كروماتوغرافيا العمود
المصدر: مختبر الدكتور جيمي فرانكو - كلية ميريماك
يعد كروماتوغرافيا العمود أحد أكثر التقنيات المفيدة لتنقية المركبات. تستخدم هذه التقنية مرحلة ثابتة ،…
1. ملاط هلام السيليكا
- صب هلام السيليكا في قارورة إرلينماير. يجب أن يكون وزن مادة التعبئة حوالي 50 ضعف وزن العينة التي يتم فصلها. إذا كانت المركبات التي يتم فصلها لها قيم Rf متشابهة جدا ، فقد يتطلب الأمر استخدام كمية أكبر من السيليكا لكل عينة ، وهذا هو الحال في هذا المثال.
- ضع 10 جم من السيليكا في قارورة إرلينماير ، حيث يتم عزل 50 مجم من العينة (45 مجم من الفلورينون و 5 مجم من رباعي الفينيل بورفيرين).
- أضف نظام المذيبات (الهكسان / ثنائي كلورو الميثان ، 70٪: 30٪) إلى قارورة Erlenmeyer التي تحتوي على هلام السيليكا. أضف ما يكفي من المذيبات للتأكد من أن كل هلام السيليكا قد تم إذابته جيدا. لن تذوب السيليكا ، لكن الخليط سيكون ملحوظا بصريا عند إذابته. بمجرد إضافة المذيب ، قم بتدوير قارورة Erlenmeyer للتأكد من أن كل السيليكا قابلة للذوبان جيدا.
2. إعداد العمود
- حدد العمود بالحجم المناسب. عادة يجب ملء العمود في منتصف الطريق تقريبا بملاط هلام السيليكا. كلما كبرت العينة التي يتم تنقيتها ، زاد حجم العمود المطلوب.
- قم بتوصيل الجزء السفلي من العمود بقطعة من الصوف الزجاجي. باستخدام قضيب طويل ، تأكد من تثبيت الصوف بإحكام في الجزء السفلي من العمود فوق محبس مباشرة.
- بمجرد أن يصبح الصوف في مكانه ، ضع طبقة رقيقة من الرمل فوق الصوف الزجاجي.
ملاحظة: إذا كان العمود مزودا بفريت زجاجي فوق محبس ، فيجب حذف هذه الخطوة. - قم بتثبيت العمود في الوضع الرأسي على حامل حلقي.
- باستخدام قمع ، اسكب الملاط المحضر من هلام السيليكا برفق في العمود. قد تحتاج إلى إضافة مذيب إضافي لنقل الملاط من قارورة Erlenmeyer إلى العمود. باستخدام ماصة ، اغسل أي هلام سيليكا يلتصق بجوانب العمود.
- عندما يستقر هلام السيليكا في العمود ، اضغط برفق على جوانب العمود للتأكد من أن هلام السيليكا يحزم بإحكام ويستبعد أي فقاعات هواء.
- افتح محبس التثبيت واترك المذيب يجف في قارورة Erlenmeyer نظيفة حتى قبل أن يلتقي هلام السيليكا ومقدمة المذيب. يجب ألا يجف هلام السيليكا أبدا حتى يكتمل الإجراء.
- ضع طبقة رقيقة من الرمل فوق هلام السيليكا ( الشكل 1 ). باستخدام ماصة ، اغسل أي رمل قد يكون عالقا على جوانب العمود.
- صفي أي مذيب إضافي حتى يجف الرمل ، ولكن ليس وصولا إلى طبقة هلام السيليكا.
الشكل 1. الإعداد المناسب لتجربة كروماتوغرافيا العمود قبل إضافة العينة.
3. إضافة العينة إلى العمود
- قم بإذابة العينة بأقل كمية ممكنة من المذيبات (باستخدام نفس المذيب الذي تم استخدامه لصنع ملاط هلام السيليكا).
- باستخدام ماصة، أضف العينة برفق إلى أعلى العمود.
- بمجرد وضع العينة على الجزء العلوي من العمود ، افتح محبس واترك المذيب يجف من خلال طبقة الرمل ولكن ليس طبقة هلام السيليكا. استخدم كمية صغيرة جدا من المذيبات لغسل أي عينة قد تكون متشبثة بجوانب العمود. قم بتصريف هذا المذيب الإضافي من خلال طبقة الرمل أيضا.
4. مسح العينة من خلال العمود
- باستخدام ماصة ، أضف برفق 4-5 مل من المذيب بطريقة لا تزعج طبقة الرمل.
