ذبابة الفاكهة تشريح اليرقات NMJ
فبراير 4, 2009
هذا البروتوكول يوضح كيفية تشريح ذبابة الفاكهة اليرقات في إعداد و / أو التصوير المناعية من مفترق الطرق العصبية والعضلية.
يبدأ هذا الإجراء بوضع يرقات الطور الثالث على لوحة التشريح. توضع المسامير في الأطراف الخلفية والأمامية لليرقات. يستخدم المقص لقطع اليرقات وتستخدم الملقط لإزالة الأعضاء الداخلية.
أخيرا ، يتم وضع أربعة دبابيس أخرى في كل ركن من أركان جدار جسم اليرقة لتثبيتها أثناء التثبيت. مرحبا ، أنا جوناثان برنت من مختبر بريان مكابي في قسم علم وظائف الأعضاء والفيزياء الحيوية الفردية في كلية الأطباء والجراحين بجامعة كولومبيا. سنعرض لك اليوم إجراء ذبابة الفاكهة وتشريح MJ.
نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التطور المشبكي للوصلة العصبية العضلية. لذلك دعونا نبدأ. في ذبابة الفاكهة ، هناك 30 عضلة لكل جزء هيمي يعرف ترتيبها داخل جدار الجسم المحيطي.
ما مجموعه 35 خلية عصبية حركية تعصف هذه العضلات بنمط نمطي للغاية. للوصول إلى الوصلة العصبية العضلية أو NMJ ، من الضروري تشريح كل يرقة بعناية مع التشريح المناسب. يمكن استخدام NMJ لتصوير الكيمياء المناعية أو الفيزيولوجيا الكهربية.
ابدأ الإجراء بوضع قطرة من المخزن المؤقت HL 3.1 على لوحة التشريح. يتم عمل المخزن المؤقت مسبقا وتبريده على الجليد. اختر بعناية يرقات نجمة الطرف الثالث المتجولة من جانب القارورة باستخدام ملقط SS كبير.
تشير الحركة إلى أن اليرقات لم تدخل الشرانق ضع الجانب الظهري لليرقات لأعلى في قطرة العازلة على لوحة التشريح. سيقوم المخزن المؤقت البارد بتخدير اليرقات وإبقائها ثابتة باستخدام الملقط. ضع دبوسا منوشين بين الكرويات الخلفية ، ثم ضع دبوسا ثانيا بالقرب من خطافات الفم الداكنة بحيث تمتد اليرقات وتكون جاهزة للفتح.
باستخدام مقص زنبركي ، قم بعمل شق أفقي صغير باتجاه الطرف الخلفي لليرقات. أدخل شفرة واحدة من المقص في العلوم وقم بعمل قطع بالطول باتجاه الطرف الأمامي لليرقة. ثم قم بعمل شقوق أفقية في الطرف الأمامي من اليرقات إلى يسار ويمين الدبوس.
لإزالة أعضاء مثل الأمعاء ، أضف عدة قطرات من المخزن المؤقت HL 3.1 إلى ، وسوف تطفو الأمعاء والأعضاء الأخرى في المحلول ويمكن سحبها بعيدا عن الجسم باستخدام الملقط. أيضا ، قم بإزالة نظام القصبة الهوائية مع الأعضاء الأخرى. الآن قم بكشف عضلات الجسم الداخلية عن طريق تثبيت اللوحات التي تم إجراؤها بواسطة الشقوق.
تأكد من تمديد جدران الجسم أفقيا ورأسيا. عند تثبيت اللوحات. قم بإزالة أي قطع عضو متبقية واغسلها مرة واحدة.
من خلال إضافة المخزن المؤقت HL 3.1 الطازج ، أصبحت اليرقة جاهزة الآن للإصلاح بالفورمالديهايد الطازج المخفف إلى 3.5٪ في XPBS واحد ، اغمر اليرقات تماما ومثبتا وانتظر 25 دقيقة. عندما تنتهي فترة التثبيت ، اغسل اليرقات مرتين باستخدام المخزن المؤقت HL 3.1 لمدة ثلاث دقائق. قم بإزالة المسامير بعناية ، وانقل اليرقات إلى أنابيب 1.5 مل تحتوي على XPBS واحد إذا لزم الأمر.
