تصوير SEM للعينات البيولوجية

غالبا ما يستخدم الفحص المجهري الإلكتروني الماسح ، أو SEM ، لتصوير المواد البيولوجية على مقياس النانو. تستخدم المجاهر البصرية ، التي تستخدم الضوء لتصوير عينة ، بشكل كبير لتصوير العينات البيولوجية بشكل غير مدمر ، ومع ذلك ، فإن دقتها وعمق مجالها محدودان ، وبالتالي يتم استخدام SEM من أجل تحقيق دقة أعلى تصل إلى نانومتر واحد.

في SEM ، يتم تركيز شعاع من الإلكترونات من خلال سلسلة من العدسات المكثفة ، والتي تضرب العينة بعد ذلك. عندما يصطدم الشعاع بالعينة ، تنتشر الإلكترونات الموجودة على السطح وقياسها بواسطة الكاشف.

في هذا الفيديو ، سنناقش كيفية عمل SEM ، ونوضح كيفية تصوير عينة بيولوجية في المختبر ، وأخيرا ، نقدم بعض التقنيات المستخدمة لتصوير العينات الحساسة.

يستخدم المجهر الإلكتروني الماسح شعاعا إلكترونيا عالي الطاقة ، يتم إنشاؤه بواسطة مسدس إلكتروني مزود بكاثود خيوط. يتم دفع الإلكترونات المتولدة نحو الأنود ثم يتم تركيزها باستخدام عدسات مكثفة قبل دخول العدسة الموضوعية. تتم معايرة العدسة الموضوعية لتركيز الحزمة على العينة ، حيث يتم مسحها ضوئيا عبر السطح. تستخدم تفاعلات الإلكترونات مع الذرات الموجودة في العينة لدراسة تضاريس العينة وتكوين العناصر وتبلورها. عندما يصطدم شعاع الإلكترون الساقط بالسطح ، فإنه ينبعث منه إلكترونات ثانوية ومتناثرة خلفيا. الإلكترونات الثانوية هي إلكترونات منخفضة الطاقة تنبعث من العينة بالقرب من السطح وتوفر معلومات طبوغرافية.

من ناحية أخرى ، تنعكس الإلكترونات المتناثرة في الاتجاه المعاكس للحزمة الساقطة. تزداد شدة التفاعل مع زيادة الوزن الذري ، مما يتيح للمستخدم التمييز بين الاختلافات التركيبية. هناك حاجة إلى اعتبار خاص لتصوير العينات البيولوجية باستخدام SEM ، نظرا لأن SEM يستخدم فراغا عاليا ، وبالتالي يجب تجفيف العينات البيولوجية ، التي تحتوي عادة على نسبة عالية من الماء ، أولا. يمكن أن يتسبب هذا في انهيار بنية العينات الحساسة ، وخاصة الخلايا. وبالتالي ، يتم معالجة الخلايا بمثبت ، وشطفها ، ثم تجفيفها ببطء عن طريق الغسيل بكميات متزايدة من الإيثانول.

بالنسبة للمواد البيولوجية الصلبة ، مثل سقالة أنسجة الكولاجين وهيدروكسيباتيت المستخدمة في هذا العرض التوضيحي ، يتم تجفيف العينة على مدى عدة أيام تحت فراغ عالي.

أخيرا ، نظرا لأن تصوير SEM النموذجي يتطلب سطحا موصلا ، فغالبا ما يتم طلاء العينات البيولوجية بطبقة رقيقة من المعدن قبل التصوير. الآن بعد أن ناقشنا كيفية عمل SEM وكيفية تحضير عينة بيولوجية للتصوير ، دعنا نلقي نظرة على كيفية تحضير وتصوير سقالة أنسجة الكولاجين وهيدروكسيباتيت.

أولا ، قم بتركيب عينة المواد الحيوية على كعب SEM باستخدام شريط كربوني موصل وتأكد من أن العينة جافة ولا تحتوي على تلوث على السطح.

بعد ذلك ، ضع العينة المركبة في حجرة طلاء الرش ، وضخ الغرفة ، وقم بتغطية العينة لمدة 40 ثانية تقريبا للحصول على طلاء رقيق من المعدن بسمك أربعة إلى ستة نانومتر ، في هذه الحالة الذهب ، مع تغطية كافية. بمجرد الطلاء ، قم بإزالة العينة واستخدم شريطا موصلا لتوصيل كعب الروتين بالجزء العلوي من العينة ، والذي أصبح الآن مغطى بمعدن موصل.

