القياس الكمي للكائنات الحية الدقيقة والفيروسات البيئية باستخدام qPCR

أتاح ظهور تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، أو qPCR ، تحديد كمية أي كائن حي دقيق في عينة بيئية كميا.

مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي ، يحدد qPCR الكائنات الحية الدقيقة عن طريق الكشف عن وجود أو عدم وجود تسلسل الحمض النووي الخاص بالكائنات الحية ذات الأهمية. هذا يسمح باكتشاف الميكروبات التي لا يمكن زراعتها في المختبر ، مما يجعل من الممكن فحص مجموعة أوسع بكثير من الكائنات البيئية. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح qPCR بتقييم كمية الحمض النووي كميا. ولكن في الوقت نفسه ، تكتشف منهجيات تفاعل البوليميراز المتسلسل الحمض النووي من جميع الكائنات الحية الميتة أو الحية ، مما يحد من القدرة على البحث فقط عن الميكروبات التي تنمو بنشاط في العينة.

سيستعرض هذا الفيديو الابتكارات الكيميائية التي تميز qPCR عن تفاعل البوليميراز المتسلسل العادي ، ويشرح كيف يمكن استخدام qPCR لقياس الحمض النووي كميا ، ويوضح بروتوكولا لاستخدام qPCR للكشف عن فيروس الحمض النووي الريبي من عينات التربة ، وأخيرا ، يوضح كيف يتم تطبيق qPCR على علم الأحياء الدقيقة البيئي اليوم.

المبادئ الأساسية وراء qPCR هي نفس الدورات المتكررة من التلدين التمهيدي إلى القالب ، واستطالة منتج PCR ، وتمسخ المنتج من القالب ، مما يؤدي إلى تضخيم أسي لتسلسل مستهدف ذي أهمية ، يعرف باسم amplicon ، من مجموعة من المواد الأولية.

يكمن ابتكار qPCR في إضافة مواد كيميائية فلورية إلى التفاعل ، مما يسمح بتصور تخليق منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل في كل دورة مباشرة في "الوقت الفعلي" بواسطة أجهزة تدوير حراري متخصصة ، مما يجعل من الممكن تحديد كمية تسلسل القالب في العينة الأصلية. عادة ما يتم قياس الكمية من حيث دورة العتبة ، واختصارها CT ، والمعروفة أيضا باسم دورة القياس الكمي أو Cq ، وهي دورة PCR التي تتجاوز فيها كمية المنتجات الفلورية مستوى الخلفية.

يمكن أن يكون القياس الكمي نسبيا ، حيث تتم مقارنة قيمة Ct لتسلسل واحد بقيمة معيار آخر أو تسلسل تحكم آخر. الكمية النسبية تساوي اثنين مرفوعين إلى قوة الفرق في Ct. بدلا من ذلك ، إذا تم تشغيل سلسلة من الحمض النووي بكمية معروفة جنبا إلى جنب مع العينات في التفاعل ، فيمكن إنتاج منحنى قياسي يقارن قيمة التألق بكمية الحمض النووي ، ويسمح بقياس كمية الحمض النووي للعينة بشكل مطلق.

هناك نوعان عريضان من جزيئات الفلورسنت المستخدمة في qPCR. في إحدى الحالات ، يتم تضمين الأصباغ الفلورية التي ترتبط على وجه التحديد بالحمض النووي مزدوج الشريطة في التفاعل. تتألق الصبغة فقط عندما ترتبط بالحمض النووي ، مما يسمح بقياس كمية منتج الحمض النووي مزدوج الشريطة.

في الطريقة الأخرى ، تم تصميم امتداد قصير من الحمض النووي ، يعرف باسم المسبار ، مقابل تسلسل مستهدف محدد ذي أهمية. يتم توصيل المسبار كيميائيا بصبغة فلورية بالإضافة إلى جزيء "مروي" يثبط إشارة التألق من الصبغة عندما يكون على مقربة. إنزيم البوليميراز ، الذي يصنع منتج الحمض النووي ، له نشاط مهين للحمض النووي من شأنه أن يتسبب في "إطلاق" جزيء الفلورسنت من المسبار ، وبالتالي فصل الصبغة عن المروي والسماح باكتشاف إشارة التألق.

