Why is solid phase synthesis better than traditional multi-step synthesis?

Solid phase synthesis improves overall yield by eliminating intermediate purification steps. Since the product remains bound to the solid support throughout synthesis, solution-phase reagents, solvents, and byproducts can be washed away without isolating each intermediate product. This streamlined approach saves time and increases efficiency in synthesizing oligomers and polymers.

What role do protecting groups play in solid phase synthesis?

Protecting groups are functional groups that remain unreactive during specific synthesis steps, ensuring monomers bind to the correct atom. Each monomer requires two binding sites but only one can be available at a time. Protecting groups are removed through deprotection, converting them back to reactive functional groups and allowing the next monomer to attach in the correct sequence.

How does the Kaiser test verify successful deprotection in peptide synthesis?

The Kaiser test detects amine groups present on resin beads after deprotection. When heated with Kaiser reagent solutions, a dark blue to purple color indicates complete deprotection and the presence of free amine groups. If coupling has occurred successfully, the beads turn yellow, showing no amine groups remain available for further reaction.

What are the main steps in solid phase peptide synthesis?

Solid phase peptide synthesis involves binding an amino acid to resin, then repeatedly deprotecting the amine group, coupling the next amino acid using a coupling agent, and washing away byproducts. After all amino acids are added in sequence, the peptide is cleaved from the resin with cleavage solution and purified. This cyclical process ensures amino acids attach in the correct order.

How is solid phase synthesis applied in combinatorial chemistry?

In combinatorial chemistry, loaded resin is split into portions that react with different monomers or molecules. After each reaction, portions are washed and recombined, repeating until many product variants are generated. This technique is valuable in pharmaceutical research for synthesizing new compounds and evaluating how a compound reacts with diverse molecules efficiently.

Why is solid phase synthesis particularly useful for synthesizing oligosaccharides?

Oligosaccharides require monomers in correct order and bonds with precise stereochemistry. Solid phase synthesis techniques enable highly stereoselective coupling of each sugar monomer, controlling stereochemistry at each bond. These methods are refined enough to be automated, making solid phase synthesis ideal for producing complex oligosaccharides with biological roles like energy storage.

What happens after the final peptide product is cleaved from the resin?

After cleavage with peptide cleavage solution, the peptide product transfers to a new receiving flask under vacuum. The solvent is then removed using a rotary evaporator to generate the final product. This purification step isolates the synthesized peptide from the resin and other impurities for analysis and characterization.

توليف المرحلة الصلبة

0 views09:42 min

< p class = "jove_title" >1. تحميل الراتنج

إلى وعاء تخليق الببتيد سعة 100 مل ، أضف راتنج 2-كلوروتريتيل كلوريد (CTC) (1.1 مليمول / جم ، 0.360 جم ، 0.400 ملليمول). أضف 20 مل من DMF واتركها تنتفخ لمدة 30 دقيقة تحت N_2.
صفي الخرزات تحت الفراغ وأضيفي 10 مل DMF.
أضف 500 مجم من Fmoc-Ala-OH (1.60 ملليمول) و 2.5 مل i-Pr ₂EtN ، واخلطها تحت N₂ لمدة 15 دقيقة.
قم بتصريف المذيب تحت الفراغ وكرر التحميل باستخدام Fmoc-Ala-OH لمدة 15 دقيقة.
صفي المذيب تحت الفراغ واغسل الخرزات ب 10 مل DMFتحت N₂ ، وصفيها تحت الفراغ 3x.

2. إلغاء حماية مجموعة Fmoc

أضف 10 مل 20٪ 4-ميثيل بيبيريدين في DMF وحرك الخرزات تحت N₂ لمدة 15 دقيقة.
استنزاف المذيب تحت الفراغ وكرر إزالة الحماية.
اغسل الخرزات ب 10 مل DMF تحت N₂ وصفيها تحت الفراغ 3x.

