Name: كشف وعزل خلايا T ماوس قابلة للحياة IL - 17 - الإخفاء (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: اكتشف طريقة عزل وكشف خلايا TH17 الفأرية المفرزة لـ IL-17 باستخدام تقنية اصطياد السيتوكين. تُحسّن هذه الطريقة دقة تحليل الاستجابات المناعية والالتهابات الذاتية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

إعداد الكواشف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل العازلة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة (0.5 ٪) ، و 2 EDTA ملم. لأن فقاعات الهواء يمكن أن تسد أعمدة الفصل MACS ، ويجب أن يكون المخزن وتخزينها في degassed 2-8 درجة مئوية قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم RPMI 1640 تحتوي على 5 ٪ متوسطة المصل الماوس. يجب أن لا يحتوي على مستنبت BSA أو FCS ، وهذه المركبات سوف يغير من خصوصية تحفيز الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وIL - 17 الفحص إفراز ماوس -- إثراء الخلية والكشف عن مجموعة من Miltenyi - بيوتيك. طقم يحتوي على العناصر التالية : وIL - 17 الكاشف الصيد ، وIL - 17 جسم كشفها (البيوتين) والمضادة للبيوتين PE ، وMicroBeads مكافحة PE. </li></ol> تحفيز Splenocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنفيذ هذا البروتوكول في وجود سيطرة السلبية والإيجابية ، مثل splenocytes unstimulated وملون مباين للخلايا T. ويتم هذا البروتوكول خارج باستخدام تقنية معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعليق خلية واحدة من الماوس splenocytes التي كانت معزولة باستخدام Dissociator ™ gentleMACS. وينبغي تركيز محدد سلفا من الخلايا عن طريق العد الخلية. بيليه في الخلايا ز × 200 لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي ، ونضح طاف بيليه قبالة باستخدام ماصة. لا صب الأنبوب لتجنب فقدان بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن ، resuspend الخلايا في مستنبت ثم إضافة إلى البئر. إضافة المتوسطة كافيا لتركيز عشرة ملايين خلية لكل مليلتر وخمسة ملايين الخلايا لكل سم مربع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحفيز استجابة مناعية في خلايانا معلق ، ونضيف إلى ionomycin (1 ميكروغرام / مل) ، وسلطة النقد الفلسطينية (10 نانوغرام / مل) على عينة والحل عن طريق مزيج pipetting بلطف صعودا وهبوطا. ثم وصفت الآبار تبعا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن ، فإننا سوف احتضان خلايانا لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية مع عدم وجود خلط لبدء فترة التحفيز. انتقل إلى IL - 17 3 ساعات من بداية التحليل من التحفيز ، والتخطيط لذلك وفقا لذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوقف إفراز ، وتوضع الخلايا على الجليد ونقوم بجمع الخلايا يحفزه pipetting بلطف صعودا ونزولا مع العازلة الباردة. ثم يتم نقل الخلايا من البئر إلى الأنبوب ويتم غسلها للمرة الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضمان أن يتم جمع كافة الخلايا ، انها فكرة جيدة للتحقق من الطبق الخاص بك تحت المجهر. إذا الخلايا لا تزال المرفقة ، يمكنك جمع الخلايا المتبقية وذلك بدهن الطبق مع العازلة الباردة. ويمكن إزالة أي كتل الخلايا في خلية التعليق الخاص باستخدام مرشحات قبل الانفصال. </li></ol> وسم خلايا الكاشف مع الصيد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من الأهمية بمكان أن نلاحظ أن هذا الفحص يعمل بشكل أمثل إذا كانت أقل من 2 ٪ من IL - 17 - إفراز خلايا موجودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان من المتوقع أن تركيز خلايا إفراز IL - 17 لتكون أكبر من 2 ٪ ضبط كميات تبعا لذلك. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="الشكل 8" width="500" height="162" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شرك واحد المحتملة من هذا الإجراء هو من التلوث عبر الكاشف الصيد ، والتي يمكن أن تحدث أثناء وضع العلامات عند الأضداد ثنائية محددة تربط إلى خلية T غير إفراز والفخاخ IL - 17 يفرز من الخلايا اللمفاوية المجاورة ، وبالتالي توليد ايجابيات كاذبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل الالتفاف على هذه المشكلة ، من المهم جدا أن الخلايا يبرد قبل وضع العلامات والعمل مع العازلة الباردة لابطاء انتشار IL - 17 ، وتجنب هذا التلوث عبر. بالإضافة إلى الحفاظ على الخلايا الباردة ، يجب أن تظل عند تركيز محدد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للبدء في إجراءات وضع العلامات ، ونحن نستخدم 10000000 الخلايا في أنبوب 15 مل محكمة السد. إذا كانت أرقام أعلى الخلية لا بد من استخدامها ، ببساطة مقياس كافة وحدات التخزين وفقا لذلك. بمجرد الحصول على تركيز خلية المثلى ، وغسل الخلايا من خلال إضافة 10 مل من العازلة الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار في خلايا 300 × ز لمدة 10 دقيقة في أجهزة الطرد المركزي المبردة (2-8 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي ، وطاف به نضح تماما ماصة. لا صب وطاف لأن ذلك سيؤدي الى