تحليل فسلجي المتداول كريات بيضاء E - Selectin بوساطة بطانة الاوعية الدموية الدقيقة في

يوضح هذا الفيديو تحليل غرفة تدفق اللوحة المتوازية لفحص العوامل التي تحفز تدحرج الكريات البيض على أسطح الخلايا البطانية. يتم تحفيز الطبقات الأحادية للخلايا البطانية باستخدام السيتوكين المؤيد للالتهابات IL بيتا واحد لتنظيم تعبير S selectin. ثم يتم وضع غرفة تدفق اللوحة المتوازية فوق الخلايا البطانية ويتم غرس الكريات البيض الإيجابية S selectin فوق الطبقة الأحادية.

وبالتالي يتم نقل التفاعلات الخلوية في الغرفة بضغط محض مشابه لتلك الموجودة في التصاق الكريات البيض بعد الشعيرات الدموية. يتم التقاط الأحداث المتجددة وتعدادها باستخدام عناصر NIS ومقايسة استقلالية تحديد E. مرحبا ، أنا جورج فايس في مختبر الدكتور تشارلز دي نيترو في قسم الأمراض الجلدية في مستشفى بريجمان للنساء ، كلية الطب بجامعة هارفارد.

سنعرض لك اليوم إجراء لتحليل دور روابط e selectin ، E selectin في التصاق الكريات البيض البشرية بالخلايا البطانية لنخاع العظم البشري في ظل ظروف تدفق الدم الفسيولوجية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة دور جزيئات سطح الخلية التي تبدأ في التصاق خلايا الدم البيضاء أو الخلايا السرطانية النقيلية بالخلايا البطانية ، التي تبطن السطح الداخلي للأوعية الدموية. يتميز هذا الحدث اللاصق بسلوك متدحرج مثل كرة البولينج التي تتدحرج في حارة.

لذلك دعونا نبدأ. تتمثل الخطوة الأولى في هذا الإجراء في تحضير الخلايا البطانية التي ستبطن غرفة التدفق. يستخدم هذا البروتوكول 60 خلية H-B-M-E-C المشتقة من نخاع العظام البشرية.

يجب أن تكون أطباق زراعة الأوعية الدموية الدقيقة مغطاة مسبقا بالفبرونيكتين لتحضير أطباق زراعة الأنسجة سعة 35 ملليلتر مع PBS التي تحتوي على 20 ميكروغراما لكل مل من الفيبرونيكتين. يمكن احتضانها بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية أو لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية. قم بتعليق خلايا H-B-M-E-C 60 في المتوسط 1 99 والبذور عند 10 إلى الخلايا الخامسة لكل طبق ، وقم بتنمية الثقافات إلى أكثر من 90٪ من التقاء.

سيستغرق هذا حوالي يومين لتنظيم e تحديد وسيط النمو والتعبير عنه, وإضافة وسط جديد مع 50 نانوغرام لكل مل من IL, حاضنة بيتا واحدة لمدة أربع إلى ست ساعات. أصبحت الطبقات الأحادية للخلية جاهزة الآن لمقايسة غرفة التدفق. يمكن تحفيز الألواح الإضافية من خلايا H-B-M-E-C 60 باستخدام IL one beta ومعالجتها بجسم مضاد للإنسان بمعدل 20 ميكروغرام لكل مل لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

سيتحكم هذا في التعبير الوظيفي عن e selectin. بعد ذلك ، قم بإعداد e selectin الكريات البيض الإيجابية. هذه هي KG واحدة من الخلايا السلفية المكونة للدم البشرية.

تزرع هذه في معلق للتقاء أو تميل إلى الخلايا الست لكل مل في RPMI 1640. يمكن سحب خلايا KG one A مباشرة من المزرعة واعتمادها على مقياس الخلوي الدموي. يعلق Resus الخلايا عند 10 إلى ست خلايا لكل مل في HBSS مع 10 ملليمولار HEP أو محلول HH يحتوي على اثنين من كلوريد الكالسيوم المليمولي.

