ذبابة الفاكهة تشريح اليرقات NMJ
فبراير 4, 2009
هذا البروتوكول يوضح كيفية تشريح ذبابة الفاكهة اليرقات في إعداد و / أو التصوير المناعية من مفترق الطرق العصبية والعضلية.
تبدأ هذه العملية بوضع يرقات في الطور الثالث على طبق التشريح. يتم وضع دبابيس في الطرفين الخلفي والأمامي لليرقة. تُستخدم المقصات لفتح اليرقة، بينما تُستخدم الملاقط لإزالة الأعضاء الداخلية.
أخيراً، يتم وضع أربعة دبابيس إضافية في كل ركن من جدار جسم اليرقة لإبقائه مشدوداً أثناء التثبيت. مرحباً، أنا جوناثان برينت من مختبر برايان مكابي في قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية الجزيئية في كلية الأطباء والجراحين بجامعة كولومبيا. سنعرض لكم اليوم إجراء تشريح يرقة drosophila و MJ.
نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التطور التشابكي للوصلات العضلية العصبية. لذا، فلنبدأ. في يرقات drosophila، يوجد 30 عضلة لكل نصف قطعة جسمانية، وترتيبها ضمن جدار الجسم المحيطي معروف.
تقوم مجموعة مكونة من 35 عصبوناً حركياً بتعصيب هذه العضلات وفق نمط نمطي للغاية. وللوصول إلى الوصلة العصبية العضلية أو الـ NMJ، من الضروري تشريح كل يرقة بعناية باستخدام أدوات التشريح المناسبة. ويمكن استخدام الـ NMJ في التصوير أو الكيمياء النسيجية المناعية أو الفيزيولوجيا الكهربائية.
ابدأ الإجراء بوضع قطرة من منظم HL 3.1 على طبق تشريح. يتم تحضير المنظم مسبقاً وتبريده على الثلج. التقط بعناية يرقات نجمية في المرحلة الثالثة من النهاية المتجولة من جانب القارورة باستخدام ملاقط SS كبيرة.
تشير هذه الحركة إلى أن اليرقة لم تدخل في مرحلة التعذر. ضع اليرقة بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى في قطرة من المحلول المنظم على طبق التشريح. سيعمل المحلول المنظم البارد على تخدير اليرقة وإبقائها ساكنة. باستخدام الملاقط، ضع دبوس "منشين" بين الكرات الخلفية، ثم ضع دبوساً ثانياً بالقرب من خطافات الفم الداكنة بحيث تكون اليرقة ممدودة وجاهزة للفتح والفرش.
باستخدام مقصات زنبركية، قم بعمل شق أفقي صغير باتجاه الطرف الخلفي لليرقات. أدخل إحدى شفرات المقص في الشق وقم بعمل قطع طولي باتجاه الطرف الأمامي لليرقة. بعد ذلك، قم بعمل شقوق أفقية عند الطرف الأمامي لليرقات على يسار ويمين الدبوس.
لإزالة الأعضاء مثل الأمعاء، أضف عدة قطرات من محلول HL 3.1 buffer إلى الحيوان، حيث ستطفو الأمعاء والأعضاء الأخرى في المحلول، ويمكن سحبها بعيدًا عن الجسم باستخدام الملاقط. كما يجب إزالة الجهاز الرغامي مع الأعضاء الأخرى. الآن، قم بكشف عضلات الجسم الداخلية عن طريق تثبيت الشقوق الناتجة عن العملية بمسامير تثبيت.
تأكد من تمديد جدران الجسم أفقياً وعمودياً عند تثبيت السدائل. قم بإزالة أي قطع متبقية من الأعضاء واغسلها مرة واحدة.
بعد إضافة منظم HL 3.1 الطازج، تصبح اليرقة الآن جاهزة للتثبيت باستخدام الفورمالديهايد المُحضّر حديثاً والمخفف بنسبة 3.5% في XPBS واحد؛ قم بغمر اليرقات والمثبت بالكامل والانتظار لمدة 25 دقيقة. عند انتهاء فترة التثبيت، اغسل اليرقات مرتين باستخدام منظم HL 3.1 لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة الدبابيس بعناية، وانقل اليرقات إلى أنابيب سعة 1.5 مل تحتوي على XPBS واحد عند الحاجة.
