مقايسة لتحريض العصبية في الأجنة الفرخ
February 13th, 2009
الحث العصبي هو الخطوة الأولى في تكوين الدماغ. وهو الآلية التي عقدة هنسن (المنظم) ، يرشد النسيج المجاور لاعتماد مصير العصبية ، أي أن تثير الجهاز العصبي. هذا الفيديو يوضح مقايسة لتحريض العصبي في الأجنة الفرخ.
يوضح هذا الفيديو الخطوات المختلفة في فحص الحث العصبي في جنين الكتكوت. أولا ، يتم زرع الجنين المضيف في الثقافة الجديدة ، يتم زرع الجنين المتبرع في محلول ملحي ويتم تمييز عقدة هينسون بصبغة الفلورسنت. يتم استئصال عقدة هينسون من الجنين المتبرع وزرعها في الجنين المضيف.
يتم استزراع الجنين المضيف لمدة 24 ساعة ، ويتم تثبيته ومعالجته من أجل الأكسدة الضوئية تحت تألق فاي. مع داب. تتم معالجة الجنين للتهجين في الموقع باستخدام علامة عصبية.
مرحبا ، أنا دلفين من Labor Fennell في مركز الطب البيئي والجيني في جامعة تكساس أ و إم في هيوستن. سنعرض لك اليوم إجراء لإجراء فحوصات الحث العصبي في جنين الخد. نستخدم هذا الإجراء في المختبر لدراسة تأثيرات الأدوية المضادة للصرع على الخصائص العصبية المحفزة لعقدة هانسن.
لذلك دعونا نبدأ. بالنسبة لمقايسة الحث العصبي ، يجب تحضير البيض. يجب تحضين هذا البيض ووضعه على جانبه في حاضنة رطبة لمدة 13 ساعة إلى الهامبرغر وهاميلتون المرحلة الثالثة زائد أو HH ثلاثة زائد.
بعد ذلك ، قم بإعداد الجنين المضيف باستخدام طريقة الثقافة الجديدة ، والتي تم إثباتها سابقا. في JoVE ، قم بتغطية سطح الجنين المضيف بمحلول ملحي 200 ميكرولتر. سيسهل ذلك نقل الكسب غير المشروع المتبرع ووضعه لاحقا.
أخيرا ، قم بتغطية المجموعة بطبق ثقافة فالكون مقلوب 35 ملم. لتخطيط الجنين المتبرع ، افتح البويضة عن طريق النقر على القشرة بالملقط. قم بإزالة الجزء العلوي من القشرة وتخلص منها.
قم بإزالة الألبومين السميك بالملقط وقم بإمالة كيس الصفار بالملقط الخشن بحيث يكون الجنين متجها لأعلى. بعد إزالة الألبومين ، استخدم مقصا جيدا لقطع مربع من كيس الصفار حول الجنين. أخرج الجنين من صفار البيض بملعقة وضعه في طبق يحتوي على PBS.
بعد ذلك ، استخدم الملقط لفصل الجنين المتبرع عن صفار البيض ومنطقة لوسيتا. بمجرد فصله ، انقل جنين المتبرع إلى طبق مغطى بواقي SIL يحتوي على PBS لتسمية الكسب غير المشروع وزرعه. استخدم مجتذب قطب كهربائي صغير لسحب ماصات شعرية صغيرة زجاجية سعة 50 ميكرولتر تحت المجهر.
قم بقص طرف الماصة الدقيقة باستخدام ملقط دقيق. ضع ماصة صغيرة في طبق بتري مبطن بشريط من طين النمذجة. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول الصبغة ، والذي سيتم استخدامه لتسمية الكسب غير المشروع قبل الزرع.