يمكن تخزين اليرقات لمدة تصل إلى يومين عند أربع درجات مئوية. للحصول على أفضل النتائج ، استخدم اليرقات المقطوعة على الفور. هناك العديد من المكونات الرئيسية ليرقة ذبابة الفاكهة التي تم تشريحها بشكل صحيح.
أولا ، احرص على عدم إتلاف العضلات ، خاصة ستة وسبعة وأربعة. ثانيا ، يجب أن يمتد بشكل صحيح. خلاف ذلك ، قد لا يكون الوصول إلى الوصلة العصبية العضلية أو يمكن تمييزها.
هنا يمكنك رؤية يرقة تشريح بشكل صحيح. إن NMJ مرئي بوضوح والنظام جاهز الآن للتجارب. لقد أوضحنا لك للتو كيفية تشريح يرقة المريء لدراسة الوصلة العصبية العضلية.
عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم قيادة العضلات سليمة. في حالة تلف العضلات ، لن تكون هناك وصلات عصبية عضلية للدراسة. هذا كل شيء.
شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول كيفية تشريح يرقات Drosophila تحضيراً للكيمياء النسيجية المناعية و/أو تصوير الوصلة العصبية العضلية. تتضمن العملية وضع الدبابيس بعناية واستخدام المقصات والملاقط لتحضير اليرقات لمزيد من التحليل.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- البيولوجيا التنموية
- الكيمياء النسيجية المناعية
خلفية علمية
- تُستخدم يرقات Drosophila بشكل شائع في الدراسات النيوروبيولوجية.
- يُعد الوصل العصبي العضلي منطقة بالغة الأهمية لدراسة الانتقال التشابكي.
- تُعتبر تقنيات التشريح السليمة ضرورية لنجاح عمليات التصوير والتحليل.
- يوفر هذا البروتوكول طريقة معيارية لتشريح اليرقات.
الغرض من الدراسة
- تجهيز يرقات Drosophila للتحليل المناعي الكيميائي النسيجي.
- تسهيل تصوير الوصلة العصبية العضلية.
- توحيد تقنيات التشريح لضمان إمكانية تكرار النتائج في الأبحاث.
الطرق المستخدمة
- وضع الدبابيس لتثبيت اليرقات أثناء عملية التشريح.
- استخدام المقصات لفتح اليرقات.
- إزالة الأعضاء الداخلية باستخدام الملاقط.
- تثبيت جدار الجسم لأغراض التصوير.
النتائج الرئيسية
- تتيح عملية التشريح الناجحة رؤية واضحة للوصلة العصبية العضلية.
- تعزز الطرق الموحدة من اتساق النتائج عبر التجارب المختلفة.
- تسهل إجراء المزيد من الدراسات حول الوظيفة المشبكية وتطورها.
- توفر أساساً للأبحاث المستقبلية في علم الأحياء العصبي لـ Drosophila.
الاستنتاجات
- يعد تشريح يرقات Drosophila خطوة حاسمة في أبحاث البيولوجيا العصبية.
- تساهم التقنيات الصحيحة في تحسين جودة التحليل الكيميائي النسيجي المناعي.
- يعد هذا البروتوكول مورداً قيماً للباحثين في هذا المجال.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يعمل الوصل العصبي العضلي (NMJ) في يرقات Drosophila كنموذج سهل التعامل معه جينياً لدراسة التطور واللدونة التشابكية، حيث يوفر إمكانية وصول عالية ودقة على مستوى الخلية الواحدة. يتيح بروتوكول التشريح هذا تحضيراً قابلاً للتكرار للوصل العصبي العضلي للتطبيقات اللاحقة مثل التصوير، والكيمياء النسيجية المناعية، والفيزيولوجيا الكهربائية، مما يدعم التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الآلية في مراحل الاكتشاف المبكرة. ومن خلال توفير طريقة معيارية لعزل وتصوير البنى التشابكية، تعزز هذه التقنية الثقة التنبؤية في تقييم الأهداف العصبية الحيوية وتوضيح المسارات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للمستحضرات الصيدلانية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية المتعلقة بالوظيفة التشابكية ومسارات النمو العصبي.
