الفحص المجهري والتلطيخ: تلطيخ الجرام والكبسولة والأبواغ الداخلية

البكتيريا هي كائنات حية مجهرية لها العديد من الخصائص المميزة مثل الشكل وترتيب الخلايا وما إذا كانت تنتج كبسولات أم لا ، وما إذا كانت تشكل جراثيم. يمكن تصور جميع هذه الميزات عن طريق تلطيخ والمساعدة في تحديد وتصنيف الأنواع البكتيرية المختلفة.

لفحص أول خاصيتين لشكل الخلية وترتيبها ، يمكننا استخدام تقنية بسيطة تسمى تلطيخ الجرام. هنا ، يتم تطبيق البنفسج البلوري على البكتيريا ، التي تم تثبيتها بالحرارة على شريحة. بعد ذلك ، يضاف محلول اليود في غرام إلى الشريحة ، مما يؤدي إلى تكوين مركب غير قابل للذوبان بين البنفسج البلوري ومحلول اليود في غرام. ثم يتم تطبيق مزيل اللون وأي بكتيريا ذات طبقة ببتيدوغليكان سميكة سوف تلطخ اللون الأرجواني ، حيث لا يمكن اختراق هذه الطبقة بسهولة بواسطة مزيل اللون. يشار إلى هذه البكتيريا باسم إيجابية الجرام.

تحتوي البكتيريا سالبة الجرام على طبقة ببتيدوغليكان أرق وستزيل تلطيخ مزيل اللون ، وتفقد اللون الأرجواني. ومع ذلك ، سوف يلطخون اللون الوردي المحمر عند إضافة بقعة مضادة للسافرانين ، والتي ترتبط بطبقة عديدات السكاريد الدهنية من الخارج. بمجرد تلطيخها ، يمكن ملاحظة الخلايا من حيث التشكل والحجم والترتيب ، كما هو الحال في السلاسل أو العناقيد ، مما يساعد بشكل أكبر في التصنيف وتحديد الهوية.

تقنية أخرى مفيدة في مجموعة أدوات علم الأحياء الدقيقة هي صبغة الكبسولة ، المستخدمة لتصور الكبسولات الخارجية التي تحيط ببعض أنواع الخلايا البكتيرية. نظرا للتركيب غير الأيوني للكبسولة والميل إلى صد البقع ، لن تعمل طرق التلوين البسيطة. بدلا من ذلك ، يتم استخدام تقنية تلطيخ سلبية ، والتي تلطخ الخلفية أولا بتلوين حمضي ، مثل الكونغو الأحمر ، قبل تلطيخ الخلايا البكتيرية بالبنفسجي الكريستالي. هذا يترك أي كبسولة موجودة كهالة واضحة حول الخلايا.

يمكن أن تساعد تقنية التلوين الرئيسية الأخيرة التي يتم تناولها هنا في تحديد ما إذا كانت البكتيريا التي تتم دراستها تشكل جراثيم. في الظروف المعاكسة ، تنتج بعض البكتيريا الأبواغ الداخلية ، والهياكل الخاملة ، والصلبة ، وغير التناسلية التي تتمثل وظيفتها الأساسية في ضمان بقاء البكتيريا خلال فترات الإجهاد البيئي ، مثل درجات الحرارة القصوى أو الجفاف. ومع ذلك ، لا تصنع جميع الأنواع البكتيرية الأبواغ الداخلية ، ويصعب تلطيخها بالتقنيات القياسية لأنها غير منفذة للعديد من الأصباغ. تستخدم طريقة Schaeffer-Fulton صبغة خضراء من الملكيت ، والتي يتم تطبيقها على البكتيريا المثبتة على شريحة. ثم يتم غسل الشريحة بالماء قبل تلطيخها بالسافرانين. ستظهر الخلايا الخضرية باللون الأحمر الوردي ، بينما ستظهر أي جراثيم داخلية موجودة باللون الأخضر. في هذا الفيديو ، سوف تتعلم كيفية إجراء تقنيات التلوين البكتيرية الشائعة هذه ثم فحص عينات التلوين باستخدام الفحص المجهري الضوئي.

لبدء الإجراء ، اربط الشعر الطويل وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات.

