تحليل فسلجي المتداول كريات بيضاء E - Selectin بوساطة بطانة الاوعية الدموية الدقيقة في

يوضح هذا الفيديو تحليل غرفة تدفق الصفائح المتوازية لفحص العوامل التي تحفز تدحرج الكريات البيضاء على أسطح الخلايا البطانية. يتم تحفيز الطبقات الأحادية من الخلايا البطانية باستخدام السيتوكين المسبب للالتهاب IL-1β لزيادة تعبير S selectin. ثم توضع غرفة تدفق الصفائح المتوازية فوق الخلايا البطانية، ويتم ضخ الكريات البيضاء الموجبة لـ S selectin فوق الطبقة الأحادية.

وبذلك تكتسب التفاعلات الخلوية في الحجرة إجهاد قص مشابه لذلك الذي يحدث أثناء التصاق الكريات البيضاء في مرحلة ما بعد الشعيرات الدموية. يتم التقاط عمليات التدحرج وتعدادها باستخدام عناصر NIS واختبار استقلالية E select. مرحباً، أنا جورج ويس من مختبر الدكتور تشارلز دي نيترو في قسم الأمراض الجلدية بمستشفى بريغهام للنساء، كلية الطب بجامعة هارفارد.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتحليل دور e selectin ورابطات E selectin في التصاق الكريات البيضاء البشرية بالخلايا البطانية لنخاع العظم البشري تحت ظروف تدفق الدم الفسيولوجية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة دور جزيئات سطح الخلية التي تحفز التصاق خلايا الدم البيضاء أو الخلايا السرطانية النقيلية بالخلايا البطانية التي تبطن السطح الداخلي للأوعية الدموية. وتتميز عملية الالتصاق هذه بسلوك تدحرجي يشبه تدحرج كرة البولينج في الممر.

لنبدأ الآن. تتمثل الخطوة الأولى في هذا الإجراء في تحضير الخلايا البطانية التي ستغطي غرفة التدفق. يستخدم هذا البروتوكول خلايا H-B-M-E-C 60 المشتقة من نخاع العظم البشري.

يجب أن تكون أطباق استزراع الأوعية الدموية الدقيقة مطلية مسبقاً بالفبرونيكتين؛ ولتحضيرها، يتم تحضين أطباق زراعة الأنسجة سعة 35 مل بـ PBS يحتوي على 20 µg/ml من الفبرونيكتين. ويمكن تحضينها طوال الليل عند 4 °C أو لمدة ثلاث ساعات عند 37 °C. يتم تعليق خلايا H-B-M-E-C 60 في الوسط 1 99 وزرعها بكثافة 10⁵ خلية لكل طبق، وتُنمى المزارع حتى تتجاوز نسبة الالتحام 90%.

سيستغرق الأمر نحو يومين لزيادة تنظيم e select والتعبير عنه؛ قم بشفط وسط النمو وإضافة وسط جديد يحتوي على 50 nanograms per mil من IL one beta، ثم حضن الخلايا لمدة تتراوح بين أربع إلى ست ساعات. وتصبح الآن الطبقات الخلوية الأحادية جاهزة لاختبار غرفة التدفق. يمكن تحفيز أطباق إضافية من خلايا H-B-M-E-C 60 باستخدام IL one beta ومعالجتها بجسم مضاد محيّد لـ e selectin البشري بتركيز 20 micrograms per mil لمدة ساعة واحدة عند 37 degrees Celsius.

سيعمل هذا كضابط للتعبير الوظيفي لـ e selectin. بعد ذلك، قم بتحضير الكريات البيضاء الموجبة لـ e selectin. هذه عبارة عن KG one، وهي خلايا سلف دمويّة بشرية.

تُنمى هذه الخلايا بنظام التعليق حتى تصل إلى مرحلة التلاقي أو بتركيز 10⁶ خلية/مل في وسط RPMI 1640. ويمكن سحب خلايا KG-1A مباشرة من المزرعة وعدّها باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). ثم يُعاد تعليق الخلايا بتركيز 10⁶ خلية/مل في محلول HBSS يحتوي على 10 millimolar HEPES أو محلول منظم HH يحتوي على 2 millimolar كلوريد الكالسيوم.

