Name: ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ المناعية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: تعلم تقنية التلوين المناعي النسيجي ليرقات Drosophila لدراسة تطور الوصلات العصبية العضلية. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تصور البروتينات وفهم تنظيم الجينات في الأعصاب.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

قبل أن تبدأ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول التالية : PBT (0.1 ٪ X100 تريتون في برنامج تلفزيوني 1X) ، PBTB (0.2 ٪ في جيش صرب البوسنة PBT) ، وPBTN (خ ع 2 ٪ في PBTB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح ذبابة الفاكهة اليرقات. يرجى الاطلاع على ذبابة الفاكهة تشريح NMJ اليرقات. </li></ol> المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل اليرقات إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي على PBT. غسل اليرقات مرتين لمدة 15 دقيقة في PBT. ملاحظة : أن يغسل ، ووضع أنبوب مل 1.5 على خلاط nutator. إزالة السائل مع pippetor واستبدالها السائلة الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBT. يغسل في PBTB مرتين لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBTB. يغسل في PBTN مرتين لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في احتضان الضد الأولية مخففة في PBTN في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو عند 4 درجات مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مرتين مع PBTB. ملاحظة : حل لشطف إضافة وإزالة بسرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل مرتين لمدة 15 دقيقة في PBTB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل في PBTN لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في احتضان الضد الثانوية (والضد الأولية مترافق إذا كنت تستخدم واحد) في PBTN المخفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطي في البربون واحتضان مقابل 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مرتين مع PBTB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل مرتين لمدة 15 دقيقة مع PBTB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشروع في التركيب. </li></ol> متزايد ملاحظة : في جبل الجلسرين إذا كان سيتم تصوير العينات على الفور. جبل الذهب في إطالة ما اذا كان سيتم تخزين العينات قبل التصوير (لأكثر من أسبوع) ، أو إذا كان يجب التقط عينات عدة مرات. للاستخدام ، وضع زجاجة من إطالة في 65 º C حمام الماء لمدة 2-3 دقائق. يأخذ قسامة من الذهب وإطالة البقاء على على كتلة حرارة 45-50 درجة مئوية في <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب محضرات الملون في PBT إلى كوب ووتش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بعض الجلسرين على شريحة زجاجية نظيفة للمعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحيوانات إلى شريحة المعالجة من قبل انتشالها من الزجاج ووتش زاوية باستخدام ملقط. ضمان أن تكون بشرة الجانب الأسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الرأس والذيل مع شفرة حلاقة جديدة على معالجة شريحة زجاجية. وexacto سكين مع شفرة # 16 يعمل بشكل جيد لهذا الغرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على شريحة أخرى (تركيب الشريحة) ، وضع قطرة صغيرة من الجلسرين / إطالة وانتشاره مع ملقط نظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الحيوانات نقل إلى الشريحة المتزايدة التي ميزتها ، مع الحرص على عدم قلب لهم. محاولة تحميل لهم في الصفوف في اتجاه واحد. جبل 6-8 الحيوانات لكل شريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض زلة تغطية على حافة طريق وضع في الجلسرين / إطالة والإفراج عن ببطء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم الشريحة مع طلاء الأظافر. علما [لا صورة حتى طلاء الأظافر جافة. هذا عادة ما يستغرق عشر دقائق. للعينات التي شنت في إطالة الذهب ، والسماح للشرائح الجافة لثلاث ساعات على الأقل قبل الختم أو التصوير.] </li></ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

المناعية (IHC) أمر حيوي لدراسة البيولوجيا NMJ لأنه يمكن تصور من NMJ. ويتم إنجاز هذا باستخدام الأجسام المضادة التي تعترف غشاء الخلايا العصبية (على سبيل المثال ، HRP) ، وpresynapse (على سبيل المثال ، CSP ، SYT) ، و / أو postsynapse (على سبيل المثال ، DLG). ويمكن أيضا الإشارة الجزيئات والبروتينات الهيكلية ، أو البروتينات الرواية تكون المصلحة الملون. ثم ، يمكن أن تحور الجينات أو missexpressed ، ويمكن الكشف عن اضطراب IHC هيكل متشابك و / أو الإشارات العصبية. <p class="jove_content" ...

