What are nanocarriers and why are they used for drug delivery?

Nanocarriers are submicron particles, typically less than 200 nanometers, loaded with therapeutic agents. Their small size enables access to many body sites and organs. Nanocarriers are usually biocompatible, meaning they don't harm living tissue or trigger immune responses. Their large surface area can be functionalized with ligands like antibodies to enable targeted delivery to specific cells.

How does the EPR effect enable passive targeting of nanoparticles to tumors?

The enhanced permeability and retention effect, or EPR effect, occurs because tumor blood vessels form rapidly and are abnormal with large gaps in their endothelial lining. This leaky vasculature increases permeability, allowing nanoparticles to escape the bloodstream and accumulate within the tumor microenvironment without requiring specific targeting ligands.

What is the difference between passive and active targeting with nanocarriers?

Passive targeting relies on the EPR effect, where nanoparticles naturally accumulate in tumors through leaky blood vessels. Active targeting uses functionalized nanocarrier surfaces with specific ligands that recognize and bind to receptors overexpressed by tumor cells, triggering receptor-mediated endocytosis for enhanced cellular uptake.

How is scanning electron microscopy used to visualize nanoparticle biodistribution in tissue samples?

SEM uses backscatter electron detection to visualize metallic nanoparticles as high-contrast regions within tissue sections. Energy dispersive X-ray spectroscopy confirms nanoparticle composition by identifying characteristic X-rays emitted during electron beam interaction. This combination provides high-resolution imaging and increased confidence in detection compared to fluorescence methods.

What tissue preparation steps are necessary before SEM imaging of nanoparticles?

Organs are fixed in phosphate-buffered formalin, then rinsed in PBS to remove excess fixative. Tissue is embedded in optimal cutting temperature compound and frozen at minus 80 degrees Celsius overnight. Cryostat sectioning produces 7-8 micrometer sections, which are collected on slides and treated with ethanol and acetone to remove OCT before SEM analysis.

What does nanoparticle biodistribution data reveal about how the body processes metallic nanoparticles?

Biodistribution graphs show nanoparticle concentration in organs over time. An overall decrease after eight weeks indicates clearance from the body. However, increased liver concentration at four weeks suggests the body may process metallic nanoparticles as toxins. Nanoparticle size significantly affects cellular uptake rates and clearance kinetics.

What are theranostics and how do they combine diagnostic and therapeutic functions?

Theranostics are loaded nanocarriers designed to simultaneously detect early-stage cancer and deliver chemotherapeutic agents. Metallic nanoparticles serve as contrast agents in imaging for tissue visualization, while also functioning as drug carriers. This integration of diagnostic imaging and therapeutic delivery enables both disease detection and treatment in a single platform.

التوزيع الحيوي لناقلات الأدوية النانوية: تطبيقات SEM

0 مشاهدة13:29 دقيقة

فئة < ص = "jove_title" >1. حقن الجسيمات النانوية وحصاد الأعضاء

حقن الجسيمات النانوية في فأر مخدر عن طريق الوريد للسماح بالاستهداف السلبي.
في النقاط الزمنية المطلوبة ، أي 1 و 4 و 8 أسابيع ، بعد الحقن ، قم بالقتل الرحيم للفئران بشكل إنساني وفقا لإرشادات الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية (AVMA).
افتح تجويف الجسم وقم بإزالة الأعضاء ذات الأهمية جراحيا. ضع الأعضاء في الفورمالين المخزن بالفوسفات بنسبة 10٪ في وعاء من مادة البولي بروبلين حتى تحضير العينة.