أولا ، قم بإعداد مخزون من صبغة العين في مليلتر واحد ، الإيثانول المطلق بنسبة 0.5٪ يمكن تخزين هذا المخزون عند سالب 20 درجة مئوية في الظلام. ثم في كتلة حرارية مثبتة على 45 درجة مئوية ، يتم خلط مخزون داي 10 ميكرولتر دافئ مسبقا إلى 90 ميكرولتر ، 0.3 ميكرو ، 0.3 ميكروز مولار. درجة الحرارة هذه ضرورية لمنع ترسيب داي وتشكيل بلورات غير قابلة للذوبان.
قم بتدوير المحلول لفترة وجيزة على جهاز SPECT صغير لمدة خمس إلى 10 ثوان. أصبح حل DAI جاهزا الآن للاستخدام باستخدام دبابيس الحشرات التي تم تأمين الجنين المتبرع في الجزء السفلي من الجانب الظهري للطبق المغطى بواقي العتبة لأعلى. بمجرد تأمين الجنين، قم بإعادة ملء الماصة الدقيقة بالعين D عن طريق الضغط اللطيف.
باستخدام مجموعة أنبوب الشفاطة. ضع بلعة صغيرة من داي على عقدة هينسون. كرر ، تأكد من تسمية عقدة هينسون بأكملها بعد ذلك.
باستخدام ماصة شعرية دقيقة أو سكين تشريح دقيق يقطع عقدة هينسون ، يمكن تمييز الجانب الظهري للعقدة عن الجانب البطني لأنه يشكل أخدودا ، في حين أن الجانب البطني من العقدة مسطح. إذا لزم الأمر ، ضع علامة على الجانب الظهري من الكسب غير المشروع بمسحوق القرمزي. سيضمن ذلك وضع الكسب غير المشروع باتجاه بطني ظهري مناسب.
باستخدام ماصة جيلسون سعة 10 ميكرولتر، انقل الطعم إلى الجنين المضيف باستخدام ماصة شعرية دقيقة. اجعل الكسب غير المشروع قريبا من منطقة لوسيتا ، المنطقة الحدودية غير الشفافة على مستوى عقدة هينسون للجنين المضيف. بعد ذلك ، استخدم ماصة شعرية صغيرة أو سكين تشريح دقيق لعمل شق صغير من 80 إلى 100 ميكرومتر في المنطقة.
منطقةLucita حدود معتمة على مستوى عقدة هينسون للجنين المضيف. باستخدام ماصة شعرية دقيقة أو سكين تشريح دقيق. ضع الكسب غير المشروع بحيث يكون الجانب البطني متجها نحوك ويكون الطرف الخلفي موازيا للمنطقة المكافئة في الجنين المضيف O.بمجرد وضعه في الموضع ، قم بإزالة المحلول الملحي من الجنين المضيف ، وتأكد من بقاء الكسب غير المشروع على مقربة من موقع المضيف ومعالجة الجنين المضيف للزراعة الجديدة لمدة 18 إلى 22 ساعة كما هو موضح في تقديمنا السابق.
بعد 24 ساعة من الثقافة ، تتم إزالة الجنين من الحاضنة وتثبيته في طبق سيجار. تتم إزالة المحتوية على P-B-S-P-B-S واستبدالها ب 4٪ para formaldehyde. ثم يتم إصلاح الجنين لمدة 24 ساعة.
تخلص من المثبت في وعاء مناسب للنفايات الخطرة وأضف PBS إلى طبق التثبيت. قم بإزالة دبابيس الحشرات بالملقط بعد إزالة المسامير. استخدم ماصة المراعي ذات النهاية الحادة لنقل الجنين إلى قارورة تلألؤ تحتوي على PBS.
اغسل الجنين مرتين في PBS لمدة خمس دقائق لكل منهما ومرة واحدة في محلول ملتوي لمدة خمس دقائق بعد الغسيل ، انقل الجنين إلى شريحة تجويف زجاجية تحتوي على 0.1 مل من محلول Tris. استبدل محلول المخزن المؤقت tris بمحلول DAB سعة 0.1 ملليلتر. تخلص من طرف einor في دلو يحتوي على محلول مبيض.
