ثنائي الفوتون axotomy والوقت الفاصل بين التصوير مبائر يعيش في الأجنة الزرد

لقطع المحاور العصبية باستخدام التصوير ثنائي الفوتون في الجسم الحي، قم بوضع أجنة سمك الزيبرا المخدرة داخل قطرة من agarose بينما تتصلب في غرفة متخصصة تتكون من TEFLون وغطاء زجاجي. يتم وضع شريحة زجاجية فوق الغرفة، ثم تُقلب الغرفة رأساً على عقب قبل إجراء عملية قطع المحور. التقط صورة قبل القطع للمحور العصبي الذي ترغب في قطعه بتكبير 40x، ثم انتقل إلى تكبير 70x في المنطقة التي ترغب في قطعها.

ومع إيقاف تشغيل الليزر، قم بزيادة قدرة الليزر. قم بتشغيل الليزر لفترة وجيزة. وفي الصورة اللاحقة للمحور العصبي، ستلاحظ وجود حطام محوري مبعثر إذا تمت عملية القطع المحوري بنجاح.

مرحباً، أنا جورجيا أوبراين. مرحباً، أنا ساندرا ريغو. وأنا شونا مارتن.

نحن من مختبر Alvarez TI في قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية والنمائية بجامعة كاليفورنيا لوس أنجلوس. سنعرض لكم اليوم إجراءً لعملية استئصال المحاور العصبية باستخدام فوتونين والتصوير البؤري المجهري بنظام الفاصل الزمني في أجنة سمك الزيبرا الحية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تنكس وتجدد المحاور الحسية الجسدية الطرفية.

فلنبدأ الآن. في البداية، سنقوم بتحضير محلول agarose منخفض الانصهار بتركيز 1% للصب. نقوم بإذابة الـ agarose في ماء مقطر مزدوج عن طريق التسخين في جهاز الميكروويف، قبل توزيع المحلول في أنابيب صغيرة وتخزينه في كتلة تسخين عند 42 درجة Celsius.

يمكن وضع الأجنة أولاً في محلول رينجر يحتوي على 5% PTU بعد مرور 22 إلى 24 ساعة على الإخصاب لتثبيط تكوين الصبغة، والتي تتميز بفلورة ذاتية ساطعة من شأنها أن تحجب رؤية المحاور العصبية عند استخدام مجهر الفوتونين. بعد ذلك، نختار الأجنة المخصصة للتصوير ونقوم بإزالة الكوريون عن طريق سحبهم بلطف باستخدام الملقط. وبمجرد اختيار الأجنة، يتم تخديرها بإضافة حوالي 0.02% tricaine إلى محلول رينجر المحتوي على PTU.

قبل المتابعة، تأكد من أن الحيوانات لا تستجيب للمس. قم بتجهيز غرفة التصوير طويلة المدى عن طريق وضع شحم مفرغ من الهواء على أحد جانبي حلقة زجاجية أو حلقة من التفلون وتثبيتها على شريحة غطاء زجاجية، مع الحرص على عدم نقل كمية كبيرة من محلول رينجر PTU.

انقل جنينًا واحدًا إلى محلول agro عند درجة حرارة 42 درجة باستخدام ماصة زجاجية. ثم انقل الجنين مع قطرة واحدة من agros إلى شريحة غطاء مُجهزة. وبمجرد النقل، قم بتوضيع الجنين في الوضع المطلوب أثناء تصلب agros.

ضع في اعتبارك أن غرفة التصوير سيتم قلبها عند الانتهاء بحيث تصبح الشريحة النحاسية هي السطح العلوي. إذا كان لديك منصة آلية ويمكنك تصوير مواقع متعددة في وقت واحد، فكرر هذه الخطوات لكل جنين. اترك الأجاروز يتصلب تماماً.

بعد ذلك، املأ الحلقة بمحلول Ringer للكلاب الذي يحتوي على 0.02% PTU. وأخيراً، ضع شحم التفريغ على الجانب الآخر من الحلقات، ثم غطِّها بشريحة زجاجية.

اقلب غرف الختم. نحن الآن مستعدون لتصوير الأجنة في المرحلة الرباعية الخلوية. للتحضير للتصوير، ضع الأجنة المثبتة على حامل شرائح تحت المجهر.

ركز على جنين واحد باستخدام عدسة شيئية مائية بقوة 40 x وفتحة عددية 0.8. ثم قم بتشغيل الليزر. اضبط الليزر على طول موجي قدره 910 nanometers وقدرة تبلغ 30 milliwatts.

افتح برنامج التصوير. نحن نستخدم برنامج تصوير المسح الذي تم تطويره في مختبر Boar للأبحاث المرجانية. عند هذه القدرة، يمكن مسح المجال للبحث عن المحور العصبي المرشح الذي سيتم قطعه.