- ضع قمعا في الجزء العلوي من العمود واملأ ما تبقى من العمود ببطء شديد وبلطف بالمذيب.
- افتح المحبس واترك المذيب يجف عبر العمود.
- ابدأ في جمع المرحلة المتنقلة أثناء تصريفها من العمود إلى أنابيب الاختبار.
- يجب وضع أنابيب الاختبار في رف أنبوب الاختبار بطريقة متسلسلة.
- أضف مذيبا إضافيا إلى الجزء العلوي من العمود حسب الحاجة حتى يتم التخلص من جميع المركبات المرغوبة من العمود.
5. استعادة المكونات
- إذا كانت المركبات ملونة ، فيمكن التعرف عليها بصريا. ومع ذلك ، إذا كانت المركبات عديمة اللون ، فسيتعين التعرف عليها باستخدام ضوء المرئي (UV) (إذا كانت المركبات تحتوي على اقتران) أو مع البقعة المناسبة. يمكن التحقق من نقاء المركبات باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة.
- حدد أنابيب الاختبار التي تحتوي على المركبة (المركبات) المطلوبة.
- ادمج جميع الكسور التي تحتوي على مركب (مركبات) معزولة مطلوبة في قارورة قاع دائري (RB) موزونة مسبقا. افعل ذلك لكل مركب يتم عزله.
- تبخر المذيب عن طريق وضع قارورة RB على المبخر الدوار.
- بمجرد إزالة كل المذيب ، قم بوزن RB مع المنتج المجفف واطرح الوزن الأولي ل RB للحصول على عائد.
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
كروماتوغرافيا العمود هي طريقة تنقية متعددة الاستخدامات تستخدم لفصل المركبات في المحلول. يحمل المذيب خليط المحلول من خلال عمود يحتوي على مادة صلبة ماصة تسمى المرحلة الثابتة. يسمى خليط المذيبات والعينة المدمجة بالمرحلة المتنقلة.
تنتقل الجزيئات في الطور المتحرك عبر العمود بمعدلات مختلفة بناء على خصائصها الكيميائية وتقاربها مع المرحلة الثابتة. وبالتالي ، يخرج كل مركب من العمود في وقت مختلف. بمجرد فصل المركبات وتنقيتها، يمكن معالجتها بشكل أكبر، أو تكون جاهزة للتوزيع. سيقدم هذا الفيديو أساسيات كروماتوغرافيا العمود ، ثم يوضح التقنية مع تنقية المركبات العضوية.
في كروماتوغرافيا العمود ، تمتص الجزيئات بشكل عكسي إلى المرحلة الثابتة أثناء تدفقها عبر العمود ، وبالتالي إبطاء تقدمها. المركبات التي تتفاعل بشكل ضعيف مع المرحلة الثابتة تكون أسرع في الخروج من العمود أو الملتوية. المركبات التي تتفاعل بقوة مع المرحلة الثابتة تكون أبطأ في العزف. المرحلة الثابتة عبارة عن مسحوق أو هلام ممتص مثل هلام السيليكا أو الألومينا. هلام السيليكا والألومينا قطبيان للغاية - لذا فهما يتفاعلان بقوة مع المركبات والمذيبات القطبية ، وبشكل ضعيف مع الجزيئات غير القطبية. يتم تحميل المرحلة الثابتة في العمود كملاط مع المذيب ، ثم يتم تعبئتها عن طريق تدفق المذيبات عبر المرحلة الثابتة. عند تعبئتها بشكل صحيح ، تكون المرحلة الثابتة متجانسة من أعلى إلى أسفل ولا تحتوي على فقاعات هواء أو بقع جافة ، حيث يتداخل التدفق غير المتكافئ الناجم عن هذه المخالفات مع فصل المركبات. عادة ما يكون المذيب ، أو المذيع ، مذيبا عضويا يتم توفيره من الخزان. بشكل عام ، تقوم المذيبات غير القطبية فقط بإخراج المركبات غير القطبية ، في حين أن المذيبات القطبية تتخلص من المركبات القطبية وغير القطبية. إذا كان الخليط يحتوي على مركبات ذات أقطاب مختلفة بشكل كبير ، فيمكن استخدام سلسلة من المذيبات القطبية بشكل متزايد لتصفية جميع المركبات ذات الأهمية. عادة ما يتم التحكم في معدل تدفق الطور المتحرك بواسطة محبس في الجزء السفلي من العمود. يتم تقليل فترات التوقف المؤقت في التدفق إلى الحد الأدنى لتجنب انتشار المركبات. يتم جمع المرحلة المتحركة التي تغادر العمود ، والتي تسمى الشطف ، في كسور للحفاظ على فصل المركبات. الآن بعد أن فهمت مبادئ كروماتوغرافيا العمود ، دعنا ننتقل إلى إجراء لتنقية خليط من المركبات العضوية.
