قياس انواع معينة ايليجانس سبان الحياة على وسائل الاعلام الصلبة

لقياس العمر في سي إلجان، يتم توليد مجموعة متزامنة مع العمر باستخدام انفجار بيض مؤقت تناسلي. يتم نقل ديدان الخنثى البالغة النشطة إلى ألواح وسط نمو الديدان المزروعة ب E col المبيض بالأشعة فوق البنفسجية التي تترك لوضع البيض لمدة ست إلى ثماني ساعات ثم تتم إزالتها خلال اليومين التاليين، وتفقس الديدان من هذه وتنمو حتى المرحلة الرابعة من اليرقة. يتم نقل الديدان الأربعة إلى صفائح NGM جديدة تحتوي على الأمبيسيلين لمنع التلوث البكتيري الحي وFUDR لمنع التكاثر وتسمح لها بالتطور إلى بالغين.

من هذه النقطة فصاعدا، تلاحظ الديدان البالغة كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى تموت جميع الديدان. في كل نقطة زمنية، تزال الديدان الميتة من اللوحة ويتم تسجيل عدد الديدان الحية والميتة. أنا جورج سيتون من مختبر مات كابلاين في قسم علم الأمراض بجامعة واشنطن.

اليوم سنريكم كيف تقيس العمر الافتراضي ونرى أناقة التهاب الكبد. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة جينات الشيخوخة. فلنبدأ.

تتطلب تجربة العمر الافتراضي الأساسية نوعين من الصفائح، صفائح NGM القياسية التي لا تحتوي على إضافات، وألواح AMP FUDR التي يضاف فيها كل من الأمبيسيلين وفلورو ديوكسي يوريدين إلى NGM. كلا النوعين من الصفائح يملكان بكتيريا الإشريكية القولونية OP 50، والتي تقتل لاحقا بالتعرض للأشعة فوق البنفسجية. ابدأ بتحضير محلول NGM سعة 10 ملليتر.

في طبق بتري بقطر 60 ملم، يذيب الغاز الطبيعي الصلب بالكامل عن طريق تسخين الميكروويف على أعلى نبضة في الدقيقة 32. قم بتدوير الوسائط بين النبضات لمنع تراكم فقاعات الغاز المضغوطة، ضع NGM السائل في حمام ماء بدرجة حرارة 55 درجة مئوية أو على الطاولة للسماح للوسط بالتبريد. بمجرد أن يبرد الوسط إلى 55 درجة مئوية، وعندها يجب أن تتمكن من حمل الحاوية الزجاجية براحة بيدين عاريتين، وتكون جاهزة لإضافة الأدوية.

ولكي تصب الصحون للأدوية، أضف 33 ميكرولتر من 150 ملليمول FUDR و100 ميكرولتر من 100 ملليغرام لكل ملليلتر. يستخدم الأمبيسيلين لكل 100 ملليلتر من NGM ودوامة لخلط الأمبيسيلين لمنع التلوث البكتيري الغريب، ويستخدم FUDR لمنع الفق من البيض. لذا لن تحتاج الديدان إلى النقل كل بضعة أيام لفصلها عن اليرقات النامية.

الآن صب الوسط ودع الصحون تجف على الطاولة لمدة يومين في اليوم الذي ينتهي فيه الطبق من تجفيف زراعة البذور السائلة باستخدام مستعمرة واحدة من سلسلة جديدة من الإشريكية القولونية. بكتيريا OP 50 على مثقاب LB. حضر على الأقل 0.5 ملليلتر من الزراعة لكل طبق بحجم 60 ملم.

ضع مزرعة OP 50 في هزاز بدرجة 37 درجة مئوية ودع البكتيريا تنمو طوال الليل. في اليوم التالي، أطلق البكتيريا OP 50 بقوة طرد مركزي 3,500 جرام لمدة 10 دقائق. قم بتفريغ كمية كافية من المادة الفائقة لإعادة تعليق البكتيريا بتركيز 10 أضعاف.