قم بتخزين الخلايا على الجليد حتى يتم فحصها. تتضمن الخطوات التالية تحضير المجهر وغرفة تدفق اللوحة المتوازية ومضخة المحقنة. للفحص قم بتشغيل المجهر ومضخة المحقنة.

حدد الهدف 10 x على المجهر. ضع أنبوبا مخروطيا سعة 50 ملليلتر في الحامل واملأه بمحلول HH بكلوريد الكالسيوم المليمولي. ثم ضع خمسة أنابيب اختبار بلاستيكية مليلتر في الحامل أدناه.

بعد ذلك ، ضع حقنة سعة 60 ملليلتر في مضخة المحقنة. تأكد من أن كل من المكبس وجسم المحقنة آمنان. نعلق الديك توقف ثلاثي الاتجاهات إلى نهاية حقنة 60 مل ثم حقنة خمسة مل إلى الديك التوقف ثلاثي الاتجاهات.

ضع جهاز غرفة التدفق المتوازي على مرحلة المجهر مع أنبوب الإدخال على أنبوب الإخراج الأيمن على اليسار والأنبوب المفرغ في الخلف. بعد توصيل الأنبوب بالمكنسة الكهربائية ، افتح صمام الهواء للسماح لجهاز اللوحة المتوازية بالالتصاق بالمرحلة. سيختبر هذا ما إذا كانت التنورة المفرغة على غرفة التدفق محكمة الإغلاق.

عند تأكيد الختم ، قم بإيقاف تشغيل صمام الهواء. الآن قم بتوصيل خط أنبوب الإخراج بقضيب التوقف ثلاثي الاتجاهات المتصل بالفعل بالمحقنة. الجهاز جاهز الآن لوضعه فوق خلايا H-B-M-E-C 60.

قم بتشغيل المكنسة الكهربائية ، وقم بخفض جهاز غرفة التدفق برفق على اللوحة واترك الجهاز يشفط لأسفل. يجب ألا تكون هناك أصوات هروب للهواء ، وفي هذه المرحلة قد تحتاج إلى الضغط على الغرفة لضغط الحشية المطاطية. بمجرد إنشاء الفراغ ، ضع أنبوب الإدخال في الأنبوب المخروطي سعة 50 ملليلترا.

افتح قضيب التوقف ثلاثي الاتجاهات إلى حقنة 60 مل وضع المضخة في وضع المضخة لإزالة الهواء من الخطوط دون رفع الخلايا على اللوحة. استخدم مضغوطة الحقنة التي تم ضبطها بسرعة ملتين في الدقيقة لملء أنبوب السحب. ثم اضبطها بسرعة على 0.5 مل في الدقيقة.

قبل وصول السائل إلى الجهاز مباشرة ، من الأهمية بمكان تجهيز الإعداد بعناية وتجنب فقاعات الهواء ، والتي سترفع الطبقة الأحادية من اللوحة. بمجرد أن ينتقل السائل إلى المحقنة سعة 60 مل ، يتم تحضير غرفة التدفق ومضخة المحقنة. الآن ، قم بتأمين التدفق في الغرفة إلى المسرح بقطعة من الشريط فوق كل خط من خطوط الإدخال والإخراج والتفريغ.

هذا يضمن أن يظل مجال الرؤية ثابتا عند تصور البيانات وجمعها. غرفة التدفق جاهزة الآن للاستخدام. يجب تكرار هذه الخطوات لكل تشغيل إدخال خلية ولكل لوحة جديدة.

لالتقاط أحداث تشغيل موقع Lucas ، افتح عناصر NIS على سطح المكتب ، واضغط على أيقونة التشغيل للحصول على صورة حية. سيسمح لك التعريض التلقائي برؤية اللوحة وتركيز الصورة. تأكد من تركيز المجهر بشكل صحيح على طبقة أحادية الخلية عن طريق ضبط التركيز يدويا على المجهر.