لبدء الإجراء ، احصل على المعدات كما هو مذكور في النص. قم بوزن قارورة مستديرة القاع لعزل كل مركب وسجل الكتلة. بعد ذلك ، قم بوزن العينة وحلها في الحد الأدنى من حجم المذيب المطلوب. يجب تحديد المذيب المناسب مسبقا باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة. يجب أن تكون قيمة التردد اللاسلكي بين 0.2 × 0.3. بعد ذلك ، حدد كمية هلام السيليكا المطلوبة للمرحلة الثابتة بناء على الوزن الجاف للعينة والفرق في مسافة هجرة المركبات ذات الأهمية بناء على الفحص المسبق ل TLC. صب الكمية المناسبة من هلام السيليكا في قارورة Erlenmeyer. أضف المذيب إلى هلام السيليكا حتى يصبح الملاط شفافا ويتحرك بحرية عند تدوير القارورة. بعد ذلك ، حدد عمودا كبيرا بما يكفي بحيث يملأه هلام السيليكا في منتصف الطريق. إذا لم يكن العمود يحتوي على فريت زجاجي ، فضع الصوف الزجاجي في العمود واضغط عليه بقوة إلى الأسفل بقضيب طويل. قم بتغطية الصوف الزجاجي بحوالي 2 سم من الرمل لمنع السيليكا من المرور عبر الصوف الزجاجي. في غطاء الدخان ، قم بتثبيت العمود بحامل دائري ، مما يتيح مساحة كافية أدناه لاستيعاب أنابيب الاختبار.
ضع قمعا في العمود وتأكد من إغلاق المحبس. صب الملاط في العمود ، واضغط برفق على الجوانب حيث يستقر الملاط لاستبعاد فقاعات الهواء. اشطف القمع والقارورة وجدران العمود بالمذيب لنقل كل الجل إلى العمود.
ضع قارورة Erlenmeyer أسفل العمود. افتح المحبس واترك المذيب يجف في القارورة حتى يصبح مستوى المذيب أعلى مباشرة من هلام السيليكا ، ثم أغلق المحبس. صب حوالي 2 سم من الرمل على الجل. اشطف برفق أي رمل عالق على جوانب العمود بالمذيب. صفي المذيب حسب الحاجة حتى يكون الرمل جافا في الغالب ، لكن السيليكا تظل مغطاة بالكامل.
لبدء الفصل ، أضف العينة إلى العمود دون إزعاج الرمال. استخدم أجزاء صغيرة من المذيبات لشطف أي عينة ملتصقة بجدران العمود وشطف حاوية العينة. قم بتصريف المذيب بحذر حتى يصبح المستوى أعلى بقليل من السيليكا. ثم ، باستخدام ماصة ، أضف 4 مل من المذيب برفق دون إزعاج طبقة الرمل. ضع قمعا في العمود واملأه ببطء بالمذيب. قم بإزالة القارورة واستبدلها بأنبوب اختبار مسمى. مع وضع أنبوب الاختبار الأول في مكانه ، افتح محبس وجمع المصفاة حتى يمتلئ أنبوب الاختبار تقريبا.
استمر في جمع الكسور حتى يتم تصفية جميع المركبات المرغوبة ، مع المضي قدما بالتتابع من خلال أنابيب الاختبار المصنفة. عند الانتهاء ، أغلق المحبس.
لكل مركب معزول ، اجمع بين الكسور النقية في قارورة مستديرة القاع موزونة مسبقا. قم بإزالة المذيب من القارورة الموجودة على مبخر دوار ثم قم بوزن القارورة ذات القاع المستدير التي تحتوي على المركب الجاف. لمزيد من المعلومات ، انظر فيديو هذه المجموعة حول التبخر الدوار.
احتوت هذه العينة على خليط من رباعي الفينيل بورفيرين ، أو TPP ، والفلورينون. تم التخلص من TPP الأرجواني المحمر الداكن أولا ، يليه الفلورينون الأصفر. تم تأكيد نقاء كل مركب معزول بواسطة التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي.