- القيمة التشغيلية: تدعم الحد من المخاطر البيولوجية من خلال التصوير عالي الدقة لأنماط تعصيب العضلات بواسطة العصبونات الحركية.
- القيمة التنبؤية: تسهل تقييم التدخلات الجينية أو الدوائية على شكل ووظيفة الوصلة العصبية العضلية NMJ.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: يتم تحضير أنظمة بيولوجية موحدة لفحص المركبات مع ضمان إمكانية الوصول المتسقة إلى الوصلات العصبية العضلية (NMJ).
- المخرجات الكمية: تتيح قياس عدد البراعم التشابكية وحجمها وتوطين البروتين كقراءات نمطية ظاهرية.
- القابلية للتوسع: تدعم المعالجة المتوازية لليرقات في حملات الفحص متوسطة الإنتاجية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: يمثل نماذج لآليات مشبكية محفوظة يمكن تطبيقها في التحقق من صحة أهداف الاضطرابات العصبية والاضطرابات العضلية العصبية.
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين النتائج الجينية في Drosophila والبيولوجيا المشبكية للثدييات من خلال المسارات المحفوظة.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يتيح التقييم في المراحل المبكرة لارتباط الهدف وتعديل المسار في نظام حي وسليم.
تكامل سير العمل والعمليات التسلسلية
يتكامل سير عمل التشريح في مراحل الاكتشاف المبكرة من خلال تمكين اختبار الفرضيات، ثم ينتقل إلى تحديد المركبات الرائدة عبر الأنماط الظاهرية التشابكية القابلة للقياس، ويدعم التحقق من الصلاحية في المرحلة قبل السريرية من خلال الفرز الظاهري ذي الصلة بالمرض.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم توضيح المسارات التشابكية والتحقق من الأهداف الوظيفية من خلال التصوير المباشر للوصلات العصبية العضلية (NMJ).
- الفحص المسحي: توفر تحضيرات جاهزة للمقايسة مع قراءات هيكلية وفلورية قابلة للتكرار لتقييم المركبات.
- التحليلات: تولد بيانات مورفولوجية وكيميائية نسيجية مناعية كمية لتحليل الظروف المقارنة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط الآليات التشابكية في ذبابة Drosophila بالنماذج قبل السريرية عبر المسارات الجزيئية المحفوظة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لتقييم الأهداف العصبية عبر حملات اكتشاف متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في الدراسات التشابكية.
- القيمة التشغيلية: تضمن التوحيد القياسي وقابلية التكرار وقابلية التوسع في تحضير الوصلات العصبية العضلية (NMJ) عبر المختبرات.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تمكين الكشف المبكر عن السمية التشابكية أو الارتباط بالهدف.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة وفقاً للمخاطر للأهداف العصبية بناءً على النتائج التشابكية الوظيفية.
اعتبارات التنفيذ
- تتطلب خبرة في التعامل مع ذبابة الفاكهة (Drosophila)، والجراحة المجهرية، والمجهر الفلوري.
- تعتمد على أطباق التشريح، ودبابيس الحشرات، ومقصات الزنبرك، والملاقط، ومحلول HL 3.1 المنظم.
- تستلزم توحيد شد الدبابيس وظروف المحلول المنظم بين جميع المستخدمين.
- تشمل اعتبارات التكيف تباين مراحل اليرقات والخلفيات الجينية التي تؤثر على سلامة العضلات.
- تشمل القيود العملية متطلبات المهارة اليدوية واحتمالية تلف العضلات في حال عدم دقة التشريح.