بمجرد أن تصبح الصورة في بؤرة التركيز ، أعد ضبط التعريض الضوئي إلى إطار واحد في الثانية واضبط الضوء على المجهر. يجب أن تظهر الصورة على الكمبيوتر ويجب ألا تكون مرئية في المجهر. يمكن بعد ذلك ضبط الرسم البياني للضوء لإزالة التعرض للخلفية أو لتحسين وضوح الخلية ، انقر فوق اثنين في اثنين أو سلة المهملات الحية للحصول على صورة مثالية لالتقاط الأفلام.

انقر فوق الماكرو في شريط القائمة وحدد اليمين للمنفذ ، وحدد المنفذ ، وحدد المنفذ ، وقم بفتحه. هذا يفتح المنفذ للتنسيق مع مضخة الحقنة. غرفة التدفق جاهزة الآن للغرس بماصة خلايا KG one A مل واحد من تعليق KG واحد A S في أنبوب الاختبار الذي يبلغ طوله خمسة مل بالقرب من خط أنابيب الإدخال.

ثم ضع خط الإدخال في أسفل أنبوب الاختبار. انتقل إلى شريط القائمة وانقر على الالتقاط والحصول على الفاصل الزمني. حدد البروتوكول الذي يستمر لمدة 210 ثانية.

هذا هو طول برنامج التدحرج على 60 خلية H-B-M-E-C. تمت برمجة كل مرحلة لالتقاط صورة كل ثانية طوال مدة بروتوكول المضخة. تم إعداده أيضا لإرسال أمر من خلال منفذ الاتصال الثالث لبدء تشغيل المضخة.

اضبط مضخة الحقنة على وضع البرنامج ، مما يسمح بالبرمجة اليدوية لمعدلات تدفق محددة. سيحدد هذا مستويات الإجهاد الهائلة داخل الغرفة ويملي تفاعلات خلية KG one A على خلايا H-B-M-E-C 60. إعدادات هذه التفاعلات هي 4.2 طعام لكل سنتيمتر مربع لمدة 45 ثانية.

تزداد النقطة الثلاث في السنتيمتر المربع لمدة 60 ثانية وتزيد الخطوات كل 15 ثانية إلى 4.2 طعام لكل سنتيمتر مربع كحد أقصى. المجهر والكمبيوتر جاهزان الآن لالتقاط التصوير الفوتوغرافي بفاصل زمني. اضغط على بدء التشغيل على الكمبيوتر لبدء الحصول على البيانات أثناء تشغيل البرنامج.

تأكد من إضافة وسائط إلى الأنبوب الذي يحتوي على خلايا KG one A من أجل الحفاظ على أنبوب إخراج الإدخال ممتلئا بالوسط ولمنع فقاعات الهواء من دخول النظام. إذا انقطع الفاصل الزمني ، فلن تتوقف المضخة من تلقاء نفسها ويجب إعادة ضبطها. اضغط على إلغاء للعودة إلى الصورة الحية.

تعمل الطبقة الأحادية للخلية البطانية غير المحفزة كعنصر تحكم سلبي لهذه التجربة. للقيام بذلك ، قم بغرس الكريات البيض KG one A في غرفة التدفق فوق خلايا H-B-M-E-C غير المعالجة 60 للتحكم في استقلالية الاختيار e ، وتحفيز الطبقة الأحادية للخلية البطانية مع IL one beta وغرس الكريات البيض فوق هذه الخلايا لمزيد من التحكم في استقلالية. عالج خلايا H-B-M-E-C 60 باستخدام IL واحد بيتا ثم بجسم S selectin المضاد للإنسان.

ثم قم بتحليل أحداث دحرجة الكريات البيض على هذه الخلايا. لا يتم تحديد دحرجة الخلية بواسطة S selectin فحسب ، بل يتم تحديدها أيضا عن طريق بقايا حمض السليك على سطح خلية الكريات البيض لإظهار ذلك ، قم بهضم خلايا KG one A مع 0.1 وحدة لكل مل نورامينيداز لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

ثم قم بتحليل الأحداث المتدحرجة على خلايا H-B-M-E-C المحفزة. البروتينات السكرية الموجودة على سطح الكريات البيض مهمة أيضا لدحرجة الخلايا. يمكن إثبات ذلك من خلال معالجة خلايا KG one A ب 0.2 وحدة لكل ميل بروما لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، ثم غرسها في غرفة التدفق.

بعد الحصول على التسلسل الزمني ، تكون البيانات جاهزة للتحليل. احفظ البيانات وانتقل إلى علامة التبويب قياس في شريط القائمة وحدد الحد المحدد. حرك الأشرطة بحيث يتم تلوين الخلايا المطلوبة باللون الأحمر ، وحدد جميع الصور ، ثم حسنا ، يجب الآن تعديل تسلسل الفاصل الزمني بالكامل باستخدام خلايا متدحرجة حمراء مرئية.

انتقل إلى قياس وتحديد القيود. يسمح هذا للمستخدم باستبعاد كائنات العتبة التي لا تمثل الخلايا المتجددة. هذه هي الخلفية التي تم إنشاؤها بشكل أساسي بواسطة منطقة تحديد أحادية الطبقة H-B-M-E-C 60 وقيم الإدخال الدنيا والقصوى ، والتي تعتبر مثالية للكريات البيض المتدحرجة.

كرر هذه الخطوة للاستطالة والدائرية: حدد القياس ثم حدد إنشاء ثنائي باستخدام القيود. سيتم الآن استخدام نفس قيم التقييد ، التي تم تعيينها في الخطوة السابقة ، لتحسين برنامج عناصر NIS للتعرف على الكريات البيض المتدحرجة على الطبقة الأحادية للخلية البطانية. ارجع لقياس بيانات الحقل المحددة ثم حدد إعادة تعيين البيانات.

أغلق القائمة، وارجع إلى القياس وحدد حقل المسح الضوئي، وافتح قياس بيانات الحقل، وحدد الرقم أو الكائنات. ثم حدد جميع الحقول وقم بتصدير البيانات إلى Microsoft Excel. أخيرا ، حدد مسح البيانات.

عناصر NIS جاهزة الآن لمزيد من جمع البيانات. توضح هذه البيانات التمثيلية كيف تستجيب تفاعلات الخلايا البطانية للكريات البيض للإجهاد الفسيولوجي الهائل ، وتختبر على وجه التحديد دور الترابط اللاصق. E selectin.

يحدث دحرجة الكريات البيض القوية عندما يتم تحفيز الخلايا البطانية مسبقا باستخدام IL one beta. عند مقارنة هذه النتيجة بالتحكم غير المحفز ، من الواضح أن دحرجة الخلايا تعتمد على تحفيز السيتوكين. من خلال معالجة خلايا H-B-M-E-C 60 باستخدام IL واحد بيتا ثم بجسم مضاد E selectin مضاد للإنسان ، يصبح من الواضح أن دحرجة الخلية تعتمد بشكل خاص على e selectin.

يمكن استخدام هذا الاختبار لاختبار المعلمات الأخرى أيضا. على سبيل المثال ، عندما تتم معالجة الخلايا المحفزة مسبقا باستخدام Sase أو مع البرولين ، تكون النتائج أقل قوة. تسلط هذه البيانات الضوء على أهمية بقايا حمض السليك الطرفية وكذلك البروتينات السكرية على سطح الخلية.

بالنسبة لنشاط ترابط S selectin ، أوضحنا لك للتو كيفية تحليل التفاعلات اللاصقة القائمة على e selectin بين الكريات البيض والخلايا البطانية في ظل ظروف تحاكي القوى الموجودة في وريد ما بعد الشعيرات الدموية ، وهي منطقة الدورة الدموية حيث تغادر الكريات البيض الدم وتدخل الأنسجة. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام الجسم المضاد المانع المناسب أو التحكم في العلاج الأنزيمي للتحقق من صحة ضرورة السيليكتين المعني والترابط الخاص به في نظام الفحص هذا. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.