تُحفظ الخلايا على الثلج حتى يحين وقت المقايسة. تتضمن الخطوات التالية تحضير المجهر، وغرفة التدفق ذات الصفائح المتوازية، ومضخة الحقنة. ولإجراء المقايسة، قم بتشغيل المجهر ومضخة الحقنة.

اختر العدسة الشيئية بقوة تكبير 10x في المجهر. ضع أنبوباً مخروطياً سعة 50 milliliter في الحامل واملأه بمحلول HH buffer يحتوي على 2 millimolar من كلوريد الكالسيوم. ثم ضع أنابيب اختبار بلاستيكية سعة 5 milliliter في الحامل بالأسفل.

بعد ذلك، ضع سرنجة سعة 60 milliliter في مضخة السرنجة. تأكد من تثبيت كل من المكبس وجسم السرنجة بإحكام. قم بتوصيل صنبور إيقاف ثلاثي الاتجاهات بنهاية السرنجة سعة 60 mil، ثم وصل سرنجة سعة 5 mil بالصنبور ثلاثي الاتجاهات.

ضع جهاز غرفة التدفق المتوازي على منصة المجهر بحيث يكون أنبوب الإدخال على اليمين، وأنبوب الإخراج على اليسار، وأنبوب التفريغ في الخلف. بعد توصيل الأنابيب بجهاز التفريغ، افتح صمام الهواء للسماح لجهاز الصفائح المتوازية بالالتصاق بالمنصة. سيؤدي ذلك إلى اختبار ما إذا كانت حافة التفريغ في غرفة التدفق محكمة الإغلاق.

عند التأكد من إحكام السد، أغلق صمام الهواء. الآن، قم بتوصيل خط أنبوب المخرجات بصنبور الإيقاف ثلاثي الاتجاهات المتصل مسبقاً بالحقنة. الجهاز الآن جاهز للوضعه فوق خلايا H-B-M-E-C 60.

قم بتشغيل المكنسة الكهربائية، ثم أنزل جهاز غرفة التدفق برفق فوق الطبق واترك الجهاز يقوم بعملية الشفط. يجب ألا تكون هناك أي أصوات لتسرب الهواء، وفي هذه المرحلة قد تحتاج إلى الضغط على الغرفة لضغط الحاشية المطاطية. وبمجرد إنشاء الفراغ، ضع أنبوب الإدخال في الأنبوب المخروطي سعة 50 milliliter.

افتح صمام الإيقاف ثلاثي الاتجاهات المتصل بالسرنجة سعة 60 mil واضبط المضخة على وضع الضخ (pump mode) لإزالة الهواء من الأنابيب دون رفع الخلايا الموجودة على الطبق. استخدم مضخة السرنجة المضبوطة على معدل ملي لترين في الدقيقة لملء أنبوب السحب، ثم اضبط السرعة بسرعة على 0.5 ملي لتر في الدقيقة.

قبل وصول السائل إلى الجهاز مباشرةً، من الضروري تحضير التجهيزات بعناية وتجنب الفقاعات الهوائية، التي قد تؤدي إلى رفع الطبقة الأحادية عن الشريحة. وبمجرد تدفق السائل إلى المحقنة سعة 60 mil، يكون قد تم تحضير غرفة التدفق ومضخة المحقنة. الآن، قم بتثبيت غرفة التدفق على المنصة باستخدام قطعة من الشريط اللاصق فوق كل من خطوط الإدخال والإخراج والتفريغ.

يضمن ذلك بقاء مجال الرؤية ثابتاً عند تصور البيانات وجمعها. غرفة التدفق الآن جاهزة للاستخدام. يجب تكرار هذه الخطوات لكل عملية إدخال للخلايا ولكل لوحة جديدة.

لالتقاط أحداث تدحرج موقع Lucas، افتح برنامج NIS elements على سطح المكتب، ثم اضغط على أيقونة التشغيل لعرض صورة مباشرة. سيتيح لك التعريض الضوئي التلقائي رؤية الطبق وتركيز الصورة. تأكد من تركيز المجهر بشكل صحيح على الطبقة الخلوية الأحادية عن طريق ضبط التركيز يدوياً في المجهر.