3. إجراء اختبار Kaiser

قم بإجراء اختبار Kaiser عن طريق إضافة 1-2 قطرات من المحلول A (0.5 مل 0.01 M KCN ، 24.5 مل بيريدين) ، المحلول B (1 جم نينهيدرين ، 20 مل n-butanol) ، والمحلول C (20 جم فينول ، 10 مل n-butanol) كل منهما في أنبوبين اختباريين. سيكون أحد أنابيب الاختبار هو التحكم بينما سيراقب الآخر رد الفعل.
أضف بضع حبات من الراتنج من وعاء التفاعل إلى أنبوب اختبار التفاعل وقم بتسخين أنبوبي الاختبار إلى 110 درجة مئوية.
إذا اكتملت إزالة الحماية ، فستتحول محتويات أنبوب الاختبار إلى اللون الأزرق الداكن / الأرجواني. إذا كانت إزالة الحماية غير مكتملة أو فشلت ، فسيظل المحلول أصفر. قارن أنبوب اختبار التفاعل مع أنبوب اختبار التحكم.

4. اقتران اللبنات الأساسية التالية

استنزاف المذيب تحت الفراغ.
اغسل الخرزات ب 10 مل N-methyl-2-pyrrolidone تحت N₂ واستنزف المذيب تحت الفراغ.
لبدء عملية التوصيل التالية ، أضف 10 مل NMP ، و 620 mgFmoc-Phe-OH (1.6 مليمول) ، و 610 مجم HBTU (1.6 مليمول) ، و 2.5 ملi-Pr ₂EtN ، واترك الراتنج يغلي تحت N₂ لمدة 30 دقيقة.
استنزاف المذيب تحت الفراغ.
اغسل الخرزات ب 10 مل DMF تحت N₂ وصفيها تحت الفراغ 3x.
قم بإجراء اختبار Kaiser (انظر الخطوات 3.1-3.3) للبحث عن اكتمال أداة التوصيل. يجب أن تكون الخرزات والمحلول في أنبوب الاختبار صفراء.

< p class = "jove_title" >5. شق الببتيد عن الراتنج

افصل مجموعة Fmoc المتبقية باستخدام الخطوات 2.1-2.3.
بعد تصريف المذيب تحت الفراغ ، أضف 40 مل من محلول الانقسام (95٪ TFA ، 2.5٪ H₂O ، 2.5٪ TIPS) إلى الراتنج والفقاعة تحت N₂ لمدة 3 ساعات.
ضع قارورة استقبال جديدة على مركب الببتيد وقم بتصريف محلول TFA الذي يحتوي على الببتيد المطلوب تحت الفراغ في القارورة الجديدة.

< p class = "jove_title" >6. هطول الأمطار وأنا عزل الببتيد

افصل محلول TFA إلى 4 قوارير مخروطية وأضف 25 مل من الأثير البارد (-20 درجة مئوية) إلى كل قارورة لترسيب الببتيد.
الطرد المركزي للقوارير (3,000 دورة في الدقيقة ، 0-4 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة. قم بصب محلول TFA والأثير المتبقي من القوارير المخروطية وتركيز راسب الببتيد لتحمل ثنائي الببتيد المطلوب كمادة صلبة بيضاء.

تخليق الطور الصلب هو طريقة يتم فيها تصنيع المنتج أثناء ربطه بمادة غير قابلة للذوبان.

غالبا ما يستخدم تخليق الطور الصلب لإنتاج أوليغومرات وبوليمرات بيولوجية مثل الببتيدات والأحماض النووية وسكريات قليلة السكاريد. تتكون هذه الجزيئات من سلاسل من وحدات فرعية جزيئية أصغر ، تسمى المونومرات. يستغرق تصنيع القلة أو البوليمر العديد من الخطوات ، حيث يجب إضافة المونومرات بالترتيب الصحيح.

تتمثل إحدى المشكلات المتعلقة بالتوليفات متعددة الخطوات في أن تنقية وعزل المنتجات المستقرة لكل خطوة ، والتي تسمى المنتجات الوسيطة ، يقلل من العائد الإجمالي. في تخليق الطور الصلب ، يظل المنتج الوسيط مرتبطا بالدعم الصلب طوال فترة التوليف. يسمح ذلك بغسل الكواشف والمذيبات والمنتجات الثانوية في مرحلة المحلول ، مما يلغي الحاجة إلى تنقية وعزل كل منتج وسيط بين الخطوات.

سيوضح هذا الفيديو إجراء تخليق الببتيد في الطور الصلب ويقدم بعض تطبيقات تخليق الطور الصلب في الكيمياء.