الآن قم بتطعيم كل طبق ب 100 ميكرولتر من الزراعة المركزة. تجنب لمس طرف الماصة لسطح الناقل لأن العيوب في سطح الوسط ستسمح للديدان بحفر صفائح دوامة حتى تغطي البكتيريا المنطقة المركزية من ال NGM دون الاقتراب من جدران اللوحة وتترك الألواح لتجف على الطاولة لمدة 24 ساعة. بعد أن تجف، عرض سطح الصفائح لجرعة UV قوية بما يكفي لإيقاف نمو البكتيريا، نستخدم رابط الأشعة فوق البنفسجية 2,400 من طبقة الطبقة UV straddle linker 2,400.

ابدأ بتحميل الألواح في رابط السترادل بدون غطاء اللوحة. الآن اضغط على الطاقة. أدخل 9 9 9 9 على لوحة المفاتيح واضغط ابدأ.

ستتعرض الألواح للأشعة فوق البنفسجية لمدة تقارب خمس دقائق. يمكن تخزين الصفائح التي تحتوي على بكتيريا مقتولة بالأشعة فوق البنفسجية مقلوبة عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر. يشرح هذا القسم كيفية تكوين مجموعة من الديدان ذات تاريخ فقس شائع.

ابدأ بنقل حوالي 20 دودة شابة إلى لوحة NGM جديدة بدون أدوية. اترك الطبق عند 25 درجة مئوية لمدة أسبوع تقريبا للسماح للديدان بالانتشار وتناول كل الطعام البكتيري خلال أسبوع. يجب أن تظهر الديدان التي فقست حديثا في مرحلة توقف النمو عند نقل 20 إلى 30 يرقة مهر إلى صفيحة NGM جديدة بدون أدوية، وتحتضنها عند 25 درجة مئوية في وجود الطعام.

ستصبح يرقات الداور بالغة نشطة تناسليا خلال يومين وتبقى نشطة تكاثريا لعدة أيام بعد ذلك. الآن انقل 10 إلى 15 من البالغين النشطين تناسليا إلى صفيحة NGM جديدة بدون أدوية. يشار إلى هذه اللوحة باسم وضع البيض المؤقتة أو لوحة TEL.

اترك لوح TEL عند 25 درجة مئوية حتى تتمكن الديدان من وضع البيض. التي تفقس من هذه ستكون التجريبية ويتم تسجيل عمرها بعد ست ساعات. افحص لوحة TEL بحثا عن بيض.

إذا لم يكن هناك ما يكفي من البيض بعد، اترك طبق TEL عند 25 درجة مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة إجمالا. أتحقق بشكل دوري من وجود بيض. عندما يتم وضع عدد كاف من البيض، أزل البالغين من صفيحة TEL.

التجربة النموذجية ذات العمر الافتراضي ستتطلب من 30 إلى 90 بيضة لكل مجموعة تجريبية، لكن يمكن توليد عدة مئات من البيض على لوحة TEL واحدة. سيتم وضع حوالي 150 بيضة بواسطة 10 إلى 15 بالغا نشطا تناسليا خلال ست إلى ثماني ساعات. عند مقارنة المجموعات التجريبية، يمكن تحقيق دلالة إحصائية لفروق كبيرة في العمر مع وجود 30 على الأقل.

يجب استخدام المزيد من لتمييز الفروق الأكثر تواضعا. الآن ضع صفيحة TEL بدون البالغين عند درجة حرارة 20 درجة مئوية حتى تفقس الديدان وتنمو الديدان إلى مرحلة اليرقات L 4. عادة ما يستغرق هذا يومين للحصول على أناقة النوع C البرية، لكنه قد يستغرق وقتا أطول للسلالات ذات الأنماط البطيئة التطور.

يصف هذا القسم كيفية متابعة حياة السكان المتزامنين مع العمر. أولا، نقل يرقات L من لوحة TEL إلى ألواح AMP FUDR المثبتة. لكل سلالة أو حالة يتم اختبارها، من المعتاد تركيب صفيحتين إلى ثلاث صفيحات تحتوي على 25 إلى 30 دودة في كل صفيحة.