< p class = "jove_title" >2. تحضير عينة الأنسجة

استخدم الملقط لنقل أنسجة الفأر من المثبت إلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). هز العينة لمدة 30 دقيقة ، واستبدل PBS كل 10 دقائق.
قم بإزالة المنديل وجففه باستخدام kimwipe. ثم ضعه في قالب بلاستيكي يحتوي على مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT). يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية طوال الليل.
في اليوم التالي ، انقل العينة إلى ناظم البرد واضبط درجة الحرارة على -23 درجة مئوية.
قم بتسمية الشرائح بنوع العضو وحجم الجسيمات النانوية ، وضعها على رف في ناظم البرد.
قم بتغطية ظرف ناظم البرد ب OCT وضع العينة في الأعلى. اخفض مكبس المستخرج فوق العينة واتركه يتوازن لمدة 3-5 دقائق.
قم بتركيب الظرف على حامل العينة وتوجيهه بحيث يمكن للشفرة أن تقطع العينة المجمدة مباشرة. اجعل العينة قريبة من الشفرة لمواجهة خشنة. اضبط السماكة على 30 ميكرومتر وقم بتقطيع عدة أقسام حتى يتم إنتاج شريحة مقطوعة بالتساوي.
قم بالتبديل إلى الوجه الدقيق عن طريق تقليل سمك القسم إلى 7-8 ميكرومتر. اجمع قسما مقطعا عن طريق الضغط على شريحة زجاجية ملصقة على الشريحة. ضع شريحتين على كل شريحة ، وقم بتخزينها في رف شرائح. اتركيه ليجف في درجة حرارة الغرفة.
بمجرد أن تجف ، قم بتجفيف العينات عن طريق غمس رف الشرائح في 50٪ من الإيثانول لمدة 3 دقائق لإزالة OCT. ثم انقل الرف إلى 80٪ من الإيثانول لمدة 3 دقائق قبل وضع الرف بنسبة 1: 1 من الميثانول البارد إلى الأسيتون لمدة 10 دقائق عند -20 درجة مئوية.
قم بإزالة رف الانزلاق وصفي المذيب الزائد على منشفة ورقية. بعد 20-30 دقيقة ، ضع الشرائح في صندوق منزلق واحفظها في الفريزر عند -20 درجة مئوية حتى التصوير.

3. تصوير عالي الدقة باستخدام SEM و EDS

قم بإعداد العينة كما هو موضح في "تصوير العينات البيولوجية عبر محرك البحث عبر محرك البحث". ثم قم بتحميل العينة في التسويق عبر محرك البحث.
قم بتشغيل SEM ، واضبط مسافة العمل على حوالي 5 مم والجهد المتسارع وتيار الشعاع إلى 25 كيلو فولت ، والتي عادة ما تكون عالية جدا بالنسبة للعينة البيولوجية. ومع ذلك ، فإن العينة مطلية للتوصيلية والحماية.
ابدأ التصوير والتكبير إلى حوالي 1,000-2,000X للتكبير لمعرفة الهياكل التي قد تحتوي على الجسيمات النانوية. لاحظ أنه بدون اكتشاف الانتثار الخلفي (BSD) لا يمكن للمرء تمييزها تحت عمق معين.
أدخل BSD تحت نفس المعلمات وحرك المرحلة في الاتجاه z إلى نفس مسافة العمل كما كان من قبل.
ابدأ التصوير بنفس التكبير تقريبا وتأكد من قدرتك على رؤية تباين عال في وجود الجسيمات النانوية. احفظ الصور.
استخدم تكوينات BSD مختلفة (حيث تتماشى الشحنات الموجودة على الكاشف) لاختيار التكوين الذي يظهر أعلى تباين للجسيمات النانوية.
تكبير منطقة عالية التباين تظهر جسيمات نانوية أو مجموعة من الجسيمات النانوية.
افتح الكاميرا الثانية للغرفة وشاهد أثناء إدخال EDS في النظام بالضغط على الزر لأسفل في مرفق SEM. بمجرد إغلاق EDS ولكن لا يلمس BSD أو البندقية ، حرر الزر.
افتح برنامج Aztec على كمبيوتر EDS (لا يزال في محطة العمل) واحصل على صورة من SEM. استخدم طريقة "التوجيه وإطلاق النار" للنقر على منطقة كثيفة جدا في التباين والجسيمات النانوية.
سيظهر EDS طيف الأشعة السينية المميزة من تلك النقطة. ابحث عن كل من قمم الباريوم والتيتانيوم ليتم تحديدها على الرسم البياني. هذا يؤكد أن ما تنظر إليه هو بالفعل الجسيمات النانوية وليس أي نوع من التلوث.
ارجع إلى العينة واستخدم برنامج Atlas لتعيين حدود الجهاز على الشريحة. حدد بروتوكول "Organ" لإنشاء صورة فسيفساء للمنطقة ، واتركها تعمل (قد يستغرق ذلك بضع ساعات على الأكثر).
بمجرد إنشاء الصورة المركبة وخياطتها بواسطة البرنامج ، قم بتصديرها كملف Tif.
افتح ملف Tif في ImageJ ، وهو برنامج مفتوح المصدر ، واضبط قيم عتبة التباين لتسليط الضوء على مناطق التباين العالي جدا (أي الجسيمات النانوية). استخدم الوظائف المضمنة لتحديد حجم الجسيمات النانوية باستخدام حجم البكسل المحدد في بروتوكول Organ (يجب أن يكون حوالي 100 نانومتر).
بينما يشير هذا الإجراء فقط إلى عينة 1 أسبوع من رئة الفأر ، يتم تكرار هذا الإجراء مع عينات من أسابيع أخرى وأعضاء أخرى لتجميع رسم بياني يوضح التوزيع.
بعد حساب التوزيع الحيوي لكل عضو لكل أسبوع ، ستظهر الرسوم البيانية للتوزيع الحيوي التغيرات في التوزيع الحيوي وتركيز الجسيمات النانوية على مدار 8 أسابيع. توضح هذه ذروة التركيز وتوفر أيضا معلومات حول المدة التي تستغرقها الجسيمات النانوية للتخلص من العضو.