أخيرا ، قم بتركيب كعب الروتين على مرحلة SEM وشد المسمار على الجانب. الآن العينة جاهزة للتصوير باستخدام SEM. أولا ، قم بتحميل المرحلة في غرفة SEM وأغلق الباب ، ثم اضغط على زر النقل لفتح الممر من غرفة التحميل إلى الفراغ. بمجرد فتح الباب الداخلي ، قم بربط القضيب المعدني في المسرح وادفع العينة إلى غرفة التفريغ ، ثم قم بفك القضيب المعدني وسحبه بالكامل في غرفة التحميل ، ثم اضغط على المتجر لإغلاق غرفة التفريغ.

الآن دعنا نصور العينة باستخدام SEM.

أولا ، حرك المرحلة باستخدام وحدة التحكم وانتقل إلى العينة إلى مجال الرؤية ، ثم حرك العينة عموديا حتى تصل مسافة العمل إلى خمسة إلى 10 ملليمترات. قم بتشغيل شعاع الإلكترون وحدد كاشف الإلكترونات الثانوية ، واضبط الحزمة على خمسة كيلو إلكترون فولت في البداية ، ثم قم بزيادة ما يصل إلى 20 إلى 30 كيلو إلكترون فولت حسب الحاجة. إذا لم تكن الصورة واضحة، فقم بتدوير مقابض التركيز والسطوع والتباين حتى تظهر صورة واضحة.

استخدم التنقل في المرحلة والاتجاهين X وY لتحديد موقع بقعة جديدة على العينة، ثم قم بزيادة التكبير حتى تصبح الميزات المطلوبة مرئية. اضبط التركيز والتباين والسطوع حسب الحاجة لتحسين جودة الصورة. قد تحتاج إلى تقليل سرعة المسح وتشغيل متوسط الخط للحصول على صورة أفضل ، ثم حفظ الصورة.

تكشف صور SEM عن بنية مسامية ثلاثية الأبعاد للغاية مع ميزات ليفية أصغر من 25 ميكرون. سيكون من الصعب تصور هذه الميزات باستخدام الفحص المجهري البصري ، حيث أن الفحص المجهري البصري له عمق مجال أقل بكثير.

هناك العديد من التحديات المرتبطة بتصوير الهياكل البيولوجية باستخدام SEM ، بما في ذلك انهيار الهيكل أو التلف الناتج عن شعاع الإلكترون عالي الطاقة. دعنا الآن نلقي نظرة على كيفية تطبيق تقنية SEM العامة على هذه الأنواع من العينات الحساسة. يجب معالجة الهياكل البيولوجية الحساسة ، مثل هذه الأنسجة النباتية الصغيرة ، أو تلك التي تحتوي على نسبة عالية من الماء ، من خلال عملية تثبيت قبل التصوير.

تمت معالجة هذه النسيج الإنشائي الزهري على الفور بمحلول مثبت للفورمالين / حمض الأسيتيك المعد حديثا. تم تشريح الأنسجة الثابتة في الإيثانول ، ووضعها في وعاء شبكي ، وتجفيفها من خلال سلسلة من الإيثانول بنسبة 70٪ و 80٪ و 90٪ و 100٪. أخيرا ، تم تجفيف الأنسجة النباتية باستخدام مجفف نقطة حرجة ، وتركيبها ، وغليها مطلية بطبقة معدنية رقيقة.

بعد تصوير SEM ، من الواضح أن الهياكل غير المعالجة تعرضت لأضرار جسيمة بسبب عملية التجفيف وأظهرت انهيارا كبيرا في الهيكل ، بينما حافظت تلك التي تم إصلاحها على هيكلها الأصلي. بدلا من ذلك ، يمكن تصوير الخلايا والعينات الأخرى ذات المحتوى المائي العالي باستخدام SEM البيئي ، أو ESEM. يستخدم ESEM شعاع إلكتروني عالي الطاقة يتم مسحه ضوئيا فوق العينة ، كما هو الحال مع SEM التقليدي ، ومع ذلك ، فإنه يتيح تصوير العينات الرطبة أو غير المطلية من خلال الحفاظ على بيئة غازية داخل الغرفة.

يتم ذلك عن طريق فصل غرفة التفريغ العالية التي تحتوي على مسدس الإلكترون عن غرفة العينة باستخدام فتحتين. تتكبد حزمة الإلكترون خسائر كبيرة بسبب تشتت جزيئات الغاز ، ولكنها عادة ما تكون طاقة عالية بما يكفي للتصوير. هنا ، نمت الخلايا على شريحة سيليكون ، وتعمل بنقاط كمومية ، وتم إصلاحها باستخدام بروتوكول تثبيت الجلوتارالديهايد. تم تصوير الخلايا في الماء وتظهر البنية غير المنهارة للخلية مع وجود نقاط كمومية فردية مرئية على سطح الخلية.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لتصور المواد الحيوية باستخدام SEM. يجب أن تفهم الآن كيفية عمل SEM ، وكيفية تحضير العينات البيولوجية وتصويرها ، بالإضافة إلى بعض تطبيقات تقنية الهياكل الحساسة.

شكرا للمشاهدة!