حضن ألواح AMP FUDR عند 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. ثم قم بتقييم الديدان بصريا، والوسطيات، والبكتيريا التي تنقل الديدان إلى صفائح AMP FUDR الطازجة. إذا كانت الديدان قد أكلت معظم الطعام البكتيري، فعادة ما يحدث ذلك مرة أو مرتين في الأسبوع.

في بداية التجربة، إذا كان هناك عدد كبير من اليرقات، فهذا عادة يشير إلى أن الديدان نقلت إلى صفائح AMP FUDR كشباب بالغين بدلا من أن تكون L 4. يمكن للشباب البالغين وضع البيض قبل أن يبدأ تأثير FUDR، وأحيانا تهرب اليرقات من تأثيرات FUDR وتنمو لتصبح بالغة. هذه اليرقات ستحيط التجربة في هذه الحالة، وتنقل الديدان البالغة إلى صفائح جديدة وتتخلص من الصفائح القديمة التي تحتوي على اليرقات.

يجب أيضا نقل الديدان إلى صفائح جديدة إذا لوحظت بكتيريا حية تنمو هناك. بشكل عام، الجمع بين AMP وقتل الأشعة فوق البنفسجية يضمن عدم تلوث التجربة من بكتيريا حية، لكن يحدث ذلك أحيانا. أيضا، انقل الديدان.

إذا لوحظ نمو فطري على الوسط. إذا تم اكتشاف الفطر مبكرا بما فيه الكفاية، يمكن استئصال الفطر باستخدام رأس ماصة أو ملعقة. بمجرد أن ينمو ليصبح أكبر من بضعة مليمترات في القطر، يصبح من الأسهل عادة نقل الديدان إلى صفيحة جديدة.

قم بتقييم جميع الديدان لطول العمر كل يومين إلى ثلاثة أيام. باستخدام منظار التشريح. حدد ما إذا كانت كل دودة حية أم ميتة.

انقر برفق على الطبق. الدودة حية إذا تحركت استجابة للطرق. إذا لم تستجب الدودة للنقر على اللوحة، قم بالتكبير على منطقة الرأس، ثم اضغط بلطف على رأس الدودة باستخدام ريشة نقل بلاتينية.

سجل الدودة كأنها ميتة. إذا لم يستجب بتحريك رأسه، قم بإزالة الدودة الميتة من اللوحة. بعد فحص جميع الديدان، سجل التاريخ وعدد الديدان الحية والميتة.

الديدان التي توضع على وسط صلب تهرب أحيانا من سطح الصفيحة عن طريق الحفر أو الزحف على الجدار. الديدان التي تهرب مستبعدة تماما من الدراسة. عند الانتهاء، أعد الألواح إلى حاضنة 20 درجة مئوية.

انتظر يومين إلى ثلاثة أيام أخرى ثم تحقق من اللوحات مرة أخرى. استمر في هذا النظام حتى تموت كل دودة. عادة ما يتم عكس عدد الديدان التي تموت في كل يوم لحساب نسبة الديدان الحية في كل يوم، ويتم رسم هذه البيانات رسميا كمنحنى بقاء مع احتساب يوم وضع البيض بتوقيت.

اليوم الصفر. متوسط العمر النموذجي ل N 2. السلالة البرية من نوع سي إلجان التي تحافظ على البكتيريا القاتلة بالأشعة فوق البنفسجية عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تكون تقريبا 25 يوما كما تم قياسها من البيضة.

لقد أظهرنا لك للتو كيف تقيس العمر وترى الأناقة. يمكنك تعديل هذا الإجراء الأساسي لاختبار مجموعة متنوعة من الظروف البيئية، بما في ذلك تقييد النظام الغذائي وتداخل الحمض النووي الريبي، وهو ما يناقش في النص الداعم. هذا كل شيء.

شكرا لمشاهدتك وحظا موفقا في تجربتك.