بعد ذلك ، قم بتنظيف شريحة مجهر جديدة بمنديل مختبر. بعد ذلك ، قم بوضع 10 ميكرولترات من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1X على الشريحة الأولى. بعد ذلك ، استخدم طرف ماصة معقم لتحديد مستعمرة بكتيرية واحدة من صفيحة أجار LB. تشويه المستعمرة البكتيرية في السائل لإنتاج طبقة رقيقة ومتساوية. ضع الشريحة على سطح الطاولة ، واتركها تجف تماما في الهواء.

بمجرد أن يجف ، أشعل موقد بنسن لإصلاح البكتيريا بالحرارة. باستخدام الملقط ، قم بتمرير الشريحة عبر لهب الموقد عدة مرات ، مع وضع جانب البكتيريا لأعلى ، مع الحرص على عدم تثبيت الشريحة في اللهب لفترة طويلة ، مما قد يؤدي إلى تشويه الخلايا.

الآن ، اعمل فوق الحوض ، أمسك مستوى الشريحة وقم بتطبيق عدة قطرات من البنفسج الكريستالي لغرام لتغطية اللطاخة البكتيرية بالكامل ثم ضع الشريحة على المقعد للوقوف لمدة 45 ثانية. بعد ذلك ، أمسك الشريحة بزاوية ورش تيار من الماء برفق على الجزء العلوي من الشريحة ، مع الحرص على عدم رش اللطاخة البكتيرية مباشرة. الآن ، مع الاستمرار في مستوى الشريحة مرة أخرى ، ضع محلول اليود الخاص بجرام لتغطية البكتيريا الملطخة بالكامل ثم اتركه لمدة 45 ثانية أخرى. بعد ذلك ، اشطف اليود بعناية من الشريحة ، كما هو موضح سابقا. أثناء الإمساك بالشريحة بزاوية ، أضف بضع قطرات من مزيل اللون الخاص ب Gram إلى الشريحة ، مما يسمح لها بالجري فوق البكتيريا الملطخة ، فقط حتى يصبح الجريان السطحي صافيا ، لمدة 5 ثوان تقريبا. اشطفها بالماء على الفور كما هو موضح سابقا. سيؤدي ذلك إلى الحد من الإفراط في إزالة لون اللطاخة. بعد ذلك ، مع الاستمرار في مستوى الشريحة مرة أخرى ، قم بتطبيق صبغة السافرانين المضادة لغرام لتغطية البكتيريا الملطخة بالكامل. بعد 45 ثانية ، اشطف السافرانين برفق من الشريحة بالماء ، كما هو موضح سابقا ، ثم جفف بالمناشف الورقية.

أخيرا ، أضف قطرة من زيت الغاطس مباشرة إلى الشريحة ، ثم افحص الشريحة باستخدام مجهر ضوئي بعدسة موضوعية زيت 100X.

لبدء بروتوكول التلوين هذا ، ارتد أولا معدات الحماية الشخصية الصحيحة ثم تأكد من نظافة الشرائح الزجاجية التي سيتم استخدامها.

بعد ذلك ، قم بإعداد الحلول. لصنع محلول بنفسجي بلوري 1٪ ، اخلطي 0.25 جرام من مسحوق البنفسج البلوري مع 25 مل من الماء المقطر والدوامة حتى يذوب. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول الكونغو الأحمر بنسبة 1٪ عن طريق خلط 0.25 جرام من مسحوق الكونغو الأحمر مع 25 مل من الماء المقطر والدوامة حتى يذوب. الآن ، قم بوضع 10 ميكرولتر من محلول الكونغو الأحمر على الشريحة. باستخدام طرف ماصة نظيف ومعقم ، حدد مستعمرة بكتيرية واحدة من لوحة أجار LB. بعد ذلك ، قم بتلطيخ المستعمرة البكتيرية في الصبغة لإنتاج طبقة رقيقة ومتساوية. جفف الشريحة البكتيرية تماما في الهواء لمدة 5-7 دقائق. بمجرد أن تجف الشريحة ، غمر اللطاخة بما يكفي من البنفسج الكريستالي بنسبة 1٪ لتغطية اللطاخة واتركها لمدة دقيقة واحدة. الآن ، أمسك الشريحة بزاوية ورش تيار من الماء برفق على الجزء العلوي من الشريحة ، مع الحرص على عدم رش البكتيريا مباشرة. استمر في الضغط على الشريحة بزاوية 45 درجة حتى تجف تماما في الهواء. أخيرا ، أضف قطرة من زيت الغمر مباشرة إلى الشريحة ، ثم افحص الشريحة باستخدام مجهر ضوئي مع هدف زيت 100X.