فقدان الخلية وأحجام غير دقيقة. كرر الخطوة الغسيل الذي يتكون من إضافة 10ML العازلة من البرد ، الطرد المركزي ، والطموح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن أن لدينا بيليه من النقاء المطلوب ، resuspend الخلايا في 80 ميكرولتر من مستنبت الباردة. لتسمية لهم ، وسوف نضيف الآن 20 ميكرولتر من IL - 17 ماوس الكاشف الصيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة حضانة المرض 5 دقائق على الجليد ، وإزالة الأنبوب وتمييع الخلايا في 10 مل من 37 درجة مئوية المتوسط ​​الدافئة. ثم تأمين أنبوب على أنبوب MACSmix الدوار واحتضان الأنبوب في 37 دقيقة لمدة 45 حركة مستمرة تحت درجة مئوية. زيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية وسوف تبدأ إعادة إفراز خلوى. </li></ol> وسم مع خلايا جسم الكشف IL - 17 (البيوتين) والمضادة للبيوتين PE - <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة 45 دقيقة في إفراز درجة مئوية 37 ، وضع أنبوب فورا على الجليد. سوف يتوقف هذا إفراز خلوى. من هنا على أنه أمر حاسم للحفاظ على الخلايا على الجليد.وسوف تعمل مع العازلة الباردة تجنب التلوث عبر الكاشف للصيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تملأ أنبوب مع العازلة الباردة والطرد المركزي في 300xg في 2-8 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. وطاف نضح تماما. تكرار غسل خطوة واحدة الى مزيد من الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو بيليه معلق الخلية في 80 ميكرولتر من المخزن البارد ويوضع أنبوب على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجنب ملزم غير محدد من الأجسام المضادة ، نوصي إضافة الكاشف FCR 10μl الحظر واحتضان على الجليد لمدة 5 دقائق. ثم نضيف 20 ميكرولتر من IL - 17 جسم الفأر كشفها (البيوتين) التي يتم مترافق لالبيوتين واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة أخرى ، وغسل الخلايا كما فعلنا قبل ذلك بإضافة 10 مل من البرد وعازلة في اجهزة الطرد المركزي في 300xg 2-8 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الآن وطاف بيليه resuspend في الخلية في 80 ميكرولتر من العازلة الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من الأجسام المضادة لدينا الثانوي ، نظام مضاد للبيوتين - PE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خليط الخلايا والثانوية حل الأضداد ، واحتضان الأنبوب مرة أخرى لمدة 10 دقائق على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة هذا الاحتضان الثانية كاملة ، يغسل خلايا العازلة مع 10 مل من البرد وأجهزة الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن الآن أن بيليه معلق في 500 ميليلتر من العازلة الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الخلايا يجب أن تكون مفصولة عن مزيد من التحليل المصب ، يمكن أن يسمى مغناطيسيا مع مكافحة PE - MicroBeads وفصلها يدويا أو آليا باستخدام MACS الأعمدة وفواصل MACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكملنا الآن وضع العلامات من splenocytes ونحن على استعداد للتحليل. </li></ol> تحليل FACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليلنا ، سوف نقوم بمقارنة splenocytes حفز وunstimulated بواسطة التدفق الخلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تحليل تدفق cytometric ، ملطخة الخلايا مع يوديد propidium عند 0.5 ميكروغرام / مل إلى بوابة الخروج الخلايا الميتة. تم تحميل محلل ™ MACSQuant مع 200،000 الخلايا لكل عينة ، ونحن الآن بصدد النظر في المؤامرات مبعثر من تفاعل الأضداد النسبي في العينات. اثنين من الاعتبارات الهامة لتحليل الخلايا نادرة -- مثل IL - 17 خلايا ايجابية -- من التدفق الخلوي هي : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بوابة على الخلايا الليمفاوية في الأمام مقابل مبعثر الجانب مؤامرة مبعثر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتبوب من الخلايا الميتة (ملطخة يوديد propidium) والخلايا البائية (التي قد تتسبب في تلوين الخلفية غير محددة) لزيادة تعزيز حساسية الكشف </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدمنا CD4 - APC الضد للكشف عن الخلايا التائية والأضداد CD45R/B220-PerCP للكشف عن خلايا B. نرى خصائص مبعثر إلى الأمام والجانب من العينات وتطبيق البوابة على السكان لمفاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم تطبيق بوابة ثانية لرؤية الخلايا الميتة والخلايا الملون ب الملون (Y المحور). ويستثنى من هذه الخلايا لتحليل الخلايا التائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في هذا المثال ، الذي هو أساسا سيطرتنا سلبية ، يمكننا أن نرى أن هناك IL - 17 CD4 إفراز الإيجابية القليلة جدا في عينات خلايا T unstimulated -- نحو 0.003 ٪ (الشكل 4). أبحث في السكان حفز خلايا T ، يمكننا أن نرى عددا كبيرا من الخلايا التائية CD4 الإيجابية التي تفرز IL - 17 -- نحو 0.367 ٪ (الشكل 5A) قبل الانفصال و60.76 ٪ بعد الفصل المغناطيسي مع تقنية MACS (الشكل 5B). </li></ol>

