مقايسة لتحريض العصبية في الأجنة الفرخ

يوضح هذا الفيديو الخطوات المختلفة في اختبار الحث العصبي في جنين الدجاج. أولاً، يتم استئصال الجنين المضيف ووضعه في مزرعة جديدة، ويتم استئصال الجنين المانح في محلول ملحي ويُسمى عقدة هينسون (Henson's node) بصبغة فلورية. ثم تُستأصل عقدة هينسون من الجنين المانح وتُزرع في الجنين المضيف.

يتم استزراع الجنين المضيف لمدة 24 ساعة، ثم يُثبَّت ويُعالج للأكسدة الضوئية تحت الفلورسنت. وباستخدام dab، يتم معالجة الجنين للتهجين الموضعي باستخدام واسمة عصبية.

مرحباً، أنا دلفين من مختبر فينيل في مركز الطب البيئي والجيني بجامعة تكساس إي أند إم في هيوستن. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتنفيذ مقايسات الحث العصبي في جنين الدجاج. نحن نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة تأثيرات الأدوية المضادة للصرع على الخصائص المحفزة عصبياً لعقدة هينسن.

لنبدأ الآن. بالنسبة لمقايسة الحث العصبي، يجب تحضير البيوض. يجب تحضين هذه البيوض وهي مستلقية على جانبها في حاضنة رطبة لمدة 13 ساعة وصولاً إلى مرحلة هامبرغر وهاملتون الثالثة بلس أو HH 3+.

بعد ذلك، يتم تحضير جنين المضيف باستخدام طريقة الزراعة الجديدة التي تم توضيحها سابقاً. في JoVE، قم بتغطية سطح جنين المضيف بـ 200 µL من المحلول الملحي؛ حيث سيسهل ذلك عملية نقل وتحديد موضع الطعم المانح لاحقاً.

أخيرًا، قم بتغطية التجميعة باستخدام طبق زراعة Falcon مقلوب بقطر 35 مليمتر. لاستخراج الجنين المانح، افتح البيضة عن طريق النقر على القشرة باستخدام الملاقط. قم بإزالة الجزء العلوي من القشرة وتخلص منه.

قم بإزالة الألبومين الكثيف باستخدام الملقط، ثم أَمِل كيس المح yolk sack باستخدام ملقط خشن بحيث يكون الجنين موجهاً للأعلى. بعد إزالة الألبومين، استخدم مقصاً دقيقاً لقص مربع من كيس المح yolk sack حول الجنين. انزع الجنين من المح باستخدام ملعقة وضعه في طبق يحتوي على PBS.

بعد ذلك، استخدم الملاقط لفصل الجنين المانح عن المح، والمنطقة الشفافة (area lucida). وبمجرد فصله، انقل الجنين المانح إلى طبق مغطى بواقٍ من نوع SIL guard ويحتوي على PBS لتحديد وتطعيم الطعم. استخدم سحّاب أقطاب ميكروية لسحب ماصات شعرية زجاجية ميكروية سعة 50 µL تحت المجهر.

اقطع طرف الماصة الدقيقة باستخدام ملقط دقيق. ضع الماصة الدقيقة في طبق بتري مبطن بشريط من صلصال النمذجة. بعد ذلك، قم بتحضير محلول الصبغة، والذي سيُستخدم لوسم الطعم قبل عملية الزرع.

أولاً، قم بتحضير محلول مخزون من صبغة dai بتركيز 0.5% في 1 ملليلتر من الإيثانول المطلق. يمكن تخزين هذا المحلول في درجة حرارة 20- درجة مئوية في الظلام. بعد ذلك، وفي كتلة تسخين مضبوطة على 45 درجة مئوية، اخلط 10 ميكرولتر من محلول dai المخزون المسخن مسبقاً مع 90 ميكرولتر من السكروز بتركيز 0.3 مولار. تُعد درجة الحرارة هذه ضرورية لمنع ترسيب dai وتكون بلورات غير قابلة للذوبان.

قم بتدوير المحلول لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي صغير (mini SPECT fuge) لمدة تتراوح من 5 إلى 10 ثوانٍ. أصبح محلول DAI الآن جاهزاً للاستخدام؛ استخدم دبابيس الحشرات لتثبيت الجنين المانح في قاع طبق مغطى بواقٍ من السيليكون بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى. وبمجرد تثبيت الجنين، املأ الماصة الدقيقة بمحلول D eye عن طريق تطبيق ضغط خفيف.

باستخدام مجموعة أنابيب الشفط، يتم وضع كمية صغيرة من dai على عقدة henson. تكرر العملية مع التأكد من وسم عقدة henson بالكامل بعد ذلك.

باستخدام ماصة شعيرية دقيقة أو سكين تشريح دقيق، قم بقص عقدة hensons؛ حيث يمكن تمييز الجانب الظهري للعقدة عن الجانب البطني لأن الجانب الظهري يشكل أخدوداً، بينما يكون الجانب البطني للعقدة مسطحاً. وعند الضرورة، قم بتمييز الجانب الظهري للطعم باستخدام مسحوق الكارمين، وذلك لضمان وضع الطعم بالتوجيه الظهري البطني الصحيح.