من أجل تطهير DAB ، ضع زلة غطاء أعلى شريحة التجويف تحت تركيز مضان إيزوثيوسيانات فلوريسين FEI. سيظهر هدف المجهر على الخلايا المانحة للكسب غير المشروع باللون الأحمر الفلوري ويتعرض لمضان FEI حتى تصبح جميع الخلايا الحمراء الفلورية بنية اللون. يحدث هذا نتيجة لتحويل فلوروكروم العجين إلى بلورات بنية غير قابلة للذوبان عن طريق التعرض للطول الموجي لإثارة FEI.
4 88 نانومتر في وجود داب. تستغرق هذه العملية ما بين 20 دقيقة وساعتين. بعد الانتهاء من تفاعل الأكسدة الضوئية ، قم بإزالة زلة الغطاء باستخدام ملقط دقيق.
نقل الجنين إلى قارورة تلألؤ سعة 20 ملليلتر تحتوي على PBTW أو PBS مع 0.1٪ توين 20. أخيرا قم بإلغاء تنشيط DAB من الغطاء والانزلاق والتجويف الزجاجي. انزلق عن طريق احتضان محلول مبيض لمعالجة الجنين للتصور.
استمر في التهجين في الموقع ، واحتضان الجنين للمسبار المسمى DIG فقط. بعد ذلك ، ابدأ التصوير والتقسيم كما هو موضح في Jo Video two. فيما يلي مثال على مقايسة الحث العصبي.
في البداية ، يتم وضع الكسب غير المشروع في الحدود بين منطقة لوسيتا ومنطقة الألبكة للجنين المضيف. كل من الأجنة المانحة والمضيفة هي المرحلة الثالثة زائد. بعد تسع ساعات في الثقافة ، يبدأ الكسب غير المشروع في التمايز والحث على ما يبدو على أنه مرحلة مصغرة ثمانية ناقص الرأس.
بعد 24 ساعة في الثقافة ، يكتمل الحث العصبي بعد التثبيت. تتم معالجة الجنين من أجل أكسدة الضوء. في البداية ، تبين أن الخلايا المصنفة بالعين الصبغية المشتقة من المتبرع قد تكاثرت لتشكل نور مصغرة كما هو موضح هنا باللون الأحمر.
بعد أكسدة الصور ، تظهر هذه الخلايا بنية اللون. ثم تتم معالجة الجنين باستخدام تهجين كامل في الموقع للعلامة العصبية. O otx اثنين تم تطويره في مختبر الدكتور بونيلي.
يظهر أن الكسب غير المشروع المتبرع يحفز التعبير عن OTX اثنين من الأنسجة المشتقة من المضيف. لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء فحص الحث العصبي في جنين الخد. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إزالة كل السوائل الموجودة في المنطقة المحيطة بالكسب غير المشروع بعد الزرع باستخدام أليف أنبوبي.
سيضمن ذلك وضع الكسب غير المشروع بشكل آمن وأنه لن يبتعد عن الجنين المضيف أثناء الزراعة. هذا كل شيء. شكرا. لذا مشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يُظهر هذا الفيديو فحصًا لتوجيه الخلايا العصبية في أجنة الدجاج، ويوضح العملية التي يعمل بها عقدة هينسون على توجيه الأنسجة المجاورة لاعتناق مصير عصبي. تشمل الخطوات المتضمنة استخراج الأجنة المضيفة والمانحة، وتسمية عقدة هينسون، وإجراء تهجين داخلي مع علامة عصبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء التنموي
- علم الأجنة
الخلفية
- التوجيه العصبي ضروري لتكوين الدماغ.
- عقدة هينسون تعمل كمنظم في التطور الجنيني.
- فهم التوجيه العصبي يمكن أن يوفر رؤى حول تكوين الجهاز العصبي.
- يستخدم هذا الفحص أجنة الدجاج ككائن نموذجي.