كافة البروتوكولات وصحائف البيانات متوفرة في www.miltenyibiotec.com. تحذيرات الكواشف تحتوي على أزيد الصوديوم. في ظل الظروف الحمضية أزيد الصوديوم حمض hydrazoic الغلة ، وهي سامة للغاية. وينبغي أن تضعف المركبات آزيد مع الماء الجاري قبل رميه. وأوصت هذه الاحتياطات لتجنب الودائع في السباكة حيث ظروف متفجرة قد تتطور.

TH17 الخلايا تلعب دورا أساسيا في الحصانة التكيف والاستجابة الالتهابية وتشكل عنصرا رئيسيا في التهاب القيادة الذاتية. يوثق هذا الفيديو كيفية استخدام الماوس في Miltenyi IL - 17 الفحص إفراز -- إثراء الخلية وكيت كشفها (PE). عندما تفعل هذا الإجراء أنه من المهم أن يكون هناك تقدير وتيرة IL - 17 - إفراز الخلايا في إعداد الخاص خلية البداية. تركيز الخلية المناسبة خلال فترة الوسم وخلوى إفراز يمنع التلوث عبر خلايا أخرى في نظام التعليق الخاص ويضمن نتائج موثوقة.

<table><tbody><tr><td>طقم إثراء وكشف الخلايا المفرزة لـ IL-17 في الفئران (PE) </td><td>الكاشف</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;رابط href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>الوسط</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;أجهزة التحكم في درجة الحرارة، تحليل التدفق الخلوي، عزل الخلايا، السيتوكينات، خلايا الطحال، IL-17، MACS Cytokine Secretion Assay، PMA/ionomycin، كاشف الالتقاط (Catch Reagent)، الأجسام المضادة ثنائية الخصوصية، CD45، البيوتين، PE، MicroBeads&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>الكاشف</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;أداة ربط تشعبية (href)&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>الكاشف</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>محلول يوديد البروبيديوم</td><td>الكاشف</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;تتيح تقنية MACS Cytokine Secretion Assay الكشف عن السيتوكينات المفرزة على مستوى الخلية الواحدة، والعزل الحساس للخلايا الحية المفرزة للسيتوكينات. ولوسم الخلايا المفرزة لـ IL-17، يتم تحضير معلق خلوي أحادي من الخلايا الطحالية للفئران وتحفيزها عند درجة حرارة 37 مئوية باستخدام PMA/ionomycin لتحفيز إفراز السيتوكين. ولإيقاف الإفراز، توضع الخلايا بعد ذلك على الثلج وتعرض لكاشف IL-17 Catch Reagent، وهو جسم مضاد ثنائي الخصوصية يرتبط بـ CD45 على سطح خلايا الكريات البيضاء، وبـ IL-17 أثناء إفرازه والتقاطه بالقرب من سطح الخلية. ثم يتم استئناف الإفراز عن طريق رفع درجة الحرارة إلى 37 مئوية، حيث يتم احتجاز IL-17 بواسطة كاشف Catch Reagent. بعد ذلك، يتم إيقاف الإفراز مرة أخرى بوضع الخلايا على الثلج. وللكشف عن IL-17 المحتجز، تُحضن الخلايا مع جسم مضاد ثانٍ متخصص في IL-17 مقترن بالبيوتين وجسم مضاد Anti-Biotin-PE. يمكن الآن تحليل الخلايا مباشرة عن طريق قياس التدفق الخلوي، أو تحضيرها للعزل والإثراء من خلال الوسم اللاحق باستخدام MicroBeads المقترنة بـ Anti-PE.&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>كاشف حجب مستقبلات Fc، للفئران </td><td>الكاشف</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;رابط لـ&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>طقم إزالة الخلايا الميتة </td><td>الكاشف</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>جهاز تدوير أنابيب MACSmix</td><td>الجهاز</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;رابط href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; جهاز تفكيك الأنسجة</td><td>الجهاز</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;رابط href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>طقم بدء التشغيل autoMACS Pro</td><td>الجهاز</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;رابط لـ&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>أعمدة MACS</td><td>أداة</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;أداة الربط التشعبي (href)&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>فاصل MACS</td><td>أداة</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

