How do optical microscopes differ from confocal microscopes in terms of image quality?

Optical microscopes illuminate the entire sample thickness, causing out-of-focus blur from light interference outside the focal plane. Confocal microscopes use a pinhole to filter out-of-focus light, illuminating only a narrow depth at one time. This produces higher resolution images with better contrast and eliminates blur, though only a small portion of the sample is imaged at once.

What is the resolution limit of optical microscopes and why does it exist?

Optical microscopes typically achieve resolution down to 200 nanometers in ideal conditions but are limited by diffraction of visible light waves, which have wavelengths around 500 nanometers. This physical limitation prevents optical microscopes from achieving the resolution of electron microscopes, yet they remain valuable tools for imaging biological macrostructures in research and clinical settings.

How does a raster scan improve confocal microscope imaging?

A raster scan moves the sample systematically in the X-Y plane while adjusting the Z height to access different focal planes. This point-by-point approach ensures maximal resolution at each location, building a complete high-resolution image of the sample surface. The technique allows confocal microscopes to capture detailed topographical information that would be impossible with single-plane imaging.

What are the key steps for acquiring an image with a confocal microscope?

Start by loading the sample and centering it beneath the lens. Begin at low magnification, adjust focus using the Z manipulator, then capture an overview image. Set reference points, gradually increase magnification to desired resolution, define the measuring range by setting top and bottom focal points, verify no light oversaturation occurs, and finally acquire the tomography image for 3D analysis.

How is a digital optical microscope used to measure biological samples?

After acquiring and optimizing an image using lighting and contrast adjustments, use the pencil tool to access measurement features. The distance and area tools measure cell sizes and cross-sectional dimensions. Software calculates internal areas of sections and generates reports. Save the job for further analysis through the results workflow tab, enabling detailed quantitative assessment of biological structures.

What clinical applications use confocal microscopy in biomedical imaging?

Scanning laser ophthalmoscopy, a confocal technique, diagnoses and monitors retinal diseases by producing high-contrast stereoscopic images of microglia, the resident macrophages of the retina. Confocal microscopy also enables live cell imaging, allowing researchers to visualize cell migration, proliferation, and protein dynamics in real time using fluorescent dyes and timelapse imaging to study receptor internalization.

Why is depth of focus important when comparing microscopy techniques?

Depth of focus determines how much of the sample remains in sharp focus at once. Confocal microscopes provide deep focus with varying depth levels, enabling detailed analysis of sample topography and 3D structure. Digital optical microscopes image entire slides but at lower resolution. Choosing the right technique depends on whether you need high resolution of thin sections or comprehensive imaging of thicker samples.

تصوير العينات البيولوجية بالفحص المجهري البصري ومتحد البؤر

0 مشاهدة10:48 دقيقة

فئة

1. التصوير متحد البؤر

قم بتحميل العينة على المسرح. قم بتوسيطه أسفل العدسة. يجب ألا يتجاوز الحد الأقصى لوزن المرحلة ، والذي يبلغ في هذه الحالة 5 كجم. يجب ألا يزيد سمك العينة عن 100 مم.
افتح برنامج التصوير وحدد "إنشاء وظيفة".
ضمن عمود الطبوغرافيات ، اختر زر المساعد.
قم بإنشاء صورة نظرة عامة بأقل تكبير، 2.5X. قبل تبديل التكبيرات، تأكد من أن العينة في بؤرة التركيز البؤري عن طريق تغيير موضع Z حتى ترى صورة واضحة. يمكن القيام بذلك عن طريق الضغط لأسفل أو سحبه لأعلى على مناور المجهر ثلاثي الأبعاد. يتم تحقيق حركة Z الدقيقة من خلال إشراك الزر الموجود على الجانب ، مما يتسبب في ظهور ضوء أزرق حول الحواف.
قم بزيادة تكبير العدسة ببطء ، وقم باللعب باستمرار مع شدة الضوء والتركيز البؤري حتى تصل إلى التكبير المطلوب. إذا رغبت في ذلك ، اختر منطقة اهتمام مختلفة عن طريق تحريك المرحلة في الاتجاهين x و y باستخدام المناور.
بمجرد التقاط صورة نظرة عامة عند التكبير المنخفض ، اضغط على الزر التالي للمتابعة إلى خطوة النقطة المرجعية. إذا رغبت في ذلك ، حدد نقطة مرجعية معينة من أجل القياس (أي زاوية العينة) ، على الرغم من أن النقطة المرجعية الافتراضية جيدة لهذا الغرض.
اضغط على السهم التالي للانتقال إلى الجزء التالي من المعالج.
قم بتغيير الهدف حسب الرغبة لرؤية الدقة المناسبة لعينتك. في هذه الحالة ، يتم استخدام العدسة الموضوعية 50X لتصور الخلايا في العينة. 50X هي العدسة الأقرب إلى العينة ، لذا انتقل تدريجيا إلى هدف 50X لضمان أنه لا يزال هناك مجال لتقليل مسافة العمل بعد عدسة 20X.
في صفحة "قياس تحديد النطاق" ، حرك الموضع Z قليلا (النقر فوق الزر الجانبي على المناور لإجراء تعديلات دقيقة) بحيث يكون الجزء العلوي من العينة فقط في التركيز وانقر فوق "تعيين الأخير". ثم حرك المرحلة في الاتجاه Z (لأسفل) حتى يصبح الجزء السفلي من العينة فقط في بؤرة التركيز واضغط على "تعيين أولا". تأكد من أن عدد الشرائح المحسوبة لا يتجاوز 1000 وإلا سيفشل البرنامج.
تأكد من أن شدة الضوء لا تفرط في التشبع (تسبب وحدات بكسل حمراء) في الصورة في أي من المستويات ثم اضغط على تم. سيؤدي هذا إلى التقاط صورة التصوير المقطعي وفتح برنامج التصوير المقطعي.
في برنامج التصوير المقطعي ، افتح علامات تبويب مثل علامة التبويب "الدراسات" لعرض البيانات في 3D وإجراء القياسات في مساحة ثنائية الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد.