في تخليق الطور الصلب ، يتم تصنيع جزيء على دعامة صلبة في سلسلة من التفاعلات. على سبيل المثال ، سيتم تصنيع قلة أو بوليمر مونومر واحد في كل مرة لتشكيل المنتج النهائي. يظل القلة أو البوليمر المتنامي مرتبطا بقوة بالدعم الصلب حتى يتم فصله أو شقه عن الدعم باستخدام الكواشف.

يجب أن يحتوي كل مونومر على موقعين على الأقل للربط ليكون جزءا من سلسلة البوليمر ، ولكن يمكن أن يتوفر موقع ربط واحد فقط في كل مرة لضمان ارتباط المونومر بالذرة الصحيحة. يتم تحقيق ذلك من خلال مجموعات الحماية ، وهي مجموعات وظيفية غير متفاعلة خلال خطوة واحدة أو أكثر من خطوات التوليف. تتم استعادة موقع الربط أو إزالته من خلال معالجة الجزيء بكواشف محددة لتحويل المجموعة الواقية إلى مجموعة وظيفية تفاعلية.

لبدء تخليق الطور الصلب ، ترتبط مادة البداية براتنج مصمم خصيصا أو بوليمر غير قابل للذوبان في موقع الربط الوحيد المتاح. بعد ذلك ، يتم إلغاء حماية مادة البداية المقيدة للسماح بربط المونومر الثاني في السلسلة. بعد ذلك ، تتم إضافة محلول المونومر الثاني في السلسلة ، جنبا إلى جنب مع عامل اقتران لتسهيل الترابط بين المونومرات.

بمجرد أن يرتبط المونومر الثاني بمادة البداية ، يتم إزالة الحماية من المنتج الوسيط الثنائي الناتج. تتكرر هذه العملية حتى يتشكل القلة أو البوليمر المستهدف. يتم شق المنتج من الدعامة الصلبة إلى محلول ، والذي يمكن من خلاله تنقيته وعزله وتحليله.

غالبا ما يستخدم تخليق الطور الصلب لتخليق الببتيدات ، وهي سلاسل من الأحماض الأمينية. تحتوي الأحماض الأمينية على مجموعة أمين ومجموعة كربوكسيل وبديلة أو "سلسلة جانبية". الأمين محمي في البداية. بمجرد إزالة الحماية ، يشكل الأمين رابطة ببتيد مع مجموعة الكربوكسيل من الحمض الأميني التالي.

الآن بعد أن فهمت مبادئ تخليق الطور الصلب ، دعنا ننتقل إلى إجراء تخليق الببتيد في الطور الصلب ، حيث سنوضح إضافة أول اثنين من الأحماض الأمينية.

لبدء الإجراء ، قم بتوصيل قارورة استقبال للنفايات بوعاء تخليق الببتيد اليدوي سعة 100 مل. ثم ضع 0.360 جم من راتنج كلوريد 2-كلوروتريتيل في الوعاء. قم بتوصيل خط غاز النيتروجين بالسلاح الجانبي للوعاء وخط تفريغ بمحول الخرطوم المسنن.

أضف 20 مل من ثنائي ميثيل فورماميد إلى الراتنج واترك حبات الراتنج تنتفخ لمدة 30 دقيقة تحت تدفق غاز النيتروجين. ثم ضع الفراغ لتصريف المذيب.

أضف 10 مل من DMF ، و 1.6 مليمول من الأحماض الأمينية المحمية ب Fmoc ، و 2.5 مل من N ، N-diisopropylethylamine إلى الوعاء. فقاعات تحت غاز النيتروجين ، الذي يمزج المحلول ، لمدة 15 دقيقة لتحميل الحمض الأميني المحمي على الراتنج.

قم بإزالة المذيب تحت الفراغ وقم بإجراء التحميل الثاني. بعد إزالة المذيب ، قم بتحريك حبات الراتنج المحملة ثلاث مرات في أجزاء سعة 10 مل من DMF ، وتصريف كل غسلة في قارورة الاستقبال.

بعد ذلك ، أضف إلى الخرزات المحملة 10 مل من محلول 20٪ من 4-ميثيل بيبيريدين في DMF. ضعي الخليط لمدة 15 دقيقة لإزالة مجموعة Fmoc.

استنزاف المذيب وكرر إجراء إزالة الحماية. اغسل وصفي الراتنج المحمل ثلاث مرات كما كان من قبل. قم بتخزين الخرزات تحت مذيب حتى تصبح جاهزة للخطوة التالية.