كشف وعزل خلايا t ماوس قابلة للحياة il - 17 - الإخفاء

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

إفراز سايتوكاين MACS تكنولوجيا الفحص يتيح الكشف عن السيتوكينات يفرز على مستوى خلية واحدة وعزل الخلايا الحساسة للخلوى - إفراز قابلة للحياة. من أجل تسمية IL - 17 - إفراز الخلايا ، تعليق خلية واحدة من الماوس splenocytes مستعدة وحفزت على 37 درجة مئوية مع سلطة النقد الفلسطينية / ionomycin للحث على إفراز خلوى. لوقف إفراز الخلايا ثم توضع على الجليد ويتعرضون إلى IL - 17 الكاشف قبض على الضد ثنائية محددة يمكن أن تتحد مع CD45 الموجودة على سطح خلية من الكريات البيض وIL - 17 كما أنها تفرز واشتعلت بالقرب من سطح الخلية. ومن ثم إعادة إفراز بدأت عن طريق زيادة درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية و هي المحاصرين IL - 17 التي الكاشف الصيد. ثم توقف إفراز مرة أخرى ، عن طريق وضع الخلايا على الجليد. للكشف عن IL - 17 المحاصرين ، يتم تحضين الخلايا مع IL - 17 - second محددة الضد مترافق لالبيوتين والأجسام المضادة لمكافحة البيوتين - PE. ويمكن الآن أن تحلل الخلايا مباشرة من التدفق الخلوي أو المعدة لتخصيب اليورانيوم بحلول العزلة ووضع العلامات اللاحقة مع مكافحة PE MicroBeads مترافق.

يصف هذا الإجراء كشف وعزل كريات الدم البيضاء التي تفرز TH17 الماوس بنشاط IL - 17 على التحفيز.

كشف وعزل خلايا T ماوس قابلة للحياة IL - 17 - الإخفاء

تتيح تقنية MACS Cytokine Secretion Assay الكشف عن السيتوكينات المفرزة على مستوى الخلية الواحدة والعزل الحساس للخلايا الحية ...