باستخدام ماصة جيلسون سعة 10 µL، انقل الطعم إلى جنين المضيف باستخدام ماصة شعرية دقيقة. قرّب الطعم من المنطقة الشفافة (area lucida)، وهي منطقة الحدود المعتمة عند مستوى عقدة هنسون (henson's node) في جنين المضيف. بعد ذلك، استخدم ماصة شعرية دقيقة أو سكين تشريح دقيق لإجراء شق صغير يتراوح بين 80 إلى 100 µm في هذه المنطقة.

حدود معتمة في منطقة لوسيتـا عند مستوى عقدة هنسون للجنين المضيف. باستخدام ماصة شعرية دقيقة أو سكين تشريح دقيق، ضع الطعم بحيث يكون الجانب البطني مواجهاً لك والنهاية الخلفية موازية للمنطقة المعادلة في الجنين المضيف O. وبمجرد استقراره في موضعه، قم بإزالة المحلول الملحي من الجنين المضيف، مع التأكد من بقاء الطعم في مكان قريب جداً من موقع المضيف، ثم قم بمعالجة الجنين المضيف للاستزراع الجديد لمدة تتراوح بين 18 إلى 22 ساعة كما هو موضح في بحثنا السابق.

بعد 24 ساعة من الزرع، يتم إخراج الجنين من الحاضنة وتثبيته باستخدام دبابيس في طبق سيجار. يُزال محلول P-B-S ويُستبدل بـ 4%para formaldehyde. ثم يُثبت الجنين لمدة 24 ساعة.

تخلص من المثبت في وعاء نفايات خطرة مناسب وأضف PBS إلى طبق التثبيت. قم بإزالة دبابيس الحشرات باستخدام الملاقط بعد سحب الدبابيس. استخدم ماصة رعوية ذات طرف غير مدبب لنقل الجنين إلى قارورة وميض تحتوي على PBS.

اغسل الجنين مرتين في PBS لمدة خمس دقائق في كل مرة، ومرة واحدة في محلول Tris buffer لمدة خمس دقائق. بعد الغسيل، انقل الجنين إلى شريحة تجويف زجاجية تحتوي على 0.1 milliliters من Tris buffer. استبدل محلول Tris buffer بـ 0.1 milliliter من محلول DAB. تخلص من رأس الماصة في دلو يحتوي على محلول مبيض.

من أجل إزالة تلوث DAB، ضع غطاء شريحة فوق شريحة التجويف تحت تركيز الفلوريسين إيزوثيوسيانات الفلوري FEI. ستظهر عدسة المجهر الموجودة فوق الخلايا المانحة للطعم باللون الأحمر الفلوري عند تعرضها لفلورية FEI حتى تتحول جميع الخلايا ذات اللون الأحمر الفلوري إلى اللون البني. يحدث هذا نتيجة لتحول الفلوروكروم الضوئي إلى بلورات بنية غير قابلة للذوبان بفعل التعرض لطول موجة إثارة FEI.

4 88 نانومتر في وجود dab. تستغرق هذه العملية ما بين 20 دقيقة وساعتين. بعد اكتمال تفاعل الأكسدة الضوئية، قم بإزالة الغطاء الزجاجي باستخدام ملقط دقيق.

انقل الجنين إلى قارورة وميض بسعة 20 milliliter تحتوي على PBTW أو PBS مع 0.1%tween 20. وأخيراً، قم بإزالة تنشيط DAB من الغطاء والشريحة والتجويف الزجاجي. قم بتحضير الشريحة عن طريق الحضن في محلول مبيض لمعالجة الجنين من أجل التصوير المرئي.

باشر بإجراء عملية التهجين الموضعي (in-situ hybridization)، مع تحضين الجنين للمسبار المسمى بـ DIG فقط. بعد ذلك، ابدأ بالتصوير والتقطيع كما هو موضح في فيديو Jo الثاني. إليك مثال على مقايسة الحث العصبي.

في البداية، يتم وضع الطعم في المنطقة الفاصلة بين المنطقة الشفافة (area lucita) والمنطقة الألبكا (area alpaca) للجنين المضيف. يكون كل من الجنين المانح والمضيف في المرحلة الثالثة بلس (stage three plus). وبعد تسع ساعات من الزراعة، يبدأ الطعم في التمايز وتحفيز ما يبدو أنه رأس مصغر في المرحلة الثامنة ماينس (stage eight minus).

بعد مرور 24 ساعة في المزرعة، يكتمل الحث العصبي عقب عملية التثبيت. يتمت معالجة الجنين من أجل الأكسدة الضوئية. في البداية، يتبين أن الخلايا الملونة بصبغة العين المشتقة من المانح قد تكاثرت لتشكل جهازًا عصبيًا مصغرًا كما يظهر هنا باللون الأحمر.

بعد عملية الأكسدة الضوئية، تظهر هذه الخلايا باللون البني. ثم يتم معالجة الجنين عن طريق التهجين الموضعي للعينة الكاملة للكشف عن العلامة العصبية. تم تطوير O otx two في مختبر الدكتور بونيللي.

يظهر أن الطُعم المانح يحفز تعبير OTX two من الأنسجة المشتقة من المضيف. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء مقايسة التحريض العصبي في جنين الدجاج. عند القيام بهذا الإجراء، من المهم تذكر إزالة جميع السوائل في المنطقة المحيطة بالطُعم بعد عملية الزرع باستخدام ماصة الرعاف.

سيضمن ذلك تثبيت الطعم بإحكام وعدم تحركه بعيداً عن جنين المضيف أثناء الزراعة. هذا كل شيء. شكراً لكم، مشاهدة ممتعة وبالتوفيق في تجاربكم.