بمجرد ضبط تركيز الصورة، أعد ضبط التعريض الضوئي ليكون إطاراً واحداً في الثانية واضبط الإضاءة في المجهر. يجب أن تظهر الصورة على جهاز الكمبيوتر وألا تكون مرئية في المجهر. يمكن بعد ذلك ضبط المدرج التكراري للضوء؛ ولإزالة التعريض الضوئي للخلفية أو لتحسين وضوح الخلايا، انقر فوق "two by two bin" أو "live bin" للحصول على صورة مثالية لتسجيل الفيديو.

انقر على "macro" في شريط القوائم واختر "right to port"، ثم اختر المنفذ "com three" واضغط على "open". سيؤدي ذلك إلى فتح المنفذ للتنسيق مع مضخة السرنجة. غرفة التدفق الآن جاهزة لضخ خلايا KG-1A؛ قم بسحب 1 mL من معلق خلايا KG-1A باستخدام الماصة وضعها في أنبوب اختبار سعة 5 mL بالقرب من خط أنبوب الإدخال.

بعد ذلك، ضع خط الإدخال في قاع أنبوب الاختبار. انتقل إلى شريط القائمة وانقر على التقاط واكتساب المفاصل الزمنية (time lapse acquisition). اختر البروتوكول الذي تستغرق مدته 210 seconds.

هذا هو طول البرنامج المخصص لعملية التدحرج على خلايا H-B-M-E-C 60. تم برمجة كل مرحلة لالتقاط صورة كل ثانية طوال مدة بروتوكول المضخة. كما تم إعداده لإرسال أمر عبر منفذ comm three لبدء تشغيل المضخة.

اضبط مضخة السرنجة على وضع البرمجة، والذي يسمح بالبرمجة اليدوية لمعدلات تدفق محددة. سيحدد ذلك مستويات إجهاد القص داخل الغرفة ويتحكم في تفاعلات خلايا KG one A مع خلايا H-B-M-E-C 60. إعدادات هذه التفاعلات هي 4.2 dines per centimeter squared لمدة 45 seconds.

ثلاث نقاط داين لكل سنتيمتر مربع لمدة 60 ثانية، وتزداد الخطوات كل 15 ثانية لتصل إلى حد أقصى قدره 4.2 داين لكل سنتيمتر مربع. المجهر والكمبيوتر الآن جاهزان لالتقاط صور الفاصل الزمني. اضغط على بدء التشغيل (start run) في الكمبيوتر لبدء الحصول على البيانات أثناء تشغيل البرنامج.

تأكد من إضافة الوسط الغذائي إلى الأنبوب الذي يحتوي على خلايا KG one A للحفاظ على امتلاء أنابيب الإدخال والإخراج بالوسط ومنع دخول فقاعات الهواء إلى النظام. في حال انقطاع التصوير الزمني (time lapse)، لن تتوقف المضخة تلقائياً ويجب إعادة ضبطها. اضغط على "إلغاء" للعودة إلى الصورة المباشرة.

تُستخدم طبقة أحادية من الخلايا البطانية غير المحفزة كعنصر تحكم سلبي في هذه التجربة. ولتحقيق ذلك، يتم ضخ كريات دم بيضاء من نوع KG one A في غرفة التدفق فوق خلايا H-B-M-E-C 60 غير المعالجة للتحقق من استقلالية e selectin، ثم يتم تحفيز الطبقة الأحادية للخلايا البطانية باستخدام IL one beta وضخ الكريات البيضاء فوق هذه الخلايا لمزيد من التحقق من استقلالية eect. تُعالج خلايا H-B-M-E-C 60 باستخدام IL one beta ثم باستخدام الجسم المضاد لـ S selectin البشري.

ثم قم بتحليل أحداث تدحرج الكريات البيضاء على هذه الخلايا. لا يتحدد تدحرج الخلايا بواسطة S selectin فحسب، بل وأيضاً بواسطة بقايا حمض السياليك الموجودة على سطح خلية الكريات البيضاء. ولإثبات ذلك، قم بهضم خلايا KG one A باستخدام 0.1 units per mil من neuraminidase لمدة ساعة واحدة عند 37 °C.