تتيح تقنية مقايسة إفراز السيتوكينات القصوى (max Cytokine secretion assay) الكشف عن السيتوكينات المفرزة على مستوى الخلية الواحدة، والعزل الحساس للخلايا الحية المفرزة للسيتوكينات من أجل وسم الخلايا المفرزة لـ IL 17. يتم تحضير معلق من الخلايا المفردة لكريات الدم البيضاء لدى الفأر وتحفيزها عند 37 degrees Celsius باستخدام PMA ion mycin لتحفيز إفراز السيتوكينات، ثم يتم إيقاف الإفراز. بعد ذلك، توضع الخلايا على الثلج حيث يتم تعريضها لكاشف التقاط IL 17.بمجرد إعادة بدء الإفراز عن طريق رفع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، يتم حجز IL 17 بواسطة كاشف الالتقاط. حيث يرتبط جسم مضاد ثنائي التخصص بـ CD 45 على سطح خلايا الكريات البيضاء وبـ IL 17 أثناء إفرازه والتقاطه بالقرب من سطح الخلية. ثم يتم إيقاف الإفراز مرة أخرى عن طريق وضع الخلايا على الثلج للكشف عن IL 17 المحتجز. تُحضن الخلايا مع جسم مضاد ثانٍ متخصص في IL 17 مقترن بالبيوتين، وجسم مضاد للبيوتين مقترن بـ PE. يمكن الآن تحليل الخلايا مباشرة عن طريق قياس التدفق الخلوي، أو تحضيرها للعزل والإثراء من خلال وسم لاحق بخرزات دقيقة مقترنة بـ anti PE. مرحباً، اسمي إيلي رانكين، إحدى العالمات في شركة Mill Tenney Biotech.سأعرض لكم اليوم إجراءً حول كيفية عزل وكشف كرات الدم البيضاء من نوع TH 17، والتي تفرز IL 17 عند تحفيزها. يلعب IL 17 دوراً هاماً في المناعة التكيفية والاستجابة الالتهابية، كما أنه مهم في تحفيز الالتهابات ذاتية المناعة. لذا، دعوني أوضح لكم كيفية إجراء هذا الاختبار. بالنسبة لبروتوكول اليوم، نحتاج أولاً إلى تحضير محلول منظم يحتوي على PBS مع BSA و 2 millimolar EDTA؛ ونظراً لأن الفقاعات الهوائية يمكن أن تسد أعمدة فصل max، يجب إزالة الغازات من المحلول المنظم وتخزينه في درجة حرارة من 2 إلى 8 °C قبل الاستخدام.ثانياً، نستخدم وسط RPMI 1640 الذي يحتوي على 5% مصل فأر. يجب ألا يحتوي وسط الزرع على BSA أو FCS لأن هذه المركبات ستغير من خصوصية تحفيز الخلايا. وأخيراً، ستحتاج إلى طقم إثراء وكشف خلايا مقايسة إفراز mouse IL 17 من شركة MIL 10 E Biotech.تحتوي المجموعة على المكونات التالية: كاشف التقاط IL 17، والأجسام المضادة للكشف عن IL 17، والبيوتين، والـ anti biotin pe، والـ anti PE microbeads. ومن الناحية المنطقية، من المرجح أن تقوم بتنفيذ هذا البروتوكول باستخدام ضابط سلبي وآخر إيجابي، مثل خلايا PLE غير المحفزة، وصبغة متباينة للخلايا التائية. وسنركز في عرضنا التوضيحي على الخلايا المحفزة فقط.سيتم تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام تقنية التعقيم. يبدأ البروتوكول الخاص بنا بمعلق خلوي مفرد من خلايا الطحال (SP cytes) للفئران، والتي تم عزلها باستخدام جهاز gentle max associator. يجب تحديد تركيز الخلايا مسبقاً عن طريق عد الخلايا.يتم ترسيب الخلايا عند 200 Gs لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد عملية الطرد المركزي، نقوم بشفط السائل الطافي بعيداً عن الراسب باستخدام ماصة. يجب عدم سكب محتويات الأنبوب لتجنب فقدان الراسب. الآن، يجب إعادة تعليق الخلايا في وسط الزرع الخاص بنا، ثم إضافتها إلى البئر، مع إضافة وسط كافٍ لتحقيق تركيز 10 million cells per milliliter و 5 million cells per square centimeter.لتحفيز الاستجابة المناعية في الخلايا المعاد تعليقها، نضيف ion mycin و PMA إلى العينة ونمزج المحلول عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام الماصة. بعد ذلك، يتم تسمية الآبار وفقاً لذلك. الآن سنقوم بتحضين العينة لمدة ثلاث ساعات عند 37 °C دون خلط لبدء فترة التحفيز.