يمكن تخزين اليرقات لمدة تصل إلى يومين عند درجة حرارة 4 °C. ولتحقيق أفضل النتائج، يجب استخدام اليرقات المشرحة فوراً. هناك عدة مكونات رئيسية لليرقة المشرحة بشكل صحيح من ذبابة Drosophila.
أولاً، يجب توخي الحذر لعدم إتلاف العضلات، وخاصة العضلات السادسة والسابعة والرابعة. ثانياً، يجب تمديد الحيوان بشكل صحيح، وإلا فقد لا يكون الوصل العصبي العضلي متاحاً أو قابلاً للتمييز.
يمكنكم رؤية يرقة تم تشريحها بشكل صحيح هنا. حيث يظهر الوصل العصبي العضلي (NMJ) بوضوح، وأصبح النظام الآن جاهزاً لإجراء التجارب. لقد قدمنا لكم للتو كيفية تشريح يرقة المريء لدراسة الوصل العصبي العضلي.
عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم ترك العضلات سليمة؛ فإذا تضررت العضلات، فلن تكون هناك وصلات عصبية عضلية لدراستها. هذا كل شيء.
شكرًا للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول كيفية تشريح يرقات Drosophila تحضيراً للكيمياء النسيجية المناعية و/أو تصوير الوصلة العصبية العضلية. تتضمن العملية وضع الدبابيس بعناية واستخدام المقصات والملاقط لتحضير اليرقات لمزيد من التحليل.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- البيولوجيا التنموية
- الكيمياء النسيجية المناعية
خلفية علمية
- تُستخدم يرقات Drosophila بشكل شائع في الدراسات النيوروبيولوجية.
- يُعد الوصل العصبي العضلي منطقة بالغة الأهمية لدراسة الانتقال التشابكي.
- تُعتبر تقنيات التشريح السليمة ضرورية لنجاح عمليات التصوير والتحليل.
- يوفر هذا البروتوكول طريقة معيارية لتشريح اليرقات.
الغرض من الدراسة
- تجهيز يرقات Drosophila للتحليل المناعي الكيميائي النسيجي.
- تسهيل تصوير الوصلة العصبية العضلية.
- توحيد تقنيات التشريح لضمان إمكانية تكرار النتائج في الأبحاث.
الطرق المستخدمة
- وضع الدبابيس لتثبيت اليرقات أثناء عملية التشريح.
- استخدام المقصات لفتح اليرقات.
- إزالة الأعضاء الداخلية باستخدام الملاقط.
- تثبيت جدار الجسم لأغراض التصوير.
النتائج الرئيسية
- تتيح عملية التشريح الناجحة رؤية واضحة للوصلة العصبية العضلية.
- تعزز الطرق الموحدة من اتساق النتائج عبر التجارب المختلفة.
- تسهل إجراء المزيد من الدراسات حول الوظيفة المشبكية وتطورها.
- توفر أساساً للأبحاث المستقبلية في علم الأحياء العصبي لـ Drosophila.
الاستنتاجات
- يعد تشريح يرقات Drosophila خطوة حاسمة في أبحاث البيولوجيا العصبية.
- تساهم التقنيات الصحيحة في تحسين جودة التحليل الكيميائي النسيجي المناعي.