للتحقق من أن المركب المحمل قد تم إزالته تماما ، ضع أولا 1 إلى 2 قطرات من كل محلول اختبار Kaiser في أنبوبين اختباريين.

ضع بعض الخرزات المحملة في أنبوب اختبار وقم بتسخين كلا الأنبوبين إلى 110 درجة في حمام الزيت. تكتمل إزالة الحماية إذا تحول خليط الراتنج إلى اللون الأزرق الداكن إلى الأرجواني ، مما يشير إلى وجود مجموعات أمين في الخليط.

لبدء خطوة الاقتران ، اغسل الخرزات أولا ب 10 مل من NMP تحت تدفق غاز N2.

بعد ذلك ، أضف 10 مل من NMP ، و 1.6 مليمول من الحمض الأميني التالي المحمي بواسطة Fmoc ، و 1.6 مليمول من عامل التوصيل HBTU ، و 2.5 مل من DIPEA إلى الراتنج المحمل.

غاز فقاعة N2 من خلال خليط الراتنج لمدة 30 دقيقة ، ثم استنزاف المذيب. اغسل وصفي الخرزات بأجزاء 10 مل من DMF ثلاث مرات ، كما كان من قبل.

كرر اختبار Kaiser. حدث الاقتران بنجاح إذا تحولت الخرزات والمحلول إلى اللون الأصفر ، مما يشير إلى عدم وجود مجموعات أمين.

بعد ذلك ، قم بشق مجموعة Fmoc الجديدة بنسبة 20٪ 4-methylpiperidine في DMF واغسل الخرزات بأجزاء 10 مل من DMF. كرر الاقتران وإزالة الحماية لكل حمض أميني متبقي في الببتيد المستهدف.

بعد إزالة الحماية من الأحماض الأمينية الأخيرة وغسل حبات الراتنج ، أضف 40 مل من محلول انقسام الببتيد لفصل منتج الببتيد عن الراتنج.

فقاعة غاز النيتروجين من خلال خليط الراتنج لمدة 3 ساعات ، ثم استبدل قارورة الاستقبال. انقل المحلول من خليط الراتنج إلى قارورة الاستقبال الجديدة تحت الفراغ.

لتوليد المنتج النهائي ، قم بإزالة المذيب باستخدام مبخر دوار.

يستخدم تخليق الطور الصلب على نطاق واسع في علم الأحياء والكيمياء. دعونا نلقي نظرة على بعض الأمثلة.

فتح تخليق الطور الصلب العديد من المسارات الاصطناعية الجديدة لقليل السكاريد ، وهي سلاسل قصيرة من مونومرات السكر البسيطة ذات الأدوار البيولوجية المهمة ، مثل تخزين الطاقة. على عكس روابط الببتيد ، تحتوي كل رابطة بين السكريات على مركز مجسم. لتصنيع السكريات قليلة السكاريد ، لا يجب أن تكون المونومرات بالترتيب الصحيح فحسب ، بل يجب أن تحتوي الروابط أيضا على الكيمياء الفراغية الصحيحة. تم تطوير تقنيات تخليق الطور الصلب لإقران كل مونومر بعملية انتقائية مجسمة للغاية ، والتي يتم تكريرها اليوم بما يكفي لتكون مؤتمتة.

تخليق الطور الصلب هو نهج شائع للكيمياء التوافقية ، وهي ممارسة تصنيع العديد من المتغيرات للمركب في عملية اصطناعية واحدة. يمكن بسهولة تقسيم الراتنج المحمل إلى أجزاء للتفاعل مع مونومرات أو جزيئات مختلفة. بعد كل تفاعل ، يتم غسل الأجزاء وإعادة تجميعها. يتكرر هذا حتى يتم إنشاء العدد المطلوب من المنتجات. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص في الأبحاث الصيدلانية ، حيث يمكن استخدامها لتوليد مركبات جديدة أو لتقييم تفاعل مركب مع مجموعة واسعة من الجزيئات.

class = "chapter_text" id = "script_5">

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لتوليف الطور الصلب. يجب أن تفهم الآن المبادئ الأساسية لتخليق الطور الصلب ، وإجراء تخليق الببتيد في الطور الصلب ، وبعض الأمثلة على كيفية استخدام تخليق الطور الصلب في الكيمياء العضوية. شكرا للمشاهدة!