تستخدم الجسيمات النانوية المعدنية والمغناطيسية على نطاق واسع كناقلات نانوية لتوصيل الأدوية. وتوزيعها الحيوي في الأنسجة ضروري لتقييم فعاليتها العلاجية وسلامتها. الناقلات النانوية عبارة عن جزيئات دون ميكرون ، تقتصر عادة على أقل من 200 نانومتر ، ويمكن تحميلها بعوامل علاجية. نظرا لحجمها ، فهي قادرة على الوصول إلى العديد من المواقع والأعضاء في الجسم. حيث ينتهي المطاف بالجسيمات في الجسم ، والتي تسمى توزيعها الحيوي ، هي معلمة مهمة تستخدم لتقييم السلامة وتحسين الجرعات وتحسين استهداف الأدوية.

في هذا الفيديو سيتم وصف المبادئ الأساسية لتوصيل الأدوية المستهدفة وسيتم عرض طريقة لتقييم التوزيع الأحيائي باستخدام تقنيات التصوير عالية الاستبانة. ستتم أيضا مناقشة التطبيقات الأخرى للناقلات القائمة على الجسيمات النانوية.

دعونا نبدأ بمناقشة أساسيات الجسيمات النانوية ونفهم سبب تطويرها كناقلات للأدوية.

أولا ، عادة ما تكون الجسيمات ذات المقياس النانوي ، والتي يمكن أن تكون بوليمرية أو شحمية أو معدنية متوافقة حيويا ، مما يعني أنها ليست ضارة أو متفاعلة مع الأنسجة الحية ولا تثير استجابة مناعية. ومع ذلك ، يجب إجراء دراسات علم السموم النانوية من أجل فهم كيفية تأثير المواد وحجم الجسيمات على التوزيع الحيوي في الجسم.