انتقل إلى تحليل IL 17 بعد ثلاث ساعات من بدء التحفيز. لذا خطط وفقاً لذلك. نرى هنا خلايا طحال الفأر المحفزة.يرجى ملاحظة المورفولوجيا المتميزة والتكتل الخلوي للخلايا المحفزة. ولغرض الوضوح، سنتابع الخلايا المحفزة فقط. ومن هنا، ومن أجل إيقاف الإفراز، نقوم بجمع الخلايا المحفزة عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام الماصة.بعد ذلك، تُنقل الخلايا من البئر إلى أنبوب باستخدام محلول منظم بارد وتُغسل للمرة الثانية. ولضمان جمع كافة الخلايا، يُنصح بفحص الطبق تحت المجهر؛ فإذا ظلت بعض الخلايا ملتصقة، يمكن جمع الخلايا المتبقية عن طريق شطف الطبق.باستخدام محلول منظم بارد، يمكن إزالة أي تكتلات خلوية في معلق الخلايا باستخدام مرشحات ما قبل المشاركة. ومن العثرات المحتملة في هذا الإجراء حدوث تلوث تبادلي لكاشف الالتقاط، والذي قد يحدث أثناء عملية الوسم. فعندما يرتبط الجسم المضاد ثنائي التخصص بخلية تائية غير مفرزة ويحبس IL 17 المفرز من خلية لمفاوية مجاورة، فإن ذلك يؤدي إلى ظهور نتائج إيجابية كاذبة. ولتجنب هذه المشكلة، من الضروري تبريد الخلايا قبل الوسم والعمل باستخدام محلول منظم بارد للحد من الإفراز وإبطاء انتشار IL 17 وتجنب هذا التلوث التبادلي.من الضروري ملاحظة أن التلوث الخلطي يمكن أن يحدث أيضاً إذا كانت نسبة الخلايا المفرزة لـ IL 17 تزيد عن 2%. إذا كان من المتوقع أن يكون تركيز الخلايا المفرزة لـ IL 17 أكبر من 2%، فيجب تعديل الأحجام وفقاً لذلك. لذا، وبالإضافة إلى الحفاظ على برودة الخلايا، يجب الحفاظ عليها بتركيز محدد.لبدء إجراء الوسم، نستخدم 10 مليون خلية في أنبوب قابل للإغلاق سعة 15 ملليلتر. في حال الحاجة لاستخدام أعداد أكبر من الخلايا، يتم ببساطة زيادة جميع الأحجام وفقاً لذلك. وبمجرد الحصول على تركيز الخلايا الأمثل، تُغسل الخلايا بإضافة 10 ملليلتر من المنظم البارد.قم الآن بطرد الخلايا مركزياً بسرعة 300 Gs لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي مبرد، وبعد انتهاء عملية الطرد المركزي، اسحب السائل الطافي تماماً باستخدام ماصة. لا تقم بسكب السائل الطافي لأن ذلك سيؤدي إلى فقدان الخلايا وعدم دقة الأحجام. كرر خطوة الغسيل التي تتكون من إضافة 10 milliliters من المنظم البارد ثم الطرد المركزي والسحب.بعد الحصول على راسب بالنقاوة المطلوبة، أعد تعليق الخلايا في أي عدد من الميكرولترات من وسط استنبات مبرد لتمييزها. سنقوم الآن بإضافة 20 µL من كاشف صيد IL 17 الخاص بالفأر. قم بتحضين الخلايا لمدة خمس دقائق على الثلج.بعد فترة تحضين مدتها خمس دقائق على الثلج، أخرج الأنبوب وقم بتخفيف الخلايا في 10 milliliters من وسط دافئ عند درجة حرارة 37 degrees Celsius. ثم ثبت الأنبوب على جهاز تدوير الأنابيب max mix وحضن الأنبوب عند درجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة 45 دقيقة.في ظل حركة مستمرة، سيؤدي رفع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية إلى استئناف إفراز السيتوكين. وبعد فترة إفراز مدتها 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية، ضع الأنبوب فوراً على الثلج، حيث سيؤدي ذلك إلى إيقاف إفراز السيتوكين.من هذه النقطة فصاعداً، من الضروري الحفاظ على الخلايا مبردة على الثلج. سيؤدي العمل باستخدام محلول منظم بارد إلى تجنب التلوث الخلطي لكاشف الالتقاط. املأ الأنبوب بالمحلول المنظم البارد ثم قم بالطرد المركزي عند 300 Gs في درجة حرارة تتراوح من درجتين إلى ثماني درجات Celsius لمدة 10 دقائق.