معالجة Loblolly باين PtGen2 ميكروأري [كدنا]

تم إنتاج هذا الفيديو من قبل باحثين في كلية وارنيل للغابات والموارد الطبيعية بجامعة جورجيا. الغرض من هذا الفيديو التدريبي هو تفصيل كيفية معالجة LOB lolly pine pt ، gen two CDNA ، microarray مع إيلاء اهتمام خاص لغسل المصفوفة والتعامل معها ، قبل التهجين وبعده. بشكل عام ، تتبع بروتوكولاتنا تلك التي تم تطويرها في معهد أبحاث الجينوم Tiger ومرفق الموارد المشتركة Vanderbilt Microarray ، VMSR ، حيث تتم طباعة مصفوفاتنا.

لقد وجدنا أن المعالجة الأكثر صرامة ل PT Gen two مطلوبة لتوفير أكبر قدر من الاتساق فيما يتعلق بتوحيد جودة الإشارة والخلفيات المنخفضة. الخطوة الأولى هي الغسيل المسبق. نقوم بذلك لأن مخزن البقع الخاص بنا يحتوي على نسبة عالية جدا من الملح وهذا الغسيل المسبق ضروري لإزالة هذا الملح.

يتم وضع الشرائح في حامل منزلق مجهر وتغرق بقوة من 15 إلى 20 مرة في محلول SDS 0.2٪ تم تسخينه مسبقا إلى 43 درجة. بعد غسل الشرائح في محلول SDS ، تتم إزالتها بعناية باستخدام ملقط في جرة كوبلاند تحتوي على مخزن مؤقت للتهجين المسبق. يحتوي هذا المخزن المؤقت على خمسة XSSC 0.1٪ SDS و 1٪ BSA ، ويتم تسخينه أيضا عند 43 درجة.

جرة كوبلاند مغطاة بالعطر وتوضع في حاضنة 43 درجة لمدة ساعة واحدة. بعد التهجين المسبق ، تتم إزالة الشرائح إلى حامل منزلق مجهر ومعالجتها على التوالي من خلال خمسة تغييرات في الماء منزوع الأيونات يغرق من 15 إلى 20 مرة في كل تغيير. أخيرا ، يتم وضع الشرائح في الأيزوبروبانول وتغمس خمس أو ست مرات قبل أن يتم طردها بالوحدة حتى تجف في جهاز طرد مركزي M mate.

بعد الطرد المركزي ، يتم نفخ الشرائح بالهواء المضغوط الذي يمر عبر مرشح 0.2 ميكرون. ثم يتم تراكب الشرائح بزلات رافع ، والتي تم تنظيفها أيضا بالهواء المضغوط ، ونستخدم طرف ماصة صغير لضبط انزلاق الرافع في الموضع الصحيح. على الشريحة.

بعد وضع زلات الرافع ، ولكن قبل إضافة المخزن المؤقت للتهجين ، نضيف 20 ميكرولترا من 100 مللي مولار ديهي ، وثلاثة أتول إلى آبار الرطوبة الموجودة في نهايات الغرفة. نحن الآن جاهزون لإضافة CDNAs المستهدفة، والتي تم تعليقها في المخزن المؤقت للتهجين. يتم وضع طرف الماصة على حافة زلة الرافع ويتم سحب الشريحة والمحلول ببطء.

وجدنا أن استخدام التأثير الشعري لتحميل المصفوفات يوفر أكبر قدر من الاتساق ويقلل بشكل كبير من دمج أي فقاعات غير مرغوب فيها. بعد إضافة المادة المستهدفة إلى المصفوفة ، يتم تجميع غرفة التهجين وتغطيتها بورق الألمنيوم. ثم يتم وضع غرفة التهجين في حمام مائي مهتز للحضانة طوال الليل ، عادة من 14 إلى 16 ساعة.