فئة

2. التصوير المجهر البصري الرقمي

قم بتحميل العينة على المسرح. ضع العينة في المنتصف أسفل العدسة. يجب ألا يتجاوز وزن العينة حد وزن المرحلة ، والذي يكون في هذه الحالة 4 كجم. يجب ألا تزيد العينة عن 12 سم.
افتح برنامج التصوير.
حدد وظيفة من قائمة القوالب المتوفرة. من الممكن أيضا العمل خارج الوظيفة عن طريق الضغط على Free Exam ، والذي يسمح لك بدراسة عينة خارج الوظيفة.
الحصول على صورة نظرة عامة توضح المرحلة بأكملها. سيكون هذا بمثابة خريطة لاحقا لعرض جزء العينة الذي يتم عرضه. أثناء الحصول على الصورة ، استخدم وحدة التحكم لتغيير التركيز وموضع الصورة.
ضع نظام إحداثيات. نظام الإحداثيات الافتراضي من الزاوية الخلفية اليسرى من المرحلة وهو جيد لهذا التطبيق. إذا كانت العينة ملتوية، فيمكنك ضبط الإحداثيات هنا.
قم بتسمية العينة والوظيفة، وهذا يضيفها إلى قائمة الوظائف حتى يتمكن المستخدمون الآخرون من العودة إليها.
حدد زر الكاميرا ضمن اكتساب. التقط صورة أولية، ثم اضغط على الزر المباشر أثناء التنقل في العينة.
حرك التركيز لأسفل حتى تصبح العينة في نطاق التركيز البؤري بوضوح. قد يكون من الضروري أيضا ضبط الإضاءة ضمن علامة التبويب الإضاءة وفتحة العدسة.
قم بتحسين الصورة باستخدام الأدوات الموجودة أسفل لوحة Image Optimization. يمكنك اللعب بمعلمات مختلفة ضمن علامة التبويب تحسينات الصورة، مثل إمالة العدسة ومستويات الإضاءة على العينة والسطوع والتباين، حتى تحصل الصورة على الوضوح المطلوب.
قم بإجراء القياسات من خلال النقر على أداة Pencil على البرنامج. من هناك ، يمكنك الوصول إلى العديد من أدوات القياس ، بما في ذلك المسافات والزوايا والمساحة. استخدم أدوات المسافة والمساحة لقياس حجم العينة.
انتقل إلى علامة التبويب سير عمل النتائج وتحقق من تخطيط سير العمل لتكوين تخطيط التقرير
اضغط على زر الحفظ لحفظ وظيفتك حتى يتمكن الآخرون من استخدام نفس سير العمل.

الفحص المجهري هو طريقة تستخدم على نطاق واسع لتصوير الهيكل التفصيلي للعينات. المجاهر البصرية ، التي تركز الضوء من خلال سلسلة من العدسات لتكبير العينات ، كانت قيد الاستخدام لعدة قرون مع ظهور أول مجهر مركب في القرن السابع عشر. خلال ذلك الوقت ، كان أنتوني فان ليوينهوك أول من لاحظ البكتيريا والخميرة وخلايا الدم الحمراء والدورة الدموية في الأوعية الدموية ، مما قدم مساهمات علمية كبيرة ومهد الطريق للتقدم المجهري.