بمجرد العثور عليه، التقط صورة للمحور العصبي المستهدف. حدد موضعي Z الأول والأخير، ثم استخرج الصورة وقم بعمل إسقاط أقصى (maximum projection) لمجموعات Z stacks. بعد ذلك، قم بالتكبير بمقدار 70x على فرع المحور العصبي الذي ترغب في فحصه بالتفصيل.

ارفع القدرة إلى 180 milliwatts واضبط عدد شرائح Z على واحدة. ابدأ عملية مسح واحدة بالليزر بالضغط على زر grab. ينبغي أن يكون هذا كافياً لقطع المحور العصبي، ومع ذلك، من الضروري تحسين هذا الإجراء بما يتناسب مع المجهر الخاص بك والهدف التجريبي.

أخيراً، قم بتصغير التكبير. خفض القدرة إلى 30 milliwatts والتقط صورة للمحوار الذي تم قطعه حديثاً. في حال عدم توفر مجهر فوتوني ثنائي مخصص في مختبركم، يمكن أيضاً استخدام مجهر Zes five 10 confocal two photon لقطع المحاور.

نبدأ بوضع الجنين المثبت على المنصة وضبط التركيز باستخدام عدسة شيئية مائية بقوة 25x. بعد ذلك، يتم تشغيل ليزر الفوتونين وليزر Argonne في إعدادات متعددة المسارات بحيث يكون من الممكن التبديل بينهما. وعلى الرغم من استخدام كلا الليزرين للكشف عن GFP، إلا أنه يتم تصور انبعاث الفوتونين باللون الأحمر وانبعاث ليزر Argonne باللون الأخضر.

من أجل التمييز بينهما، استخدم ليزر Argonne لتحديد محور عصبي يتم فحصه تحت إعدادات Z. حدد المقطعين البصريين الأول والأخير. التقط صورة مجهرية بؤرية (confocal image) وأنشئ مسقطاً أقصى (maximum projection) للـ Zack.

قم بإيقاف تشغيل ليزر الأرجون وتشغيل مسح ليزر الفوتونين بكثافة تبلغ حوالي 9% transmission. للتأكد من أن المحوار لا يزال في نطاق التركيز، انقر فوق زر الإيقاف حتى تتوفر أداة الاقتصاص. استخدم أداة الاقتصاص للتكبير على المنطقة المراد دراستها.

عادةً ما نقوم بالتكبير إلى حوالي 70 x. اختر منطقة المحور العصبي المراد إصابتها واجعل هذه المنطقة في بؤرة التركيز. يمكن التحقق من مستوى التكبير من علامة تبويب الوضع (mode).

بعد ذلك، تحت علامة تبويب القنوات (channels)، قم بتغيير كثافة الفوتونين من حوالي 9% transmission إلى 15 إلى 30% transmission. لتفعيل الإعدادات الجديدة، انقر فوق زر fast XY ثم انقر فوق stop سريعاً بعد ذلك. ولتجنب حدوث ضرر مفرط، يجب أن يظهر المحور العصبي على شكل حطام مبعثر إذا نجحت العملية.

وأخيرًا، للتأكد من تضرر المحوار بالفعل، عُد إلى استخدام ليزر الأرجون بطول موجي 488 nanometer. التقط صورة مجهرية بؤرية أخرى وأنشئ مسقطًا أقصى للمحاور. والآن بعد أن استعرضنا طريقتين لقطع المحاور باستخدام المجهر الليزري ثنائي الفوتون، سننتقل إلى التصوير المجهري البؤري بنظام الفاصل الزمني لمراقبة التجدد باستخدام جهاز zeiss LSM 510.

لتحضير التصوير بالفاصل الزمني، تأكد من تشغيل المنصة المسخنة قبل 30 دقيقة على الأقل من إعداد فيلم الفاصل الزمني. ضع الأجنة المثبتة على حامل شرائح تحت المجهر. ثم قم بضبط التركيز على جنين واحد باستخدام العدسة الشيئية الهوائية المطلوبة.

نستخدم عدسة شيئية بفتحة عددية 20 x 0.5، ونقوم بفتح برنامج التصوير Zeiss LSM five 10، ثم نشغل أشعة الليزر المناسبة ونضبط التكوين المطلوب. نفتح مرحلة المسح ونوافذ التوقيت المتعدد. وفي حال توفر برنامج التوقيت المتعدد، يتم تحديد موضع وتكوين الجنين الأول في نافذة التوقيت المتعدد.

قم بتفعيل المسح السريع (fast scan) في نافذة المسح، ثم حرك المنصة إلى موضع XY المطلوب. حدد موضع Z الأول والأخير في نافذة المسح. اضغط على إيقاف (stop) ثم على المنتصف (mid) أيضاً في نافذة المسح، وانتظر حتى ينتهي مسح شريحة Z الوسطى.