قم بشفط السائل الطافي تماماً. كرر خطوة الغسيل مرة واحدة أخرى. يتم إعادة تعليق الراسب الخلوي في 80 µL من المنظم البارد ويوضع الأنبوب على الثلج.لتجنب الارتباط غير النوعي للجسم المضاد، نوصي بإضافة 10 µL من كاشف حجب FCR والتحضين على الثلج لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، نضيف 20 µL من الجسم المضاد الكاشف لـ IL 17 الخاص بالفئران والمقترن بالبيوتين، والتحضين لمدة 10 دقائق على الثلج. مرة أخرى، نغسل الخلايا كما فعلنا سابقاً بإضافة 10 mL من المنظم البارد والطرد المركزي بسرعة 300 Gs عند درجة حرارة من 2 إلى 8 °C لمدة 10 دقائق.الآن قم بشفط السائل وإعادة تعليق كتلة الخلايا في 80 µL من المحلول المنظم البارد، ثم أضف 20 µL من الجسم المضاد الثانوي، Anti biotin pe. اخلط الخلايا مع محلول الجسم المضاد الثانوي ثم قم بحضن الأنبوب مرة أخرى لمدة 10 دقائق على الثلج.بمجرد اكتمال فترة الحضن الثانية، اغسل الخلايا باستخدام 10 milliliters من المنظم البارد ثم قم بالطرد المركزي. يمكن الآن إعادة تعليق الراسب في 500 microliters من المنظم البارد. وإذا كان من الضروري فصل الخلايا لإجراء تحليلات لاحقة، فيمكن وسمها مغناطيسياً باستخدام حبيبات مجهرية مضادة لـ PE وفصلها يدوياً أو آلياً باستخدام أعمدة max وفواصل max.لقد انتهينا الآن من وسم خلايا SPLU وباتت جاهزة للتحليل. سنقوم بمقارنة خلايا SP المحفزة وغير المحفزة عن طريق قياس التدفق الخلوي قبل البدء. يتم صبغ الخلايا باستخدام propidium iodide بتركيز 0.5 micrograms per milliliter لاستبعاد الخلايا الميتة.تم تحميل جهاز قياس التدفق الخلوي بـ 200, 000 خلية لكل عينة، وسنلقي نظرة الآن على مخططات التشتت للتفاعل النسبي للأجسام المضادة في العينات. هناك اعتباران مهمان لتحليل الخلايا النادرة مثل الخلايا الموجبة لـ IL 17 عن طريق قياس التدفق الخلوي، وهما تحديد بوابة للخلايا اللمفاوية في مخطط التشتت الأمامي مقابل التشتت الجانبي، واستبعاد الخلايا الميتة المصبوغة بـ propidium iodide والخلايا البائية التي قد تسبب صبغاً خلفياً غير نوعي. وذلك من أجل تعزيز حساسية الكشف بشكل أكبر.نستخدم هنا جسم مضاد CD4 APC للكشف عن الخلايا التائية في الجسم المضاد CD45RB 20 per CP. وللكشف عن الخلايا البائية، نقوم بفحص خصائص التشتت الأمامي والجانبي للعينات ونطبق بوابة (gate) على مجموعة الخلايا اللمفاوية. كما تم تطبيق بوابة ثانية لرؤية الخلايا الميتة المصبوغة والخلايا البائية المصبوغة على المحور Y.تُستبعد هذه الخلايا من تحليل الخلايا التائية. في هذا المثال، والذي يمثل أساساً المجموعة الضابطة السالبة، نلاحظ وجود عدد قليل جداً من الخلايا التائية CD four positive المفرزة لـ IL 17 في العينات غير المحفزة، بنسبة 0.003% تقريباً. وبالنظر إلى مجتمع الخلايا التائية المحفزة، يمكننا رؤية عدد كبير من الخلايا التائية CD four positive التي تفرز IL 17، بنسبة 0.367% تقريباً قبل الفصل، و 60.76% بعد الفصل المغناطيسي باستخدام تقنية max. لقد عرضنا لكم للتو من خلال التوثيق المرئي كيفية استخدام مجموعة kit إثراء الخلايا والكشف عن إفراز mouse IL 17 من شركة mul 10 biotech باستخدام pe.الجزء الأكثر أهمية في هذا الإجراء هو تكوين فكرة عن تردد الخلايا المفرزة لـ IL 17 الموجودة في المجتمع الخلوي البدائي. سيضمن التركيز الخلوي الصحيح تقليل التلوث الخلطي أثناء عملية الوسم وفترة إفراز السيتوكينات، مما يضمن الحصول على نتائج موثوقة. هذا كل شيء.شكراً للمشاهدة مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