لا تزال المجاهر البصرية تستخدم على نطاق واسع حتى اليوم في البيئات البحثية والسريرية للتشخيص الطبي. ومع ذلك ، في السنوات الستين الماضية ، ظهر الفحص المجهري متحد البؤر الذي يضيء العينة من خلال ثقب لزيادة الدقة البصرية والتباين.

سيوضح هذا الفيديو مبادئ تشغيل الفحص المجهري البصري ومتحد البؤر ، ويوضح كيفية تحليل الصور عالية الدقة ، ويناقش العديد من تطبيقات الفحص المجهري في مجال الهندسة الطبية الحيوية.

دعونا نبدأ بمناقشة أساسيات الفحص المجهري متحد البؤر. يعتمد الفحص المجهري البصري على مبدأ تركيز الضوء على عينة لتصوير هيكلها التفصيلي. يتكون المجهر من مكونين من التكبير. العدسة الموضوعية ، التي تركز صورة حقيقية لجسم ما ، والعدسة العينية ، التي تركز صورة افتراضية مكبرة قبل أن تستقبلها العين. يتم تحقيق التكبير الكلي بضرب تكبير هاتين العدستين.

يعطي تركيز الضوء مستوى تركيزا محددا حيث يلتقي كل من التكبير وضوء المصباح في نفس النقطة ، مما يعطي أفضل دقة في الصورة. عندما تكون خارج المستوى البؤري ، تكون مساحة الإضاءة أكبر وتتداخل أشعة الضوء من أجزاء أخرى من العينة ، مما يتسبب في ضبابية الصورة. عندما تضيء المجاهر الضوئية العينة بأكملها وتصورها ، يستخدم المجهر متحد البؤر ثقبا بين مرحلة العينة والكاشف بحيث يتم تركيز شعاع ضوئي صغير فقط على عمق ضيق واحد في كل مرة.

وبالتالي ، فإن المنطقة المرئية الوحيدة للعينة هي نقطة التركيز البؤري ، مما يوفر صورة جيدة الحل. ومع ذلك ، مع دقة أعلى ، يتم تصوير جزء صغير فقط من هذه العينة في المرة الواحدة. عن طريق تحريك العينة في المستوى XY ، يمكن إجراء مسح نقطي لسطحها. لكل نقطة من نقاط المسح ، يتم تحسين التركيز عن طريق ضبط ارتفاع Z للوصول إلى مستويات بؤرية مختلفة. هذا يضمن نقطة دقة قصوى لكل نقطة من عينة الصورة.

الآن دعنا نستخدم مبادئ الفحص المجهري ودقة الصورة لتصوير دماغ الفأر باستخدام كل من المجهر البصري والمجهر.

بعد مراجعة المبادئ الرئيسية للفحص المجهري ، دعنا الآن نجري قياسا باستخدام مجهر متحد البؤر. أولا ، قم بتشغيل المجهر في محطة عمل الكمبيوتر. ثم قم بتحميل العينة على المسرح وتوسيطها أسفل العدسة. افتح الآن برنامج التصوير وحدد إنشاء وظيفة جديدة. انتقل إلى عمود التضاريس واختر زر المساعد. حدد أقل تكبير ، وهو 2.5x لهذا المجهر. ثم استخدم مناور المجهر ثلاثي الأبعاد لضبط الموضع Z للعينة والتركيز على العينة. اضغط على الزر الموجود على الجانب بحيث يظهر ضوء أزرق حول الحواف. هذا يسمح بحركة Z وتركيز أدق. الآن التقط صورة نظرة عامة.

قم بزيادة تكبير العدسة ببطء واضبط شدة الضوء والتركيز للحصول على التكبير المطلوب. استخدم مناور 3D في الاتجاهين X و Y لتحديد مجالات الاهتمام المختلفة على العينة. بمجرد التقاط صورة بتكبير منخفض، اضغط على التالي لأخذ نقطة مرجعية. استخدم إما النقطة المرجعية الافتراضية، أو حدد نقطة مرجعية جديدة في زاوية العينة، ثم اضغط على التالي. الآن قم بتغيير الهدف تدريجيا إلى الدقة المطلوبة للعينة. بالنسبة لهذه العينة ، يتم استخدام هدف 20x لتصور الخلايا في أنسجة دماغ الفئران. تأكد من وجود مجال لتقليل مسافة العمل.

لتحديد المسافة لجمع الشرائح ، انتقل أولا إلى صفحة تعريف نطاق القياس واستخدم مناور 3D لضبط العينة أخيرا في الاتجاه Z. انقر فوق تعيين الأخير عندما يكون الجزء العلوي من العينة في التركيز وانقر فوق تعيين أولا عندما يكون الجزء السفلي من العينة في نطاق التركيز. تأكد من أن عدد الشرائح المحسوبة لا يتجاوز 1,000 وإلا سيفشل البرنامج. تحقق من عدم وجود وحدات بكسل حمراء ، مما يشير إلى أن شدة الضوء مشبعة.