اضغط بعد ذلك على تحديد الموضع (mark position) في نافذة المنصة. إذا كنت تقوم بتصوير جنين واحد فقط، فانقر فوق علامة تبويب الموقع الواحد (single location) في نافذة تعدد الأوقات (multi-time). انقر فوق استبدال X و y و Z، ثم انقر فوق حفظ التكوين (save configuration).

وافق عندما يُطلب منك تجاوز التكوين السابق. يمكنك الآن ضبط معاملات الحصول على الصور في نافذة multi lo. إذا كانت لديك منصة ميكانيكية، فيمكنك إعداد مواقع متعددة لتصوير أجنة متعددة.

في هذه الحالة، يجب عليك اختيار علامة تبويب المواقع المتعددة قبل تحديد إحداثيات X و Y و Z والتكوين للموقع الأول. تأكد أيضاً من أن القائمة المنسدلة الموجودة أسفل علامة تبويب المواقع المتعددة مضبوطة على الموقع الأول، وأن القائمة المنسدلة في قسم التكوين تشير إلى "multi lo one". وقبل النقر على حفظ التكوين، حدد الموضع والتكوين لبقية الأجنة في النافذة متعددة الأوقات.

حدد موقع المسح السريع التالي للجنين، ثم حرك المنصة إلى موضع XY المطلوب وحدد موضعي Z الأول والأخير في نافذة المسح. اضغط على إيقاف (stop). ثم اضغط على المنتصف (mid) أيضاً في نافذة المسح، وانتظر حتى ينتهي مسح شريحة Z الوسطى.

بعد ذلك، اضغط على mark position. في نافذة stage، انقر على replace X, Y, Z. تأكد من أن القائمة المنسدلة الموجودة أسفل تبويب multiple locations مضبوطة على location two، وأن القائمة المنسدلة في قسم configuration تشير إلى multi lobe two. ثم انقر على save configuration. وافق على ذلك. وعندما يُطلب منك استبدال التكوين السابق، كرر هذه العملية لبقية الأجنة.

قم بضبط معلمات الحصول على الصور في نافذة multi lo. اختر خيار GR GL من قائمة block section، ثم أدخل عدد تكرارات المجموعة المطلوب.

يمثل هذا عدد المرات التي سيلتقط فيها المجهر البؤري صوة عند كل موقع. أدخل فاصل الوزن المطلوب في قسم المعلمات. هذا هو مقدار الوقت من بداية تكرار التصوير الأول إلى بداية التكرار التالي.

حدد Zack XY في قسم التكوين. أدخل اسم الملف الأساسي في القسم السفلي. انقر فوق select image db واختر قاعدة البيانات الخاصة بك.

انقر فوق زر الخيارات، ثم حدد مجلد MDB الخاص بك لحفظ الملفات المؤقتة أيضًا. حدد خيار "keep final image open". احفظ الصورة النهائية، ومنتصف الـ Zack، وحدد الفاصل الزمني للوزن.

انقر فوق "موافق" لإغلاق نافذة الخيارات، ثم انقر فوق "وقت البدء". اترك نافذة الأوقات المتعددة مفتوحة طوال مدة التصوير. الآن حان الوقت لتحليل بياناتك.

عند انتهاء التصوير بالفاصل الزمني، سيقوم برنامج multi-time بتجميع كافة ملفاتك المؤقتة في ملف ملخص لكل موقع. إذا كنت ترغب في إيقاف تسجيل الفيديو قبل اكتماله، تأكد من الضغط على finish بدلاً من stop لضمان إنشاء ملف الملخص.

يجب حفظ الملفات المؤقتة وملفات الملخص تلقائيًا في مجلد MDB المخصص. فيما يلي مثال نموذجي لفيلم مجهري بؤري زمني يصور عملية استئصال المحوار (ex otomy) بعد 54 ساعة من الإخصاب. يظهر الإطار الأول عرضًا ظهريًا للمحوار قبل عملية الاستئصال، مع وجود سهم أصفر يشير إلى موقع الاستئصال في الوقت التالي.

يبدأ تصوير الفاصل الزمني (Lapse movie) خلال ساعة واحدة بعد عملية الاستئصال (ex otomy) ويستمر لمدة 12 ساعة. تم جمع مجموعة صور بؤرية واحدة (confocal stack) كل 20 دقيقة. تم تسجيل هذا الفيلم البؤري الفاصل الزمني باستخدام نفس المعايير عند 78 ساعة بعد الإخصاب.

يظهر الإطار الأول عرضاً جانبياً للمحوار قبل عملية الاستئصال، مع سهم أصفر يشير إلى موقع الاستئصال. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إحداث تلف دقيق في الأنسجة وتصوير أجنة سمك الزيبرا الحية باستخدام الاستئصال بفوتونين والتصوير البؤري المتسارع زمنياً. عند إجراء هذه العملية، من المهم تحسين مقدار الطاقة المستخدمة في الاستئصال بليزر الفوتونين لتجنب التسبب في تلف مفرط.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربتكم.