What is the difference between Gram-positive and Gram-negative bacteria?

Gram-positive bacteria have a thick peptidoglycan layer that retains crystal violet stain, appearing dark purple. Gram-negative bacteria have a thinner peptidoglycan layer and higher lipid content, so they lose the purple stain during decolorization and are counterstained red by safranin, which binds to their lipopolysaccharide layer.

Why is heat-fixing used in Gram staining but not in capsule staining?

Heat-fixing adheres bacterial cells to the slide and makes them more readily accepting of stains in Gram staining. However, heat-fixing is avoided in capsule staining because it can disrupt or dehydrate the capsule, causing false negatives, and can shrink cells, creating a clearing that mimics a capsule and causes false positives.

How does capsule staining reveal bacterial capsules?

Capsule staining uses negative staining, applying an acidic colorant like Congo red to stain the background and bacterial cells, while leaving capsules unstained. The capsule appears as a clear halo around the purple-stained bacterial cells against the dark background, making it visible under light microscopy.

What are endospores and why are they difficult to stain?

Endospores are dormant, tough, non-reproductive structures that bacteria produce under adverse conditions like extreme temperatures or dehydration to ensure survival. They are difficult to stain with standard techniques because they are impermeable to most dyes, requiring specialized methods like the Schaeffer-Fulton technique with malachite green and heat.

What colors result from endospore staining and what do they indicate?

In endospore staining, vegetative cells appear pinkish-red after safranin counterstaining, while endospores retain the malachite green stain and appear bluish-green. These distinct colors allow differentiation between spore-forming and non-spore-forming bacteria and confirm the presence of spores in a sample that could lead to bacterial contamination.

How can Gram staining be used to identify bacterial morphology and arrangement?

After Gram staining, bacterial cells can be observed under light microscopy to determine their shape and arrangement. Cocci are round bacteria, while bacilli are rod-shaped. Bacteria may arrange as single cells, pairs, chains, or clusters, and these morphological features aid in bacterial classification and identification.

Why is negative staining necessary for capsule visualization?

Capsules have a non-ionic composition and tend to repel stains, making simple staining methods ineffective. Negative staining works by coloring the background and cells while leaving the capsule unstained, creating contrast. This approach avoids heat-fixing, which could damage the capsule and produce false results when using pure cultures and streak plating isolation of single bacterial colonies.