لإجراء تلطيخ الأبواغ الداخلية ، أولا ، قم بإعداد محلول أخضر 0.5٪ من الملكيت عن طريق خلط 0. 125 جرام من مسحوق الملكيت الأخضر مع 25 مل من الماء المقطر ، ثم قم بدوامة المحلول حتى يذوب. بعد ذلك ، قم بوضع 10 ميكرولتر من 1X PBS في وسط الشريحة. بعد ذلك ، استخدم طرف ماصة معقم لتحديد مستعمرة بكتيرية واحدة من صفيحة أجار LB. تشويه البكتيريا في السائل لإنتاج طبقة رقيقة ومتساوية. الآن ، ضع الشريحة على سطح الطاولة ، واتركها تجف تماما في الهواء. بمجرد أن يجف ، أشعل موقد بنسن لإصلاح البكتيريا بالحرارة. مرر الشريحة عبر لهب الموقد الأزرق عدة مرات ، بحيث يكون جانب البكتيريا متجها لأعلى. بعد ذلك ، بمجرد أن تبرد الشريحة ، ضع قطعة من ورق العدسة المقطوع مسبقا فوق اللطاخة المثبتة بالحرارة. بعد ذلك ، قم بتشغيل لوح التسخين إلى أعلى إعداد ، واترك دورق الماء ليغلي.

قم بتشبع ورق العدسة بمحلول الملكيت الأخضر ، وباستخدام الملقط ، ضع الشريحة فوق دورق الماء المغلي على البخار لمدة 5 دقائق. حافظ على رطوبة ورق العدسة عن طريق إضافة المزيد من الصبغة، قطرة واحدة في كل مرة، حسب الحاجة. بعد ذلك ، مرة أخرى باستخدام الملقط ، التقط الشريحة من الدورق وقم بإزالة ورق العدسة والتخلص منه. دع الشريحة لتبرد لمدة 2 دقيقة. العمل فوق الحوض ، أمسك الشريحة بزاوية ، ورش تيار من الماء برفق على الجزء العلوي من الشريحة. الآن ، استمر في الضغط على مستوى الشريحة وقم بتطبيق Safranin لتغطية الشريحة بالكامل. ثم اتركه لمدة 1 دقيقة. بعد ذلك ، أمسك الشريحة بزاوية واشطفها كما هو موضح سابقا. اترك الشريحة تجف في الهواء على سطح الطاولة. أخيرا ، أضف قطرة من زيت الغمر مباشرة إلى الشريحة ، ثم افحص الشريحة بمجهر ضوئي ، بهدف زيت 100X.

في بروتوكول تلطيخ غرام ، يمكن أن ينتج عن ذلك بقعتان ملونتان مختلفتان. يشير التلوين الأرجواني الداكن إلى أن البكتيريا موجبة الجرام وأنها احتفظت بصبغة البنفسج البلوري. في المقابل ، فإن تلطيخ اللون الوردي المحمر هو سمة من سمات البكتيريا سالبة الجرام ، والتي سيتم تلوينها بدلا من ذلك بواسطة صبغة السافرانين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصور أشكال وترتيبات مختلفة من البكتيريا بعد تلطيخ الجرام. على سبيل المثال ، من الممكن التمييز بين المكورات ، أو البكتيريا المستديرة ، عن العصيات على شكل قضيب ، أو تحديد البكتيريا ، التي تشكل خيوطا ، مقارنة بتلك التي تتجمع عادة على شكل كتل أو تحدث منفردة.

في صورة المجهر الملون بالكبسولة ، عادة ما تكون الخلايا البكتيرية ملطخة باللون الأرجواني ، ويجب أن تكون خلفية الشريحة ملطخة بشكل داكن. على هذه الخلفية المظلمة ، ستظهر كبسولات البكتيريا ، إن وجدت ، كهالة واضحة حول الخلايا.

أخيرا ، في تلطيخ الأبواغ الداخلية ، سيتم تلطيخ الخلايا الخضرية باللون الأحمر بواسطة صبغة السافرانين. إذا كانت الأبواغ الداخلية موجودة في العينة ، فستحتفظ ببقعة الملكيت الخضراء وتظهر لونها أخضر مزرق.