أخيرا ، اضغط على done لالتقاط صورة التصوير المقطعي. عند فتح برنامج التصوير المقطعي ، حدد علامة التبويب الدراسات لعرض البيانات في 3D وأخذ قياسات ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد.

الآن دعنا نلتقط صورة باستخدام مجهر بصري رقمي. أولا ، قم بتشغيل المجهر وافتح برنامج التصوير. ثم قم بتحميل العينة على المسرح وتوسيطها أسفل العدسة. عندما يكون برنامج التصوير مفتوحا، حدد وظيفة من قائمة القوالب أو اختر الفحص المجاني. بعد ذلك ، احصل على صورة نظرة عامة توضح المرحلة بأكملها. استخدم وحدة التحكم لتغيير التركيز وموضع الصورة.

بمجرد اكتمال الاستحواذ ، ضع نظام إحداثيات على الصورة. نظام الإحداثيات الافتراضي في منتصف المرحلة. لمزيد من المرونة ، يمكن تغيير الإحداثيات يدويا.

ثم قم بتسمية العينة وحدد زر الكاميرا. اضغط على الزر المباشر أثناء التنقل في العينة وحرك التركيز لأسفل حتى يصبح التركيز البؤري واضحا للعينة. إذا لزم الأمر، استخدم علامة تبويب الإضاءة وفتحة العدسة لضبط الإضاءة. ثم احصل على صورة للعينة.

استخدم الأدوات الموجودة أسفل لوحة تحسين الصورة، مثل إمالة العدسة ومستويات الإضاءة على العينة والسطوع والتباين في الصورة لتحسين الصورة إلى الوضوح المطلوب. الآن اضغط على أداة القلم الرصاص لإجراء القياسات. استخدم أدوات المسافة والمساحة لقياس حجم الخلايا الموجودة على العينة.

أخيرا ، انتقل إلى علامة تبويب سير عمل النتائج وقم بتكوين تخطيط التقرير. اضغط على زر الحفظ لحفظ المهمة لمزيد من التحليل.

الآن دعنا نحلل صور دماغ الفأر التي تم التقاطها باستخدام المجاهر البصرية متحدة البؤر والرقمية. الصورة متحدة البؤر بتكبير 50x عالية الدقة وتوفر تركيزا عميقا بمستويات عمق متفاوتة من المعلومات.

على الخريطة المقطعية ، يتراوح ارتفاع هذه العينة من ميكرون إلى تسعة ميكرون. يمكن تحليل خصائص مثل السعة وملف تعريف الخشونة ومعلمات المنحنى بشكل أكبر. ومع ذلك ، يمكن تصوير الشريحة الكاملة لأنسجة المخ المقطعة باستخدام مجهر بصري رقمي.

يؤدي

تكبير القسم إلى إظهار المزيد من التفاصيل عن العينة ولكن بدقة أقل بكثير مما تم الحصول عليه باستخدام المجهر متحد البؤر. تم الحصول على هذه العينة بتكبير 300x. يوفر البرنامج المخصص أدوات لقياس أبعاد المقطع العرضي ، مثل القطر ، وكذلك لحساب المساحة الداخلية للقسم.

يعد

الفحص المجهري الرقمي والبصري ومتحد البؤر من الأدوات القياسية المستخدمة في العديد من التطبيقات الطبية الحيوية. يعد تنظير العين بالليزر أو SLO تقنية تصوير غير جراحية تستخدم على نطاق واسع في طب العيون السريري لتشخيص ومراقبة تطور أمراض الشبكية.

ينتج SLO صورا مجسمة عالية التباين تصور الخلايا الدبقية الصغيرة. الضامة المقيمة في شبكية العين ، التي تشارك في العديد من أمراض الشبكية. يستخدم الفحص المجهري متحد البؤر أيضا في تصوير الخلايا الحية مما يسمح للباحثين بتصور وظيفة الخلية البيولوجية المجهرية في الوقت الفعلي.

تستخدم هذه التقنية لدراسة هجرة الخلايا وتكاثرها وديناميكيات البروتين وغيرها. هنا ، تم تصنيف مستقبلات الغشاء والليزوزومات بأصباغ الفلورسنت وتم تحليل توسيطها باستخدام التصوير بفاصل زمني للتحقيق في استيعاب المستقبلات.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE للفحص المجهري الرقمي والبصري ومتحد البؤر. يجب أن تفهم الآن مبادئ الفحص المجهري ودقة الصورة ، وكيفية تشغيل كل من المجاهر البصرية ومتحدة البؤر لتصوير العينات البيولوجية ، والعديد من تطبيقات استخدامها في مجال الهندسة الطبية الحيوية.

شكرا للمشاهدة.