<table><tbody><tr><td>المجهر المجسم &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>مصدر الضوء KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>ملقط Dumont SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>ملقط Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>خلاط Nutator Adams&amp;#8482;</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>سكين دقيق رقم 1</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>شفرات رقم 16</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>كاشف ProLong Gold Antifade لمنع البهتان</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

ذبابة الفاكهة اليرقات nmj المناعية

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

و<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الوصل العصبي العضلي (NMJ) هو نظام يستخدم نموذج المتبع لدراسة تطوير واللدونة متشابك. استخدام على نطاق واسع<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; محرك النظام هو نتيجة لسهولة الوصول إليها عالية. ويمكن تحليل ذلك مع قرار وحيد الخلية. هناك 30 في عضلات hemisegment الذين الترتيب داخل جدار الجسم هامشية معروفة. مجموعه من الخلايا العصبية الحركية 31 نعلق على هذه العضلات في النمط الذي الدقة العالية. استخدام البيولوجيا الجزيئية وعلم الوراثة ، ويمكن للمرء أن خلق حيوانات معدلة وراثيا أو المسوخ. ثم ، يمكن للمرء أن دراسة الآثار التنموية على التشكل وظيفة NMJ. ويمكن استخدام المناعية لصورة واضحة لعناصر NMJ. في هذه المقالة ، ونحن لشرح كيفية استخدام تلوين الأجسام المضادة لتصور<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; NMJ اليرقات.

هذا البروتوكول يوضح كيفية تنفيذ المناعية على يرقة ذبابة الفاكهة تشريح.

ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ المناعية

يُعد الوصل العصبي العضلي (NMJ) في ذبابة الفاكهة (Drosophila) نظاماً نموذجياً راسخاً يُستخدم لدراسة التطور واللدونة المشبكية. إن الاستخدام الواسع...

يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء الصبغ الكيميائي النسيجي المناعي على يرقات gsof المشرحة لتصوير البروتينات المشاركة في تطور المشابك العصبية. يُستخدم أنبوب سعة 1.7 مل طوال الإجراء لعمليات تحضين الأجسام المضادة الأولية والثانوية، وكذلك لخطوات الغسيل. ثم تُنقل اليرقات إلى شريحة معالجة حيث يتم تهذيبها باستخدام سكين exacto، ومن ثم تُنقل العينات المراد فحصها إلى قطرة من كاشف منع التلاشي.في النهاية، يتم إغلاق غطاء الشريحة بإحكام على شريحة التثبيت باستخدام طلاء الأظافر. مرحباً، أنا جوناثان برنت من مختبر برايان مكيد في قسم الفسيولوجيا والفيزياء الحيوية الخلوية بكلية الأطباء والجراحين بجامعة كولومبيا. نحن نستخدم هذا الإجراء لدراسة التنظيم الجيني لتكوين التشابكات العصبية عند الوصلة العصبية العضلية وفي العقدة النامية.لنبدأ الآن. قبل إجراء الكيمياء النسيجية المناعية على يرقات gsof n MJ، يجب أولاً تشريح اليرقات بشكل صحيح. لتعلم هذا الإجراء، شاهد المقال المرئي المصاحب بعنوان Drosophila Larva N MJ Dissection.لبدء الإجراء، قم بتحضير ثلاثة محاليل طازجة. أولاً، قم بتحضير محلول PBT عن طريق إضافة المنظف إلى محلول PBS المحضر حديثاً. ثانياً، خذ كمية محددة من bovine serum albumin وأضفها إلى محلول PBT.لتحضير PBTB ثالثاً، خذ مصل ماعز طبيعي مائي وأضفه إلى محلول PB TB لتحضير محلول PBTN. بعد تحضير هذه المحاليل، انقل اليرقات إلى أنبوب سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من PBT. وتعد هذه هي الغسلة الأولى.تتضمن كل عملية غسل استبدال المحلول الذي تغمر فيه اليرقات، ثم تحضين اليرقات على جهاز خلط دوار (mutator mixer) يدور ببطء. لا تنقل اليرقات من أنبوب إلى آخر لأن ذلك سيؤدي إلى إتلافها. تستمر عملية الغسل الأولى هذه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد 15 دقيقة من الخلط، استبدل PBT بـ PBT جديد باستخدام ماصة واغسل اليرقات لمدة 15 دقيقة أخرى. عند استبدال محاليل الغسيل، احرص دائماً على تجنب إتلاف اليرقات. عند الانتهاء من عمليات الغسيل بـ PBT، اغسل اليرقات في PBTB لمدة 30 دقيقة.كرر عملية الغسيل هذه باستخدام محلول جديد لمدة 30 دقيقة أخرى. بهذا تكتمل عملية الغسيل بمحلول PBTB. اغسل مرتين بمحلول PBTN لمدة 15 دقيقة لكل غسلة.خلال خطوة الغسيل الثانية، يمكن تخفيف الأجسام المضادة الأولية في PBTN بتركيز العمل المطلوب. بعد الغسيل، تُحضن اليرقات في خليط الأجسام المضادة هذا لمدة ساعة واحدة مع الخلط اللطيف في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. عند اكتمال فترة التحضين، يُسحب محلول الأجسام المضادة الأولية بعيداً وتُشطف اليرقات بسرعة باستخدام PBTB عدة مرات لإزالة أي أجسام مضادة متبقية.لتحضير اليرقات لعملية تحضين الأجسام المضادة التالية، اغسلها مرة واحدة في محلول PBTB لمدة 15 دقيقة، واغسلها مرتين بمحلول PBTN لمدة 30 دقيقة. خفف الجسم المضاد الثانوي في محلول PBTN بالتركيز التشغيلي المطلوب، وحضن اليرقات في هذا الخليط لمدة ساعة ونصف. في درجة حرارة الغرفة، تأكد من تغطية اليرقات لمنع التعرض للضوء ولتقليل تبييض floor four.بعد مرور ساعة ونصف، قم بإزالة محلول الجسم المضاد الثانوي واغسل اليرقات عدة مرات أخرى باستخدام PBTB. الآن، اغسل اليرقات في PBTV لمدة 15 دقيقة مرتين. يجب أن تتم جميع عمليات الغسيل والتخزين المتبقية لليرقات مع الحد الأدنى من التعرض للضوء، لذا تأكد من إبقائها مغطاة.انقل اليرقات من أنبوب 1.5 mil إلى PBT في شريحة معالجة زجاجية. أصبحت اليرقات الآن جاهزة للتثبيت؛ لتثبيت اليرقات المصبوغة في محلول الذهب المطول حرارياً، ضعها في حمام مائي عند 65 درجة Celsius لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بعد ذلك، خذ Eloqua وضعها على كتلة تسخين مضبوطة عند 50 درجة Celsius.ضع كمية من PB TB على شريحة معالجة. انقل اليرقات إلى PB tb. قم بتدوير اليرقات بحيث يكون جانب الكيوتيكل لأسفل باستخدام سكين exacto بنصل رقم 16، ثم قم بقص الرؤوس والذيول من اليرقات.يمكنك أيضاً استخدام شفرة حلاقة لهذه الخطوة. الآن، قم بتجهيز شريحة التثبيت بوضع 40 microliters من الذهب المطول من الجزء المسخن على شريحة نظيفة، ثم وزعه باستخدام ملقط نظيف.انقل بعناية من ست إلى ثمان من اليرقات المُحضرة من شريحة المعالجة إلى شريحة التثبيت. حاول الحفاظ على اتجاهها نفسه وإبقاء جوانب كيوتيكول اليرقات لأسفل من أجل تثبيتها. ضع غطاء الشريحة فوق المحلول الممتد.ثبت غطاء الشريحة على إحدى الحواف عند محيط الحوض المستطيل، ثم أنزله بعناية ليغطي العينات. قم بإغلاق حواف غطاء الشريحة وإلصاقها بالشريحة باستخدام طلاء أظافر سميك ورخيص بأي لون تفضله. اترك الشريحة لتجف لمدة ثلاث ساعات على الأقل.إذا كان سيتم تصوير الشرائح مرة واحدة فقط ومباشرة بعد التحضير، فيمكن استبدال محلول الذهب المطول بالجلسرول. وفي هذه الحالة، يكون وقت تجفيف طلاء الأظافر والجلسرول حوالي 10 دقائق فقط، وذلك خلافاً لبروتوكولات الصبغ التي تستغرق ثلاث ساعات. والهدف من ذلك هو الحصول على إشارة نوعية عالية مقترنة بخلفية منخفضة.يتم تحقيق ذلك باستخدام أجسام مضادة عالية الجودة ومن خلال تنفيذ خطوات الحجب والغسيل بدقة. تظهر هذه الصور المشابك العصبية في النوع البري بالإضافة إلى تلك المأخوذة من سلالة ذباب تعبر عن مستقبل BMP من النوع الثاني طافر، والمعروف باسم طافرة wishful thinking أو witch. تم تلوين الغشاء العصبي باللون الأزرق باستخدام جسم مضاد ضد horse radish peroxidase.تم صبغ الحويصلات المشبكية الموضحة باللون الأحمر باستخدام جسم مضاد لمضاد المشبك. أما ما بعد المشبك الموضح باللون الأخضر فقد صبغ بجسم مضاد ضد بروتين discs large. وأظهرت هذه النتائج أن طفرة مستقبل BMP من النوع الثاني تؤدي إلى ظهور نمط ظاهري يتمثل في نقص نمو المشابك.لقد كان هذا الطافر عاملاً رئيسياً في إثبات أن البروتينات المكونة للعظم (BMPs) تعمل كإشارات تراجعية تنظم عدد البراعم في النهايات التشابكية. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء الصبغ الكيميائي النسيجي المناعي على الوصلات العصبية العضلية في مريء اليرقة. عند تنفيذ هذا الإجراء.من المهم تنفيذ الإجراء بالتوقيت المناسب لضمان أقصى قدر من إمكانية التكرار وتقليل الضجيج الخلفي. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.

drosophila-larval-nmj-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذا البروتوكول يوضح كيفية...