ثانيا ، يسمح حجمها الصغير بتسرب البطانة في المواقع الالتهابية ، كما هو الحال في الأورام ، ويؤدي إلى امتصاص خلوي فعال. مع انقسام الخلايا السرطانية ، هناك حاجة إلى إمدادات الأوعية الدموية لتوفير العناصر الغذائية والأكسجين ودعم نمو الورم. تتشكل هذه الأوعية الدموية بسرعة وبالتالي عادة ما تكون غير طبيعية وفعالة ، وتحتوي على فجوات كبيرة في بطانتها البطانية ، مما يؤدي إلى تسرب الأوعية الدموية وزيادة النفاذية. ثم تكون الجسيمات النانوية قادرة على الهروب من مجرى الدم والتراكم داخل البيئة المكروية للورم. وهذا ما يسمى بالاستهداف السلبي حيث يصل الناقل النانوي إلى العضو المستهدف من خلال ظاهرة تعرف باسم تأثير EPR أو النفاذية المحسنة وتأثير الاحتفاظ

أخيرا ، تحتوي هذه الجسيمات النانوية على مساحة سطح كبيرة يمكن تشغيلها باستخدام روابط معينة مثل الأجسام المضادة أو البروتينات. في الاستهداف النشط ، يمكن لهذه الروابط بعد ذلك التعرف على المستقبلات التي تعبر عنها الخلايا في موقع الورم والارتباط بها. تؤدي التفاعلات المحددة بين الروابط الموجودة على سطح الناقل النانوي ومستقبلات الخلية إلى الالتقام الخلوي بوساطة المستقبلات وتسهيل امتصاص الخلايا.

والآن بعد أن فهمنا أساسيات توصيل الأدوية بالجسيمات النانوية، دعونا نرى عرضا توضيحيا يستخدم تصويرا عالي الدقة لتحديد التوزيع الحيوي للجسيمات النانوية المعدنية في نموذج الفأر.

أولا ، قم بإعداد الجسيمات النانوية التي سيتم حقنها في الماوس. هنا تم استخدام جزيئات الباريوم والتيتانيوم 30 نانومتر. بعد تخدير الفأر ، قم بحقن الجسيمات النانوية عن طريق الوريد عبر الوريد الذيلي. اسمح للفأر بالتعافي بينما يستهدف الأعضاء بشكل سلبي على مدار أسبوع وأربعة وثمانية أسابيع.

في النقطة الزمنية المناسبة بعد الحقن ، قم بالقتل الرحيم للفئران بشكل إنساني وفقا لإرشادات AVMA. ثم افتح تجويف الجسم وقم بإزالة الأعضاء ذات الأهمية جراحيا مثل الطحال والكلى والكبد والرئتين. وتخزين الأعضاء في 10٪ من الفورمالين المخزن بالفوسفات حتى التحليل.

استخدم الآن الملقط لنقل أنسجة الفأر من المثبت إلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات. هز العينة لمدة 30 دقيقة ، واستبدل PBS كل 10 دقائق لإزالة المثبت الزائد. ثم قم بإزالة الأنسجة من شاكر. أضف مركب درجة حرارة القطع الأمثل الذي يحتوي على جليكول وراتنجات قابلة للذوبان في الماء إلى قالب بلاستيكي مسمى.

جفف المنديل باستخدام Kimwipe ثم ضعه في قالب بلاستيكي. املأ القالب بمركب OCT الذي يغطي الأنسجة وضعه في كيس بلاستيكي. ضع الكيس في دلو يحتوي على ثلج جاف وانقله إلى الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل.

في اليوم التالي ، أخرج العينة من الفريزر وضعها على الثلج الجاف أثناء نقلها إلى ناظم البرد. اضبط درجة حرارة الغرفة على 23 درجة تحت الصفر ثم انقل العينة إلى ناظم التبريد. قم بتسمية الشرائح بنوع العضو وحجم الجسيمات النانوية للعينة التي ستقوم بتقسيمها. ثم قم بتنشيط ناظم التبريد. بعد ذلك ، قم بتغطية ظرف ناظم البرد باستخدام OCT. ثم قم بإزالة العينة من القالب وضعها فوق الظرف. قم بتركيب الظرف على حامل العينة وقم بتوجيهه وضبطه بحيث تقطع الشفرة مباشرة عبر العينة المجمدة. الآن قم بتقريب العينة من الشفرة واضبط السماكة على 30 ميكرومتر للمواجهة الخشنة. قم بتدوير عجلة اليد لتقطيع أقسام بسمك 30 ميكرومتر واستمر في التقسيم حتى يتم قطع شريحة من الأنسجة بشكل متساو. للوجه الدقيق ، اضبط سمك القسم على سبعة إلى ثمانية ميكرومترات وقم بتقطيع العينة.

