الموقع محلية الصنع تطفير موجه من البلازميدات الجامعة

اسم Hi.My هو مارك بلو. أنا طالب دراسات عليا في علم الأحياء في جامعة المناجم في ألمانيا. اليوم ، أود أنا وصديقي كاجو أن نوضح لك كيفية إجراء تكوين الخلايا العصبية الموجه محلي الصنع.

تم تطوير الطريقة في الأصل بواسطة Ethal وتم تكييفها من قبل العديد من الآخرين. لذلك عندما تنظر إلى الإنترنت اليوم ، سنجد الكثير من البروتوكولات المختلفة التي تختلف معها في بعض النقاط الأكثر أهمية أو أقل. اليوم ، نود أن نعرض لك طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة تناسبنا بشكل جيد.

لذلك دعونا نبدأ. في هذه التجربة ، تحتاج إلى تدقيق لغوي مستقر حراريا ، بوليميراز الحمض النووي. نستخدم دائما بوليميراز PFU من المخمرات. منطقيا.

تحتاج أيضا إلى مخزن البوليميراز المؤقت و DNTP والمزيج والماء. علاوة على ذلك ، فأنت بحاجة إلى إنزيم التقييد ، DPN واحد ، وخلايا الإشريكية القولونية المختصة ، ولوحة المثقاب ، ومرق الثقافة البكتيرية ، ومجموعة من أعواد الأسنان. الجزء الأكثر أهمية وأهمية في هذه الطريقة هو تصميم الاشعال المطفرة.

هناك بعض الإرشادات البسيطة التي يجب مراعاتها عند تصميم زوج التمهيدي الخاص بك. يجب أن تكون الاشعال مكملة لبعضها البعض ويتراوح طولها بين 25 و 45 نيوكليوتيد. يتم إدخال الطفرات في شكل عدم تطابق مع البلازميد الأصلي.

يجب احتواء عدم التطابق في كلا البادئات ويجب أن يقع في منتصف التمهيدي ، محاطا بثمانية نيوكليوتيدات على الأقل على كل جانب. يجب أن تحتوي البادئات على محتوى GC لا يقل عن 40٪ وأن تحتوي على واحد أو أكثر من Gs و Cs في نهاياتها الخمسة الأولية وثلاثة نهايات أولية. قبل استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يجب تحلية الفسفرة البادئاتية.

FPLC أو تنقية الصفحة ليست ضرورية. ليست هناك حاجة لحساب درجة حرارة الانصهار. ما عليك سوى التأكد من أن درجة حرارة الانصهار في شهادة الشحن أعلى من 60 درجة مئوية ، ولأغراض الفحص ، نقوم دائما بإضافة أو حذف موقع تقييد من البلازميد.

للحصول على تفاصيل حول ذلك ، يرجى مراجعة البروتوكول المكتوب الخاص بنا. الخطوة الأولى في الإجراء بأكمله هي إعداد تفاعل التدوير الحراري. لهذا ، تحتاج إلى 10 إلى 60 نانوغراما من البلازميد الذي تريد تحوره.

من الأهمية بمكان أن يتم عزل البلازميد من سلالة بكتيرية موجبة رطبة. ثم أضف حوالي 150 نانوغرام من كل برايمر مطفر. 1.5 ميكرولتر من واحد من كل 10 مخفف مائة مخزون Picomolar سيعطي 150 نانوغراما من البرايمر.

أكمل التفاعل باستخدام dn و tps و polymerase buffer و PFU polymerase و water. قمنا بضبط البداية والمتكررة de وقت النضج ودرجة الحرارة على جهاز التدوير الحراري على 30 ثانية. عند 95 درجة مئوية ، يتم ضبط درجة حرارة ووقت الإيلينغ على 55 درجة مئوية ودقيقة واحدة.

البوليميراز. نستخدم مكالمات لدرجة حرارة استطالة تبلغ 72 درجة C.To فك تشفير وقت الاستطالة. نحسب دقيقة واحدة لكل كيلو قاعدة من البلازميد ونضيف دقيقة إضافية.

حتى ذلك الوقت ، تكفي 18 دورة لإنشاء ما يكفي من البلازميد المتحور مباشرة بعد انتهاء التدوير من تحميل خمسة ميكرولتر من التفاعل على هلام 1٪ TAE agros. إذا كان التضخيم ناجحا ، فيجب أن ترى نطاقا مميزا لإزالة البلازميد الأصلي من التفاعل. نضيف ميكرولتر واحد من إنزيم التقييد الحساس للمثيلة DPN واحد.

ثم نحتضن الهضم المقيد لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 37 درجة مئوية ، وبعد ذلك ، يتم تحويل خمسة ميكرولتر من DPN واحد الهضم إلى خلايا مختصة. لهذا الغرض ، نستخدم دائما تحويل الصدمة الحرارية القياسي. الخلايا المختصة هي عامل رئيسي يحدد نجاح هذه الطريقة.

لذلك ، يفضل الخلايا المتوسطة أو عالية الكفاءة. بعد ليلة واحدة من الحضانة يجب أن تظهر مستعمرات لأن كفاءة الطفرة ليست مائة بالمائة. نحن بحاجة إلى فحص المسوخ.

نقوم بذلك عن طريق تقييد الهضم ، لذلك في اليوم الثاني من الإجراء ، نحتاج فقط إلى اختيار بعض المستنسخة وتنميتها بين عشية وضحاها للتحضير الصغير في اليوم التالي. في اليوم التالي بعد التحضير المصغر ، نقوم بإجراء عملية هضم تقييدية باستخدام إنزيم تقييد العلامة. ثم نقوم بتحميل عمليات الهضم التقييدية على جل agro agros ، ونقوم بإجراء الرحلان الكهربائي.

على الجل النهائي ، يمكنك أن ترى مباشرة أي من مستعمراتك تحمل البلازميد المتحور بنجاح. في هذه الحالة ، قمنا بحذف موقع eco Armon أثناء إدخال الطفرة. لذا فإن النطاق الثالث من اليسار يمثل استنساخا سالبا بينما جميع النطاقات الأخرى موجبة.

ومع ذلك ، يجب عليك تأكيد طفرتك الناجحة عن طريق التسلسل. كان هذا هو بالفعل. كما قلنا ، هذه طريقة بسيطة للغاية ومباشرة.

بدون أي مزالق كبيرة ، نأمل أن يساعدك البرنامج التعليمي الخاص بنا على توفير الكثير من التكاليف وزيادة الإنتاجية في مختبرك. نتمنى لك حظا سعيدا في بحثك. شكرا للمشاهدة.