هدف الدراسة
- لإظهار عملية التوجيه العصبي.
- لتوضيح دور عقدة هينسون في تحديد المصير العصبي.
- لتوفير دليل مرئي لإجراء الفحص.
الطرق المستخدمة
- استخراج الأجنة المضيفة والمانحة.
- تسمية عقدة هينسون بصبغة فلورة.
- زرع عقدة هينسون إلى الجنين المضيف.
- تهجين داخلي مع علامة عصبية بعد الثقافة.
النتائج الرئيسية
- تسمية وزرع عقدة هينسون بنجاح.
- إظهار تعبير علامة عصبية في الجنين المضيف.
- تأكيد بصري لعمليات التوجيه العصبي.
- رؤى حول آليات تحديد المصير العصبي.
الاستنتاجات
- يُظهر الفحص بشكل فعال التوجيه العصبي في أجنة الدجاج.
- تلعب عقدة هينسون دورًا حيويًا في توجيه المصير العصبي.
- يمكن استخدام هذه الطريقة في الدراسات الإضافية في علم الأعصاب التنموي.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This assay provides a mechanistic framework for evaluating neural inducing activity of candidate compounds in a vertebrate model, supporting early target validation in neurotherapeutic discovery. By enabling visualization of neural fate specification through organizer grafting, it aids in de-risking mechanisms of action for compounds targeting neurodevelopmental pathways. The assay’s reliance on quantitative readouts such as marker expression supports predictive confidence in lead identification stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether a candidate molecule can mimic or inhibit organizer-derived neural inducing signals.
- Operational Value: Enables functional validation of targets involved in neural fate determination through gain- or loss-of-function assays.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking compound effects to early neurodevelopmental outcomes in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantifiable outputs via in-situ hybridization for neural markers, enabling dose-response assessment.
- Operational Value: Establishes a reproducible platform for screening compound libraries for neural inducing or inhibitory activity.
- Scalability: Supports adaptation to multi-well formats for medium-throughput evaluation of bioactive molecules.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Connects discovery-phase mechanism to preclinical models by validating effects on conserved neural induction pathways.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from on-target modulation of neural inducers versus off-target toxicity.
- Predictive Continuity: Supports advancement decisions by demonstrating target engagement in a physiological embryonic context.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, informing lead identification by providing functional readouts on neural pathway modulation before commitment to preclinical investment.
- Discovery Biology: Tests mechanistic hypotheses about neural inducers and pathway modulation in a vertebrate embryo.
- Screening: Delivers quantitative, spatially resolved data on neural marker expression to compare compound effects.
- Analytics: Generates measurable outcomes (e.g., marker domain size, intensity) that support statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Establishes biological plausibility for neurodevelopmental effects observed in vitro.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform for evaluating diverse compound classes affecting neural induction.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuroactive compound screening by linking phenotype to developmental mechanism.
- Operational Value: Promotes assay standardization through defined grafting, culture, and detection steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying compounds with unwanted developmental neuroactivity early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by flagging molecules that alter neural induction as potential safety concerns.
Implementation Considerations
- Requires expertise in avian embryology and microsurgical techniques for embryo handling and tissue grafting.
- Dependent on sterile incubation systems, microsurgical tools, and fluorescence or chromogenic detection platforms.
- Necessitates standardized host-donor staging and graft orientation to ensure reproducibility across users.
- Adaptation to non-avian models may require validation of organizer equivalence and neural marker conservation.
- Practical limitations include embryo variability and the need for skilled execution to maintain graft viability and positioning.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Introduction
1:15
Preparing the Host Embryo for New Culture
2:01
Explanting the Donor Embryo in Saline
3:00
Labeling, Excising and Transplanting the Donor Graft
5:29
Securing the Graft and Culturing the Host Embryo
6:56
Photooxidise the Graft Under Fluorescence and Follow with Embryo Processing
9:21
Representative Results/Outcome
10:35
Conclusion