الآن بعد أن فهمت المبادئ الكامنة وراء qPCR ، دعنا نلقي نظرة على بروتوكول لاستخدام هذه التقنية لتحديد فيروس الحمض النووي الريبي الذي يصيب النباتات ، فيروس الفلفل الخفيف ، من عينات التربة.

في هذا العرض التوضيحي ، سيتم جمع عينة من الجذور ، وهي منطقة التربة التي تبلغ مساحتها حوالي 7 مم حول جذور النباتات والتي تتأثر بالجذور والكائنات الحية الدقيقة التكافلية بينها.

لجمع تربة الجذور ، قم أولا باستخراج النبات محل الاهتمام بعناية من الأرض ، واضربه لإزالة أكبر قدر ممكن من التربة السائبة الزائدة. قم بتعبئة المصنع لمزيد من المعالجة في المختبر.

بعد إعادة العينات إلى المختبر ، استخدم ملعقة معقمة لكشط التربة المرغوبة في وعاء تجميع. ثم اجمع الفيروس من التربة واستخرج الحمض النووي الريبي.

بمجرد جمع الحمض النووي الريبي من العينة ، قم بتحويله إلى تكميلي أو (كدنا) عن طريق النسخ العكسي. يرجى الرجوع إلى فيديو JoVE SciEd على النسخ العكسي PCR للحصول على تفاصيل هذا الإجراء.

عندما تكون جاهزا لإجراء qPCR ، قم بإذابة الكواشف المجمدة في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء تدفق رقائقي مخصص ، وضعها على الثلج بمجرد إذابتها. يجب دائما الاحتفاظ بمكونات الكاشف التي تحتوي على إنزيم بوليميراز الحمض النووي على الجليد.

قم بإذابة عينة (كدنا) والحمض النووي الإيجابي للتحكم ، مثل قطعة دائرية من الحمض النووي تعرف باسم البلازميد التي تحتوي على امبليكون الاهتمام المستنسخ فيها.

قبل تجميع التفاعلات في لوحة qPCR مكونة من 96 بئرا ، قم بإعداد قالب طاولة مكون من 96 خلية على الورق ، وقم بتسمية كل خلية بالتفاعل الذي سيتم تحميله في اللوحة. قم بتضمين التفاعلات لكل عينة ومعيار في ثلاث نسخ ، وكذلك للتحكم الإيجابي والتحكم السلبي ، مثل تفاعل عدم وجود حمض النووي.

احسب أحجام الكاشف اللازمة للتفاعل "المزيج الرئيسي"، والذي يتضمن جميع الكواشف الثابتة بين التفاعلات. قم بإعداد مزيج رئيسي كاف للتفاعلات الثلاثية لجميع العينات بالإضافة إلى عناصر التحكم، و10٪ إضافية لحساب خطأ سحب العينات.

بمجرد إذابة الكواشف ، قم بتجميع المزيج الرئيسي في أنبوب ميكرو ميكرو منخفض الامتزاز سعة 1.5 مل. للقيام بذلك ، قم بدوامة كل كاشف لفترة وجيزة لخلطها جيدا ، وجمع أي سائل على جانب الأنابيب باستخدام جهاز طرد مركزي صغير ، وقم بإدخال الكاشف في أنبوب الطرد الدقيق. تأكد من استخدام أطراف ماصة جديدة لكل مكون تفاعل. بعد إضافة جميع الكواشف ، دوامة للخلط والطرد المركزي. بعد ذلك ، قم بتقسيم الكمية المناسبة من المزيج الرئيسي في الآبار المخصصة على لوحة PCR.