ذبابة الفاكهة تشريح اليرقات NMJ

هذا البروتوكول توضح طريقة موثوقة لالتخدير والتصوير من دون...

في التصوير من يرقات ذبابة الفاكهة فيفو سليمة الفرعية الخلوية في القرار

الوصل العصبي العضلي (NMJ)...

تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي

الخلايا العصبية الحسية تشجر شجيري...

تحليل الصرفي ذبابة الفاكهة اليرقات المحيطية الانشعابيات عصبون حسي والمحاوير استخدام الفسيفساء الوراثية

تلوين الأجسام المضادة...

ذبابة الفاكهة المناعية العذراء البطن

لفهم كيفية تحقيق الأشكال الخلية المعقدة ، مثل التشعبات العصبية ، خلال التنمية ، فمن المهم أن تكون قادرة على فحص دقيق أنيبيب المنظمة. نحن هنا وصف طريقة قوية لفحص العلامات immunohistological منظمة أنيبيب من التشعبات شجيري الخلايا العصبية الحسية تشجر والقصبة الهوائية ، والعضلات ،...

Immunohistological بطاقات المواد ميكروتثبول في الخلايا العصبية الحسية الانشعابيات ، القصبات الهوائية ، وعضلات في ذبابة الفاكهة الجدار اليرقة الهيئة

&lt; p class = "jove_content" &gt;ذبابة الفاكهة يتم استخدام الوصلة العصبية العضلية (NMJ) كنموذج لدراسة مورفولوجيا ووظيفة نقاط الاشتباك العصبي. يصف هذا الفيديو الميزات المهمة التي يحددها الباحثون لتوصيف NMJ. يوضح مثال البروتوكول برنامجا قادرا على إجراء القياس الكمي تلقائيا.

ذبابة الفاكهة القياس الكمي للوصلة العصبية العضلية (NMJ): طريقة لتقييم مورفولوجيا الوصلة المشبكية ووظيفتها

يوضح هذا البروتوكول كيف القرب ربط الفحص يمكن استخدامها للكشف في الموقع تفاعلات البروتين البروتين في ذبابة الفاكهة العصبي العضلي اليرقات تقاطع. مع هذه التقنية، وترد أقراص كبيرة وهو جين تاو لى شاو تاي لتشكيل مجمع في المنطقة بعد المشبكي، وهي جمعية التي سبق تحديدها من خلال المشاركة في مناعي.

الكشف عن في الموقع مجمعات البروتين البروتين في ذبابة الفاكهة اليرقية الموصل العصبي العضلي عن طريق القرب ربط الفحص

يتم الحفاظ على مورفولوجيا وحجم وموقع العضيات داخل الخلايا تطوريا ويبدو أنها تؤثر بشكل مباشر على وظيفتها. أصبح فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات هدفا مهما لعلم الأحياء الحديث. نوضح هنا كيف يمكن تسهيل هذه الدراسات من خلال تطبيق التقنيات الكمية.

لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات عصبي عضلي مفرق

يقدم هذا التقرير إجراء جديدا لإعداد العينات لتصور الوصلات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة . هذه الطريقة أكثر فعالية في منع تجعد العينات مقارنة بالطريقة التقليدية وهي مفيدة بشكل خاص لتحليل البنية التحتية للوصلات العصبية العضلية ذبابة الفاكهة .

تحسين عملية تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني النافذ للتقاطعات العصبية العضلية في يرقات ذبابة الفاكهة

هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتصور شبكات الأنابيب الدقيقة في الوصلات العصبية العضلية وخلايا العضلات. إلى جانب الأدوات الوراثية القوية لذبابة الفاكهة ، يسهل هذا البروتوكول إلى حد كبير الفحص الجيني وتحليل ديناميكيات الأنابيب الدقيقة لدور البروتينات التنظيمية لشبكة الأنابيب الدقيقة في الجهاز العصبي.

استخدام ذبابة الفاكهة اليرقات العصبية العضلية والخلايا العضلية لتصور شبكة الأنابيب الدقيقة

تعلم تقنية التلوين المناعي النسيجي ليرقات Drosophila لدراسة تطور الوصلات العصبية العضلية. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تصور البروتينات وفهم تنظيم الجينات في الأعصاب.

ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ المناعية

استكشف المزيد من الفيديوهات