- يعد هذا البروتوكول مورداً قيماً للباحثين في هذا المجال.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يعمل الوصل العصبي العضلي (NMJ) في يرقات Drosophila كنموذج سهل التعامل معه جينياً لدراسة التطور واللدونة التشابكية، حيث يوفر إمكانية وصول عالية ودقة على مستوى الخلية الواحدة. يتيح بروتوكول التشريح هذا تحضيراً قابلاً للتكرار للوصل العصبي العضلي للتطبيقات اللاحقة مثل التصوير، والكيمياء النسيجية المناعية، والفيزيولوجيا الكهربائية، مما يدعم التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الآلية في مراحل الاكتشاف المبكرة. ومن خلال توفير طريقة معيارية لعزل وتصوير البنى التشابكية، تعزز هذه التقنية الثقة التنبؤية في تقييم الأهداف العصبية الحيوية وتوضيح المسارات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للمستحضرات الصيدلانية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية المتعلقة بالوظيفة التشابكية ومسارات النمو العصبي.
- القيمة التشغيلية: تدعم الحد من المخاطر البيولوجية من خلال التصوير عالي الدقة لأنماط تعصيب العضلات بواسطة العصبونات الحركية.
- القيمة التنبؤية: تسهل تقييم التدخلات الجينية أو الدوائية على شكل ووظيفة الوصلة العصبية العضلية NMJ.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: يتم تحضير أنظمة بيولوجية موحدة لفحص المركبات مع ضمان إمكانية الوصول المتسقة إلى الوصلات العصبية العضلية (NMJ).
- المخرجات الكمية: تتيح قياس عدد البراعم التشابكية وحجمها وتوطين البروتين كقراءات نمطية ظاهرية.
- القابلية للتوسع: تدعم المعالجة المتوازية لليرقات في حملات الفحص متوسطة الإنتاجية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: يمثل نماذج لآليات مشبكية محفوظة يمكن تطبيقها في التحقق من صحة أهداف الاضطرابات العصبية والاضطرابات العضلية العصبية.
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين النتائج الجينية في Drosophila والبيولوجيا المشبكية للثدييات من خلال المسارات المحفوظة.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يتيح التقييم في المراحل المبكرة لارتباط الهدف وتعديل المسار في نظام حي وسليم.
تكامل سير العمل والعمليات التسلسلية
يتكامل سير عمل التشريح في مراحل الاكتشاف المبكرة من خلال تمكين اختبار الفرضيات، ثم ينتقل إلى تحديد المركبات الرائدة عبر الأنماط الظاهرية التشابكية القابلة للقياس، ويدعم التحقق من الصلاحية في المرحلة قبل السريرية من خلال الفرز الظاهري ذي الصلة بالمرض.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم توضيح المسارات التشابكية والتحقق من الأهداف الوظيفية من خلال التصوير المباشر للوصلات العصبية العضلية (NMJ).
- الفحص المسحي: توفر تحضيرات جاهزة للمقايسة مع قراءات هيكلية وفلورية قابلة للتكرار لتقييم المركبات.
- التحليلات: تولد بيانات مورفولوجية وكيميائية نسيجية مناعية كمية لتحليل الظروف المقارنة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط الآليات التشابكية في ذبابة Drosophila بالنماذج قبل السريرية عبر المسارات الجزيئية المحفوظة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لتقييم الأهداف العصبية عبر حملات اكتشاف متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في الدراسات التشابكية.
- القيمة التشغيلية: تضمن التوحيد القياسي وقابلية التكرار وقابلية التوسع في تحضير الوصلات العصبية العضلية (NMJ) عبر المختبرات.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تمكين الكشف المبكر عن السمية التشابكية أو الارتباط بالهدف.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة وفقاً للمخاطر للأهداف العصبية بناءً على النتائج التشابكية الوظيفية.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في التعامل مع ذبابة الفاكهة (Drosophila)، والجراحة المجهرية، والمجهر الفلوري.
- تعتمد على أطباق التشريح، ودبابيس الحشرات، ومقصات الزنبرك، والملاقط، ومحلول HL 3.1 المنظم.
- تستلزم توحيد شد الدبابيس وظروف المحلول المنظم بين جميع المستخدمين.
- تشمل اعتبارات التكيف تباين مراحل اليرقات والخلفيات الجينية التي تؤثر على سلامة العضلات.
- تشمل القيود العملية متطلبات المهارة اليدوية واحتمالية تلف العضلات في حال عدم دقة التشريح.