بعد ذلك ، قم بعمل دوامة وطرد مركزي لكل أنبوب بعينة والتحكم في الحمض النووي ، وقم بإدخال الكمية المناسبة في الآبار المعنية على لوحة PCR. بمجرد إضافة العينات ، أغلق اللوحة بورق مانع للتسرب ، واستخدم أداة الختم لتسطيح الختم بالكامل ودفع أي فقاعات هواء للخارج. قم بتمزيق الألسنة غير اللاصقة بعناية من نهايات الختم.

لتجميع خليط التفاعل بالكامل في قاع الآبار ، ضع لوحة التفاعل في جهاز طرد مركزي مع حامل لوحة وقم بموازنة الدوار بشكل صحيح مع لوحة ثقل الموازنة. قم بعمل الطرد المركزي النبضي للوحة حتى 1,000 دورة في الدقيقة ، ثم اترك جهاز الطرد المركزي يتوقف ببطء بدون فرامل.

ضع لوحة التفاعل في جهاز qPCR. اضبط برنامج PCR وفقا لمواصفات الشركة المصنعة ، واضبط درجة حرارة الانذهار وفقا لزوج التمهيدي المستخدم. اضبط برنامج التفاعل للتشغيل.

بمجرد اكتمال برنامج qPCR ، سيكون البرنامج قادرا على استخدام التركيزات المعروفة للتحكم الإيجابي لحساب كمية (كدنا) في كل تفاعل. يمكن بعد ذلك حساب كمية الفيروس في العينة الأصلية.

بمجرد اكتمال برنامج qPCR ، سيكون البرنامج قادرا على استخدام التركيزات المعروفة للتحكم الإيجابي لحساب كمية (كدنا) في كل تفاعل.

مع نتائج qPCR ، والحجم المنقول إلى الآبار ، والاستخراج من التربة ، والعامل من النسخ العكسي ، يمكن حساب عدد الفيروسات في عينة التربة الأولية.

الآن بعد أن عرفت كيفية إجراء qPCR ، دعنا نلقي نظرة على كيفية استخدامه لتحليل العينات البيئية المختلفة.

qPCR يمكن استخدامه لتحديد كمية الفيروسات المستردة من العديد من أنواع العينات المختلفة. في هذا التطبيق ، تم تركيز نوعين مختلفين من الفيروسات الغدية من عينات المياه بعدد من الطرق المختلفة. ثم تم استخراج الحمض النووي من الفيروسات وإخضاعه ل qPCR ، لتقييم الكفاءة النسبية لطرق التركيز.

تطبيق آخر للتعداد الميكروبي القائم على qPCR هو تحديد المحتوى البكتيري في عينات الأغذية والزراعية - في هذا المثال ، عينات البراز والقمامة من مزارع الدجاج. بدلا من استهداف الأنواع الفردية ، أجرى العلماء qPCR باستخدام بادئات ضد جين محفوظ للغاية موجود في جميع البكتيريا وقاموا بقياس إجمالي المجتمع البكتيري الموجود في العينات.

أخيرا ، كما ذكرنا سابقا ، فإن أحد عيوب منهجية qPCR التقليدية هو أنه لا يمكن التمييز بين الميكروبات الحية والميتة. ومع ذلك ، من خلال إضافة مادة كيميائية تعرف باسم بروبيديوم مونوازيد ، أو PMA ، والتي يمكن أن تدخل الخلايا الميتة فقط حيث ترتبط بالحمض النووي لتثبيط التفاعلات الأنزيمية اللاحقة مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تمكن الباحثون هنا من التمييز بين الثقافات الحية والميتة من الإشريكية القولونية O157: H7 ، وهي سلالة مسببة للأمراض شائعة موجودة في الطعام والماء الملوثين.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لقياس الكائنات الحية الدقيقة والفيروسات البيئية باستخدام qPCR. يجب أن تفهم الآن كيفية عمل qPCR ، وكيفية استخدام qPCR لقياس كمية الميكروب في عينة بيئية ، وبعض تطبيقات هذه التقنية. شكرا للمشاهدة!