الفحص المجهري والتلطيخ: تلطيخ الجرام والكبسولة والأبواغ الداخلية

0 مشاهدة11:33 دقيقة

1. تلطيخ الجرام

الإعداد
1. ارتد قفازات ومعطف مختبر غير قابل للاشتعال ، لأن الأصباغ ستلطخ اليدين والملابس.
2. يستخدم موقد بنسن لإصلاح البكتيريا بالحرارة. توخي الحذر عند العمل باللهب ؛ ربط الشعر الطويل.
3. سيتم استخدام كواشف بقع الجرام المتوفرة تجاريا.
4. نظف شرائح المجهر بمناديل المختبر.
البروتوكول
1. Pipet 10 ميكرولتر من المحلول الملحي أو المرق المزروع بالفوسفات على الشريحة.
2. تشويه مستعمرة بكتيرية في السائل لإنتاج طبقة رقيقة ومتساوية.
  ملاحظة: لا تستخدم الثقافات التي يزيد عمرها عن 24 ساعة ، لأن البكتيريا القديمة جدا يمكن أن يكون لها تغييرات في جدار الخلية ، مما سيؤثر على نتائج صبغة الجرام (1 ، 4).
3. شريحة جافة تماما في الهواء.
4. بمجرد أن تجف ، تثبت البكتيريا بالحرارة عن طريق تمريرها عبر اللهب (جانب البكتيريا لأعلى) 4-5 مرات.
  ملاحظة: لا تمسك الشريحة في اللهب لفترة طويلة وإلا فقد تشوه الخلايا البكتيرية (1).
5. العمل فوق الحوض ، مع الاستمرار في مستوى الشريحة وتطبيق Gram's Crystal Violet لتغطية البكتيريا الثابتة بالحرارة بالكامل ، واتركها تقف لمدة 45 ثانية.
6. اشطف الكريستال البنفسجي الزائد عن طريق إمساك الشريحة بزاوية ورش تيار لطيف غير مباشر من الماء على الشريحة وتركها تتدفق فوق البكتيريا الملطخة. لا ترش الماء مباشرة على البكتيريا.
7. مع الاستمرار في مستوى الشريحة مرة أخرى ، قم بتطبيق محلول اليود من Gram لتغطية البكتيريا الملطخة بالكامل ، واتركه لمدة 45 ثانية.
8. اشطف اليود الزائد كما في الخطوة 1.2.6 أعلاه.
9. أثناء الإمساك بالشريحة بزاوية ، أضف بضع قطرات من Decolorizer على الشريحة ، واتركها تتدفق فوق البكتيريا الملطخة حتى يصبح الجريان السطحي واضحا ؛ عادة ، حوالي 5 ثوان. اشطفها على الفور بالماء كما في الخطوة 1.2.6 أعلاه.
  ملاحظة: هذه خطوة حاسمة في البروتوكول. سيؤدي السماح لمزيل اللون بالتنقيط لفترة طويلة جدا أو ليس لفترة كافية إلى تلطيخ الجرام الكاذب (4).
10. مع الاستمرار في مستوى الشريحة مرة أخرى ، قم بتطبيق سافرانين غرام لتغطية البكتيريا بالكامل ، واتركها لمدة 45 ثانية.
11. اشطف السافرانين الزائد كما في الخطوة 1.2.6 أعلاه.
12. لطخة ، لا تفرك ، الماء الزائد من الشريحة باستخدام المناشف الورقية.
13. افحص الشريحة على المجهر باستخدام الغمر بالزيت بهدف 100X.
النتائج وتحليل البيانات
1. سوف تلطخ البكتيريا موجبة الجرام اللون الأرجواني.
2. سوف تلطخ البكتيريا سالبة الجرام باللون الأحمر.
3. سيكون شكل البكتيريا (المكورات ، العصيات ، القضبان المنحنية ، اللوالب) مرئيا.
4. سيكون ترتيب الخلايا البكتيرية (الخلايا المفردة ، الخلايا المزدوجة ، سلاسل الخلايا ، المجموعات ، التجمعات) مرئيا.

2. تلطيخ الكبسولة

الإعداد
1. ارتد قفازات ومعطف مختبر لأن الأصباغ تلطخ اليدين والملابس.
2. لتحضير محلول بنفسجي كريستالي 1٪ ، اخلطي 0.25 جرام من البنفسج الكريستالي مع 25 مل من الماء المقطر حتى يذوب.
3. لتحضير محلول كونغو ريد 1٪ ، اخلطي 0.25 جرام من الكونغو الأحمر مع 25 مل من الماء المقطر حتى يذوب.
4. نظف الشرائح بمناديل المختبر.
البروتوكول
1. ضع 10 ميكرولتر من الكونغو الأحمر على الشريحة.
2. باستخدام طرف الماصة ، قم بتلطيخ مستعمرة بكتيرية في الصبغة لإنتاج طبقة رقيقة متساوية.
3. شريحة جافة تماما بالهواء مع خليط الصبغة / الخلايا ، 5-7 دقائق.
  ملاحظة: لا تقم بإصلاح الحرارة لأن التسخين يمكن أن يجفف أو يشوه الكبسولة.
4. اغمر اللطاخة ب 1٪ كريستال بنفسجي لمدة 1 دقيقة.
5. اشطف البقعة الزائدة عن طريق إمساك الشريحة بزاوية ورش تيار لطيف غير مباشر من الماء على الشريحة وتركها تتدفق فوق البكتيريا الملطخة. لا ترش الماء مباشرة على البكتيريا.
6. امسك الشريحة بزاوية 45 درجة حتى تجف تماما في الهواء.
7. افحص اللطاخة على المجهر تحت الغمر بالزيت بهدف 100X.
النتائج وتحليل البيانات
1. سوف تلطخ الخلايا البكتيرية اللون الأرجواني.
2. سوف تلطخ خلفية الشريحة داكنة.
3. ستكون الكبسولات هالة واضحة حول الخلايا على خلفية داكنة.