يستخدم كروماتوغرافيا العمود في التنقية والتحليل في مجموعة متنوعة من المجالات العلمية.
الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ، أو HPLC ، هي شكل من أشكال كروماتوغرافيا العمود التي توفر فصلا ممتازا بين المركبات ويمكن أن تتضمن كاشفات متخصصة مثل كاشف الإشعاع للجزيئات ذات العلامات الإشعاعية. باستخدام HPLC ، يمكن بسهولة عزل الدهون الفوسفورية ذات العلامات الإشعاعية عن خليط من العديد من العناصر الأخرى حتى لو كان يشكل نسبة صغيرة من الخليط. يمكن أن تساعد هذه المعلومات في توضيح إنتاج وتنظيم ووظائف العديد من الجزيئات الحيوية المهمة.
كروماتوغرافيا الفلاش هي نوع مختلف من كروماتوغرافيا العمود حيث تتحرك المرحلة المتحركة عبر العمود تحت ضغط الهواء أو الغاز بدلا من تدفق الجاذبية وحده.
هذا يخلق معدل تدفق أسرع ، مما يقلل من الانتشار لفصل أفضل. يتم جمع المركب المطلوب في عدد قليل من الكسور النقية المركزة ، كما هو موضح في كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ، مما ينتج عنه إنتاجية ونقاء ممتازين بعد التنقية.
جهاز العمود المعتاد غير مناسب لفصل الأحجام الصغيرة ، لكن بعض الخلائط غير متوافقة مع التقنيات المتخصصة مثل HPLC. يتم إجراء التنقية على نطاق صغير باستخدام أعمدة الماصة الزجاجية، مع لمبة ماصة تستخدم في كروماتوغرافيا الفلاش على نطاق صغير. هذا مفيد بشكل خاص عند تحضير عينة لتقنيات التنقية المتخصصة أو كخطوة أخيرة بعد التنقية على نطاق واسع.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لكروماتوغرافيا الأعمدة. يجب أن تكون الآن على دراية بمبادئ كروماتوغرافيا العمود ، وإجراء كروماتوغرافيا عمود هلام السيليكا ، وبعض تطبيقات هذه التقنية.
شكرا للمشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the mobile phase in column chromatography?
The mobile phase is the combined solvent and sample mixture that flows through the column. It carries the dissolved compounds through the stationary phase, allowing separation based on how strongly each molecule interacts with the adsorbent. The solvent used is typically an organic solvent selected based on the polarity of compounds being purified.
Q2: Why do different compounds elute at different times in column chromatography?
Compounds elute at different rates because they interact differently with the stationary phase. Molecules that bind weakly to the adsorbent exit the column quickly, while those with strong interactions elute more slowly. This differential adsorption, based on chemical properties and polarity, enables separation of the mixture into pure fractions.
Q3: What are the most common stationary phases used in column chromatography?
Silica gel and alumina are the two most commonly used stationary phases. Both are highly polar adsorbents that interact strongly with polar compounds and solvents, but weakly with nonpolar molecules. These materials are packed into the column as a slurry and must be properly compacted to ensure homogeneous packing without air bubbles or dry patches.
Q4: How do you prepare the stationary phase before starting column chromatography?
The stationary phase is prepared by mixing the adsorbent powder with solvent to create a slurry that is translucent and moves freely. This slurry is poured into the column and packed by flowing solvent through it. Proper packing ensures the stationary phase is homogeneous from top to bottom with no air bubbles, which is critical for effective separation.
Q5: What role does solvent polarity play in selecting the mobile phase?
Solvent polarity determines which compounds will elute from the column. Nonpolar solvents only elute nonpolar compounds, while polar solvents elute both polar and nonpolar compounds. For mixtures with significantly different polarities, a series of increasingly polar solvents may be used sequentially to elute all compounds of interest.
Q6: How is thin layer chromatography used to prepare for column chromatography?
Thin layer chromatography is used as pre-screening to determine the appropriate solvent and predict separation success. The Rf value should be between 0.2 and 0.3 to ensure good separation. This information helps determine the amount of silica gel needed and guides the selection of the mobile phase solvent for the column.
Q7: What happens after fractions are collected in column chromatography?
Pure fractions are combined in a pre-weighed flask, and the solvent is removed using rotary evaporation to yield the isolated dry compound. The flask is then weighed to determine the mass of purified product. The purity of isolated compounds can be confirmed using analytical techniques such as nuclear magnetic resonance spectroscopy.