اجمع الأقسام بالضغط على شريحة زجاجية مصنفة على الشريحة. ثم أضف الشرائح إلى الرف وجففها في الهواء في درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن يجف ، اغمس رف الشرائح بشكل متكرر في 50٪ من الإيثانول لمدة ثلاث دقائق لإزالة OCT. انقل الرف إلى 80٪ من الإيثانول واغمس لمدة ثلاث دقائق. ثم انقل الرف إلى نسبة واحد إلى واحد من الميثانول البارد إلى الأسيتون وضعه في الفريزر عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد 10 دقائق ، قم بإزالة رف الشرائح من الفريزر وصفيه على منشفة ورقية. عندما تجف ، ضع الشرائح في صندوق منزلق وخزنها على حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام.

الآن دعونا نصور أنسجة رئة الفئران التي تم جمعها بعد أسبوع واحد من الحقن بجزيئات الباريوم والتيتانيوم 30 نانومتر لتحديد توزيعها الحيوي. للبدء ، قم أولا بتركيب شريحة معدة على مرحلة SEM. لمعرفة كيفية رش الطلاء وإعداد عينتك ، يرجى مشاهدة الفيديو السابق في هذه المجموعة. ثم قم بتحميل المرحلة في غرفة SEM. بمجرد أن تصبح العينة في مجال الرؤية ، انقل العينة عموديا إلى مسافة عمل تبلغ حوالي خمسة ملليمترات. قم بتشغيل حزمة الإلكترون وحدد كاشف الإلكترونات الثانوية. ثم اضبط جهد تسريع الحزمة على 25 كيلو إلكترون فولت. لبدء التصوير، قم بتكبير العينة إلى تكبير يتراوح بين 1,000 إلى 2,000 ضعف. عند هذا التكبير ، يجب أن يكون الهيكل الذي يحتوي على الجسيمات النانوية مرئيا ، على الرغم من أن الجسيمات النانوية ليست مرئية. وهذا ما يسمى الصورة الثانوية.

الآن قم بتشغيل وضع الكشف عن الإلكترون الخلفي في وحدة SEM لتصور الجسيمات النانوية. حرك المرحلة في الاتجاه Z للوصول إلى نفس مسافة العمل البالغة خمسة ملليمترات المستخدمة أعلاه. اضبط تكوين كاشف التشتت الخلفي واستخدم تحيزات جهد مختلفة للوحات الكشف حتى تصبح الصورة واضحة. يجب أن تكون المناطق ذات التباين العالي ، الجسيمات النانوية ، مرئية الآن. هذه هي الصورة المتناثرة في الخلف. التقط الصورة واحفظها.

بعد ذلك ، احصل على التحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة أو بيانات EDS للعينة. قم بتكبير منطقة التباين العالي لمجموعة من الجسيمات النانوية. ثم افتح الكاميرا الثانية في الغرفة وقم بخفض EDS في النظام. شاهد شاشة الكاميرا للتأكد من اقتراب EDS ، لكنه لا يلمس BSD أو مسدس الإلكترون. ثم افتح برنامج التحليل المجهري واحصل على صورة. استخدم الماوس لتحديد منطقة الاهتمام لمزيد من التحليل. ثم يتم عرض طيف الأشعة السينية لتلك المنطقة. هنا تمثل القمم الباريوم والتيتانيوم مما يؤكد وجود الجسيمات النانوية المعدنية في العينة. الآن افتح برنامج تحليل البيانات النوعية وقم بتعيين حدود العضو على الشريحة. ثم حدد وقم بتشغيل البروتوكول المناسب من القائمة لإنشاء صورة فسيفساء للعضو. قد يستغرق ذلك عدة ساعات.