ثم قم بتحليل أحداث التدحرج فوق خلايا H-B-M-E-C 60 المحفزة. وتعد البروتينات السكرية الموجودة على سطح الكريات البيضاء مهمة أيضاً لتدحرج الخلايا. ويمكن إثبات ذلك عن طريق معالجة خلايا KG one A بـ 0.2 units per mil من broma lane لمدة ساعة واحدة عند 37 °C، ثم حقنها في غرفة التدفق.

بعد الحصول على التسلسل الزمني، تصبح البيانات جاهزة للتحليل. احفظ البيانات، ثم انتقل إلى علامة تبويب القياس (measure) في شريط القائمة واختر العتبة المحددة (defined threshold). حرك الأشرطة بحيث تظهر الخلايا المطلوبة باللون الأحمر، ثم حدد جميع الصور واضغط موافق؛ ومن المفترض الآن أن يتم تعديل تسلسل التصوير المتقطع الزمني بالكامل بحيث تظهر الخلايا المتدحرجة باللون الأحمر الواضح.

انتقل إلى القياس (measure) واختر القيود (restrictions). يتيح ذلك للمستخدم استبعاد الكائنات التي تتجاوز العتبة والتي لا تمثل الخلايا المتدحرجة. وتتمثل هذه الكائنات بشكل أساسي في الخلفية الناتجة عن طبقة H-B-M-E-C 60 أحادية الخلايا، ثم حدد المنطقة وأدخل القيم الدنيا والقصوى، والتي تعد مثالية لكرات الدم البيضاء المتدحرجة.

كرر هذه الخطوة لعمليتي الاستطالة والدائرية؛ اختر measure ثم اختر create binary using restrictions. ستُستخدم قيم التقييد نفسها، التي تم تعيينها في الخطوة السابقة، لتحسين برنامج NIS elements للتعرف على الكريات البيضاء المتدحرجة على الطبقة أحادية الخلايا المبطنة.

أغلق القائمة، ثم عُد إلى القياس واختيار حقل المسح، وافتح بيانات حقل القياس، واختر عدد الأجسام. بعد ذلك، حدد جميع الحقول وصَدّر البيانات إلى Microsoft Excel. وأخيراً، اختر مسح البيانات.

أصبحت عناصر NIS الآن جاهزة لجمع المزيد من البيانات. وتوضح هذه البيانات التمثيلية كيفية استجابة التفاعلات بين الكريات البيضاء والخلايا المبطنة للأوعية الدموية لإجهاد القص الفسيولوجي، وتحديداً من خلال اختبار دور الربيطة اللاصقة E selectin.

يحدث تدحرج قوي للكريات البيضاء عندما يتم تحفيز الخلايا البطانية مسبقاً بواسطة IL one beta. وعند مقارنة هذه النتيجة بالمجموعة الضابطة غير المحفزة، يتضح أن تدحرج الخلايا يعتمد على التحفيز بالسيتوكين. ومن خلال معالجة خلايا H-B-M-E-C 60 بواسطة IL one beta ثم باستخدام جسم مضاد لـ E selectin البشري، يصبح من الواضح أن تدحرج الخلايا يعتمد تحديداً على e selectin.

يمكن استخدام هذا المقايسة لاختبار معايير أخرى أيضًا. على سبيل المثال، عندما يتمت معالجة الخلايا المحفزة مسبقًا بـ sase أو brolin، تكون النتائج أقل قوة. وتسلط هذه البيانات الضوء على أهمية بقايا حمض السياليك الطرفية بالإضافة إلى البروتينات السكرية على سطح الخلية.

بالنسبة لنشاط ربيطة السيلكتين S، لقد أظهرنا لكم للتو كيفية تحليل التفاعلات الالتصاقية القائمة على السيلكتين e بين الكريات البيضاء والخلايا البطانية تحت ظروف تحاكي القوى الموجودة في الوريد ما بعد الشعيري، وهي منطقة في الجهاز الدوري حيث تترك الكريات البيضاء الدم وتدخل إلى الأنسجة. عند إجراء هذا البروتوكول، من المهم تذكر استخدام الجسم المضاد الحاجب المناسب أو تحكم المعالجة الإنزيمية للتحقق من ضرورة السيلكتين المعني وربيطته في نظام المقايسة هذا. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.