكهربائي على "تشغيل". ستلاحظ فقاعات صغيرة تتحرك على جانبي الغرفة إذا كان الرحلان الكهربائي يسير بشكل صحيح.

بمجرد أن تتقدم واجهة الصبغة بدرجة كافية أسفل الجل ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة. انقل الجل بعناية إلى جهاز تصوير الهلام لتصور المنتجات الكهربائية. باستخدام درع واقي ، قم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية وتصور عصابات الحمض النووي على الجل. قم بتحليل موضع النطاقات لمعرفة ما إذا كان يتطابق مع النمط المتوقع الذي يشير إلى وجود الأنواع ذات الأهمية في العينة البيئية.

الآن بعد أن رأيت كيفية إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، دعنا نلقي نظرة على طرق مختلفة يتم تطبيقها للكشف عن الكائنات الحية الدقيقة ذات الأهمية في البيئة.

يتمثل أحد استخدامات الكشف عن الميكروبات البيئية القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل في تحديد الكائنات الحية المسببة للأمراض مثل "الأميبا الآكلة للدماغ" Naegleria fowleri ، وهو كائن حي وحيد الخلية يوجد في المسطحات المائية العذبة والبرك غير المكلورة التي يمكن أن تهاجم الجهاز العصبي البشري ، وغالبا ما تكون قاتلة. يمكن اختبار وجود هذا الميكروب القاتل إما في عينات المياه أو السائل النخاعي للمرضى المشتبه بهم عن طريق إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات تستهدف تسلسل الحمض النووي الفريد في جينوم الأميبا.

تطبيق آخر لتحديد الميكروبات القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل هو اختبار وجود البكتيريا المسببة للأمراض في الذباب الذي يتم اصطياده بالقرب من المؤسسات الغذائية ، كجزء من مراقبة الصحة العامة وتحقيقات تفشي الأمراض.

هنا ، بحث الباحثون عن وجود بكتيريا مسببة للأمراض مثل السالمونيلا والليستيريا ، عن طريق عزل البكتيريا أولا عن سطح الجسم والقناة الهضمية للذباب ، ثم استخدام ظروف الاستزراع الخاصة بالأنواع لإثراء هذه الأنواع ذات الأهمية. بعد استخراج الحمض النووي من أي بكتيريا تم استزراعها ، تم استخدام مجموعات PCR للكشف عن الأنواع المتاحة تجاريا لاختبار هويتها.

أخيرا ، يمكن تحديد سلالات مختلفة من البكتيريا المسببة للأمراض المقاومة للمضادات الحيوية مثل المكورات العنقودية الذهبية ، والتي تمثل مخاوف كبيرة تتعلق بالصحة العامة ، وتمييزها باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

في هذا المثال ، قام الباحثون بعزل واستزراع المكورات العنقودية الذهبية من العينات السريرية ، ثم استخرجوا الحمض النووي من المستعمرات البكتيرية وأجروا تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). كانت تفاعلات التضخيم هنا "متعددة الإرسال" ، مما يعني أنه تم دمج مجموعات أولية متعددة تستهدف مناطق فريدة مختلفة من الجينوم البكتيري في نفس التفاعل. تم تصميم مجموعات التمهيدي الفردية بحيث تنتج منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن الحمض النووي لبعض السلالات فقط وليس غيرها ، بحيث تمت ملاحظة أنماط نطاق المنتج الفريدة لكل سلالة.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول الكشف عن الكائنات الحية الدقيقة المستندة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لقد نظرنا في المبادئ الكامنة وراء تفاعل البوليميراز المتسلسل. بروتوكول لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على الحمض النووي المستخرج من الكائنات الحية الدقيقة البيئية. وأخيرا ، العديد من التطبيقات المحددة لهذه التقنية لاختبار الكائنات الحية ذات الأهمية في أنواع مختلفة من العينات البيئية أو السريرية. شكرا للمشاهدة!