detection-and-isolation-of-viable-mouse-il-17-secreting-t-cells

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوضح هذا الفيديو طريقة لعزل الخلايا التائية القاتلة الطبيعية الثابتة ، والمعروفة أيضا باسم خلايا iNKT. يبدأ الإجراء بحقن جليكوليبيد اصطناعي في الفأر لتحفيز تنشيط وتكاثر خلايا iNKT في الطحال. بعد ذلك ، يتم تحضير معلقات أحادية الخلية من الطحال وتحضنها بمجمعات التعرف على خلايا iNKT المسمى بالفلوروفورات ، متبوعة بالفصل القائم على الخرزة المغناطيسية ، لعزل خلايا iNKT.

عزل الخلايا التائية القاتلة الطبيعية الثابتة من نموذج الفأر

مع وظائف المستجيب متميزة عن غيرها فرعية الخلايا التائية والخلايا TH17 قد تورطت مركزيا في المناعة الذاتية للالتهابات. يوفر هذا البروتوكول في المختبر TH17 التمايز وسيلة لتحديد ما إذا كان من السذاجة اللمفاويات CD4 + T يمكن أن تفرق في خلايا TH17، ومواصلة دراسة دورها في المناعة الذاتية والاستجابة المضيف.

العزلة والتمايز TH17 من السذاجة CD4 T الخلايا اللمفاوية

يمثل التحليل في المختبر لإعادة تركيب تبديل الفصل في الفئران أمرا صعبا بسبب جزيئات IgE المحبة للخلايا المرتبطة بمستقبلات Fc على سطح الخلايا البائية.  نصف طريقة للكشف عن IgE باستخدام الانقسام بوساطة التربسين ل IgE المرتبط بالسطح قبل التثبيت والنفاذية لتلوين التألق السيتوبلازمي.

كشف صحيح فريق الخبراء الحكومي الدولي، معربا عن ماوس B خلايا سلالته

خلايا CD4 + T الساذجة تستقطب إلى مجموعات فرعية مختلفة اعتمادا على البيئة في وقت التنشيط.  يمكن تحقيق تمايز خلايا CD4 + T الساذجة إلى مجموعات فرعية مختلفة من المستجيبات في المختبر من خلال إضافة محفزات مستقبلات الخلايا التائية وإشارات السيتوكين المحددة.

الماوس السذاجة CD4<sup&gt; +</sup&gt; عزل T خلية و<em&gt; في المختبر</em&gt; التمايز إلى T مجموعات فرعية خلية

هنا ، نصف بروتوكولا لتحليل النمط الظاهري للخلايا التائية التنظيمية (Treg) المعزولة من الفئران المصابة بفيروس التهاب السحايا المشيمي اللمفاوي الساذج والمزمن. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم عملية لتقييم النشاط القمعي لخلايا Treg.

المظهرية والتحليل الوظيفي من المنشط خلايا تنظيم تي المعزولة من الفئران المصابة بفيروس المزمنة الليمفاوي المشيمي

نصف هنا نموذج فأر مراسل معدل وراثيا لتصور الخلايا المنتجة ل IL-22 داخل أنسجة الفئران المختلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة لتتبع موقع السيتوكينات الأخرى أو بروتينات السكرتير في الفأر.

التصور من الخلايا اللمفاوية معربا-22-IL عن طريق الفئران مراسل

تصف هذه الورقة بروتوكولات تقييم استجابة تفه و GC B في نموذج الماوس للعدوى بفيروس الإنفلونزا.

تقييم T الخلايا المساعدة الجريب و استجابة مركز Germinal أثناء عدوى فيروس الأنفلونزا A في الفئران

تشارك الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 (ILC2s) ، المتورطة في التهاب النوع 2 ، بشكل أساسي في الاستجابة لعدوى الديدان الطفيلية وأمراض الحساسية والتوازن الأيضي وإصلاح الأنسجة. في هذه الدراسة ، تم إثبات إجراء لعزل ILC2s من الغشاء المخاطي للأنف الفئران والكشف عن تعبير CD226.

عزل الخلايا اللمفاوية الفطرية من المجموعة 2 من الغشاء المخاطي للأنف في الفأر للكشف عن تعبير CD226

يصف هذا البروتوكول تمايز الخلايا التائية CD4 + T الساذجة إلى خلايا Th17 المسببة للأمراض في المختبر. على وجه التحديد ، عند دمجها مع نهج قائم على قياس التدفق الخلوي متعدد المعلمات ، يمكن الحصول على نقاء 90٪ من خلايا Th17 المسببة للأمراض من خلايا CD4 + T الساذجة باستخدام طريقة التمايز هذه.

التمايز في المختبر للخلايا التائية CD4 + الساذجة إلى خلايا Th17 المسببة للأمراض في الماوس

تعرض الدراسة الحالية بروتوكولات لتقييم الالتزام المبكر بالمصير لخلايا TFH الخاصة بالفيروس والتلاعب بالتعبير الجيني في هذه الخلايا.

الوصول إلى التمايز المبكر للخلية التائية المساعدة المسامية CD4 + الخاصة بالفيروس في الفئران المصابة بفيروس LCMV الحاد

نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل وتحديد مجموعات الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد في رئتي الفئران من خلال إثراء الخلايا التائية القائمة على الخرزة المغناطيسية والببتيد: رباعيات معقد التوافق النسيجي الرئيسي (MHC).

تحديد الخلايا التائية النادرة الخاصة بالمستضد من رئتي الفأر مع الببتيد: رباعيات التوافق النسيجي المعقدة الرئيسية

اكتشف طريقة عزل وكشف خلايا TH17 الفأرية المفرزة لـ IL-17 باستخدام تقنية اصطياد السيتوكين. تُحسّن هذه الطريقة دقة تحليل الاستجابات المناعية والالتهابات الذاتية.

كشف وعزل خلايا T ماوس قابلة للحياة IL - 17 - الإخفاء

استكشف المزيد من الفيديوهات