بمجرد الانتهاء ، قم بتصديره كملف TIF وافتح الملف في ImageJ. اضبط قيم عتبة التباين لتسليط الضوء على المناطق ذات التباين العالي جدا ، الجسيمات النانوية. ثم حدد تحليل الجسيمات للحصول على متوسط عدد الجسيمات النانوية في العضو والنسبة المئوية لمساحة العضو الذي يحتوي على الجسيمات النانوية.

كرر جميع الخطوات في هذا الإجراء لعينات الأنسجة المتبقية من النقاط الزمنية والأعضاء الأخرى. بمجرد جمع جميع البيانات ، قم بتجميعها في رسم بياني لتوزيع السيرة الذاتية.

الآن دعنا نحلل الصور لتحديد التوزيع الحيوي ومعرفة كيفية معالجة الجسم للجسيمات النانوية. ارسم أولا توزيع الجسيمات المقاسة كدالة للوقت لجميع العينات التي تم تحليلها. هذا هو توزيع الجسيمات النانوية بحجم 30 نانومتر في أعضاء الفئران المختلفة بمرور الوقت. هناك انخفاض عام في الجسيمات النانوية بعد ثمانية أسابيع مما يشير إلى إزالة الجسيمات النانوية من الجسم.

ومع ذلك ، هناك زيادة في تركيز الجسيمات النانوية في الكبد بعد أربعة أسابيع. يشير هذا إلى أن الجسم قد يعالج جزيئات الباريوم النانوية والتيتانيوم التي يبلغ قطرها 30 نانومتر المستخدمة في هذه الدراسة كسام. يمكن أيضا إجراء هذا التحليل لتقييم كيفية تأثير حجم الجسيم النانوي على توزيعه الحيوي في الجسم. أثر تغيير حجم الجسيمات النانوية على معدل الامتصاص الخلوي الكلي ومعدل التخليص.

تستخدم الجسيمات النانوية والناقلات النانوية على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية ولها تطبيقات كعوامل تصوير وتشخيص وعلاجية. يتم تطوير الجسيمات النانوية لاستخدامها في توصيل اللقاحات ضد مجموعة متنوعة من الأمراض المعدية لأنها تحمي مكونات اللقاح من التدهور وتزيد من التحفيز المناعي. يتم تطوير الحويصلات متعددة الصفائح المتشابكة بين الطبقات الثنائية ، أو ICMVs ، لتحريض استجابات الخلايا التائية الإيجابية CD8 الخاصة بالمستضد.

تتمركز هذه ICMVs على وجه التحديد في الغدد الليمفاوية للفئران من أجل توصيل اللقاح بكفاءة وقد أثارت استجابات مناعية قوية ضد مستضدات الملاريا والخلايا السرطانية. غالبا ما تستخدم الجسيمات النانوية المعدنية كعوامل تباين في التصوير بالرنين المغناطيسي لتصور بنية الأنسجة ووظيفتها للكشف المبكر عن المرض. جسيمات أكسيد الحديد النانوية هي مجسات تشخيصية مفيدة. عند تصنيعها مع جزء من البايفوسفونات ، تتراكم هذه الجسيمات النانوية بسرعة وانتقائية في لويحات تصلب الشرايين وتسمح بتصورها في غضون ساعة واحدة للتشخيص السريع.

في الآونة الأخيرة ، تم تطوير الناقلات النانوية المحملة كاستراتيجية للكشف عن السرطان في مراحله المبكرة في وقت واحد وتقديم عوامل العلاج الكيميائي. تسمى هذه الناقلات النانوية بالخلايا العلاجية لأنها تدمج القدرات التشخيصية والعلاجية.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول تحديد التوزيع الحيوي لناقلات الأدوية النانوية. يجب أن تعرف الآن المبادئ الأساسية لناقلات الأدوية النانوية ، وكيفية اكتشاف الناقلات النانوية في عينات الأنسجة باستخدام SEM عالي الدقة ، وتحديد توزيعها الحيوي ، وبعض تطبيقات الجسيمات النانوية في الهندسة الطبية الحيوية.

شكرا للمشاهدة.