3. تلطيخ الأبواغ الداخلية (طريقة شيفر-فولتون)

الإعداد
1. ارتد قفازات ومعطف مختبر غير قابل للاشتعال لحماية اليدين والملابس من الأصباغ واللهب.
2. يستخدم موقد بنسن لتسخين إصلاح البكتيريا. توخي الحذر عند العمل باللهب ؛ ربط الشعر الطويل.
3. لتحضير محلول 0.5٪ من الملكيت الأخضر ، اخلطي 0.125 جرام من الملكيت الأخضر مع 25 مل من الماء المقطر حتى يذوب.
4. استخدم حل كاشف سافرانين من Gram المتاح تجاريا.
5. نظف الشرائح بمناديل المختبر.
البروتوكول
1. Pipet 10 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) أو مرق الاستزراع على الشريحة.
2. باستخدام تقنية التعقيم ، قم بتلطيخ مستعمرة بكتيرية في السائل لإنتاج طبقة رقيقة ومتساوية.
  ملاحظة: لا تتشكل الأبواغ الداخلية بشكل عام في الخلايا الصغيرة. لذلك ، يوصى بأن تكون الثقافة بين 18 و 36 ساعة (9).
3. شريحة جافة تماما في الهواء.
4. إصلاح الحرارة عن طريق تمرير الشريحة (جانب البكتيريا لأعلى) عبر اللهب 4-5 مرات.
5. للمساعدة في احتواء الصبغة ، ضع قطعة من ورق العدسة (مقطوعة لتناسب اللطاخة البكتيرية) فوق اللطاخة المثبتة بالحرارة.
6. ورق العدسة المشبع بمحلول الملكيت الأخضر.
7. ضع الشريحة فوق دورق الماء المغلي على طبق ساخن ، وانزلق بالبخار لمدة 5 دقائق ، مع الحفاظ على رطوبة ورق العدسة عن طريق إضافة المزيد من الصبغة قطرة في كل مرة حسب الحاجة.
  ملاحظة: تجنب ارتفاع درجة الحرارة وتجفيف محلول الصبغة.
8. إزالة الشريحة من الدورق ، وإزالة وتجاهل ورق العدسة ، واترك الشريحة لتبرد 2 دقيقة.
9. اضغط مع الاستمرار على الشريحة بزاوية ، واشطفها جيدا عن طريق رش تيار لطيف غير مباشر من الماء على الشريحة ، مما يسمح لها بالتصريف فوق اللطاخة.
10. عقد مستوى الشريحة ، مسحة الفيضانات مع Safranin ، السماح للوقوف 1 دقيقة.
11. اشطف السافرانين الزائد كما في الخطوة 3.2.9 أعلاه.
12. اتركيه ليجف في الهواء.
13. افحص الشريحة على المجهر تحت الغمر بالزيت بهدف 100X.
تحليل النتائج والبيانات
1. سوف تلطخ الجراثيم باللون الأخضر.
2. سوف تلطخ الخلايا الخضرية باللون الأحمر.
3. ستحتوي بعض الخلايا الخضرية على جراثيم. سوف تلطخ الخلايا باللون الأحمر ، بينما تصبغ الأبواغ الداخلية باللون الأخضر.

المصدر: Rhiannon M. LeVeque¹, Natalia Martin¹, Andrew J. Van Alst¹, and Victor J. DiRita¹
¹ قسم علم الأحياء الدقيقة وعلم الوراثة الجزيئية ، جامعة ولاي…