ضبط الحمام المائي على 48 درجة والخلاط على 50 دورة في الدقيقة. من المهم أيضا ملاحظة أنه من نقطة إضافة محلول التهجين من خلال جميع عمليات الغسيل بعد التهجين ، يتم تنفيذ الإجراءات في الإضاءة المنخفضة لمنع أكسدة الضوء. في اليوم التالي ، تتم إزالة الشرائح من غرفة التهجين ووضعها في وعاء كوبلاند يحتوي على محلول الغسيل رقم واحد ، والذي تم تسخينه مسبقا إلى 53 درجة.

يسمح للشرائح بالبقاء في جرة كوبلاند لمدة دقيقة تقريبا حتى ينزلق الرافع بعيدا ، وعند هذه النقطة تتم إزالة الشرائح برفق باستخدام ملقط ووضعها في حامل منزلق مجهر لمتابعة الغسيل. ثم يتم غمر الشرائح بقوة حوالي 15 إلى 20 مرة في حاوية ثانية ، تحتوي أيضا على محلول الغسيل رقم واحد عند 53 درجة. ثم يتم تغطية الحاوية بالعطر وتوضع في شاكر هواء حاضنة على درجة حرارة 53 درجة ومائة دورة في الدقيقة.

بعد محلول الحضانة والغسيل لمدة 10 دقائق ، رقم واحد ، يتم غمر الشرائح بقوة من 15 إلى 20 مرة في حاوية بها محلول غسيل رقم اثنين ، وهو في درجة حرارة الغرفة للحاوية. يتم تغطيتها بفيلم para ووضعها مرة أخرى على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أخيرا ، تتم إزالة الشرائح من محلول الغسيل رقم اثنين وتغمس بقوة من 15 إلى 20 مرة في حاوية بمحلول غسيل رقم ثلاثة.

ثم تتم إزالة الشرائح في حاوية ثانية من محلول الغسيل رقم ثلاثة مغطاة بالبرفيل وتوضع مرة أخرى على الخلاط لمدة 10 دقائق. بعد الغسيل النهائي ، نقوم بالطرد المركزي للشرائح لإكمال الجفاف. للقيام بذلك ، نضع غطاء Falcon سعة 15 مل في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، ونضع جانب الباركود للمصفوفات لأسفل في الأنبوب المخروطي.

ثم يتم تدوير الأنابيب في رأس دلو متأرجح بسرعة 1500 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، تتم إزالة الشرائح إلى مجموعة ثانية من الأنابيب المخروطية سعة 50 مل ، والتي تم تغطيتها بورق الألمنيوم. ثم يتم تطهير الأنابيب بغاز النيتروجين ، والذي يتم ترشيحه من خلال مرشح وغطاء 0.22 ميكرون للنقل أو للتخزين حتى المسح.

نقوم بجمع بيانات المسح الضوئي على مصفوفة مسح PerkinElmer 5,000. يتم ربط صورة المصفوفة بالشبكة ومعالجة بيانات المسح الخام ويتم إجراء تحليل البيانات الأولي باستخدام مجموعة برامج التصوير الخاصة ب bio discovery. بعد ذلك ، يتم تطبيع بيانات شدة الإشارة الموضعية حيث يتم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام أدوات مصفوفة BRB ، وهي حزمة إحصائية قوية ومتاحة مجانا يمكن تنزيلها من المعهد الوطني للسرطان.

يتم إجراء التحليل الإحصائي الآخر وعمليات البحث عن أنماط التعبير الجيني باستخدام نمط التعبير الجيني ومجموعة التحليل Jeep PPAs. حزمة تحليل أخرى متاحة مجانا على شبكة الإنترنت. شكرا لك على مشاهدة الفيديو الخاص بنا حول كيفية معالجة المصفوفة الدقيقة lob lolly pine PT Gen two microray.

كان الأفراد التالية أسماؤهم مسؤولين عن محتوى وإنتاج هذا الفيديو التدريبي.